專利名稱：一種冬凌草有效成分提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種冬凌草有效成份提取物定量化的制備方法。
背景技術(shù)：
冬凌草又名冰凌草，學(xué)名碎米亞Rabdosia rubescens(Hem sl.)，系唇形科香茶菜屬多年生草本，廣泛分布于我國的河南、河北以及山西等省地，收載于《中國藥典》1977年版第一部。中醫(yī)認(rèn)為冬凌草味甘苦，性微寒，具有清熱解表，活血止痛的作用。西醫(yī)認(rèn)為冬凌草具有抗菌消炎和抗腫瘤的作用，是一種天然的抗生素。目前市場上已經(jīng)有復(fù)方冬凌草片，冬凌草糖漿制劑等藥品，臨床上主要用于治療急慢性扁桃體炎、咽喉炎和口腔炎等疾病。
近年來的研究資料證實(shí)，中藥材冬凌草還具有明顯的抗腫瘤活性，經(jīng)過化學(xué)成分和藥理實(shí)驗(yàn)分析，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)及衍生物、冬凌草乙素(Ponicidin)等二萜類化合物和熊果酸(Ursolic acid)和齊墩果酸等三萜類成分。其分子結(jié)構(gòu)式如下圖 冬凌草甲素
冬凌草乙素 熊果酸熊果酸(Ursolic acid)又名烏索酸、烏蘇酸，是一種存在于天然植物中的三萜類化合物，具有殺滅和抑制變形鏈球菌組及牙周病原菌、抑制口腔舌癌細(xì)胞作用。近年來很多科研單位發(fā)現(xiàn)熊果酸具有一定的抗腫瘤活性作用。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院研究人員發(fā)現(xiàn)熊果酸具有抗致癌、抗促癌、誘導(dǎo)F9畸胎瘤細(xì)胞分化和抗血管生成作用，很有可能成為低毒高效的新型抗癌藥物。
目前對于冬凌草進(jìn)行的研究主要集中在冬凌草甲素以及衍生物、冬凌草乙素、貝殼杉烯類二萜的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及它們的抗癌作用。從專利信息的檢索發(fā)現(xiàn)，涉及到冬凌草有效成分的專利主要有下列所示1.鄭州大學(xué)申請了“冬凌草甲素衍生物及其制備方法”，申請?zhí)枮?9101179；通過改變冬凌草甲素的分子結(jié)構(gòu)式達(dá)到尋找新型的抗腫瘤藥物；2.中國科學(xué)院武漢植物所申請了“一種冬凌草甲素的制備方法”，申請?zhí)枮?2139049.5，涉及到提取制備其中的冬凌草甲素成分；3.北海國發(fā)海洋生物產(chǎn)業(yè)股份有限公司申請了“中藥冬凌草有效部位抗腫瘤藥物提取物及其制備方法”，申請?zhí)枮?3125250.8，涉及到中藥冬凌草有效部位組合物以及制備方法，其冬凌草總萜含量在50％以上；4.山西省醫(yī)藥研究所申請的“冬凌草提取物及其制備方法和應(yīng)用”，申請?zhí)枮?2151503.4，內(nèi)容涉及冬凌草提取物包括有粗提取物、有效部位和單一成分，單一成分是冬凌草甲素和乙素；上述專利主要涉及冬凌草中的一種有效成分或是有效部位提取物，用于抗腫瘤方面的治療作用等。
大量的藥理研究表明，冬凌草具有抗菌消炎，止痛活血的作用。最近發(fā)現(xiàn)冬凌草具有明顯的抗腫瘤作用，主要作用于食管癌、賁門癌以及肝癌等腫瘤。到目前為止，以冬凌草藥材為原料，已經(jīng)開發(fā)了冬凌草片、冬凌草糖漿以及冬凌草萜含片等藥品，這些都是以冬凌草的粗提取為主要活性成分。
但是上述公開的內(nèi)容中僅是用傳統(tǒng)工藝制備得到冬凌草有效部位提取物，對其中的活性成份缺乏適合工業(yè)化規(guī)模的連續(xù)過程集成化提取工藝，對中成藥的質(zhì)量可控性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于應(yīng)用中藥提取和分析技術(shù)，制備冬凌草多個有效成份的定量化提取物。
本發(fā)明提供了一種冬凌草有效成份提取物的連續(xù)過程集成化制備方法。
本發(fā)明方法是應(yīng)用了“過程化集成技術(shù)”原理。該過程化集成技術(shù)是利用一個連續(xù)的工藝流程中，按比例一次性連續(xù)制備多種有效成份。
本發(fā)明的方法包括下列步驟(1)取材選取1000g的冬凌草原料進(jìn)行粉碎，加入5-8倍量80-95％的乙醇提取3-4次，每次提取時間2-4小時，合并冬凌草提取液，回收乙醇后得到冬凌草浸膏，加入4-6倍量無水乙醇進(jìn)行溶解，后加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到萃取液。
(2)過程化連續(xù)分離純化取乙酸乙酯萃取物，加入3-5倍的石油醚進(jìn)行沉淀，得到沉淀物，向其中加入100ml乙酸乙酯或乙醇進(jìn)行溶解，溶解液上硅膠柱，在設(shè)備上采用了自制的中間可以連續(xù)取樣的多柱系統(tǒng)，采用石油醚∶乙酸乙酯＝(10∶1)-(1∶5)混合溶劑以10-15ml/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，按照每份200ml收集，同時做TLC和HPLC在線跟蹤，在不同部位分開收集洗脫液，在4∶1-1∶2的洗脫物中，第10-22份有部分白色結(jié)晶析出，對于需要的成分進(jìn)行合并，收集得到洗脫液。
(3)集中得到成品將各部位收集到的洗脫液，分別回收洗脫液至1/3～1/4體積，向其中加入粉狀活性炭(原料∶活性炭＝40∶1-100∶1，質(zhì)量比)脫色，抽濾，然后干燥，得到比例提取物。
(4)檢驗(yàn)經(jīng)過TLC和HPLC的含量檢測，和對照品做比較，分析出比例提取物的關(guān)系，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)含量在5～75％之間，冬凌草乙素(Ponicidin)含量控制在5～10％范圍內(nèi)，而熊果酸(Ursolic acid)含量在5～10％之間。
本發(fā)明的方法工藝簡單，可以得到冬凌草活性成分的比例提取物，即冬凌草甲素∶冬凌草乙素∶熊果酸＝(5～75)∶(5～10)∶(5～10)，該提取工藝，有機(jī)溶劑殘留少，適用于規(guī)?；a(chǎn)，可以有效的提高冬凌草中的活性成分含量。
本發(fā)明檢測條件(1)冬凌草甲素的檢測條件流動相甲醇∶水＝55∶45檢測波長 242nm流速 0.8ml/min色譜柱日本島津C18ODS，柱規(guī)格250*4.6mm；5um靈敏度0.005 AUFS
柱溫 25℃(2)冬凌草乙素的檢測條件流動相水∶乙睛＝75∶25檢測波長 252nm流速 0.8ml/min色譜柱日本島津C18ODS 250*4.6mm；5um靈敏度0.005 AUFS柱溫 25℃(3)熊果酸的檢測條件流動相甲醇∶乙腈∶水∶磷酸＝30∶70∶10∶0.5檢測波長 220nm流速 0.85ml/min色譜柱Waters C18ODS 250*4.6mm；5um靈敏度0.005 AUFS柱溫 25℃本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步如下1.使用一種新的提取方法-“過程化集成技術(shù)”，是現(xiàn)代提取分離技術(shù)領(lǐng)域中的最新成果，即在一個連續(xù)的分離純化工藝流程中集中制備冬凌草活性成份的比例提取物。本發(fā)明的方法流程連續(xù)，工藝簡單，設(shè)備集成化程度高，質(zhì)量可控性好，溶劑殘留量小，適于規(guī)?；a(chǎn)。
2.生產(chǎn)工藝簡便，使用的填料是硅膠，采用柱層析分離方法，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
3.目前首次利用比例制備方法生產(chǎn)得到冬凌草中有效成分，并且可以控制在一個合適的比例范圍內(nèi)，其生產(chǎn)回收率高于目前的0.2％。
4.本制備方法中采用的溶劑解決了溶劑殘留和污染問題，可操作性強(qiáng)。


附圖為本發(fā)明制備含有冬凌草活性成分比例提取物的流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1選取200g的冬凌草原料，粉碎，加入5倍量85％的乙醇提取3次，每次提取時間2小時，得到冬凌草提取液?；厥找掖嫉玫骄G褐色的冬凌草浸膏12.3g，加入50ml無水乙醇進(jìn)行溶解，后加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到萃取物。
取乙酸乙酯萃取物，加入4倍的石油醚進(jìn)行沉淀，得到沉淀物，向其中加入50ml乙醇進(jìn)行溶解，得溶解液上硅膠柱，采用石油醚∶乙酸乙酯＝(10∶1)-(1∶1)混合溶劑以12ml/min進(jìn)行梯度洗脫，同時做TLC和HPLC在線跟蹤，不同部位分開收集洗脫液，對于需要的成分進(jìn)行合并，得到洗脫液。將各個部位收集到的洗脫液，分別回收洗脫液至1/3體積，向其中加入4g粉狀活性炭脫色，抽濾，然后干燥，得到比例提取物成品0.49g。
經(jīng)過TLC和HPLC的含量檢測，和對照品做比較，分析出比例提取物的關(guān)系，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)含量為40.8％，冬凌草乙素(Ponicidin)含量為8.2％，而熊果酸(Ursolic acid)含量為7.5％。
實(shí)施例2選取1000g的冬凌草原料，粉碎，加入6倍量90％的乙醇提取3次，每次提取時間3小時，得到冬凌草提取液。回收乙醇得到綠褐色的冬凌草浸膏62.8g，加入300ml無水乙醇進(jìn)行溶解，后加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到萃取物。
取乙酸乙酯萃取物，加入4倍的石油醚進(jìn)行沉淀，得到沉淀物，向其中加入300ml乙醇進(jìn)行溶解，得溶解液上硅膠柱，采用石油醚∶乙酸乙酯＝(8∶1)-(1∶4)混合溶劑以10ml/min進(jìn)行梯度洗脫，同時做TLC和HPLC在線跟蹤，在不同部位分開收集洗脫液，對于需要的成分進(jìn)行合并，得到洗脫液。將各個部位收集到的洗脫液，分別回收洗脫液至1/3體積，向其中加入10g粉狀活性炭脫色，抽濾，然后干燥，得到比例提取物成品2.86g。
經(jīng)過TLC和HPLC的含量檢測，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)含量為70.6％，冬凌草乙素(Ponicidin)含量為8.2％，而熊果酸(Ursolic acid)含量為8.5％。
實(shí)施例3選取3000g的冬凌草原料，粉碎，加入5倍量95％的乙醇提取4次，每次提取時間3小時，得到冬凌草提取液?；厥找掖嫉玫骄G褐色的冬凌草浸膏192.6g，加入1000ml無水乙醇進(jìn)行溶解，后加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到萃取物。
取乙酸乙酯萃取物，加入5倍的石油醚進(jìn)行沉淀，得到沉淀物，向其中加入800ml乙酸乙酯進(jìn)行溶解，得溶解液上硅膠柱，采用石油醚∶乙酸乙酯＝(4∶1)-(1∶3)混合溶劑以15ml/min進(jìn)行梯度洗脫，同時做TLC和HPLC在線跟蹤，在不同部位分開收集洗脫液，得到洗脫液。將各部位收集到的洗脫液，分別回收洗脫液至1/4體積，向其中加入50g粉狀活性炭脫色，抽濾，然后干燥，得到比例提取物成品8.21g。
經(jīng)過TLC和HPLC的含量檢測，其中含有冬凌草甲素(Oridonin)含量為60％，冬凌草乙素(Ponicidin)含量為7.5％，而熊果酸(Ursolic acid)含量為6.8％。
權(quán)利要求
1.一種冬凌草有效成份提取物的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)取材選取1000g的冬凌草原料進(jìn)行粉碎，加入5-8倍量80-95％的乙醇提取3-4次，每次提取時間2-4小時，合并冬凌草提取液，回收乙醇后得到冬凌草浸膏，加入4-6倍量無水乙醇進(jìn)行溶解，后加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到萃取液；(2)過程化連續(xù)分離純化取乙酸乙酯萃取物，加入3-5倍的石油醚進(jìn)行沉淀，得到沉淀物，向其中加入100ml乙酸乙酯或乙醇進(jìn)行溶解，溶解液上硅膠柱，在設(shè)備上采用了自制的中間可以連續(xù)取樣的多柱系統(tǒng)，采用石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1-1∶5混合溶劑以10-15ml/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，按照每份200ml收集，同時做TLC和HPLC的在線跟蹤，在不同部位分開收集洗脫液，在4∶1-1∶2的洗脫物中，第10-22份有部分白色結(jié)晶析出，對于需要的成分進(jìn)行合并，收集得到洗脫液；(3)集中得到成品將各個部位收集到的洗脫液，分別回收洗脫液至1/3～1/4體積，向其中加入粉狀活性炭，原料∶活性炭＝40∶1-100∶1，質(zhì)量比，脫色，抽濾，然后干燥，得到比例提取物；(4)檢驗(yàn)經(jīng)過TLC和HPLC的含量檢測，和對照品做比較，分析出比例提取物的關(guān)系，其中含有冬凌草甲素Oridonin含量在5-75％之間，冬凌草乙素Ponicidin含量控制在5-10％范圍內(nèi)，而熊果酸Ursolicacid含量在5-10％之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬凌草有效成份提取物的制備方法，其特征在于其中所述步驟(4)的檢驗(yàn)中HPLC的含量檢測條件為(1)冬凌草甲素的檢測條件流動相甲醇∶水＝55∶45檢測波長242nm流速0.8ml/min色譜柱日本島津C18ODS，柱規(guī)格250*4.6mm；5um靈敏度0.005 AUFS柱溫25℃(2)冬凌草乙素的檢測條件流動相水∶乙睛＝75∶25檢測波長252nm流速0.8ml/min色譜柱日本島津C18ODS 250*4.6mm；5um靈敏度0.005 AUFS柱溫25℃(3)熊果酸的檢測條件流動相甲醇∶乙腈∶水∶磷酸＝30∶70∶10∶0.5檢測波長220nm流速0.85ml/min色譜柱Waters C18ODS 250*4.6mm；5um靈敏度0.005 AUFS柱溫25℃
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種冬凌草有效成分提取物定量化的制備方法。本發(fā)明的方法采用“過程化集成技術(shù)”，是現(xiàn)代提取分離技術(shù)領(lǐng)域中的最新成果，即在一個連續(xù)的分離純化工藝流程中集中制備冬凌草活性成分的比例提取物。本發(fā)明的方法流程連續(xù)，工藝簡單，設(shè)備集成化程度高，質(zhì)量可控性好，溶劑殘留量小，適于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號A61P11/04GK1733067SQ20041005360
公開日2006年2月15日 申請日期2004年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月10日
發(fā)明者張士敏 申請人:上海天毓?jié)舍t(yī)藥開發(fā)有限公司