專利名稱：臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種物質(zhì)在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用，更具體地說(shuō)它是臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大量的醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成具有正性調(diào)控效應(yīng)，它們?cè)隈：鄣男纬芍芯哂兄匾饔?，正常的真皮成纖維細(xì)胞中某種生長(zhǎng)因子及其受體為陰性或低表達(dá)，現(xiàn)已證實(shí)胎兒創(chuàng)傷的無(wú)疤痕愈合與轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β(TGFβ)的缺乏直接有關(guān)。相反成年人的皮膚創(chuàng)傷后，愈合的纖維化瘢痕特性又與TGFβ的過(guò)量和I、III前膠原mRNA表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)。增生性瘢痕成纖維母細(xì)胞在傷口愈合時(shí)，如果過(guò)分活化，分泌大量的TGF-β1，則會(huì)造成傷口中累積大量細(xì)胞間質(zhì)，愈合后疤痕顯著。某些對(duì)TGF-β1具有拮抗作用藥物能抑制瘢痕疙瘩的形成使這類藥物成為治療瘢痕疙瘩的有效藥物。在創(chuàng)傷愈合及纖維化疾病中應(yīng)用抗TGFβ的特殊療法可能成為減輕疤痕的形成的有效手段。但由于這類藥物往往又具有較強(qiáng)的毒付效應(yīng)，因而，其臨床應(yīng)用受到制約。新近有人用反義技術(shù)和RNA干擾技術(shù)等方法能有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的體外增殖，誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡，為應(yīng)用基因藥物方法改善創(chuàng)傷愈合提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但基因治療技術(shù)尚不能完全為醫(yī)學(xué)工作者認(rèn)同和患者所接受。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述背景技術(shù)的不足之處而提供一種臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用，它是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、無(wú)毒副作用的全新皮膚傷口無(wú)疤痕愈合和無(wú)功能障礙的應(yīng)用技術(shù)。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下措施來(lái)達(dá)到的臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用，它是在無(wú)菌條件下采集健康孕婦娩出胎盤臍帶血血清，抗凝后放置-30℃冰箱內(nèi)保存，所述臍帶血血清在用于傷口瘢痕治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、不抑制機(jī)體免疫功能，亦無(wú)TGF-b基因封閉所致的毒副作用。


圖1為血清作用下巨噬細(xì)胞TGF-beta I PT-PCR結(jié)果；圖2為血清作用下巨噬細(xì)胞TGF-betaR II PT-PCR結(jié)果；圖3為血清作用下巨噬細(xì)胞TGF-b受體II蛋白Western blot結(jié)果；圖4為本發(fā)明在體實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組和外周血清組實(shí)驗(yàn)切口愈合后，在切口處取材切片，經(jīng)HE染色后鏡下觀察到的組織學(xué)變化圖，可見組織中纖維母細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(炎癥細(xì)胞、膠原纖維和新生血管)明顯多于臍帶血清組(圖5)。
圖5為本發(fā)明在體實(shí)驗(yàn)的臍帶血清組實(shí)驗(yàn)切口愈合后，在切口處取材切片，經(jīng)HE染色后鏡下觀察到的組織學(xué)變化圖，可見臍血處理組傷口愈合組織中纖維母細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(炎癥細(xì)胞、膠原纖維和新生血管)較空白對(duì)照組和外周血清組(圖4)明顯減少。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和相關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
1.離體實(shí)驗(yàn)采用小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株為TGF-beta及其受體表達(dá)模型，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后接種于6孔板，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)后，按下列分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照、LPS(100ng/ml)、10％臍帶血清組。10％臍帶血清作用1小時(shí)后，加入LPS(100ng/ml)，4小時(shí)后，Trizol(Invitrogen)法提取細(xì)胞總RNA。經(jīng)紫外分光光度法定量后，取4ugRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取1ulcDNA作為模板進(jìn)行PCR，以actin為內(nèi)參，觀察各組TGF-beta及其受體的基因表達(dá)情況(結(jié)果見圖1、圖2)。
從圖1可知正常RAW264.7巨噬細(xì)胞TGF-b mRNA呈強(qiáng)表達(dá)；LPS輕度抑制TGF-b mRNA表達(dá)；臍血血清明顯抑制上述兩種狀況巨噬細(xì)胞TCF-b mRNA表達(dá)。
從圖2可知正常RAW264.7巨噬細(xì)胞TGF-b受體IImRNA呈強(qiáng)表達(dá)；LPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞TGF-b受體IImRNA呈強(qiáng)表達(dá)幾無(wú)影響。臍血血清明顯抑制上述兩種狀況巨噬細(xì)胞TGF-b受體II mRNA表達(dá)。
小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)后接種于6cm培養(yǎng)皿，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)后，按上述分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
24小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白，用于western blot檢測(cè)炎癥因子COX-2及TGF-beta受體II蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。(結(jié)果見圖3)
從圖3可知正常RAW264.7巨噬細(xì)胞TGF-b受體II蛋白呈強(qiáng)表達(dá)；LPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞TGF-b受體II蛋白表達(dá)幾無(wú)影響。臍血血清明顯抑制上述兩種狀況巨噬細(xì)胞TGF-b受體II蛋白的表達(dá)。
2.在體實(shí)驗(yàn)選取雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組(每組8只)空白對(duì)照組、外周血清組及臍帶血清組。3％戊巴比妥(3mg/kg)肌肉注射麻醉，背部剪毛后，于無(wú)菌條件下，在背部正中作1cm長(zhǎng)與脊柱平行的切口，深達(dá)筋膜?？瞻讓?duì)照組切口內(nèi)注入0.2ml生理鹽水；外周血清組切口內(nèi)注入0.2ml健康孕婦外周血清；臍帶血清組切口內(nèi)注入0.2ml臍帶血清。3-0絲線縫合切口，術(shù)后一周每日肌注2萬(wàn)單位青霉素。4周后處死動(dòng)物，肉眼觀察切口愈合情況及疤痕大小，切口處取材切片HE染色，鏡下觀察切口處組織學(xué)變化。(結(jié)果見圖4、圖5)從圖4-1、4-2可知臍血處理組傷口愈合組織中纖維母細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(炎癥細(xì)胞、膠原纖維和新生血管)較對(duì)照組明顯減少。
我們根據(jù)胎兒創(chuàng)傷的無(wú)疤痕愈合現(xiàn)象得到啟示，創(chuàng)造性研究出臍帶血減輕疤痕的形成的有效方法。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)臍帶血能更加有效的抑制巨噬細(xì)胞TGFβ的表達(dá)，下調(diào)TGFβ受體；在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)傷口局部注射臍帶血能有效抑制I、III前膠原mRNA表達(dá)增強(qiáng)，減少瘢痕形成。從而為成年人的皮膚無(wú)疤痕愈合創(chuàng)造了一種全新方法。
本方法通過(guò)一次性傷口局部注射適量臍帶血血清可有效減少傷口疤痕形成，切口處取材切片，經(jīng)HE染色證實(shí)傷口愈合組織中纖維母細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(炎癥細(xì)胞、膠原纖維和新生血管)較對(duì)照組明顯減少。離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)臍帶血清可有效減少巨噬細(xì)胞TGF-b及其受體基因表達(dá)，下調(diào)TGF-b受體II。我們認(rèn)為臍帶血清可能主要通過(guò)抑制相關(guān)細(xì)胞TGF-b及其受體表達(dá)，進(jìn)而抑制膠原纖維和新生血管生成，從而減少傷口疤痕形成。本方法較通過(guò)抑制免疫或封閉TGF-b基因等方法具有很大優(yōu)勢(shì)方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、不抑制機(jī)體免疫功能，亦無(wú)TGF-b基因封閉所致的毒副作用。
權(quán)利要求
1.臍帶血血清在制備用于治療傷口瘢痕藥物中的應(yīng)用。
2.一種用于治療傷口瘢痕的藥物，其特征在于它是在無(wú)菌條件下采集的健康孕婦娩出的胎盤臍帶血血清。
3.制備權(quán)利要求2所述治療傷口瘢痕藥物的方法，包括以下步驟a.在無(wú)菌條件下采集健康孕婦娩出胎盤的臍帶血血清；b.抗凝后放置-30℃保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用，它是在無(wú)菌條件下采集健康孕婦娩出胎盤臍帶血血清，抗凝后放置－30℃冰箱內(nèi)保存，所述臍帶血血清可用于治療傷口瘢痕。它克服了現(xiàn)有藥物具有較強(qiáng)的毒副效應(yīng)，因而，其臨床應(yīng)用受到制約的不足；本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、不抑制機(jī)體免疫功能。為皮膚創(chuàng)傷無(wú)疤痕愈合創(chuàng)造了一種全新方法。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1795872SQ200410061470
公開日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者葉篤筠 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)