專利名稱：一種基于pva水凝膠軟骨支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種醫(yī)用材料，具體涉及一種醫(yī)用的可降解、可吸收的軟骨制備方法，其具體涉及到組織工程化軟骨細(xì)胞移植及其制備方法，屬于生物組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:由于疾病、衰老、事故和戰(zhàn)爭等導(dǎo)致的軟骨缺損常見于媒體和臨床病例中，特別是對于體育運(yùn)動員來說，軟骨缺損極有可能導(dǎo)致其過早結(jié)束自己的運(yùn)動員生涯，嚴(yán)重的更可能對其以后的正常生活造成影響。因此軟骨修復(fù)問題刻不容緩，解決軟骨缺損這一問題最有效的方法是對缺損軟骨位進(jìn)行人工替代。但軟骨的再生是面臨的一大難題，目前臨床上主要用骨膜或不可降解或可降解的生物材料來修復(fù)，但是這些治療方法都有其固有的缺陷。如降解產(chǎn)物對機(jī)體的不良反應(yīng)，不可降解的材料引起機(jī)體的排異反應(yīng)和遠(yuǎn)期效果不好等。當(dāng)今應(yīng)用的多是利用高分子材料支架傳遞軟骨細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損，但是醫(yī)用高分子材料昂貴且其降解產(chǎn)物對組織有破壞性，所以，生物組織工程中對軟骨支架的制備一般是采用水凝膠，而PVA水凝膠的使用最為廣泛，因?yàn)镻VA水凝膠除了具備一般水凝膠的性能外，特別具有毒性低、機(jī)械性能優(yōu)良(高彈性模量和高的機(jī)械強(qiáng)度)、吸水量高和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，因而備受青睞。但軟骨支架的制備技術(shù)還存在很大的難題一不能保證軟骨支架在培養(yǎng)過程中，成骨細(xì)胞按臨床所需的生長方向進(jìn)行生長。目前也有在軟骨支架培養(yǎng)過程中添加誘導(dǎo)因子來誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的生長方向，但這一過程過于復(fù)雜，不好控制。對此我們提出了一種利用羥基磷灰石生物材料制備模具，來控制成骨細(xì)胞在軟骨支架培養(yǎng)過程中的生長方向，從而實(shí)現(xiàn)了對軟骨支架外形的可控，但與此同時(shí)，支架在培養(yǎng)完成后，需要對其進(jìn)行脫模處理，這又引入了另外一個(gè)問題——在脫模過程中，由于軟骨支架材料PVA水凝膠與羥基磷灰石模具存在一定的粘附力，因此在脫模過程中很可能會對培養(yǎng)所得的軟骨支架產(chǎn)生破壞，同時(shí)所制備出來的軟骨支架在力學(xué)性能方面也不一定滿足人體需求。所以我們很有必要從分子角度對PVA水凝膠的力學(xué)性能進(jìn)行計(jì)算，探索出在滿足支架不被破壞和滿足一定力學(xué)性能的前提下，PVA水凝膠中PVA所占的百分比，從而以此來指導(dǎo)實(shí)踐。基于實(shí)現(xiàn)軟骨支架的力學(xué)性能以及其微結(jié)構(gòu)，外形的可控性，本發(fā)明提出了一種基于PVA水凝膠軟骨的制備方法
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明是為了提供一種以PVA水凝膠為載體材料，采用羥基磷灰石模具來制備具有良好生物相容性和相互相通的細(xì)胞組織容納的空間，同時(shí)又具備生物力學(xué)性能、外形結(jié)構(gòu)可控的軟骨組織工程支架。為了達(dá)到發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種基于PVA水凝膠軟骨支架的制備方法，包括如下步驟:
步驟一、軟骨支架模具的制備，包括如下子步驟:子步驟1:建立模具的三維CAD模型，將其從下至上順序分割成間距為Λ h的二維截面圖形N份，第i份截面圖形面積為Ai，其中Ah的大小為多孔生物陶瓷微球的直徑；子步驟2:將子步驟I中輸出的N份二維截面圖形導(dǎo)入三維打印機(jī)，并將生物膠黏劑裝入三維打印機(jī)的儲液腔；子步驟3:1 = 1，啟動三維打印機(jī)；子步驟4:在成型工作臺上均勻的鋪上第i層多孔生物陶瓷微球；子步驟5:把第i層生物膠黏劑噴灑到第i層多孔生物陶瓷微球上；形成第i層；子步驟6:判斷i值，如果i <N，則i = i+1，進(jìn)入子步驟4 ;否則，進(jìn)入子步驟7 ;子步驟7:支架模具制作完畢，取出模具，將支架模具放入到醫(yī)用消毒酒精中浸泡，然后水洗，晾干，此時(shí)得到的是一種微孔結(jié)構(gòu)的軟骨骨支架模具；步驟二、運(yùn)用分子動力學(xué)進(jìn)行數(shù)值計(jì)算:運(yùn)用分子動力學(xué)來計(jì)算不同PVA百分含量PVA水凝膠的力學(xué)性能，從而探索出滿足生物力學(xué)性能要求的PVA水凝膠的配比；步驟三、PVA水凝膠及其與成骨細(xì)胞的混合體的配備:按分步驟二所得參數(shù)，配制一定濃度的PVA溶液，加熱90°C恒溫水浴溶解，60°C烘箱恒溫去泡。待溶液澄清后轉(zhuǎn)入容器內(nèi)，將其置于常溫下冷卻至室溫，而后將軟骨細(xì)胞及軟骨生長因子(CDGF)放置于水凝膠中均勻混合，并將該混合液填充滿步驟一制得的軟骨骨支架模具，最后連同模具一同放置于紫外線光照環(huán)境下進(jìn)行交聯(lián)成型。步驟四:支架培養(yǎng):將步驟三制成的填充滿含有成骨細(xì)胞、軟骨生長因子的PVA水凝膠置于動態(tài)灌流系統(tǒng)平臺進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，每IOOml培養(yǎng)液中添加有IOml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/鏈霉素；數(shù)周后將其取出，得到PVA水凝膠軟骨支架。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:I)本發(fā)明的軟骨支架保證了支架的一次成型，不必考慮結(jié)構(gòu)負(fù)型的去除，同時(shí)所采用的基體材料為PVA水凝膠，該水凝膠具有良好的柔軟性、彈性、儲液能力和生物相容性，從而對支架實(shí)現(xiàn)了零污染的制備2)本發(fā)明運(yùn)用了分支動力學(xué)數(shù)值運(yùn)算，從分子的微觀角度考計(jì)算了不同濃度PVA水凝膠的力學(xué)性能，從而實(shí)現(xiàn)了軟骨支架力學(xué)性能的可控性，避免了支架在脫模過程中北破壞，為實(shí)踐提供了參數(shù)指導(dǎo)，縮短了軟骨支架的制備周期，避免了不必要的浪費(fèi)。3)本發(fā)明采用了三維打印機(jī)制備軟骨支架的模具，并以其來約束軟骨支架成骨細(xì)胞的生長方向，實(shí)現(xiàn)了軟骨支架外形的可控，同時(shí)模具以羥基磷灰石微球?yàn)榛w材料，可以實(shí)現(xiàn)模具具有一定的空隙結(jié)構(gòu)，便于支架灌流培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞代謝產(chǎn)物的流通與排泄。4)該發(fā)明還可以與PLA、PGA等其他力學(xué)性能優(yōu)異但生物性能較差的生物材料復(fù)合，組成生物力學(xué)性能和生物學(xué)性能都很優(yōu)異的支架系統(tǒng)。該方法首先是建立軟骨支架的CAD模型，并據(jù)此模型設(shè)計(jì)的成型模具，以羥基磷灰石微球?yàn)榛w材料，通過三維打印機(jī)打印出軟骨成型模具；利用分子動力學(xué)計(jì)算出不同PVA百分含量的PVA水凝膠的力學(xué)性能，找出符合要求 的配比，并以此數(shù)據(jù)指導(dǎo)實(shí)踐，將其與適量的成骨細(xì)胞均勻混合來調(diào)制出含有成骨細(xì)胞的PVA水凝膠，然后在模具里填充含有成骨細(xì)胞的PVA水凝凝膠，最后連接到體外動態(tài)灌流系統(tǒng)平臺中，對其進(jìn)行培養(yǎng)，最后在軟骨支架成型后將其從模具中取出使用。


:圖1是實(shí)施例中制備出來的半月板軟骨支架照片具體實(shí)施實(shí)例:本發(fā)明以半月板軟骨支架的制備為例，來詳述該方法的制備過程:步驟一、半月板軟骨支架模具的制備，包括如下子步驟:子步驟1:根據(jù)所需半月 板外形，建立半月板軟骨支架模具的三維CAD模型，將其從下至上順序分割成間距為Ah的二維截面圖形30份，第i份截面圖形面積為Ai，其中Ah的大小為多孔生物陶瓷微球的直徑d = 0.3mm ;子步驟2:將子步驟I中輸出的30份二維截面圖形導(dǎo)入三維打印機(jī)，并將生物膠黏劑α-氰基丙烯酸正丁酯裝入三維打印機(jī)的儲液腔；子步驟3:1 = I,啟動三維打印機(jī)；子步驟4:在成型工作臺上均勻的鋪上第i層多孔生物陶瓷微球；子步驟5:把第i層生物膠黏劑噴灑到第i層多孔生物陶瓷微球上；形成第i層；子步驟6:判斷i值，如果i < N，則i = i+Ι，進(jìn)入子步驟4 ;否則，進(jìn)入子步驟7 ;子步驟7:支架模具制作完畢，取出模具，將支架模具放入到醫(yī)用消毒酒精中浸泡，然后水洗，涼干，此時(shí)得到的是一種微孔結(jié)構(gòu)的軟骨支架模具；步驟二、運(yùn)用分子動力學(xué)進(jìn)行數(shù)值計(jì)算:運(yùn)用分子動力學(xué)來計(jì)算不同PVA百分含量PVA水凝膠的力學(xué)性能，從而探索出滿足生物力學(xué)性能要求的PVA水凝膠的配比，此處，經(jīng)計(jì)算所得當(dāng)PVA含量為20%時(shí)，所對應(yīng)的PVA水凝膠彈性模量為0.5Mpa，壓縮斷裂強(qiáng)度可達(dá)25Mpa，足以滿足半月板的力學(xué)性能需求；步驟三、PVA水凝膠及其與成骨細(xì)胞的混合體的配備:按步驟二所得參數(shù)，配制PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PVA溶液，加熱90°C恒溫水浴溶解，60°C烘箱恒溫去泡。待溶液澄清后，將其置于常溫下冷卻至室溫，而后將具有活性的軟骨細(xì)胞及生長因子放置于水凝膠中按2:3的體積比均勻混合，其中軟骨細(xì)胞的細(xì)胞密度為
8.0X IO8細(xì)胞/ml，軟骨生長因子(⑶GF)的密度為80 μ g/ml ;而后再將該混合液填充滿步驟一所制得的半月板模具；最后連同模具一同放置于紫外線光照環(huán)境下進(jìn)行交聯(lián)成型。步驟4、支架培養(yǎng):將填充滿含有成骨細(xì)胞/生長因子的PVA水凝膠置于動態(tài)灌流系統(tǒng)平臺進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，其中每IOOml培養(yǎng)液中添加有IOml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/鏈霉素。數(shù)周后將其取出，便可可用于病患半月板移植手術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種基于PVA水凝膠軟骨支架的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、軟骨支架模具的制備，包括如下子步驟: 子步驟1:建立模具的三維CAD模型，將其從下至上順序分割成間距為Ah的二維截面圖形N份，第i份截面圖形面積為Ai，其中Ah的大小為多孔生物陶瓷微球的直徑； 子步驟2:將子步驟I中輸出的N份二維截面圖形導(dǎo)入三維打印機(jī)，并將生物膠黏劑裝入三維打印機(jī)的儲液腔； 子步驟3:1 = I,啟動三維打印機(jī)； 子步驟4:在成型工作臺上均勻的鋪上第i層多孔生物陶瓷微球； 子步驟5:把第i層生物膠黏劑噴灑到第i層多孔生物陶瓷微球上；形成第i層；子步驟6:判斷i值，如果i < N，則i = i+Ι，進(jìn)入子步驟4 ;否則，進(jìn)入子步驟7 ；子步驟7:支架模具制作完畢，取出模具，將支架模具放入到醫(yī)用消毒酒精中浸泡，然后水洗，晾干，此時(shí)得到的是一種微孔結(jié)構(gòu)的軟骨骨支架模具； 步驟二、運(yùn)用分子動力學(xué)進(jìn)行數(shù)值計(jì)算: 運(yùn)用分子動力學(xué)計(jì)算不同PVA百分含量PVA水凝膠的力學(xué)性能，從而探索出滿足生物力學(xué)性能要求的PVA水凝膠的配比； 步驟三、PVA水凝膠及其與成骨細(xì)胞的混合體的配備: 按分步驟二所得參數(shù)，配制一定濃度的PVA溶液，加熱90°C恒溫水浴溶解，60°C烘箱恒溫去泡。待溶液澄清后轉(zhuǎn)入容器內(nèi)，將其置于常溫下冷卻至室溫，而后將軟骨細(xì)胞及軟骨生長因子放置于水凝膠中均勻混合，并將該混合液填充滿步驟一制得的軟骨骨支架模具，最后連同模具一同放置于紫外線光照環(huán)境下進(jìn)行交聯(lián)成型； 步驟四:支架培養(yǎng): 將步驟三制成的填 充滿含有成骨細(xì)胞、軟骨生長因子的PVA水凝膠置于動態(tài)灌流系統(tǒng)平臺進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，每IOOml培養(yǎng)液中添加有IOml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/鏈霉素；數(shù)周后將其取出，得到PVA水凝膠軟骨支架。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于PVA水凝膠軟骨支架的制備方法，屬于生物組織工程領(lǐng)域。該方法首先建立軟骨支架的CAD模型，并據(jù)此以羥基磷灰石微球?yàn)榛w材料，通過三維打印機(jī)打印出軟骨成型模具；利用分子動力學(xué)計(jì)算出不同PVA百分含量的PVA水凝膠的力學(xué)性能，找出符合要求的配比，并以此數(shù)據(jù)指導(dǎo)實(shí)踐，將其與適量的成骨細(xì)胞均勻混合來調(diào)制出含有成骨細(xì)胞的PVA水凝膠，然后在模具里填充含有成骨細(xì)胞的PVA水凝凝膠，最后連接到體外動態(tài)灌流系統(tǒng)平臺中，對其進(jìn)行培養(yǎng)，最后在軟骨支架成型后將其從模具中取出使用。本方法實(shí)現(xiàn)了零污染的支架制備，縮短了制備周期，可以實(shí)現(xiàn)模具具有一定的空隙結(jié)構(gòu)，便于支架灌流培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞代謝產(chǎn)物的流通與排泄。
文檔編號A61L27/58GK103120806SQ201310015460
公開日2013年5月29日 申請日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者汪焰恩, 魏慶華, 葉東東, 龍水軍, 毛海龍, 郭葉, 潘飛龍, 李川川, 張磊, 李欣培, 楊明明, 魏生民 申請人:西北工業(yè)大學(xué)