交聯(lián)透明質(zhì)酸的方法，制備可注射水凝膠的方法，得到的水凝膠，得到的水凝膠的用圖
【專利說明】交聯(lián)透明質(zhì)酸的方法，制備可注射水凝膠的方法，得到的水 凝膠，得到的水凝膠的用途
[oocn] 本發(fā)明的目的是：
[0002] -用于交聯(lián)透明質(zhì)酸，或它的一種鹽，和任選的其他生物相容的聚合物的方法，
[0003]-用于制備根據(jù)所述交聯(lián)方法獲得的可注射的水凝膠的方法，
[0004]-根據(jù)所述交聯(lián)方法得到的水凝膠，和
[0005] -根據(jù)所述交聯(lián)方法得到的水凝膠在美學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的用途。
[000引透明質(zhì)酸是通過由D-葡萄糖醒酸和N-乙酷基葡萄糖胺（N-actetyl glucosamine)。結(jié)構(gòu)是線性的且不具有任何物種特異性。透明質(zhì)酸廣泛分布在人和動物生 物體內(nèi)，在其中它實現(xiàn)了許多生物學(xué)功能，例如水合作用水平的控制或流體或組織粘彈性 的維持。尤其是發(fā)現(xiàn)它在眼睛的滑液流體、玻璃體和在真皮中有高濃度。一個70千克的人 大約有15克透明質(zhì)酸，其中一半是含在皮膚中且該量隨著年齡增長而下降。
[0007] 透明質(zhì)酸凝膠是已知的且已被用在美學(xué)和醫(yī)學(xué)的廣泛領(lǐng)域許多年的。運(yùn)些凝膠尤 其通常被注入：
[0008]-眼睛，在眼科手術(shù)中，W維持眼內(nèi)空間和保護(hù)眼的組織，
[0009] -連接點(diǎn)，在關(guān)節(jié)的情況下，用于補(bǔ)充不充足的滑膜液和暫時恢復(fù)所述生物流體的 軟骨保護(hù)性能，
[0010] -注入或在皮膚下，W填充皺紋或增加臉部或身體的某些區(qū)域的體積。
[0011] 透明質(zhì)酸在生物體內(nèi)半衰期短（小于1周）。在美學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多應(yīng)用的情況下， 所施用的可注射水凝膠包含通過交聯(lián)穩(wěn)定的透明質(zhì)酸，所述交聯(lián)給出顯著增加該多糖在體 內(nèi)的壽命（也稱為存在期）并因此增加所注射產(chǎn)品效果的持續(xù)時間的可能性。因此，借助 于通過交聯(lián)的該修飾，基于交聯(lián)的透明質(zhì)酸的水凝膠具有例如在數(shù)月的時間內(nèi)填充皺紋的 能力。
[0012] 為了提高基于透明質(zhì)酸的可注射水凝膠的體內(nèi)存在期，本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到他 /她可增加透明質(zhì)酸的交聯(lián)度；但運(yùn)種分子修飾使凝膠的粘度增加并因此使將其通過針擠 出和后續(xù)將該凝膠注射入執(zhí)業(yè)醫(yī)生所希望的區(qū)域。運(yùn)必然意味著：
[0013]-或者限制透明質(zhì)酸的交聯(lián)度并因此凝膠在體內(nèi)的存在期，目的是具有保持滿意 的推頂力，
[0014]-或使用W較大直徑的針W能夠減少通過該針擠出凝膠所需的推頂力，運(yùn)對于被 治療的患者在注射區(qū)域產(chǎn)生更大的疼痛和更大的創(chuàng)傷（疲斑，紅色斑點(diǎn)，炎癥，水腫，……）。
[0015] 已經(jīng)提出了許多解決方案用于克服該問題，工作者力圖提供具有合適存在期和黏 度性能并因此通過針擠出凝膠的令人滿意水平的可注射制劑。提議可由如下實例組成：
[0016]-基于交聯(lián)透明質(zhì)酸顆粒的制劑，所述交聯(lián)透明質(zhì)酸顆粒是通過將交聯(lián)的凝膠通 常是通過研磨分裂為顆粒得而到；多種制備方法已被描述用于得到該類型的制劑，如申請 W097/04012 的案例，
[0017] -基于含不同交聯(lián)成分（crosslinkingidentities)的交聯(lián)透明質(zhì)酸的制劑，來 自申請WO2005/085329中描述的特定的制備方法。
[0018] -基于交聯(lián)透明質(zhì)酸的制劑，含不彼此交聯(lián)即不通過共價鍵彼此連接的交聯(lián)凝膠 混合物；運(yùn)些制劑根據(jù)在FR2924615中描述的特定的制備方法得到，和
[0019] -基于交聯(lián)透明質(zhì)酸的制劑，由與交聯(lián)的透明質(zhì)酸基質(zhì)交聯(lián)在一起的交聯(lián)的透明 質(zhì)酸顆粒組成；運(yùn)些制劑根據(jù)申請EP2011816或申請US2010/0028435制備。
[0020] 然而，運(yùn)些解決方案并不完全令人滿意。
[0021] 申請WO97/04012描述了一種特定的制備方法，給出得到基于顆粒形式的多糖 (其可為透明質(zhì)酸）的可能性?；诮宦?lián)的透明質(zhì)酸的顆粒凝膠，在文獻(xiàn)中也被稱為"雙相 凝膠"，其特征是存在分散在非交聯(lián)的透明質(zhì)酸溶液中的直徑約200微米至大于1000微米 的顆粒，運(yùn)給出有助于通過潤滑現(xiàn)象促進(jìn)噴射的可能性。運(yùn)些凝膠不完全令人滿意，因為通 過針擠出凝膠是不規(guī)則的，特別是具有含大直徑顆粒的產(chǎn)品；其中起載體作用的基于非解 交聯(lián)透明質(zhì)酸的溶液在體內(nèi)被迅速再吸收，運(yùn)設(shè)及所需效果的至少部分損失（特別是在注 射致力于產(chǎn)生體積的產(chǎn)品后接下來的數(shù)天內(nèi)的填充損失）；并且最后相比較于基于不含任 何顆粒一一其促進(jìn)對外來體的響應(yīng)和/或在治療區(qū)域的機(jī)械作用下產(chǎn)生運(yùn)些粒子遷移一一 的透明質(zhì)酸的凝膠，產(chǎn)品的安全性不太好（即更高水平的副效應(yīng)）。
[0022] 申請WO2005/0853描述了一種特定的制備方法，其特征在于引發(fā)確定量的至少 一種聚合物（可為透明質(zhì)酸）交聯(lián)的步驟，和然后通過在具有反應(yīng)混合物稀釋物的溶液中 添加額外量的分子量大于500, 000化的聚合物（可為透明質(zhì)酸）W降低聚合物在溶液中的 整體濃度同時使交聯(lián)反應(yīng)繼續(xù)。此溶液不給予有效交聯(lián)透明質(zhì)酸的可能性。確實，額外量 的聚合物添加伴隨著稀釋并因此降低反應(yīng)混合物的透明質(zhì)酸濃度。透明質(zhì)酸鏈和交聯(lián)劑之 間接觸的概率因此下降且交聯(lián)反應(yīng)不是很有效。
[0023] 申請F(tuán)R2924615描述了一種制備方法，特征在于相同或不同的在混合前交聯(lián)的X 聚合物（其可能是透明質(zhì)酸）的均勻混合物。混合是指X聚合物的并置而不在后者間產(chǎn)生 共價鍵。該解決方案不完全令人滿意，因為聚合物不相互結(jié)合并因此由此獲得的凝膠可在 注射區(qū)域內(nèi)分離，特別是在其中非常顯著的機(jī)械應(yīng)力的作用下。例如，可提及的有注入嘴唇 的旨在產(chǎn)生體積的產(chǎn)品的案例；所述嘴唇經(jīng)受強(qiáng)的機(jī)械應(yīng)力。所經(jīng)歷的機(jī)械作用可產(chǎn)生植 入的凝膠的遷移和因此在治療區(qū)域及其周圍的副效應(yīng)。
[0024] 申請EP2011816設(shè)及到可注射的多糖凝膠（其可為透明質(zhì)酸），其包含至少一種 顆粒形式的第一強(qiáng)交聯(lián)的多糖凝膠，和至少一種形成基質(zhì)的弱交聯(lián)多糖凝膠，所述至少一 種第一凝膠通過共價鍵與所述至少一種第二凝膠結(jié)合。與申請WO97/04012的產(chǎn)品不同， 強(qiáng)交聯(lián)的顆粒與弱交聯(lián)多糖基質(zhì)結(jié)合；因此該實施方案在短期和/或中期強(qiáng)烈限制顆粒的 遷移而不是長期（在弱交聯(lián)的多糖已被再吸收入組織之后，釋放具有遷移可能性的強(qiáng)交聯(lián) 的顆粒）。由于該解決方案包含強(qiáng)交聯(lián)的多糖顆粒，由于產(chǎn)品的顆粒性質(zhì)和運(yùn)些顆粒高的交 聯(lián)度，對外來體響應(yīng)的風(fēng)險因此很高（透明質(zhì)酸因此被顯著改性，因此通過生物體提升分 子的非識別性）。
[002引 申請US2010/0028435公開了用于制備基于交聯(lián)的透明質(zhì)酸的制劑的方法，所述 交聯(lián)的透明質(zhì)酸由與交聯(lián)的透明質(zhì)酸基質(zhì)共交聯(lián)的交聯(lián)的透明質(zhì)酸顆粒組成。因此，適用 與上述給出的對申請EP2011816的相同的評論，加上必要的變更。
[0026] 本發(fā)明通過提出交聯(lián)透明質(zhì)酸，或其一種鹽，或任選的其他生物可相容聚合物的 新型方法給出解決運(yùn)些不同缺點(diǎn)的可能性，所述方法給出得到W下列內(nèi)容為顯著特征的水 凝膠的可能性：
[0027] -良好的通過針被擠出的能力，和因此能夠被執(zhí)業(yè)醫(yī)生輕易注射至將被治療的區(qū) 域的能力，而運(yùn)不設(shè)及患者的疼痛和嚴(yán)重的創(chuàng)傷，
[0028]-在交聯(lián)方法的過程中不發(fā)生水凝膠的一種或多種構(gòu)成相轉(zhuǎn)化成顆粒（但具有低 的推頂力，盡管不含通常使推頂力下降的顆粒）；在產(chǎn)品中共交聯(lián)力的缺乏導(dǎo)致顯著改善 的安全性（在短和/或中/長期較少的副作用和并發(fā)癥），水凝膠至組織中的增強(qiáng)的遷移/ 植入能力（產(chǎn)品在組織中的更平均的分布），也可導(dǎo)致顯著較短和較不復(fù)雜的制備方法（因 為制備不包括乏味冗長的研磨步驟），
[0029]-由所得到的水凝膠的特定結(jié)構(gòu)引起的顯著的粘彈性，運(yùn)提供向執(zhí)業(yè)醫(yī)生建議具 有特定機(jī)械/流變特性的產(chǎn)品的可能性，用于滿足他/她對治療所需區(qū)域的期望，同時遵守 其解剖，控制它的生理機(jī)制，和，如果適用的話，將允許其更正確定的缺陷，
[0030]-由于所得水凝膠的特定"多結(jié)構(gòu)化"（且無共交聯(lián)的顆粒）結(jié)構(gòu)，W簡單方式被 植入要被治療區(qū)域的組織的能力，
[0031]-由于較好的在被治療區(qū)域內(nèi)不分離和因此不向其他相鄰或更遠(yuǎn)區(qū)域遷移的能力 而顯著加強(qiáng)的安全性，尤其是在機(jī)械應(yīng)力的作用下，
[0032]-所得到凝膠的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，特征在于"多結(jié)構(gòu)化"，從而允許當(dāng)適用時活性和/或生 物物質(zhì)的受控釋放的最優(yōu)化，
[0033]-所得水凝膠的最佳化的存在期W擴(kuò)展美學(xué)或治療處理的效能，從而給出限制每 次醫(yī)療或手術(shù)程序的操作數(shù)量的可能性。
[0034] 對于該目的，本發(fā)明的目的是用于交聯(lián)透明質(zhì)酸，或其一種鹽，或任選的其他生物 可相容聚合物的新型方法，包含至少W下步驟：
[0035]a)制備部分交聯(lián)的透明質(zhì)酸和任選的其他生物相容的聚合物的第一水相，特征在 于：
[0036]-將透明質(zhì)酸或其一種鹽和任選的其他生物相容的聚合物添加至水溶液中W得到 濃度Cl的透明質(zhì)酸，
[0037]-添加Ql的量的交聯(lián)劑，
[0038]-通過控制交聯(lián)反應(yīng)的溫度Tl和持續(xù)時間tl得到部分交聯(lián)的透明質(zhì)酸，
[0039] 其中所制備的部分交聯(lián)的透明質(zhì)酸的第一水相通常不轉(zhuǎn)化為顆粒，
[0040]b)制備部分交聯(lián)的透明質(zhì)酸和任選的其他生物相容的聚合物的至少一種第二水 相，特征在于：
[0041]-將透明質(zhì)酸或其一種鹽和任選的其他生物相容的聚合物添加至水溶液中W得到 濃度C2的透明質(zhì)酸，
[0042]-添加Q2的量的交聯(lián)劑，
[0043]-通過控制交聯(lián)反應(yīng)的溫度T2和持續(xù)時間t2得到部分交聯(lián)的透明質(zhì)酸，
[0044] 其中所制備的部分交聯(lián)的透明質(zhì)酸的至少一種第二水相通常不轉(zhuǎn)化為顆粒，
[0045]C)將至少第二部分交聯(lián)的透明質(zhì)酸相添加至第一相中，然后通過任選地添加額外 的Qm的量的交聯(lián)劑實施所述至少兩相的混合，
[0046] d)通過控制交聯(lián)反應(yīng)的溫度Tm和持續(xù)時間tm繼續(xù)進(jìn)行預(yù)先形成的混合物的交 聯(lián)。
[0047] 然后停止交聯(lián)反應(yīng)，有利地通過用水溶液稀釋和/或通過實施純化移除未反應(yīng)的 交聯(lián)劑。
[004引根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)方法因此由W下構(gòu)成：在交聯(lián)過程中混合已部分交聯(lián)的透明質(zhì) 酸和任選的其他生物相容的聚合物的至少兩個水相，然后繼續(xù)交聯(lián)反應(yīng)W通過共價鍵結(jié)合 所述至少兩個水相。
[0049] "部分交聯(lián)的"是指如下事實：所述至少2個水相的透明質(zhì)酸，任選地含其他生物 相容的聚合物，在聚合物鏈上仍具有可利用的能夠與交聯(lián)劑反應(yīng)用于交聯(lián)/橋接透明質(zhì)酸 和/或其他生物相容聚合物的新鏈的反應(yīng)位點(diǎn)。
[0050] 指定如下內(nèi)容是重要的：根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)方法在所述交聯(lián)方法的步驟中例如在 上述步驟a、b、C和d中不設(shè)及透明質(zhì)酸或其一種鹽或任何其他聚合物的交聯(lián)顆粒的制備 和/或添加。在所述交聯(lián)方法的步驟中，所有部分交聯(lián)的相任何時間均不通過例如研磨轉(zhuǎn) 化為顆粒。因此，根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)方法不給出具有與透明質(zhì)酸凝膠交聯(lián)在一起的交聯(lián)顆 粒的可能性。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，部分交聯(lián)的透明質(zhì)酸的第二水較部分交聯(lián)的透明質(zhì) 酸的第一水相具有更大的部分交聯(lián)度。運(yùn)特別地給出了促進(jìn)第二更強(qiáng)交聯(lián)的相在第一相中 混合的可能性。
[0052] "部分交聯(lián)度"是指所述相在其與另一相混合前的交聯(lián)水平；所述交聯(lián)水平僅為 部分，因為它將隨著在混合