專利名稱：注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料及其制備方法，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
(1)可注射凝膠給藥系統(tǒng)將藥物與可降解材料復(fù)合，然后經(jīng)注射送達(dá)體內(nèi)特定部位，使之固化形成凝膠并釋放出藥物和發(fā)揮治療作用是一種較好的給藥系統(tǒng)。這種給藥體系使用方便，可以延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間，減少藥物使用劑量以避免可能存在的副作用，而且不通過(guò)手術(shù)就將藥物植入體內(nèi)，減少了病人的痛苦。
(2)骨修復(fù)生物活性材料骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一類細(xì)胞生長(zhǎng)因子，它們能誘導(dǎo)未分化的間質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞并增殖，形成軟骨和新生骨，所以具有很強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性。雖然骨形態(tài)發(fā)生蛋白對(duì)骨缺損有明顯的修復(fù)作用，但為了使其在病灶部位持久發(fā)揮作用，通常將它與多種不同性質(zhì)的載體復(fù)合而制成各種類型的骨修復(fù)材料。這些骨修復(fù)材料可用于骨折、骨不連、骨缺損的修復(fù)，也可用于整形外科和牙科?，F(xiàn)有的骨修復(fù)材料需要通過(guò)手術(shù)植入到創(chuàng)傷部位，不僅操作復(fù)雜，使用費(fèi)用高，病人受到很大痛苦，而且不適合臨床上出現(xiàn)最多的閉合性骨折和其他不需手術(shù)的骨科病例使用，發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料的制備方法。
本發(fā)明的注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料，其特征是每個(gè)使用劑量由1毫升A組分和45～55mg B組分組成，其中，A組分的成分及其含量為每毫升蒸餾水中含有海藻酸鈉 10～40mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白 0.1～1mg甘露醇 10～20mg
B組分的成分及其含量為每mg中含有水難溶性鈣化合物 0.05～0.15mg葡萄糖酸內(nèi)酯 0.05～0.3mg聚乙烯吡咯烷酮 0.004～0.016mg甘露醇 余量上述的A組分可以是經(jīng)過(guò)冷凍干燥的凍干品，B組分是過(guò)60目篩的顆粒。
注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料的制備方法，包括以下步驟1)將1～4g的海藻酸鈉溶于100ml水中，然后在每毫升海藻酸鈉水溶液中加入0.1～1mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，再加入甘露醇10～20mg，凍干，此為A組分。
2)將500～1500mg水難溶性鈣化合物和500～3000mg葡萄糖酸內(nèi)酯混合，再加入稀釋劑甘露醇至總重量為10g，混合均勻；3)在步驟(2)所得混合物中加入1～2ml的濃度為4～8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤(rùn)濕，混合，調(diào)制成軟膏，擠壓過(guò)20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過(guò)60目篩整粒，此為B組分；4)A、B兩個(gè)組分分別用鈷60(60Co)照射進(jìn)行滅菌，照射劑量是6Kgy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
本發(fā)明中，所說(shuō)的海藻酸鈉為大連雅威特生物公司產(chǎn)品；骨形態(tài)發(fā)生蛋白是從動(dòng)物骨中提取的天然骨形態(tài)發(fā)生蛋白或是用基因工程方法生產(chǎn)的重組骨形態(tài)蛋白，例如可采用杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)基因技術(shù)所生產(chǎn)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白無(wú)菌凍干粉末，葡萄糖酸內(nèi)酯來(lái)自SIGMA，聚乙烯吡咯烷酮來(lái)上海伯奧生物技術(shù)公司，羥基磷灰石來(lái)自默克公司，碳酸鈣、硫酸鈣、甘露醇均為分析純。
本發(fā)明的骨修復(fù)生物活性材料在治療修復(fù)骨缺損中的應(yīng)用。
使用時(shí)，將凍干的A組分用1ml無(wú)菌生理鹽水溶解，吸入注射器中待用，根據(jù)治療需要取B組分，并按1mg用1ul無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)濕，然后將注射器中A組分加入B組分中，均勻混合成混懸液，經(jīng)注射器注入病灶部位。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后在病灶部位形成凝膠。此后，凝膠中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白緩慢釋出并發(fā)揮誘導(dǎo)新骨生成的作用。其原理是組分A中的載體海藻酸鈉是鈣離子介導(dǎo)的凝膠劑，組分B中葡萄糖酸內(nèi)酯在緩慢水解過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄糖酸能控制水難溶性鈣化合物中鈣離子的釋放。被釋放的鈣離子則與海藻酸鈉反應(yīng)而使它形成凝膠，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白保留在一定部位。
本發(fā)明將骨形態(tài)發(fā)生蛋白和載體以液體形式通過(guò)注射器注入病灶部位，經(jīng)一定時(shí)間后在體內(nèi)形成凝膠，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白固著在需要修復(fù)的骨損傷部位并發(fā)揮誘導(dǎo)骨生成的作用，這個(gè)骨修復(fù)材料生物相容性好，不僅使用簡(jiǎn)單，可避免手術(shù)造成的新的創(chuàng)傷，減輕病人的痛苦，而且可以根據(jù)治療需要調(diào)整用量，多次注射。本發(fā)明中的載體無(wú)毒害作用，植入體內(nèi)無(wú)不良反應(yīng)。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的成骨活性和含骨形態(tài)發(fā)生蛋白的固態(tài)骨修復(fù)材料相當(dāng)，治療效果確切。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例從幾個(gè)方面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例11)將1.5g海藻酸鈉溶于100ml水中，配置成濃度為1.5％的水溶液，在100ml該溶液中加入10mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，加入2g甘露醇，混勻，凍干，此為A組；2)取367mg碳酸鈣和436mg葡萄糖酸內(nèi)酯，加入4197mg甘露醇，混合均勻；3)在2)所得混合物中加入800ul濃度為8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤(rùn)濕后混合均勻，調(diào)制成軟膏，擠壓過(guò)20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過(guò)60目篩整粒。此為B組分；4)用60Co照射A組分和B組分，進(jìn)行滅菌，照射劑量為6KGy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
實(shí)施例21)將1.5g海藻酸鈉溶于100ml水中，配置成濃度為1.5％的水溶液，在100ml該溶液中加入50mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，加入甘露醇2g，混勻，凍干，此為A組分；2)440mg硫酸鈣，436mg葡萄糖酸內(nèi)酯，加入4124mg甘露醇，混合均勻。
3)在2)所得混合物中加入800ul 8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤(rùn)濕后混合均勻，調(diào)制成軟膏，擠壓過(guò)20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過(guò)60目篩整粒。此為B組分。
4)用60Co照射A組分和B組分，進(jìn)行滅菌，照射劑量為6KGy。
5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
實(shí)施例31)將1.5g海藻酸鈉溶于100ml水中，配置成濃度為1.5％的水溶液，在100ml該溶液中加入100mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，加入甘露醇1.5g，混勻，凍干，此為A組分；2)220.2mg碳酸鈣，261.6mg葡萄糖酸內(nèi)酯，加入2518.2mg甘露醇，混合均勻；3)在2)所得混合物中加入480ul 8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤(rùn)濕后混合均勻，調(diào)制成軟膏，擠壓過(guò)20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過(guò)60目篩整粒。此為B組分；4)用60Co照射A組分和B組分，進(jìn)行滅菌，照射劑量為6KGy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
實(shí)施例41)將4g海藻酸鈉溶于100ml水中，配置成濃度為4％的水溶液，在100ml該溶液中100mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，加入甘露醇2g，混勻，凍干，此為A組分；2)368.4mg羥基磷灰石，1307.3mg葡萄糖酸內(nèi)酯，加入3324.3mg甘露醇，混合均勻；3)在2)所得混合物中加入800ul 8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤(rùn)濕后混合均勻，調(diào)制成軟膏，擠壓過(guò)20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過(guò)60目篩整粒。此為B組分；4)用60Co照射A組分和B組分，進(jìn)行滅菌，照射劑量為6KGy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
實(shí)施例5細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例4制得的A、B兩種組分，按照使用劑量1毫升A組分和50mg B組分的配比，混合成3ml混懸液，鋪到T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中放置半小時(shí)。在凝固后，向瓶中輕輕加入10ml 1640培養(yǎng)液。繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中，浸提24小時(shí)。然后，取出培養(yǎng)液，2000g離心，直徑為0.22um的濾膜過(guò)濾，所得濾液就是浸提液。浸提液用1640培養(yǎng)基稀釋一倍后按GB/T16886.5.2003中規(guī)定的體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法進(jìn)行。其結(jié)果應(yīng)符合該標(biāo)準(zhǔn)中4.6.5要求。
評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(采用L929細(xì)胞測(cè)試)


結(jié)果

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為合格。說(shuō)明此骨修復(fù)材料生物相容性好，無(wú)毒、安全。
實(shí)施例6異位成骨活性實(shí)驗(yàn)試劑與材料1.5％戊巴比妥鈉，75％酒精，0/5#縫合線，15#手術(shù)刀片，止血鉗，縫合針，1ml注射器；18-22g ICR小鼠，同一性別。
操作1.對(duì)照組骨形態(tài)發(fā)生蛋白與明膠、卵磷脂復(fù)合材料——用1.5％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將左后肢剃毛和酒精消毒后，在肌肉陷窩表皮處割開(kāi)一個(gè)長(zhǎng)度為0.5cm的切口，用止血鉗分離皮膚，鈍性分離肌肉，暴露肌肉陷窩，植入含0.1mg重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋何(rhBMP-2)的復(fù)合材料，縫合。
2.實(shí)驗(yàn)組本發(fā)明的注射的凝膠型骨修復(fù)材料——用1.5％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，在其左后肢剃毛和酒精消毒后，將1毫升A組分和50mg B組分混合好的注射混懸劑注射到后肢肌肉陷窩內(nèi)，每個(gè)小鼠注射含1mg/ml rhBMP-2的凝膠型骨修復(fù)材料0.1ml。
3.21天后，解剖，取鮮骨，稱重。
成骨活性定義為每毫克rhBMP-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的新骨重量，若1mg rhBMP-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的新骨重量為1000mg時(shí)，其成骨活性就是1000U。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表新骨重量以mg計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明注射的凝膠型骨修復(fù)材料具有較好的誘骨活性。
權(quán)利要求
1.注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料，其特征是，每個(gè)使用劑量由1毫升A組分和45～55mg B組分組成，其中，A組分的成分及其含量為每毫升無(wú)菌生理鹽水中含有海藻酸鈉10～40mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白 0.1～1mg甘露醇 10～20mgB組分的成分及其含量為每mg中含有水難溶性鈣化合物0.05～0.15mg葡萄糖酸內(nèi)酯0.05～0.3mg聚乙烯吡咯烷酮 0.004～0.016mg甘露醇 余量
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料，其特征是所說(shuō)的水難溶性鈣化合物為碳酸鈣、硫酸鈣或羥基磷灰石。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料，其特征是所說(shuō)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白是從動(dòng)物骨中提取的天然骨形態(tài)發(fā)生蛋白或是用基因工程方法生產(chǎn)的重組骨形態(tài)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料，其特征是所說(shuō)的A組分為凍干品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料，其特征是所說(shuō)的B組分是過(guò)60目篩的顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復(fù)生物材料的制備方式，其特征是包括以下步驟1)將1～4g的海藻酸鈉溶于100ml水中，然后在每毫升海藻酸鈉水溶液中加入0.1～1mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，再加入甘露醇10～20mg，凍干，此為A組分；2)將500～1500mg水難溶性鈣化合物和500～3000mg葡萄糖酸內(nèi)酯混合，再加入稀釋劑甘露醇至總重量為10g，混合均勻；3)在步驟2)所得混合物中加入1～2ml的濃度為4～8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤(rùn)濕，混合，調(diào)制成軟膏，擠壓過(guò)20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過(guò)60目篩整粒，此為B組分；4)A、B兩個(gè)組分分別用鈷60照射進(jìn)行滅菌，照射劑量是6Kgy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種注射的凝膠型骨修復(fù)生物活性材料及其制備方法，該材料每個(gè)使用劑量由1毫升A組分和45～55mg B組分組成，其中，A組分的組成為每毫升無(wú)菌生理鹽水中含有海藻酸鈉10～40mg，骨形態(tài)發(fā)生蛋白0.1～1mg，甘露醇10～20mg，B組分的組成為每mg中含有水難溶性鈣化合物0.05～0.15mg，葡萄糖酸內(nèi)酯0.05～0.3mg，聚乙烯吡咯烷酮0.004～0.016mg，余量為甘露醇。此注射型骨修復(fù)材料生物相容性好，使用簡(jiǎn)便安全，無(wú)須手術(shù)就可以植入骨科患者需要治療的部位。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其成骨活性與需要通過(guò)手術(shù)植入的含骨形態(tài)發(fā)生蛋白的固態(tài)骨修復(fù)材料相當(dāng)。
文檔編號(hào)A61L27/44GK1586621SQ20041005324
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者徐放, 潘綿立 申請(qǐng)人:徐放