專利名稱：一種高效的聚乙二醇活化工藝及活化物的蛋白質(zhì)修飾應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)化學領(lǐng)域，特別涉及蛋白質(zhì)修飾劑及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
聚乙二醇(PEG)化學修飾蛋白質(zhì)作為一種提高蛋白質(zhì)在醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域應用的方法，正引起人們越來越多的關(guān)注。經(jīng)過適當?shù)幕瘜W修飾，蛋白質(zhì)的很多特征會發(fā)生變化，同時有效地保持其主要的生物功能，如酶活性或受體識別能力。通過PEG修飾可掩飾蛋白質(zhì)的表面并增加其分子體積，從而降低被腎小球過濾的幾率；還可防止抗體、抗原、酶等的靠近，減少被蛋白酶類的降解。PEG還可將自身的理化性質(zhì)賦予蛋白質(zhì)，例如改變蛋白質(zhì)的生物體內(nèi)的分布及溶解性[i]，實現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物的靶向給藥。
許多實驗已證明，蛋白質(zhì)經(jīng)PEG修飾后免疫原性與抗原性大大降低。例如經(jīng)PEG修飾的牛血清蛋白(BSA)不與BSA抗血清發(fā)生沉淀，經(jīng)PEG修飾的BSA免疫血清既不與BSA反應，也不與經(jīng)PEG修飾的BSA反應，可見BSA喪失了免疫原性和抗原性[ii]。蛋白質(zhì)經(jīng)PEG修飾后其循環(huán)半衰期也有不同程度提高，如超氧化物歧化酶(SOD)經(jīng)PEG化后，在體內(nèi)的半衰期(T1/2)從0.667h延長到5.09h[iii]。另外，經(jīng)PEG共價修飾后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性也往往有不同程度的提高，許多不溶性藥物經(jīng)PEG修飾后給藥更為容易[iv]。
目前，至少有2種PEG修飾的蛋白藥物(PEG-L-天冬酰胺酶，PEG-腺苷脫氨酶)由FDA批準上市，有5種以上處于臨床實驗階段。據(jù)不完全統(tǒng)計，有27種酶處于研究階段?？梢姡琍EG化學修飾技術(shù)是生化藥物研究開發(fā)的重要手段，如果與基因重組技術(shù)相結(jié)合，將有更好的發(fā)展前景。
另外，由于PEG可改變蛋白質(zhì)的可溶性、生物相容性、藥代動力學等性質(zhì)，在應用生物技術(shù)領(lǐng)域也具有很大潛力。例如，在有機相中不可溶的酶經(jīng)PEG修飾后變?yōu)榭扇芮颐富钚缘玫奖Ａ?，這對生物催化及制藥技術(shù)的發(fā)展具有重大意義。
PEG簡介PEG是一種線性的或分支的中性聚合物，溶于水及其他很多有機溶劑，其分子式為HO-(CH2CH2O)n-CHCH2OH；用于蛋白質(zhì)修飾的聚乙二醇多為單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，分子式為HO-(CH2CH2O)n-CHCH2O-CH3。mPEG分子只有一個羥基用于偶聯(lián)反應，另一端的羥基被甲基化，避免了偶聯(lián)反應中蛋白質(zhì)分子的相互交聯(lián)。
PEG化學修飾蛋白質(zhì)在生物技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域引起人們很大興趣有以下幾個原因(1)PEG沒有毒性，已經(jīng)被FDA批準用于體內(nèi)服用[v，vi，vii]。
(2)靜脈注射到人體內(nèi)的游離PEG很容易通過腎排出[viii]。
(3)PEG的免疫原性很小。
(4)在蛋白質(zhì)適當?shù)牟课还矁r偶聯(lián)上PEG后，活性不會完全喪失，某些蛋白質(zhì)還有活性升高的情況。并且能消除一些異體蛋白質(zhì)的免疫原性，能延長蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的半衰期[ix]。
(5)水溶液中PEG存在的條件下它能有效地排除其它聚合物，這一性質(zhì)已經(jīng)應用到雙水相萃取的研究中。
PEG與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后，PEG可以穩(wěn)定被修飾的蛋白質(zhì)分子；降低或消除蛋白質(zhì)的免疫原性及提高耐受性；降低蛋白質(zhì)被腎臟清除的速率；提高蛋白質(zhì)對細胞膜的穿透力；改善藥物動力學。
PEG活化技術(shù)單甲氧基聚乙二醇的一端羥基被甲基封閉，可以避免蛋白質(zhì)的交聯(lián)；另一端的羥基化學反應活性較低，只能在較激烈的條件下直接與其它基團反應，而這樣的條件常為蛋白質(zhì)所不能耐受。因此需要用一定的方法改造PEG的末端羥基，即連接特定的活潑基團之后才能在溫和的條件下，以較高的反應速率與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)。這便是PEG的活化技術(shù)(activation)。
PEG修飾的位點可以是蛋白質(zhì)表面的氨基，也可以是巰基或其它特殊基團，但大多數(shù)是修飾氨基。因為蛋白質(zhì)分子表面的游離氨基，具有較高的親核反應活性，使之成為蛋白質(zhì)化學修飾中最常用的被修飾基團。
幾種用于偶聯(lián)蛋白質(zhì)分子的mPEG的常用的活化方法在文獻以及專利中都有報道。下圖列出了常用的PEG活化方法，即mPEG的活性中間體的制備。mPEG的活性中間體含有能和蛋白質(zhì)分子上的氨基或其它活性基團相反應的功能基團，與蛋白質(zhì)分子的反應條件必須足夠溫和，以維持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。同時，為達到此目的，應使用以水為溶劑的緩沖液以及接近中性的pH值。
在DAVIS及其最初合作者的研究工作中，三聚尿氰(1、2)和PEG上的醇羥基反應，以使三聚尿氰(或稱三氯均嗪)環(huán)上的鹵原子只有一個被取代，其它的鹵原子可和蛋白質(zhì)分子上的氨基反應(三氯均嗪，第一個Cl在4℃就可以反應，第二個在25℃，第三個在80℃才反應)。這一方法已被很多研究者所采用及改進，至今仍是最常用的方法之一。雖然這種活化只需一步即可完成，但因三鹵均嗪衍生物的毒性以及過強的反應活性而使反應速度難以控制，因而使其應用受到限制。事實上，尿嗪鹵化物被認為是蛋白質(zhì)修飾最不合適的試劑。用其修飾的蛋白質(zhì)常伴隨生物活性的較大損失。
用N-羥基琥珀酰亞胺與其它化學試劑(3～8)聯(lián)合對PEG活化的方法和修飾產(chǎn)物，實施可行性好、活性高，是近年來常被采用的方法和修飾劑，但這些修飾劑存在著容易水解、儲存性能不穩(wěn)定的缺點，而且對某些蛋白質(zhì)反應活性過高，不利于控制修飾度和修飾位點。
1986年That T.Ngo在US4,582,875中公開了一種用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽(2-Fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate)活化固體載體聚合物羥基的方法，如多糖介質(zhì)等。該試劑也可以用于PEG或mPEG羥基的活化。用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽活化的PEG或mPEG與前述方法的活化產(chǎn)物相比具有抗水解能力強的優(yōu)點，因此特別適合于在水性溶液中對多肽或者蛋白質(zhì)等生物活性分子進行活化修飾。但是That T.Ngo提供的活化方法并不特別適合于PEG或mPEG的活化，主要因為(1)該專利所公開的工藝是針對不溶于活化用溶劑的固體載體，而PEG或mPEG溶解于活化用溶劑，因此，包括原料處理、活化條件、產(chǎn)物分離、產(chǎn)物純化等工藝將不同；(2)用于生物活性分子化學修飾的活化PEG或mPEG都有很高的要求，例如活化產(chǎn)物的活化率要高(＞95％)，活化產(chǎn)物的純度要高(＞99％)等等。但是，很可惜用That T.Ngo提供的活化方法得到的活化PEG或mPEG并不能滿足這些要求，因為它們的活化度較低(＜30％)，產(chǎn)物的純度較低(＜75％)。用這樣的活化PEG或mPEG對蛋白質(zhì)進行化學修飾顯然是不理想的，因為活化率低勢必要用很高濃度的修飾劑，而修飾劑濃度過高對蛋白質(zhì)的生物活性保護是不利的；修飾劑純度低的話其含有的一些雜質(zhì)也會對蛋白質(zhì)的生物活性造成傷害。
為此，本發(fā)明提供一種高效的聚乙二醇(PEG)末端羥基的活化工藝及其活化產(chǎn)物在蛋白質(zhì)修飾中的應用。其特征是(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性質(zhì)將PEG溶解在甲苯中，然后加熱到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)。(2)無水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽在無水的極性有機溶劑(水份含量＜50ppm)中進行反應，例如乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等。(3)反應過程中滴加叔胺或者吡啶等有機堿維持溶液pH在8～9之間。(4)利用乙醚沉淀的方法分離PEG活化產(chǎn)物；利用異丙醇重結(jié)晶的方法純化PEG活化產(chǎn)物。(5)純凈的PEG活化產(chǎn)物在緩沖水溶液中與蛋白質(zhì)等帶有親核基團的生物活性分子反應，得到PEG與該分子的偶聯(lián)物。本發(fā)明提供的PEG的活化方法與US4,582,875中公開的方法相比具有以下的優(yōu)點產(chǎn)物活化率高(95％vs 30％)；產(chǎn)物純度高(99％vs 75％)。另外，還具有活化產(chǎn)物的化學穩(wěn)定性好；修飾反應條件溫和；修飾速度可控性好；修飾產(chǎn)物的化學穩(wěn)定性好；修飾產(chǎn)物的生物活性保留值高等優(yōu)點。所以本發(fā)明的活化PEG能應用于各種帶親核基團的分子的修飾，尤其適用于各種帶氨基和巰基的生物活性分子，例如多肽和蛋白質(zhì)的修飾，以達到降低其免疫原性、降低其被體內(nèi)酶分解的速度、增加其分子量和溶解度、改善其在體內(nèi)的藥物動力學性質(zhì)等目的。
蛋白質(zhì)修飾技術(shù)本發(fā)明提供的高純度PEG修飾劑對三種蛋白質(zhì)藥物進行了修飾，即血紅蛋白、重組人粒細胞集落刺激因子(rh G-CSF)以及重組人a-干擾素(rhIFN-a)。
血液最重要的生物學功能是通過血紅蛋白實現(xiàn)的。將從動物血液或人體血液中提取的血紅蛋白再輸入人體，可以期望獲得血紅蛋白的攜氧功能。首次報告使用血紅蛋白作為紅細胞替代物是在1898年，Von Stark用血紅蛋白治療一個貧血病人。盡管做了許多嘗試，結(jié)果存在著(1)血紅蛋白很快從腎臟排泄出去，(2)腎毒性，(3)血壓升高等現(xiàn)象；經(jīng)人們研究發(fā)現(xiàn)快速從腎臟排除是由于血紅蛋白分子太小，腎毒性是由于血紅蛋白進入血液后分解成二聚體，二聚體具有腎毒性；血壓升高則是因為”血管活性”效應。血紅蛋白由于有上述缺陷，因而不能直接用作血液替代品。一個解決的辦法就是對血紅蛋白用聚乙二醇或其它大分子進行化學修飾。這方面的研究在60-70年代作出了幾個非常重要的發(fā)現(xiàn)。然而，真正努力開發(fā)用于人體的修飾血紅蛋白是由于受到公眾對于捐獻血液中存在的HIV和丙肝及其它病毒的關(guān)注在80年代才開始的。
人體內(nèi)粒細胞集落刺激因子(G-CSF)由單核巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、纖維母細胞和骨髓間質(zhì)細胞產(chǎn)生，其功能是(1)作用于中性粒細胞的前體細胞，促進多功能干細胞進入細胞周期，刺激其增殖和分化，加速粒細胞的生成；(2)感染時G-CSF的分泌增加，可促進中性粒細胞向炎癥部位移動，增強其對病原微生物的吞噬和殺傷力；(3)加強中性粒細胞依賴細胞介導的細胞毒作用，增強其抗腫瘤能力；(4)活化單核巨噬細胞功能；(5)誘導某些白血病細胞分化和成熟。自從1986年Seuza等報道人粒細胞集落刺激因子基因在大腸桿菌中重組成功，表達并制備出重組蛋白以來，世界上一些藥業(yè)公司相繼對這一產(chǎn)品進行了開發(fā)、報批和批量生產(chǎn)，為這一產(chǎn)品的臨床研究和應用創(chuàng)造了條件。然而其在人體內(nèi)的循環(huán)半衰期卻很短，主要是由于注入人體后，免疫系統(tǒng)會識別G-CSF并發(fā)生免疫反應將其清除，同時體內(nèi)的蛋白水解酶也會將其水解一部分，腎小球?qū)⑵渥鳛樾》肿游镔|(zhì)濾出。綜上原因可見，G-CSF實際在體內(nèi)的利用率是很低的，這無疑是一種極大的浪費。通過將PEG等大分子與G-CSF偶聯(lián)的方法就可以達到以下的目的(1)降低G-CSF的免疫原性，使其不因體內(nèi)的免疫反應而被清除；(2)增強其抗蛋白酶水解能力；(3)增大G-CSF的分子量，大大降低腎小球?qū)-CSF的過濾速度。同時G-CSF的熱穩(wěn)定性、抗酸堿能力及抗變性能力都會有所增強，最終目的就是要延長G-CSF在體內(nèi)的循環(huán)半衰期，提高利用率。
干擾素是一種細胞因子，它是機體感染病毒時，宿主細胞通過抗病毒應答反應而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能相近的低分子糖蛋白。干擾素是1957年英國科學家發(fā)現(xiàn)的。干擾素有多種亞型，其中最大的一類亞型是α-干擾素。α-干擾素具有三大功能(1)抗病毒作用這是干擾素最重要的也是應用最廣的作用。干擾素通過抑制病毒復制和調(diào)節(jié)機體免疫功能，從而發(fā)揮抗病毒作用。(2)抗腫瘤作用α-干擾素是臨床上應用最廣的治療腫瘤的細胞因子。它通過直接抗腫瘤細胞增殖和調(diào)節(jié)機體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。(3)免疫調(diào)節(jié)作用α-干擾素通過調(diào)節(jié)機體的免疫功能，從而間接地發(fā)揮抗病毒作用和抗腫瘤作用。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染呈全球分布，易慢性化，其中20％的慢性患者將發(fā)展為肝硬化等終末期肝病，而HCV感染引起的肝硬化又是肝細胞癌變的重要相關(guān)因素。迄今為止，干擾素是唯一相對有效的治療藥物，然而，僅30％左右的干擾素治療者可保持長期的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常，即使在干擾素治療中合并使用病毒唑，其長期效果也僅僅達到40％。干擾素單劑或干擾素聯(lián)合病毒唑治療丙型肝炎的低反應率主要與病毒因素、宿主因素以及治療制劑因素三個方面有關(guān)。干擾素藥代動力學過程對有效性的影響與HCV的復制特性有關(guān)。干擾素吸收后很快并分布到全身，腎臟清除率高，由于其這一特性，天然的干擾素或基因工程干擾素半衰期都很短，在血清中僅持續(xù)6h(4h～8h)。將聚乙二醇與干擾素偶聯(lián)通過以下幾個方面的機制來延長蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的半衰期，從而達到增強其生物學活性的作用(1)蛋白質(zhì)與聚乙二醇偶聯(lián)后，分子質(zhì)量增大，皮下注射后吸收緩慢；(2)聚乙二醇的甲基中含有大量的氫原子，其氫鍵可與水分子結(jié)合，因此，增加了聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的水溶性；(3)聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的分子質(zhì)量增大，減少了腎臟的排泄。一般分子質(zhì)量在68kD以下的蛋白質(zhì)常由腎小球濾過經(jīng)尿排出，聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物質(zhì)量增大，同時流體半徑加大，導致腎小球濾過減少。聚乙二醇鏈的復雜程度也會影響聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物被腎臟的清除，所以，偶聯(lián)分支鏈PEG的蛋白質(zhì)比偶聯(lián)線性PEG的蛋白質(zhì)腎臟清除率更低，半衰期更長。(4)PEG干擾了細胞清除機制，減少了蛋白質(zhì)的細胞清除；(5)聚乙二醇與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物在血液循環(huán)中能抵抗被蛋白酶與肽酶的降解，這一特性可能與PEG包裹了蛋白質(zhì)，阻斷蛋白質(zhì)與蛋白酶的接觸有關(guān)。此外，血液循環(huán)中的胰蛋白酶的作用位點位于賴氨酸與精氨酸之間，而聚乙二醇與蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)的主要位點也是賴氨酸，該位點與聚乙二醇的偶聯(lián)妨礙了蛋白酶進入活性位點；(6)結(jié)合于組氨酸的PEG結(jié)合位點往往位于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)核心，保證了聚乙二醇化的穩(wěn)定性，(7)PEG本身并不具備抗原性，當?shù)鞍踪|(zhì)與聚乙二醇偶聯(lián)后，PEG遮蓋了蛋白的抗原決定族，從而降低了蛋白的抗原性。
i Francesco M.Veronese.Review Peptide and protein PEGylationa review of problems andsolutions.Biomaterials.2001，22405-417ii Abuchowshi A，Davis FF.Alteration of immunoiogical proporties of bovine serum albumin bycovalent attachment of polyethylene glycol.J Biol Chem，1997，2523568-358liii 楊保珍，張?zhí)烀?，王樹歧。聚乙二醇修飾超氧化物歧化酶的研究，藥物生物技術(shù)。1998，5(1)12-16iv Herman S，Hooftman G，Schacht E.Poly(ethylene glycol)with reactive endgroupsI.Modification of proteins.J Bioactive Compatible Polym.1995，10145-87vD.A.Herold，K.Keil，and D.E.Bruns，Biochem.pharmacol，38，73(1989)viH，F(xiàn)，Smyth，Jr，C，P.Carpenter，andC.S.Weil，J，Am，pharm，Assoc。39，349(1950)viiA，J.Johnson，M.H.darpatkin，andJ，Newman，Br.J.Hematol.21，21(1971)viiiC.B.Shaffer and F.H.Critchfield，J.Am.Pharm.Assol，36，152(1947)ixA.Abuchowski，J.R.Mccoy，N.C.Palczuk，Vanes，and F.F.Davis，J.Biol.Chem.，252，3582(1997)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種高效的聚乙二醇(PEG)末端羥基的活化工藝及其活化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)等帶親核基團的生物活性分子的修飾反應方法和反應產(chǎn)物。其特征是(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性質(zhì)將PEG溶解在甲苯中，然后加熱到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)。(2)無水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽在無水的極性有機溶劑(水份含量＜50ppm)中進行反應，例如乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等。(3)反應過程中滴加叔胺或者吡啶等有機堿維持溶液pH在8～9之間。(4)利用乙醚沉淀的方法分離PEG活化產(chǎn)物；利用異丙醇重結(jié)晶的方法純化PEG活化產(chǎn)物。(5)純凈的PEG活化產(chǎn)物在緩沖水溶液中與蛋白質(zhì)等帶有親核基團的生物活性分子反應，得到PEG與該分子的偶聯(lián)物。本發(fā)明提供的PEG的活化方法具有以下的優(yōu)點產(chǎn)物活化率高；產(chǎn)物純度高。另外，還具有活化產(chǎn)物的化學穩(wěn)定性好；修飾反應條件溫和；修飾速度可控性好；修飾產(chǎn)物的化學穩(wěn)定性好；修飾產(chǎn)物的生物活性保留值高等優(yōu)點。所以本發(fā)明的活化PEG能應用于各種帶親核基團的分子的修飾，尤其適用于各種帶氨基和巰基的生物活性分子，例如多肽和蛋白質(zhì)的修飾，以達到降低其免疫原性，降低其被體內(nèi)酶分解的速度，增加其分子量和溶解度，改善其在體內(nèi)的藥物動力學性質(zhì)等目的。
本發(fā)明提供的高效活化工藝、高純度活化產(chǎn)物及其與帶親核配基的分子的偶聯(lián)方法和偶聯(lián)產(chǎn)物可以帶來以下效應1.本發(fā)明提供的高效活化工藝及其與帶親核基團的分子的偶聯(lián)方法可用于帶羥基的分子的活化，微球、藥物載體、膜等表面的活化及其與帶親核基團的分子的連接。
2.各種帶氨基或巰基的蛋白質(zhì)、多肽、核酸的修飾，以達到降低蛋白質(zhì)等的免疫原性，提高蛋白質(zhì)和多肽的分子量，避免蛋白質(zhì)被酶分解，提高蛋白質(zhì)、多肽、核酸等藥物在體內(nèi)的半衰期，改變蛋白質(zhì)、多肽、核酸等分子在各種溶劑中的溶解度等目的。
3.各種帶親核基團的低分子化合物的修飾，以達到提高低分子化合物的分子量，提高低分子藥物在體內(nèi)的半衰期，改變低分子化合物在各種溶劑中的溶解度等目的。
4.帶羥基的各種低分子化合物的活化，以達到在低分子化合物上連接其它分子的目的。


圖1聚乙二醇的活化及其與帶親核基團分子的偶聯(lián)反應示意圖。
圖2(A)和(B)是FMP-mPEG分別在0.5NHCl和0.5NNaOH溶液中的紫外-可見光吸收光譜。
圖3(A)和(b)分別為m-PEG和FMP-mPEG的紅外光譜。
圖4FMP-mPEG修飾蛋白質(zhì)(血紅蛋白、G-CSF、α-干擾素)的SDS-PAGE電泳圖。
具體實施方案本發(fā)明包括一種高效的聚乙二醇(PEG)末端羥基的活化方法及其高純度活化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)等帶親核基團的生物活性分子的偶聯(lián)方法和偶聯(lián)產(chǎn)物。PEG的活化流程以及活化產(chǎn)物與帶親核基團的分子的偶聯(lián)反應流程如圖1所示，其中TEA表示三乙胺，P-AH2和P-SH表示帶有親核基團的分子。
具體方法和步驟說明如下1)聚乙二醇(PEG)的預處理利用水和甲苯在140℃共沸的性質(zhì)將PEG溶解在甲苯中，然后加熱到140℃共沸除去PEG中的水份。然后用PEG的非溶劑，例如乙醚將PEG從甲苯溶液中沉淀出來，并在真空干燥器中將乙醚完全除去得到干燥的PEG固體(PEG水份含量＜50ppm)。
2)聚乙二醇(PEG)的活化將預處理后的聚乙二醇溶解在無水的極性有機溶劑中，然后加入2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽(FMP)進行反應，反應過程中滴加叔胺或者吡啶等有機堿維持溶液pH在8～9之間。
上述反應所使用的極性溶劑包括乙氰、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮以及四氫呋喃等。叔胺包括三乙胺或三丁胺等。反應條件為常溫常壓，反應時間為15分鐘左右。聚乙二醇的分子量范圍為1000-30000d。
3)聚乙二醇活化產(chǎn)物(FMP-PEG)的分離提純用PEG的非溶劑，例如乙醚、乙酸乙酯等，將FMP-PEG從極性有機溶劑中沉淀出來，然后過濾除去溶劑。再將沉淀物溶于異丙醇中，并加熱到55℃使固體完全溶解，然后在攪拌的條件下自然降溫直到固體重新完全沉淀出來。再過濾除去異丙醇。最后用真空干燥器進一步除去溶劑得到干燥的FMP-PEG白色固體。
4)聚乙二醇活化產(chǎn)物(FMP-PEG)與帶親核基團的生物活性分子的偶聯(lián)(修飾)將FMP-PEG與帶親核基團的分子在水性緩沖液(pH7-10)或極性有機溶劑中混合，使兩者反應得到結(jié)構(gòu)為RO-(CH2CH2O)nCH2CH2-AH2-P或RO-(CH2CH2O)nCH2CH2-B-P(A、B為親核基團)的偶聯(lián)產(chǎn)物。
偶聯(lián)反應的可以在不同的溫度和pH條件下，在水溶液或極性有機溶劑中進行。反應條件根據(jù)反應試劑的敏感性和實際操作難易程度來確定。
帶親核基團的分子包括帶伯氨、仲胺或巰基等基團的分子。任何可以取代PEG上1-甲基-2-吡啶基的基團都可以用作被修飾的分子。因此，被修飾分子可以包含任何的脂肪基、芳香基、雜環(huán)基或芳香雜環(huán)基或者任何包含前述基團組合的分子，只要該分子含有可以被偶聯(lián)的功能基團。尤其是具有生物活性的分子，如包括酶、抗原或抗體在內(nèi)的蛋白質(zhì)分子；氨基酸；聚氨基酸；多肽；硫醇化合物；輔因子；核苷；多聚核苷酸；半抗原等。
實施例1用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽(FMP)活化單甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5000)將250ml甲苯和50g mPEG5000加到1000ml的圓底燒瓶中，在圓底燒瓶上依次接上分水器、回流冷凝管和干燥塔，然后加熱甲苯溶液到140℃。保持回流狀態(tài)兩個小時。然后將回流裝置改為減壓蒸餾裝置，蒸出200ml甲苯。再向圓底燒瓶中加入500ml乙醚，在攪拌的條件下自然降溫，直到固體完全沉淀出來。然后過濾除去乙醚，并將沉淀物放到真空干燥器中把殘余的乙醚除去。得到干燥的無水mPEG5000。然后用卡氏水分測定儀測定干燥后無水mPEG5000中的水分含量，要求水分含量低于50ppm。
用量筒稱量干燥25ml乙腈倒入500ml的圓底燒瓶中，將567mg FMP溶解于乙腈中。然后向燒瓶中加入10g分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。攪拌溶液的同時緩慢地向燒瓶中滴加三乙胺以維持溶液pH值在8～9之間。在常溫常壓的條件下反應15分鐘。反應結(jié)束后向乙腈溶液中加入足量的乙醚，直到?jīng)]有白色固體生成為止。用漏斗過濾乙醚和乙腈的混合溶液，并用300ml乙醚洗滌沉淀物。然后，將白色的固體重新溶于250ml異丙醇中，并加熱到55℃完全溶解固體。在攪拌的條件下自然降溫，直到固體完全沉淀出來。然后過濾除去異丙醇，并將沉淀物放到真空干燥器中干燥3個小時把殘余的異丙醇除去。得到蓬松的白色固體。
使用紫外-可見光吸收光譜和紅外光譜兩種方法鑒定mPEG的活化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。將mPEG的活化產(chǎn)物(FMP-mPEG5000)分別溶于0.5N HCl溶液和0.5NNaOH溶液，對這兩種溶液分別進行紫外-可見光的全波長掃描檢測。圖2是FMP-mPEG5000分別在這兩種溶液中的特征吸收圖譜。對比圖2(A)和(B)可知，F(xiàn)MP-PEG的活性末端在酸性溶液中穩(wěn)定，而在堿性溶液中發(fā)生水解，末端從PEG上脫落下來，吸光峰2從280nm移到297nm。另用傅利葉變換紅外光譜鑒定活化產(chǎn)物的基團，圖3(a)和(b)分別是mPEG-5000及其活化產(chǎn)物FMP-mPEG5000的紅外光譜圖。比較(a)和(b)可知，PEG經(jīng)活化后，在3500cm-1附近的O-H特征峰基本消失，而在1600cm-1附近出現(xiàn)吡啶環(huán)的特征峰。將不同濃度的FMP溶于氨水中水解，然后用在229nm下測定的吸光值作標準曲線。同樣，將活化的FMP-PEG溶于氨水并測定其在229nm下的吸光值。根據(jù)標準曲線可以計算出產(chǎn)物的活化率(95％)。根據(jù)活化率可以進一步計算得到產(chǎn)物的純度(99％)。
實施例2用FMP-mPEG5000偶聯(lián)重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)將G-CSF溶于0.1M硼酸-硼砂緩沖液，pH值為8.6，濃度為2.3mg/ml。取40ml溶液倒入200ml的錐形瓶并放到25℃的恒溫振蕩器中振蕩。然后向錐形瓶中加入0.98克FMP-mPEG5000。反應持續(xù)30分鐘后將反應體系的pH值調(diào)到4.0以終止偶聯(lián)反應。然后用凝膠過濾色譜除去未反應的FMP-mPEG，將收集到的偶聯(lián)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析其分子量變化情況，結(jié)果如圖4所示，用FMP-mPEG修飾后的產(chǎn)物分子量增大，表明FMP-mPEG與G-CSF生了偶聯(lián)反應，得到了偶聯(lián)產(chǎn)物。
實施例3用FMP-mPEG5000偶聯(lián)重組人α-干擾素(rhα-Interferon)將α-干擾素溶于0.1M硼酸-硼砂緩沖液，pH值為7.6，濃度為3.5mg/ml。取40ml溶液倒入200ml的錐形瓶并放到25℃的恒溫振蕩器中輕輕振蕩。然后向錐形瓶中加入3.1克FMP-mPEG5000。反應持續(xù)30分鐘后將反應體系的pH值調(diào)到4.0以終止偶聯(lián)反應。然后用凝膠過濾色譜除去未反應的FMP-mPEG，將收集到的偶聯(lián)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析其分子量變化情況。結(jié)果如圖4所示，用FMP-mPEG修飾后的產(chǎn)物分子量增大，表明FMP-mPEG與α-干擾素生了偶聯(lián)反應，得到了偶聯(lián)產(chǎn)物。
實施例4用FMP-mPEG5000修飾牛血紅蛋白(BHb)將血紅蛋白(Hemoglobin)溶于0.1M的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.6，濃度為2.5mg/ml。取40ml溶液倒入200ml的錐形瓶并放到4℃的恒溫振蕩器中輕輕振蕩。然后向錐形瓶中加入3.1克FMP-mPEG5000。反應持續(xù)30分鐘后將反應體系的pH值調(diào)到4.0以終止偶聯(lián)反應。然后用凝膠過濾色譜除去未反應的FMP-mPEG，將收集到的偶聯(lián)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析其分子量變化情況。結(jié)果如圖4所示，用FMP-mPEG修飾后的產(chǎn)物分子量增大，表明FMP-mPEG與血紅蛋白發(fā)生了偶聯(lián)反應，得到了偶聯(lián)產(chǎn)物。
前面所述幾個實施方案的目的是為了更好地說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。但是很明顯，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來講對本方法和材料的任何改進或改變都不超出本發(fā)明的范圍和精神。例如，使用其他分子量的mPEG或者其他的生物大分子。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇(PEG)末端羥基的高效活化工藝，其特征在于(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性質(zhì)將PEG溶解在甲苯中，然后加熱到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)；(2)無水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽在無水的極性有機溶劑(水份含量＜50ppm)中進行反應；(3)反應過程中滴加叔胺或者吡啶等有機堿維持溶液的pH在8～9之間；(4)利用乙醚沉淀的方法分離PEG活化產(chǎn)物；利用異丙醇重結(jié)晶的方法純化PEG活化產(chǎn)物。
2.一種如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇(PEG)末端羥基的高效活化工藝，其特征在于，活化產(chǎn)物的活化率達95％；產(chǎn)物純度達99％；產(chǎn)物化學穩(wěn)定性好，在中性和酸性條件條件下能穩(wěn)定保存6個月以上。
3.一種如權(quán)利要求1所述的工藝制備的PEG的純凈活化產(chǎn)物，其特征是PEG末端的羥基被1-甲基-2-吡啶基取代，結(jié)構(gòu)式如下圖所示。 CH2CH2(OCH2CH2)n-OR (R為H或烴基)
4.一種如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇(PEG)末端羥基的高效活化工藝，其特征在于聚乙二醇的分子量為1,000～30,000，優(yōu)選為2,000～20,000。
5.一種如權(quán)利要求2所述的聚乙二醇(PEG)純凈活化產(chǎn)物對帶親核基團的生物活性分子的修飾(偶聯(lián))工藝，其特征在于PEG活化產(chǎn)物與帶親核基團的被修飾分子在pH7～10的緩沖液中直接反應。
6.一種如權(quán)力要求5所述的修飾工藝制備的PEG活化產(chǎn)物與帶親核基團的生物活性分子的偶聯(lián)(偶聯(lián))產(chǎn)物，其特征在于PEG末端的C原子與親核基團直接以共價鍵結(jié)合，其結(jié)構(gòu)式為RO-(CH2CH2O)nCH2CH2-AH-P或RO-(CH2CH2O)nCH2CH2-B-P(A、B為親核基團，P為帶親核基團的分子)
7.一種如權(quán)利要求5所述的聚乙二醇(PEG)純凈活化產(chǎn)物對帶親核基團的生物活性分子的修飾(偶聯(lián))工藝，其特征在于帶親核基團的生物活性分子為血紅蛋白。
8.一種如權(quán)利要求5所述的聚乙二醇(PEG)純凈活化產(chǎn)物對帶親核基團的生物活性分子的修飾(偶聯(lián))工藝，其特征在于帶親核基團的生物活性分子為人體內(nèi)粒細胞集落刺激因子。
9.一種如權(quán)利要求5所述的聚乙二醇(PEG)純凈活化產(chǎn)物對帶親核基團的生物活性分子的修飾(偶聯(lián))工藝，其特征在于帶親核基團的生物活性分子為干擾素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種高效的聚乙二醇(PEG)末端羥基的活化工藝及其活化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)等帶親核基團的生物活性分子的修飾反應方法和反應產(chǎn)物。其特征是(1)將PEG和甲苯加熱到140℃共沸除去PEG中的水份。(2)無水PEG和2－氟－1－甲基吡啶鎓甲苯－4－磺酸鹽在無水極性有機溶劑中進行反應。(3)反應過程中滴加有機堿維持pH在8－9。(4)用乙醚沉淀PEG活化產(chǎn)物，用異丙醇重結(jié)晶法純化活化產(chǎn)物。(5)PEG活化產(chǎn)物在緩沖水溶液中與蛋白質(zhì)等帶有親核基團的生物活性分子反應，得到PEG與該分子的偶聯(lián)物。本發(fā)明提供的PEG的活化工藝具有產(chǎn)物活化率高(95％)，產(chǎn)物純度高 (99％)，修飾速度可控性好，修飾產(chǎn)物的化學穩(wěn)定性好等特點。本發(fā)明的活化PEG尤其適用于多肽和蛋白質(zhì)的修飾。
文檔編號C07K17/02GK1580082SQ0315328
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者蘇志國, 馬光輝, 贠強 申請人:中國科學院過程工程研究所