專利名稱：一種促進(jìn)豬生長的生物制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)與豬的飼養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種促進(jìn)豬生長的生物制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
提高動物的生產(chǎn)性能一直是畜牧業(yè)中一個重要的研究課題。人們通過各種途徑(包括選育良種、改進(jìn)飼料配方、增加某些飼料添加劑等)以求達(dá)到這一目的。使用外源性生長激素應(yīng)該是一個快速、有效的方法。豬生長激素(Porcine Growth Hormone，pGH)是一種腦垂體前葉分泌、含190個氨基酸的單鏈多肽激素，具有刺激骨及軟骨組織的生長、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、脂類和糖類代謝的功能。大量的研究結(jié)果表明豬生長激素能顯著提高動物的生長速度、瘦肉率及飼料報(bào)酬、降低脂肪的積聚，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益。由于生長激素是蛋白質(zhì)，不具有象類固醇類激素那樣的殘毒污染，是一種很有生產(chǎn)實(shí)用價值的生物制劑，但在目前的生產(chǎn)實(shí)際中卻不能普遍應(yīng)用。其主要原因是1、豬生長激素在動物組織中含量極少，從組織中提取的豬生長激素顯然不能滿足于生產(chǎn)的需要。近十多年來，人們通過生物技術(shù)的方法，包括大腸桿菌表達(dá)、昆蟲桿狀病毒表達(dá)、重組痘苗病毒表達(dá)或腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus)表達(dá)等，可以生產(chǎn)重組豬生長激素(例如中國專利申請00103044.2號)。但由于用這些方法(如腺相關(guān)病毒)制備復(fù)雜，滴度不高，并需要去除輔助病毒的污染等，因此，其產(chǎn)品都必需進(jìn)行提純、濃縮，其生產(chǎn)成本一般都比較高，不容易為畜主所接受。2、重組豬生長激素在動物體內(nèi)的半衰期很短，必需每天注射給藥，除了在生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中帶來極大的不便之外，還增加了動物的應(yīng)激反應(yīng)，不利于動物的生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，提供一種促進(jìn)豬生長的生物制劑的制備方法。該制劑的制作方法簡單，生產(chǎn)成本低，在動物體內(nèi)發(fā)揮作用時間長。
本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
第一步 克隆豬生長激素基因參照基因庫發(fā)表的豬生長激素基因cDNA序列，設(shè)計(jì)合成用于克隆豬生長激素基因的PCR引物(P15’TTAGATCTATGGCTGCAGGCCCTCGGACCTCC；P25’TTAGATCTCTAGAAGGCACAGCTGCTCTCCACAGATCT)，從豬的腦垂體組織mRNA中克隆豬生長激素基因的cDNA片斷；第二步 構(gòu)建重組腺病毒豬生長激素基因克隆到含有人巨細(xì)胞病毒早期啟動子(CMV)的表達(dá)載體(pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP)中，將重組表達(dá)載體和腺病毒基因組的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株，在菌體內(nèi)進(jìn)行病毒基因的同源重組，將所得到的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞株)；由于該表達(dá)載體可以同時表達(dá)綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因，因此，在熒光顯微鏡下觀察到帶綠色熒光的細(xì)胞，即可初步確定細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生帶豬生長激素基因的重組腺病毒；經(jīng)空斑技術(shù)進(jìn)一步分離病毒克隆，并對病毒DNA進(jìn)行PCR分析，證實(shí)重組腺病毒含有豬生長激素基因。用感染重組腺病毒的293細(xì)胞和PK-15細(xì)胞(豬腎細(xì)胞株)的培養(yǎng)液及細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western blot等分子生物學(xué)方法的檢測，證明所分離的重組腺病毒能在人源和豬源細(xì)胞培養(yǎng)中正確地表達(dá)豬生長激素蛋白。
第三步 生物制劑的制備293細(xì)胞培養(yǎng)于含體積百分比濃度為5～10％新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，在體積百分比含量5％二氧化碳、37℃的條件下生長，接種含有豬生長激素基因的重組腺病毒，待細(xì)胞發(fā)生病變后，收集含有重組腺病毒的細(xì)胞和培養(yǎng)液，凍融，離心，取上清液，即為本生物制劑。
測定病毒空斑形成單位(plaque forming unit，PFU)或半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(tissue culture infectious dose 50，TCID50)作為本生物制劑的效價。
為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述克隆豬生長激素基因采用RT-PCR DNA擴(kuò)增技術(shù)；所述共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株采用電激轉(zhuǎn)化方法。
本發(fā)明應(yīng)用時，將所述一種促進(jìn)豬生長的生物制劑直接肌肉注射到豬體內(nèi)，由重組腺病毒將豬生長激素基因帶到動物體內(nèi)的組織細(xì)胞中高效表達(dá)，其基因表達(dá)產(chǎn)物——重組豬生長激素將從細(xì)胞釋放到血流中而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，從而達(dá)到促進(jìn)動物生長的目的。
腺病毒(Adenovirus)為線狀雙鏈DNA、無包膜病毒。重組腺病毒作為基因表達(dá)載體，廣泛用于人類基因治療及其他基因表達(dá)方面的研究和應(yīng)用，在全世界600項(xiàng)基因治療的臨床試驗(yàn)中，28％是應(yīng)用重組腺病毒作為基因表達(dá)載體。其優(yōu)點(diǎn)是1、安全性好，尤其是應(yīng)用復(fù)制缺陷型的重組腺病毒；2、高效的基因表達(dá)；3、可感染的宿主范圍大，能感染分裂和不分裂的細(xì)胞；4、重組腺病毒感染時，病毒DNA游離在細(xì)胞核內(nèi)，而不整合到染色體上，因而沒有激活原癌基因或滅活抑癌基因的危險性。據(jù)報(bào)道，腺病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)，在動物體內(nèi)可持續(xù)六個星期以上。因此，可以有效地解決每天注射豬生長激素的問題。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、本發(fā)明采用復(fù)制缺陷型腺病毒作為豬生長激素基因的表達(dá)載體，直接在豬體內(nèi)高效生物合成具有生物學(xué)活性的重組豬生長激素，因而省去在體外表達(dá)、生產(chǎn)、提純重組生長激素等工序，大大降低了生產(chǎn)成本。
2、本發(fā)明使豬生長激素基因在動物體內(nèi)連續(xù)表達(dá)，表達(dá)時間長，表達(dá)量高，因而無需每天注射給藥，可達(dá)到長效的效果，既節(jié)省勞動力又減少對動物生活的干擾，更利于動物的生長，有效改善肉質(zhì)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說明。
在本發(fā)明實(shí)施例中，人胚胎腎細(xì)胞采用美國ATCC公司的293細(xì)胞株，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國Invitrogen公司，新生牛血清購于上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司。
實(shí)施例一第一步 克隆豬生長激素基因參照基因庫發(fā)表的豬生長激素基因cDNA序列，設(shè)計(jì)合成用于克隆豬生長激素基因的PCR引物，應(yīng)用RT-PCR DNA擴(kuò)增技術(shù)，從豬的腦垂體組織mRNA中克隆豬生長激素基因的cDNA片斷；第二步 構(gòu)建重組腺病毒豬生長激素基因克隆到含有人巨細(xì)胞病毒早期啟動子(CMV)的表達(dá)載體中，將重組表達(dá)載體和腺病毒基因組的質(zhì)粒用電激轉(zhuǎn)化方法(采用美國Bio-Rad公司的電激儀，參數(shù)為200Ω，25μF，2.5kV)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株，在菌體內(nèi)進(jìn)行病毒基因的同源重組，將所得到的重組腺病毒質(zhì)粒用脂質(zhì)體法(采用美國GIBCOBRL公司的Lipofectamine)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生帶豬生長激素基因的重組腺病毒；第三步 生物制劑的制備293細(xì)胞培養(yǎng)于含體積百分比濃度為5％新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，在體積百分比含量5％二氧化碳、37℃的條件下，等細(xì)胞生長成單層后，接種含有豬生長激素基因的重組腺病毒，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞發(fā)生病變后，如細(xì)胞變圓，脫落，即可收集含有重組腺病毒的細(xì)胞和培養(yǎng)液，-20℃/37℃反復(fù)凍融三次，3000rpm離心十分鐘，取上清液，即為本生物制劑。
實(shí)施例二第一步 克隆豬生長激素基因參照基因庫發(fā)表的豬生長激素基因cDNA序列，設(shè)計(jì)和合成用于克隆豬生長激素基因的PCR引物，應(yīng)用RT-PCR DNA擴(kuò)增技術(shù)，從豬的腦垂體組織mRNA中克隆豬生長激素基因的cDNA片斷；第二步 構(gòu)建重組腺病毒豬生長激素基因克隆到含有人巨細(xì)胞病毒早期啟動子(CMV)的表達(dá)載體中，將重組表達(dá)載體和腺病毒基因組的質(zhì)粒用電激轉(zhuǎn)化方法(采用美國Bio-Rad公司的電激儀，參數(shù)為200Ω，25μF，2.5kV)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株，在菌體內(nèi)進(jìn)行病毒基因的同源重組，將所得到的重組腺病毒質(zhì)粒用脂質(zhì)體法(采用美國GIBCOBRL公司的Lipofectamine)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生帶豬生長激素基因的重組腺病毒；第三步 生物制劑的制備293細(xì)胞培養(yǎng)于含體積百分比濃度為7％新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，在體積百分比含量5％二氧化碳、37℃的條件下，等細(xì)胞生長成單層后，接種含有豬生長激素基因的重組腺病毒，待細(xì)胞發(fā)生病變后，如細(xì)胞變圓，脫落，即可收集含有重組腺病毒的細(xì)胞和培養(yǎng)液，-20℃/37℃反復(fù)凍融三次，3000rpm離心十分鐘，取上清液，即為本生物制劑。
實(shí)施例三第一步 克隆豬生長激素基因參照基因庫發(fā)表的豬生長激素基因cDNA序列，設(shè)計(jì)和合成用于克隆豬生長激素基因的PCR引物，應(yīng)用RT-PCR DNA擴(kuò)增技術(shù)，從豬的腦垂體組織mRNA中克隆豬生長激素基因的cDNA片斷；第二步 構(gòu)建重組腺病毒豬生長激素基因克隆到含有人巨細(xì)胞病毒早期啟動子(CMV)的表達(dá)載體中，將重組表達(dá)載體和腺病毒基因組的質(zhì)粒用電激轉(zhuǎn)化方法(采用美國Bio-Rad公司的電激儀，參數(shù)為200Ω，25μF，2.5kV)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株，在菌體內(nèi)進(jìn)行病毒基因的同源重組，將所得到的重組腺病毒質(zhì)粒用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生帶豬生長激素基因的重組腺病毒；第三步 生物制劑的制備293細(xì)胞培養(yǎng)于含體積百分比濃度為10％新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，在體積百分比含量5％二氧化碳、37℃的條件下，等細(xì)胞生長成單層后，接種含有豬生長激素基因的重組腺病毒，待細(xì)胞發(fā)生病變后，如細(xì)胞變圓，脫落，即可收集含有重組腺病毒的細(xì)胞和培養(yǎng)液，-20℃/37℃反復(fù)凍融三次，3000rpm離心十分鐘，取上清液，即為本生物制劑。
實(shí)施例四對比試驗(yàn)(在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行)8頭雜交長白豬(平均體重為18公斤)隨機(jī)分成2組，每組4頭。對照組肌肉注射生理鹽水；試驗(yàn)組肌肉注射帶豬生長激素基因的重組腺病毒(1011TCID50/頭)。所有試驗(yàn)豬均采用自由采食方式，喂飼混合飼料。在注射前和注射后第四、六周稱體重。通過測定體重來評價外源豬生長激素對豬生長的促進(jìn)作用及生物學(xué)活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組的豬平均增重比對照組的豬增加37％(注射后第四周)和18％(注射后第六周)(見表1)。飼料報(bào)酬提高28％(注射后第四周)和18％(注射后第六周)(見表2)。該試驗(yàn)結(jié)果證明，由重組腺病毒表達(dá)的豬生長激素具有其生物學(xué)活性，在豬體內(nèi)起到促進(jìn)動物生長的作用。重組腺病毒介導(dǎo)的豬生長激素基因在豬體內(nèi)的表達(dá)期應(yīng)在四個星期之內(nèi)。
表1 Ad-pGH注射后豬平均體重增重比較


表2 Ad-pGH注射后飼料報(bào)酬比較

實(shí)施例五對比試驗(yàn)(在養(yǎng)豬農(nóng)場中進(jìn)行)對照組9頭雜交長白豬平均體重為51公斤，肌肉注射生理鹽水；試驗(yàn)組12頭雜交長白豬，平均體重為55公斤，肌肉注射含豬生長激素基因的重組腺病毒(3×109TCID50/頭)。所有試驗(yàn)豬均采用自由采食方式，喂飼混合飼料。在注射前和注射后第四周稱體重。結(jié)果表明，試驗(yàn)組的豬平均增重比對照組的豬增加12％(見表3)。
表3 Ad-pGH注射后豬平均體重增重比較

實(shí)施例六對比試驗(yàn)(在養(yǎng)豬農(nóng)場中進(jìn)行)對照組9頭雜交長白豬，平均體重為52公斤，肌肉注射生理鹽水；試驗(yàn)組11頭雜交長白豬，平均體重為45公斤，肌肉注射含豬生長激素基因的重組腺病毒(3×109TCID50/頭)。所有試驗(yàn)豬均采用自由采食方式，喂飼泔水。在注射前和注射后第35天稱體重。結(jié)果表明，試驗(yàn)組的豬平均增重比對照組的豬增加12％(見表4)。
表4 Ad-pGH注射后豬平均體重增重比較

實(shí)施例七毒性試驗(yàn)1、用本生物制劑皮下注射0.1ml(108TCID50/只)3天齡的小白鼠8只。觀察四周。結(jié)果表明，全部小白鼠都存活，未見任何異常癥狀。
2、用本生物制劑靜脈注射0.5ml(5×108TCID50/只)35天齡的小白鼠5只。觀察四周。結(jié)果表明，全部小白鼠都存活，未見任何異常癥狀。
3、在所有的試驗(yàn)豬只均沒有發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)。
上述的試驗(yàn)結(jié)果證明，本生物制劑對動物是安全的。
如上所述，即可較好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)豬生長的生物制劑的制備方法，其特征是，包括如下步驟第一步 克隆豬生長激素基因參照基因庫發(fā)表的豬生長激素基因cDNA序列，設(shè)計(jì)合成用于克隆豬生長激素基因的PCR引物，從豬的腦垂體組織mRNA中克隆豬生長激素基因的cDNA片斷；第二步 構(gòu)建重組腺病毒豬生長激素基因克隆到含有人巨細(xì)胞病毒早期啟動子的表達(dá)載體中，將重組表達(dá)載體和腺病毒基因組的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株，在菌體內(nèi)進(jìn)行病毒基因的同源重組，將所得到的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞；第三步 生物制劑的制備
293細(xì)胞培養(yǎng)于含體積百分比濃度為5～10％新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，在體積百分比含量5％二氧化碳、37℃的條件下生長，接種含有豬生長激素基因的重組腺病毒，待細(xì)胞發(fā)生病變后，收集含有重組腺病毒的細(xì)胞和培養(yǎng)液，凍融，離心，取上清液，即為本生物制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)豬生長的生物制劑的制備方法，其特征是，所述PCR引物為P15’TTAGATCTATGGCTGCAGGCCCTCGGACCTCC；P25’TTAGATCTCTAGAAGGCACAGCTGCTCTCCACAGATCT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)豬生長的生物制劑的制備方法，其特征是，所述含有人巨細(xì)胞病毒早期啟動子的表達(dá)載體為pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)豬生長的生物制劑的制備方法，其特征是，所述克隆豬生長激素基因采用RT-PCR DNA擴(kuò)增技術(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)豬生長的生物制劑的制備方法，其特征是，所述共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株采用電激轉(zhuǎn)化方法。
全文摘要
本發(fā)明是一種促進(jìn)豬生長的生物制劑的制備方法，首先設(shè)計(jì)合成用于克隆豬生長激素基因的PCR引物，克隆豬生長激素基因的cDNA片斷；然后將豬生長激素基因克隆到含有人巨細(xì)胞病毒早期啟動子的表達(dá)載體中，將重組表達(dá)載體和腺病毒基因組的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株，所得到的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞；最后接種含有豬生長激素基因的重組腺病毒，待細(xì)胞發(fā)生病變后，取上清液即為本生物制劑。本發(fā)明省去在體外表達(dá)、生產(chǎn)、提純重組生長激素等工序，大大降低了生產(chǎn)成本，使豬生長激素基因在動物體內(nèi)連續(xù)表達(dá)，表達(dá)時間長，表達(dá)量高，無需每天注射給藥，既節(jié)省勞動力又減少對動物生活的干擾，利于動物生長，有效改善肉質(zhì)。
文檔編號A61K48/00GK1616106SQ20041005140
公開日2005年5月18日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月9日
發(fā)明者曹漢威, 黃忠, 林潔 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所