專利名稱：組織工程化周圍神經(jīng)移植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種外科移植物，特別是用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的神經(jīng)移植物。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)損傷及損傷后導(dǎo)致的神經(jīng)缺損，是臨床常見的致殘性疾病。對于因各種意外事故引起的周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)，一直是神經(jīng)外科治療的一個難題。我國每年新增的病例近100萬例，其中，需要通過植入神經(jīng)移植物來修復(fù)損傷神經(jīng)的約45萬例。目前，神經(jīng)移植物的來源非常匱乏，急需研究和開發(fā)神經(jīng)替代物。
國內(nèi)外對神經(jīng)移植物的研制一直停留在仿神經(jīng)結(jié)構(gòu)的導(dǎo)管上，目前所開發(fā)的人工產(chǎn)品均為將神經(jīng)的兩個斷端連接起來的管狀醫(yī)用材料，即所謂的“人造神經(jīng)管”或“人造神經(jīng)移植物”。在中國專利“醫(yī)用人造神經(jīng)移植物及其制備方法”(專利號01108208.9)中揭示了一種由殼聚糖材料制成的生物導(dǎo)管，生物導(dǎo)管嵌有纖維支架，纖維支架材料為聚乙醇酸或聚乳酸；在中國專利申請“人工神經(jīng)管”(申請?zhí)?0810000.4)、“人造神經(jīng)管”(申請?zhí)?9807035.1)、“人工神經(jīng)管”(申請?zhí)?7199928.7)中都揭示了由生物體內(nèi)分解吸收材料形成的管，其內(nèi)腔中具有微細(xì)纖維化膠原體，其空隙中填充有昆布氨酸。
上述現(xiàn)有產(chǎn)品都是用可降解的生物材料制成的導(dǎo)管，能在植入體內(nèi)后“橋接”缺損的神經(jīng)，但是，上述產(chǎn)品僅僅是為再生神經(jīng)軸突的生長提供了一條“橋梁”或“通道”，本身沒有生物活性，不能提供神經(jīng)生長所必要的內(nèi)環(huán)境，也沒有促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實，許旺細(xì)胞在人體神經(jīng)生長過程中有極為重要的作用，它們附著并包圍軸突形成髓鞘，促進(jìn)軸突的延伸和成熟。因為上述現(xiàn)有產(chǎn)品沒有提供神經(jīng)再生所必需的許旺細(xì)胞或具有類似功能的活性細(xì)胞，在近斷端長出新生軸突時，只能依賴機(jī)體本身的許旺細(xì)胞連帶一齊長過來，這個過程就不僅很緩慢，而且機(jī)體本身的許旺細(xì)胞的遷移有一定限度，如果許旺細(xì)胞進(jìn)不去，或者進(jìn)得很少，神經(jīng)的生長就大受影響，如果應(yīng)用于臨床，僅能修復(fù)短距離的神經(jīng)缺損，一般不超過15毫米，臨床上對如此短距離的神經(jīng)缺損往往可以直接縫合，而不需要借助這些神經(jīng)移植物。對更長距離的神經(jīng)缺損，即使“橋接”上述導(dǎo)管，再生的神經(jīng)軸突也不能到達(dá)遠(yuǎn)斷端，不能恢復(fù)損傷神經(jīng)的功能，因而修復(fù)效果十分不理想。
近年來，組織工程學(xué)的出現(xiàn)為組織損傷的修復(fù)帶來了新希望。組織工程學(xué)是一門運用工程學(xué)與生命科學(xué)的原理和方法，研究正常及病變的哺乳動物組織形態(tài)和功能的相互關(guān)系，開發(fā)修復(fù)損傷組織形態(tài)和功能的生物替代物的科學(xué)，是生物技術(shù)領(lǐng)域的重要內(nèi)容。具體來說是利用仿生學(xué)的原理，制備具有特定的三維結(jié)構(gòu)和生物活性的復(fù)合體，營造出有正常生理功能的組織，可用于替代人體缺損組織的形態(tài)與功能。組織工程學(xué)的出現(xiàn)標(biāo)志著醫(yī)學(xué)將從現(xiàn)有的自體或異體組織和器官移植的模式，進(jìn)入用人工制造的組織和器官移植修復(fù)缺損和重建功能的新階段。
上述現(xiàn)有產(chǎn)品沒有生物活性，都不是真正意義上的組織工程化周圍神經(jīng)移植物，這是導(dǎo)致現(xiàn)有產(chǎn)品在神經(jīng)修復(fù)中效果不理想的根本原因。

發(fā)明內(nèi)容
本實用新型的目的在于提供一種組織工程化周圍神經(jīng)移植物，用于修復(fù)周圍神經(jīng)損傷后出現(xiàn)的神經(jīng)缺損。
本實用新型所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物，包括用于連接神經(jīng)兩斷端的支架和具有促進(jìn)神經(jīng)再生功能的種子細(xì)胞，所述的去細(xì)胞異體神經(jīng)支架由多根去細(xì)胞的神經(jīng)基底膜管組成，種子細(xì)胞附著于神經(jīng)基底膜管的空腔內(nèi)壁上，或附著于神經(jīng)基底膜管外表面，形成具有仿神經(jīng)三維結(jié)構(gòu)和生物活性的復(fù)合體。
所述的支架為去細(xì)胞異體神經(jīng)，優(yōu)選是采用化學(xué)萃取法制備的去細(xì)胞異體神經(jīng)。
為進(jìn)一步增強(qiáng)支架對種子細(xì)胞的粘附性，并促進(jìn)神經(jīng)再生和移植物的血管化過程，所述的去細(xì)胞異體神經(jīng)中可加入能促進(jìn)細(xì)胞粘附、神經(jīng)再生和移植物血管化的物質(zhì)。
上述的能促進(jìn)細(xì)胞粘附、神經(jīng)再生和移植物血管化的物質(zhì)可以為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，包括膠原、氨基聚糖、糖蛋白三大類；也可以是各種生長因子。
所述的種子細(xì)胞是成體干細(xì)胞。優(yōu)選為骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，或者脂肪干細(xì)胞。
周圍神經(jīng)由神經(jīng)細(xì)胞、許旺細(xì)胞、結(jié)締組織、血管、淋巴管以及特殊支持細(xì)胞組成。神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)又是由胞體部分和突起的胞突構(gòu)成，胞突的末端反復(fù)分支后與神經(jīng)元接觸，軸突是其中的一個最長和最重要的胞突，可伸延至效應(yīng)器。許旺細(xì)胞包繞軸突形成神經(jīng)纖維。上萬條纖維集中在一起形成神經(jīng)束，一個或數(shù)個神經(jīng)束由結(jié)締組織聯(lián)系在一起，就組成了周圍神經(jīng)。當(dāng)周圍神經(jīng)斷裂并出現(xiàn)缺損后，需要用移植物來“橋接”缺損的神經(jīng)段，新生的神經(jīng)軸突從近斷端長入移植物，在許旺細(xì)胞的引導(dǎo)下向遠(yuǎn)斷端生長?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實，許旺細(xì)胞在人體神經(jīng)生長過程中具有極其重要的作用，它們附著并包圍軸突形成髓鞘，促進(jìn)軸突的延伸和成熟。發(fā)明人已成功將成體干細(xì)胞附著于支架一并移植到體內(nèi)，在體內(nèi)環(huán)境中使成體干細(xì)胞誘導(dǎo)成為具有許旺細(xì)胞形態(tài)和功能特征的細(xì)胞，命名為“類許旺細(xì)胞”，這些細(xì)胞應(yīng)是人類周圍神經(jīng)損傷修復(fù)所設(shè)計的組織工程化神經(jīng)所采用的種子細(xì)胞中最為合適的細(xì)胞之一，其在體內(nèi)的增殖為神經(jīng)軸突的再生鋪平了道路。
現(xiàn)有的所謂“人造神經(jīng)管”或“人造神經(jīng)移植物”僅僅是為再生神經(jīng)軸突的生長提供的“橋梁”或“通道”，而本實用新型所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物具有突破性的優(yōu)點，即采用了在連接神經(jīng)斷端的支架上“種植”具有生物學(xué)活性的種子細(xì)胞，該種子細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中可被促使分化為具有許旺細(xì)胞(Schwann’s cells)形態(tài)和功能特征的“類許旺細(xì)胞”，細(xì)胞有貼附生長的特性，類許旺細(xì)胞可在支架表面粘附、遷移、增殖，形成具有特殊三維結(jié)構(gòu)和活性細(xì)胞的人造神經(jīng)組織。支架和種子細(xì)胞都是本實用新型所述的周圍神經(jīng)移植物必不可少的組成部分，由此構(gòu)成了真正意義上的組織工程化周圍神經(jīng)移植物。
現(xiàn)有的利用生物降解材料制備的“人造神經(jīng)管”或“人造神經(jīng)移植物”，仍存在許多有待改進(jìn)之處。這類由生物降解材料制備的支架畢竟是人工仿制品，與天然神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)相比，其三維結(jié)構(gòu)過于簡單，而要加工成具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的支架的技術(shù)成本很高。因此，本實用新型采用去細(xì)胞異體神經(jīng)作為支架，能進(jìn)一步克服現(xiàn)有生物降解材料導(dǎo)管的缺陷。
本實用新型的特點是將異體神經(jīng)作去細(xì)胞處理而利用其天然的神經(jīng)基底膜管結(jié)構(gòu)作為支架。發(fā)明人已成功用化學(xué)藥物破壞并洗脫人類周圍神經(jīng)中的細(xì)胞，得到“去細(xì)胞異體神經(jīng)支架”。經(jīng)處理后的支架只清除神經(jīng)組織中的各種細(xì)胞而保留神經(jīng)基底膜管及管之間的基質(zhì)，神經(jīng)的纖維骨架仍然完好。
本實用新型在應(yīng)用時，將所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物植入人體的神經(jīng)缺損部位，從神經(jīng)斷端長出的新生軸突開始長進(jìn)支架內(nèi)并在支架內(nèi)延伸和成熟。在這個過程中，附著于支架上的種子細(xì)胞則按再生軸突的生長方向不斷增殖、遷移，形成“類許旺細(xì)胞”的細(xì)胞帶，等候著新生軸突的到來，在新生神經(jīng)軸突生長的過程中，種子細(xì)胞相當(dāng)于“迎接”新生軸突的“引路人”，提供了必要的營養(yǎng)作用和誘導(dǎo)作用。新生的周圍神經(jīng)軸突就有一個接一個的類許旺細(xì)胞去“迎接”它，并包圍軸突，形成髓鞘，并使之達(dá)到功能上的成熟。同時，作為支架的去細(xì)胞異體神經(jīng)逐漸被機(jī)體吸收，并最終被新生的神經(jīng)纖維所取代。
因為周圍神經(jīng)生長一定需要許旺細(xì)胞的“保駕護(hù)航”?，F(xiàn)有的神經(jīng)移植物產(chǎn)品僅提供支架而不提供許旺細(xì)胞或具有類似功能的活性細(xì)胞，在近斷端長出新生軸突時，只能依賴機(jī)體本身的許旺細(xì)胞連帶一齊長過來，這個過程就不僅很緩慢，而且機(jī)體本身的許旺細(xì)胞的遷移有一定限度，如果許旺細(xì)胞進(jìn)不去，或者進(jìn)得很少，神經(jīng)的生長就大受影響，如果應(yīng)用于臨床，僅能修復(fù)短距離的神經(jīng)缺損，一般不超過15毫米，臨床上對如此短距離的神經(jīng)缺損往往可以直接縫合，而不需要借助這些神經(jīng)移植物。對更長距離如3厘米以上的神經(jīng)缺損，即使“橋接”上述導(dǎo)管，再生的神經(jīng)軸突也不能到達(dá)遠(yuǎn)斷端，難以恢復(fù)損傷神經(jīng)的功能，因而修復(fù)效果十分不理想。而本實用新型采用種子細(xì)胞與支架相結(jié)合的結(jié)構(gòu)，不僅為再生的神經(jīng)纖維通過神經(jīng)缺損區(qū)提供了仿生化的通道，而且其內(nèi)在的種子細(xì)胞對神經(jīng)再生有促進(jìn)作用，因此可用于修復(fù)更長距離的神經(jīng)缺損，神經(jīng)修復(fù)效果顯著提高，臨床應(yīng)用范圍更廣。


圖1為本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為圖1的A-A剖面局部放大示意圖。
圖3為本實用新型的應(yīng)用示意圖。
具體實施方式
本實用新型所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物，如圖1和圖2所示，包括用于連接神經(jīng)兩斷端的支架1和具有促進(jìn)神經(jīng)再生功能的種子細(xì)胞2，種子細(xì)胞2附著于支架1上，形成具有仿神經(jīng)三維結(jié)構(gòu)和生物活性的復(fù)合體。支架1為去細(xì)胞異體神經(jīng)。如圖2所示，去細(xì)胞異體神經(jīng)由許多神經(jīng)基底膜管11組成，神經(jīng)基底膜管11內(nèi)的細(xì)胞已去除，剩下空腔，種子細(xì)胞2主要附著于神經(jīng)基底膜管11的內(nèi)壁上，也可附著于神經(jīng)基底膜管11外。如圖3所示，當(dāng)修復(fù)神經(jīng)缺損時，將本實用新型所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物植入近斷端3與遠(yuǎn)斷端4之間。
在實際產(chǎn)品中，去細(xì)胞異體神經(jīng)所含有的神經(jīng)基底膜管極小，圖1至圖3均為微觀示意圖，其比例不代表實際產(chǎn)品的比例。
種子細(xì)胞2為成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞包括有多種干細(xì)胞，如骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等，以下實施例以骨髓間質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞分別作為種子細(xì)胞加以說明實施例一從捐獻(xiàn)者的肢體上切取完整的神經(jīng)，用化學(xué)藥物(如三硝基甲苯和脫氧膽酸鈉等)破壞神經(jīng)組織中的細(xì)胞并將其細(xì)胞成分萃取出來，得到去細(xì)胞異體神經(jīng)，滅菌后作為支架1。在患者體內(nèi)(如髂骨、脛骨等部位)抽取骨髓，分離出骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，將分離后的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞2注射到滅菌后的去細(xì)胞異體神經(jīng)支架1中，進(jìn)行體外培養(yǎng)，即得到了本實用新型所述的由骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與去細(xì)胞異體神經(jīng)構(gòu)造的組織工程化周圍神經(jīng)移植物。臨床使用時，將本實用新型所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物植入到要修復(fù)的周圍神經(jīng)缺損處，在體內(nèi)環(huán)境中促使成體干細(xì)胞分化成“類許旺細(xì)胞”，并且類許旺細(xì)胞沿再生軸突的生長方向增殖、遷移。如圖3所示，周圍神經(jīng)斷裂后，新生軸突從神經(jīng)的近斷端3長出來，類許旺細(xì)胞靠近和包圍軸突，向軸突提供營養(yǎng)，并引導(dǎo)軸突向神經(jīng)的遠(yuǎn)端生長，同神經(jīng)纖維的遠(yuǎn)斷端4相連接。在這個過程中，類許旺細(xì)胞發(fā)揮許旺細(xì)胞的功能，而作為支架的去細(xì)胞異體神經(jīng)則被機(jī)體吸收，最終被再生的神經(jīng)纖維取代。
為進(jìn)一步增強(qiáng)支架對種子細(xì)胞的粘附性，并促進(jìn)神經(jīng)再生和移植物的血管化過程，本實施例中，去細(xì)胞異體神經(jīng)可加入能促進(jìn)細(xì)胞粘附、神經(jīng)再生和移植物血管化的物質(zhì)。該物質(zhì)可以為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，包括膠原、氨基聚糖、糖蛋白三大類；也可以是各種生長因子。
在本實施例中，當(dāng)患者的指神經(jīng)缺損2厘米時，可取相應(yīng)長度的異體指神經(jīng)進(jìn)行去細(xì)胞處理作為支架；當(dāng)患者的正中神經(jīng)缺損4厘米時，可取相應(yīng)長度的異體正中神經(jīng)進(jìn)行去細(xì)胞處理作為支架當(dāng)患者的坐骨神經(jīng)缺損6厘米時，可取相應(yīng)長度的異體坐骨神經(jīng)進(jìn)行去細(xì)胞處理作為支架。
實施例二從捐獻(xiàn)者的肢體上切取完整的神經(jīng)，用化學(xué)藥物(如三硝基甲苯和脫氧膽酸鈉等)破壞神經(jīng)組織中的細(xì)胞并將其細(xì)胞成分萃取出來，得到去細(xì)胞異體神經(jīng)，滅菌后作為支架1。在患者體內(nèi)脂肪較豐富處(如腹壁)抽取脂肪組織，分離出脂肪干細(xì)胞，將分離后的脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞2注射到滅菌后的去細(xì)胞異體神經(jīng)支架1上，即得到了本實用新型所述的由脂肪干細(xì)胞與去細(xì)胞異體神經(jīng)構(gòu)造的組織工程化周圍神經(jīng)移植物。臨床使用時，將本實用新型所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物植入到要修復(fù)的周圍神經(jīng)缺損處，在體內(nèi)環(huán)境中促使脂肪干細(xì)胞分化成“類許旺細(xì)胞”，并且類許旺細(xì)胞沿再生軸突的生長方向增殖、遷移。如圖3所示，周圍神經(jīng)斷裂后，新生軸突從神經(jīng)的近斷端3長出來，類許旺細(xì)胞靠近和包圍軸突，向軸突提供營養(yǎng)，并引導(dǎo)軸突向神經(jīng)的遠(yuǎn)端生長，同神經(jīng)纖維的遠(yuǎn)斷端4相連接。在這個過程中，類許旺細(xì)胞發(fā)揮許旺細(xì)胞的功能，而作為支架的去細(xì)胞異體神經(jīng)則被機(jī)體吸收，最終被再生的神經(jīng)纖維取代。
為進(jìn)一步增強(qiáng)支架對種子細(xì)胞的粘附性，并促進(jìn)神經(jīng)再生和移植物的血管化過程，本實施例中，去細(xì)胞異體神經(jīng)可加入能促進(jìn)細(xì)胞粘附、神經(jīng)再生和移植物血管化的物質(zhì)。該物質(zhì)可以為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，包括膠原、氨基聚糖、糖蛋白三大類；也可以是各種生長因子。
在本實施例中，當(dāng)患者的指神經(jīng)缺損2厘米時，可取相應(yīng)長度的異體指神經(jīng)進(jìn)行去細(xì)胞處理作為支架；當(dāng)患者的正中神經(jīng)缺損4厘米時，可取相應(yīng)長度的異體正中神經(jīng)進(jìn)行去細(xì)胞處理作為支架；當(dāng)患者的坐骨神經(jīng)缺損6厘米時，可取相應(yīng)長度的異體坐骨神經(jīng)進(jìn)行去細(xì)胞處理作為支架。
上列詳細(xì)說明是針對本實用新型的可行實施例的具體說明，但該實施例并非用以限制本實用新型的專利范圍，凡未脫離本實用新型精神所為的等效實施或變更，均應(yīng)包含于本實用新型的專利范圍中。
權(quán)利要求1.組織工程化周圍神經(jīng)移植物，其特征在于包括用于連接神經(jīng)兩斷端的去細(xì)胞異體神經(jīng)支架(1)和具有促進(jìn)神經(jīng)再生功能的種子細(xì)胞(2)，所述的去細(xì)胞異體神經(jīng)支架(1)由多根去細(xì)胞的神經(jīng)基底膜管(11)組成，種子細(xì)胞(2)附著于神經(jīng)基底膜管(11)的空腔內(nèi)壁上，或附著于神經(jīng)基底膜管(11)外表面，形成具有仿神經(jīng)三維結(jié)構(gòu)和生物活性的復(fù)合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物，其特征在于所述的去細(xì)胞異體神經(jīng)支架(1)中含有能促進(jìn)細(xì)胞粘附、神經(jīng)再生和移植物血管化的物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物，其特征在于所述的種子細(xì)胞(2)是成體干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物，其特征在于所述的成體干細(xì)胞是骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物，其特征在于所述的成體干細(xì)胞是脂肪干細(xì)胞。
專利摘要本實用新型公開了一種組織工程化周圍神經(jīng)移植物，以提供適用范圍更廣和質(zhì)量更好的修復(fù)神經(jīng)缺損的外科移植物。本實用新型所述的組織工程化周圍神經(jīng)移植物，包括用于連接神經(jīng)兩斷端的支架和具有促進(jìn)神經(jīng)再生功能的種子細(xì)胞，種子細(xì)胞附著于支架上，形成具有仿神經(jīng)三維結(jié)構(gòu)和生物活性的復(fù)合體。所述的支架為去細(xì)胞異體神經(jīng)，所述的種子細(xì)胞是成體干細(xì)胞。本實用新型是真正意義上的組織工程化周圍神經(jīng)移植物，不僅為再生的神經(jīng)纖維通過神經(jīng)缺損區(qū)提供了仿生化的通道，而且其內(nèi)在的種子細(xì)胞對神經(jīng)再生有促進(jìn)作用，因此可用于修復(fù)更長距離的神經(jīng)缺損，神經(jīng)修復(fù)效果顯著提高，臨床應(yīng)用范圍更廣。
文檔編號A61F2/02GK2830410SQ200420045860
公開日2006年10月25日 申請日期2004年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月18日
發(fā)明者朱家愷, 劉小林, 朱慶棠, 勞鎮(zhèn)國, 許揚濱 申請人:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院