專利名稱：含有免疫球蛋白fc區(qū)作為載體的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫球蛋白Fc片段的新用途。更具體而言，本發(fā)明涉及含有免疫球蛋白Fc片段作為載體的藥物組合物，以及延長與免疫球蛋白Fc片段連接的藥物的體內(nèi)作用持續(xù)時間的方法。
背景技術(shù)：
從前，許多藥理學(xué)家和化學(xué)家致力于從化學(xué)上改變和/或修飾天然存在的生理學(xué)活性分子的體內(nèi)活性。這些努力主要集中于提高或延長生理學(xué)活性物質(zhì)的某些體內(nèi)活性、減輕其毒性、消除或減少其副作用或改變其特異的生理學(xué)活性。當生理學(xué)活性物質(zhì)被化學(xué)修飾時，在許多情況下它會喪失自身的某些或大部分生理學(xué)活性。不過，在某些情況下，修飾可導(dǎo)致生理學(xué)活性的提高或改變。在這點上，許多研究已集中于能實現(xiàn)所需生理學(xué)活性的化學(xué)修飾上，且大部分這樣的研究涉及將生理學(xué)活性物質(zhì)(藥物)與生理學(xué)可接受載體共價鍵合。
例如，國際專利申請WO 01/93911應(yīng)用了具有數(shù)種酸成分作為藥物載體的聚合物。國際專利申請公開WO 03/00778公布了含陰離子基團的兩性嵌段共聚物，當將它用作陽離子藥物的藥物載體時，它可提高藥物的穩(wěn)定性。歐洲專利EP0 681 481描述了一種以環(huán)式糊精和酸作為載體改進堿性藥物特性的方法。另一方面，疏水藥物在體內(nèi)具有低穩(wěn)定性，這主要是由于它們的低水溶性造成的。為了改進疏水藥物的低水溶性，國際專利申請WO 04/064731利用了脂類作為載體。不過，迄今為止，還未有關(guān)于將免疫球蛋白Fc片段作為藥物載體的報道。
通常，因為多肽由于其低穩(wěn)定性而相對容易變性、在血液中被蛋白水解酶降解并容易通過腎臟或肝臟清除掉，所以蛋白質(zhì)藥物，包括以多肽作為藥物有效成分的藥物需要頻繁的施用于患者以維持所需要的血液水平濃度和效價。不過，這樣頻繁施用蛋白質(zhì)藥物，尤其是通過注射施加會引起患者的痛苦。為了解決這些問題，已進行了許多努力來提高蛋白質(zhì)藥物的血清穩(wěn)定性并長時期保持藥物在血液中的高水平，從而使藥物的藥效最大化。因此，具有相同活性的藥物組合物需要提高蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性并保持足夠水平的效價而不會引起患者的免疫應(yīng)答。
為了穩(wěn)定蛋白質(zhì)、預(yù)防酶促降解和被腎臟清除，常規(guī)上使用了諸如聚乙二醇(下文中簡稱為“PEG”)等具有高溶解性的聚合物來化學(xué)修飾蛋白質(zhì)藥物的表面。通過與靶蛋白質(zhì)的特定區(qū)域或各種區(qū)域結(jié)合，PEG穩(wěn)定了蛋白質(zhì)并防止其水解，同時不會造成嚴重的副作用(Sada等，J.Fermentation Bioengineering 71137-139，1991)。不過，盡管它能增強蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，PEG偶聯(lián)也存在一些問題，諸如大大降低了生理學(xué)“活性”蛋白質(zhì)的效價。此外，隨著PEG分子量的提高，其產(chǎn)量會有所降低，這是由于該蛋白質(zhì)的反應(yīng)性有所降低所致。
最近，已經(jīng)公開了聚合物-蛋白質(zhì)藥物綴合物。例如，如美國專利5,738,846中所述，可通過在PEG兩端連接同樣的蛋白質(zhì)藥物來制備綴合物，以提高蛋白質(zhì)藥物的活性。此外，如國際專利申請公開WO 92/16221中所述，也可以將兩種不同的蛋白質(zhì)藥物連接于PEG的兩端，得到具有兩種不同活性的綴合物。不過，以上方法在維持蛋白質(zhì)藥物的活性上不是非常成功。
另一方面，Kinstler等報道了一種通過將粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)與人白蛋白而相偶聯(lián)而制備的融合蛋白顯示出改良的穩(wěn)定性(Kinstler等，Pharmaceutical Research 12(12)1883-1888，1995)。不過，在這篇文章中，由于與單純施用天然G-CSF相比，具有G-CSF-PEG-白蛋白結(jié)構(gòu)的經(jīng)修飾藥物只顯示出體內(nèi)停留時間提高了大約4倍和血清半衰期的稍微延長，所以它尚未作為蛋白質(zhì)藥物的長效制劑而被工業(yè)化生產(chǎn)。
改進生理學(xué)活性蛋白質(zhì)體內(nèi)穩(wěn)定性的一種備選方法是通過用遺傳重組技術(shù)將生理學(xué)活性蛋白質(zhì)的基因與編碼具高血清穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)的基因相連接并培養(yǎng)用所述重組基因轉(zhuǎn)染的細胞以產(chǎn)生融合蛋白。例如，可通過用遺傳重組將白蛋白或其片段與感興趣的生理學(xué)活性蛋白質(zhì)綴合來制備融合蛋白，所述白蛋白是已知在增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性上最有效的一種蛋白質(zhì)(國際專利申請WO 93/15199和WO93/15200，歐洲專利公開413,622)。由人類基因組科技公司(HumanGenome Science Company)研發(fā)并以商品名‘AlbuferonTTM’被銷售的α干擾素和白蛋白的融合蛋白，在猴子中的半衰期從5小時延長到了93小時，但已知成問題的是它將體內(nèi)活性降低到低于未修飾的α干擾素的5％(Osborn等，J.Phar.Exp.Ther.303(2)540-548，2002)。
重組DNA技術(shù)被用于將蛋白質(zhì)藥物與免疫球蛋白Fc片段融合。例如，干擾素(韓國專利公開申請文件2003-9464)和白介素-4受體、白介素-7受體或促紅細胞生成素(EPO)受體(韓國專利登記號249572)先前以與免疫球蛋白Fc片段融合的形式表達于哺乳動物中。國際專利申請公開WO 01/03737描述了一種包含通過肽鍵與免疫球蛋白Fc片段連接的細胞因子或生長因子的融合蛋白。此外，美國專利5,116,964公布了通過遺傳重組與免疫球蛋白Fc片段的氨基或羧基末端融合的蛋白質(zhì)。美國專利5,349,053公布了含有通過肽鍵與免疫球蛋白Fc片段融合的IL-2的融合蛋白。通過遺傳重組制備的Fc融合蛋白的其它例子包括β干擾素或其衍生物與免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白(國際專利申請WO 00/23472)，和IL-5受體與免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白(美國專利5,712,121)、α干擾素和免疫球蛋白G4的Fc片段的融合蛋白(美國專利5,723,125)，以及CD4蛋白質(zhì)和免疫球蛋白G2的Fc片段的融合蛋白(美國專利6,451,313)。
涉及免疫球蛋白Fc片段的氨基酸殘基修飾的技術(shù)同樣也是已知的。例如，美國專利NO.5,605,690公布了一種TNFR-IgG1 Fc融合蛋白，它是通過遺傳重組利用在補體結(jié)合區(qū)或受體結(jié)合區(qū)中有氨基酸變化的IgG1 Fc片段制備的。此外，用修飾過的免疫球蛋白Fc片段通過遺傳重組制備融合蛋白的其它方法參閱美國專利6,277,375、6,410,008和6,444,792。
這樣的通過遺傳重組產(chǎn)生的Fc融合蛋白具有以下缺點蛋白質(zhì)融合只發(fā)生在免疫球蛋白Fc片段的特定區(qū)域，即在氨基或羧基末端；只能產(chǎn)生均二聚體形式而不產(chǎn)生單體形式；融合只可能發(fā)生在糖基化蛋白質(zhì)之間或非糖基化(aglycosylated)蛋白質(zhì)之間，而不可能形成由糖基化蛋白質(zhì)和非糖基化蛋白質(zhì)組成的融合蛋白。此外，融合所建立的新氨基酸序列可能引發(fā)免疫應(yīng)答，而接頭區(qū)可能變得對蛋白水解的降解作用敏感。
為了解決這些問題，本申請的發(fā)明者經(jīng)過研究得知，當藥物以與IgG Fc片段連接的形式被施用時，所述藥物在展示體內(nèi)活性最小程度的降低的同時提高了在體內(nèi)的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的一個目的是提供包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供用于通過包含免疫球蛋白Fc片段作為載體而改善藥物的體內(nèi)作用持續(xù)時間的方法。
附圖簡述本發(fā)明的以上及其它目的、特性和其它優(yōu)勢可通過以下詳述并結(jié)合附圖而更清楚地加以理解，其中

圖1顯示了用木瓜蛋白酶切割免疫球蛋白獲得的免疫球蛋白Fc片段的層析結(jié)果；圖2顯示了純化的免疫球蛋白Fc片段的SDS-PAGE結(jié)果(M分子量標準，泳道1IgG，泳道2Fc)；圖3顯示了IFNα-PEG-Fc(A)，17Ser-G-CSF-PEG-Fc(B)與EPO-PEG-Fc(C)綴合物的SDS-PAGE結(jié)果，它們是通過偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的(M分子量標準，泳道1Fc，泳道2生理學(xué)活性蛋白質(zhì)，泳道3生理學(xué)活性蛋白質(zhì)-PEG-Fc綴合物)；圖4顯示了偶聯(lián)反應(yīng)后純化的IFNα-PEG-Fc綴合物大小排阻層析的結(jié)果；圖5顯示了EPO-PEG-Fc綴合物的MALDI-TOF質(zhì)譜的結(jié)果；圖6a和6b分別顯示了天然免疫球蛋白Fc和去糖基化免疫球蛋白Fc(DG Fc)的MALDI-TOF質(zhì)譜和SDS-PAGE分析結(jié)果；圖7顯示了IFNα-PEG-Fc綴合物和IFNα-PEG-DG Fc綴合物的MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)果；圖8a至8c顯示了IFNα-PEG-Fc、IFNα-PEG-DG Fc和IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物綴合體的反相HPLC結(jié)果；圖9是顯示天然IFNα、IFNα-40K PEG復(fù)合物、IFNα-PEG-白蛋白綴合物和IFNα-PEG-Fc綴合物的藥物代謝動力學(xué)分析結(jié)果的曲線圖；圖10是顯示天然EPO、高度糖基化的EPO、EPO-PEG-Fc綴合物和EPO-PEG-AG Fc綴合物的藥物代謝動力學(xué)分析結(jié)果的曲線圖；圖11是顯示IFNα-PEG-Fc、IFNα-PEG-DG Fc和IFNα-PEG-重組體AG Fc綴合物的藥物代謝動力學(xué)分析結(jié)果的曲線圖；圖12是顯示Fab′、Fab′-S-40K PEG復(fù)合物、Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物和Fab′-S-PEG-N-Fc綴合物的藥物代謝動力學(xué)的曲線圖；圖13是顯示Fab′、Fab′-S-40K PEG復(fù)合物和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物和Fab′-S-PEG-N-Fc綴合物體內(nèi)活性的曲線圖；圖14是顯示人IgG亞型與C1q補體結(jié)合親和力的比較結(jié)果的曲線圖；以及圖15是顯示糖基化Fc、酶促去糖基化DG Fc和其中載體為大腸桿菌所產(chǎn)生的AG Fc的干擾素-PEG-載體綴合物與C1q補體結(jié)合親和力的比較結(jié)果的示意圖。
實施本發(fā)明的最佳方式一方面，本發(fā)明涉及包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的藥物組合物。
術(shù)語“載體”用于此處時指與藥物連接的物質(zhì)，它通常通過與藥物結(jié)合而提高、降低或消除藥物的生理學(xué)活性。不過，就本發(fā)明的目的而言，載體用于本發(fā)明中以使與載體連接的目的藥物的生理學(xué)活性的降低最小化，同時增強了藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性。
為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明應(yīng)用了免疫球蛋白Fc片段作為載體。
免疫球蛋白Fc片段就用作藥物載體而言是安全的，因為它是在體內(nèi)可新陳代謝的生物可降解多肽。此外，免疫球蛋白Fc片段與整個免疫球蛋白分子相比具有相對較低的分子量，因此有利于目的綴合物的制備、純化和生產(chǎn)。另外，由于免疫球蛋白Fc片段不包含F(xiàn)ab片段(后者的氨基酸序列在抗體亞型之間有所不同，因此具有高度的非同源性)，它可能極大的提高了物質(zhì)的均一性并且具有較低的抗原性。
術(shù)語“免疫球蛋白Fc片段”用于此處時是指含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)2(CH2)和重鏈恒定區(qū)3(CH3)且不含免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)1(CH1)和輕鏈恒定區(qū)1(CL1)的蛋白質(zhì)。它可能進一步包含位于重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)域。此外，除了重鏈和輕鏈可變區(qū)之外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段可能包含重鏈恒定區(qū)1(CH1)和/或輕鏈恒定區(qū)1(CL1)的一部分或全部。同樣，只要它具有與天然蛋白質(zhì)基本上相似或優(yōu)于天然蛋白質(zhì)的生理學(xué)功能，IgG Fc片段就可以是在CH2和/或CH3氨基酸序列的相對較長部分中有缺失的片段。即，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段可能包含1)CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和CH4結(jié)構(gòu)域，2)CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，3)CH1結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，4)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，5)一個或多個結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白鉸鏈區(qū)(或鉸鏈區(qū)的一部分)的組合，和6)重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)各個結(jié)構(gòu)域的二聚體。
本發(fā)明的Fc片段包括天然氨基酸序列和其序列衍生物(突變體)。氨基酸序列衍生物是由于一個或多個氨基酸殘基的缺失、插入、非保守性或保守性取代或它們的聯(lián)合而不同于天然氨基酸序列的序列。例如，在IgG Fc中，已知對于結(jié)合重要的、位于位點214至238、297至299、318至322或327至331處的氨基酸殘基可用作修飾的適當靶目標。此外，其它各種衍生物也是有可能的，包括其中能形成二硫鍵的區(qū)域被刪除，或者天然Fc形式N末端的某些氨基酸殘基被除去或在此添加了甲硫氨酸殘基的衍生物。此外，為了去除效應(yīng)器功能，缺失可以發(fā)生在補體結(jié)合位點，諸如C1q結(jié)合位點和ADCC位點。制備這樣的免疫球蛋白Fc片段序列衍生物的技術(shù)參閱國際專利申請WO 97/34631和WO 96/32478。
蛋白質(zhì)和肽中通常不改變該蛋白質(zhì)或肽活性的氨基酸替換是本領(lǐng)域所已知的(H.Neurath，R.L.Hill，蛋白質(zhì)The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最通常發(fā)生的替換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，包括兩種方向上的替換。
此外，如果需要，F(xiàn)c片段可以通過磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙?；?、酰胺化等等作用被修飾。
上述Fc衍生物是具有與本發(fā)明Fc片段同樣的生物學(xué)活性或提高了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性(例如抗熱、pH等等)的衍生物。
此外，這些Fc片段可獲自從人和包括牛、山羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠和豚鼠在內(nèi)的其它動物中分離的天然形式，或可以是重組體或它們的衍生物，獲自被轉(zhuǎn)化的動物細胞或微生物。在此，它們可通過從人或動物體中分離完整的免疫球蛋白并用蛋白水解酶加以處理而從天然免疫球蛋白獲得。木瓜蛋白酶將天然的免疫球蛋白消化成Fab和Fc片段，而胃蛋白酶處理則導(dǎo)致了pF′c和F(ab′)2片段的產(chǎn)生?？蓪@些片段進行例如大小排阻層析，以分離Fc或pF′c。
優(yōu)選的，人源Fc片段是獲自微生物的重組免疫球蛋白Fc片段。
此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段可以是具有天然糖鏈、與天然形式相比糖鏈增加或與天然形式相比糖鏈減少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖鏈的增加、減少或去除可以通過本領(lǐng)域的通用方法完成，諸如化學(xué)法、酶促法和利用微生物的遺傳工程方法。將糖鏈從Fc片段中去除導(dǎo)致了它與第一補體成分C1的C1q部分的結(jié)合親和力明顯降低和抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)的降低或喪失，從而不會在體內(nèi)引起不必要的免疫應(yīng)答。在這點上，去糖基化或未糖基化形式的免疫球蛋白Fc片段可能更適于本發(fā)明作為藥物載體的目的。
用于此處時，術(shù)語“去糖基化”指從Fc片段中酶促除去了糖基部分，而術(shù)語“未糖基化”指Fc片段以非糖基化的形式由原核生物，優(yōu)選大腸桿菌所產(chǎn)生。
另一方面，免疫球蛋白Fc片段可來自人類或其它動物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠和豚鼠，優(yōu)選人類。此外，免疫球蛋白Fc片段可以是來自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc片段，或者通過它們的組合或雜合制備而來的Fc片段。優(yōu)選Fc片段來自IgG或IgM，它們是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)之一，最優(yōu)選來自IgG(已知它能延長配體結(jié)合蛋白質(zhì)的半壽期)。
另一方面，術(shù)語“組合”用于此處時是指編碼同一來源的單鏈免疫球蛋白Fc片段的多肽與不同來源的單鏈多肽連接形成二聚體或多聚體。即，二聚體或多聚體可以由IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc和IgG4 Fc片段中的兩種或多種片段所形成。
術(shù)語“雜合體”用于此處時指編碼不同來源的兩種或多種免疫球蛋白Fc片段的序列存在于單鏈免疫球蛋白Fc片段中。在本發(fā)明中，各種類型的雜合體都是有可能的。即，結(jié)構(gòu)域雜合體可以由IgG1Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc和IgG4 Fc的CH1、CH2、CH3和CH4中的一種至四種結(jié)構(gòu)域組成，且可能包含鉸鏈區(qū)。
另一方面，IgG被劃分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型，本發(fā)明包括它們的組合和雜合體。優(yōu)選IgG2和IgG4亞型，最優(yōu)選IgG4的Fc片段，它幾乎不具有諸如CDC(補體依賴型細胞毒性)等效應(yīng)器功能(參閱圖14和15)。
即，作為本發(fā)明的藥物載體，最優(yōu)選的免疫球蛋白Fc片段是人IgG4來源的非糖基化Fc片段。人源Fc片段比非人源Fc片段更為優(yōu)選，它可能在人體內(nèi)作為抗原起作用，并引起不期望有的免疫應(yīng)答，諸如產(chǎn)生抗該抗原的新抗體。
如上所述制備的本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段可用作藥物載體并與藥物形成綴合物。
術(shù)語“藥物綴合物”或“綴合物”用于此處時指一種或多種藥物與一種或多種免疫球蛋白Fc片段連接。
術(shù)語“藥物”用于此處時指在施用于人類或動物時展現(xiàn)出治療活性的物質(zhì)，例如，但不局限于多肽、化合物、提取物和核酸。優(yōu)選多肽藥物。
術(shù)語“生理學(xué)活性多肽”、“生理學(xué)活性蛋白質(zhì)”、“活性多肽”、“多肽藥物”和“蛋白質(zhì)藥物”用于此處時在其意義上是可互換的，其特征在于，它們都處于展示各種體內(nèi)生理學(xué)功能的生理學(xué)活性狀態(tài)。
多肽藥物具有不能長期保持生理學(xué)作用的缺點，這是由于其易被體內(nèi)存在的蛋白水解酶變性或降解的特性造成。不過，當多肽藥物與本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段相綴合而形成綴合物時，該藥物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性得以提高，降解半壽期也延長了。同樣，與Fc片段綴合的多肽與其它已知的多肽藥物制劑相比，其生理學(xué)活性的降低要小得多。因此，與常規(guī)多肽藥物的體內(nèi)生物利用率相比，依照本發(fā)明的多肽和免疫球蛋白Fc片段的綴合物的特征為具有顯著提高的體內(nèi)生物利用率。這一點也通過本發(fā)明的實施方案進行了清楚的闡述。即，與它們單獨綴合PEG或綴合PEG和白蛋白二者的常規(guī)形式相比，當與本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段連接時，IFNα、G-CSF、hGH和其它蛋白質(zhì)藥物呈現(xiàn)出體內(nèi)生物利用率提高了大約2至6倍(表8、9和10)。
另一方面，蛋白質(zhì)和本發(fā)明免疫球蛋白Fc片段之間的連接的特征在于，它不是通過常規(guī)的重組方法形成的融合體。通過重組方法獲得并用作藥物的免疫球蛋白Fc片段與活性多肽的融合形式是以如下方式得到的，即，將多肽與Fc片段的N末端或C末端連接，并由此從編碼該融合形式的核苷酸序列表達和折疊成單一多肽。
這導(dǎo)致了所產(chǎn)生的融合蛋白的活性顯著降低，因為蛋白質(zhì)作為生理學(xué)功能性物質(zhì)的活性是由蛋白質(zhì)的構(gòu)象決定的。因此，當多肽藥物通過重組方法與Fc融合時，即使融合蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高了，它對其體內(nèi)生物利用率也沒有影響。同樣，由于這樣的融合蛋白常常錯誤折疊并以包涵體形式表達，融合方法在蛋白質(zhì)產(chǎn)生和分離產(chǎn)率方面是不經(jīng)濟的。此外，當多肽的活性形式是糖基化形式時，多肽應(yīng)在真核細胞中表達。這種情況下，F(xiàn)c也被糖基化，而此糖基化可能引起體內(nèi)不適當?shù)拿庖邞?yīng)答。
也就是說，只有本發(fā)明有可能產(chǎn)生糖基化活性多肽和非糖基化免疫球蛋白Fc片段的綴合物，并克服所有上述問題，包括提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量，因為復(fù)合物的兩種組分是通過最佳體系單獨制備和分離的。
能與本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段綴合的蛋白質(zhì)藥物的非局限性例子包括人生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素和干擾素受體(例如干擾素-α、-β和-γ，水溶性I型干擾素受體，等)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰高血糖素樣肽(例如GLP-1等)、G-蛋白偶聯(lián)受體、白介素(例如白介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20-、21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30等)和白介素受體(例如IL-1受體、IL-4受體等)、酶(例如葡糖腦苷酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-半乳糖苷酶-A、agalsidaseα和β、α-L-iduronidase、丁酰膽堿酯酶、幾丁質(zhì)酶、谷氨酸脫羧酶、imiglucerase、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性內(nèi)肽酶、髓過氧化物酶、等)、白介素和細胞因子結(jié)合蛋白(例如IL-18bp、TNF結(jié)合蛋白，等)、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、變態(tài)反應(yīng)抑制物、細胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制物、轉(zhuǎn)移生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、載脂蛋白-E、促紅細胞生成素、高度糖基化的促紅細胞生成素、angiopoietins、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體激活肽、凝血調(diào)節(jié)蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子XIII、纖溶酶原活化因子、纖維蛋白結(jié)合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應(yīng)蛋白、腎素抑制物、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、leptin、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、制管張素、血管緊張素、骨生長因子、骨刺激蛋白質(zhì)、降鈣素、胰島素、心房肽激素(atriopeptin)、軟骨誘發(fā)因子、依降鈣素(elcatonin)、結(jié)締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、黃體生成素、黃體生成素釋放激素、神經(jīng)生長因子(如神經(jīng)生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、axogenesis因子-1、腦促尿鈉排泄肽、神經(jīng)膠質(zhì)來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子、netrin、neurophil抑制因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、neuturin等)、甲狀旁腺激素、松弛素、促胰液素(secretin)、生長調(diào)節(jié)素、胰島素樣生長因子、腎上腺皮質(zhì)激素、胰高血糖素、縮膽囊素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、促甲狀腺素、自分泌運動因子(autotaxin)、乳鐵蛋白、筒箭毒堿(myostatin)、受體(如TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受體、VEGF受體、B細胞活化因子受體，等)、受體拮抗劑(如IL1-Ra等)、細胞表面抗原(如CD2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69等)、病毒疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(如scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fd)和病毒衍生疫苗抗原。抗體片段可以是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd或scFv，它能結(jié)合特異的抗原，優(yōu)選Fab′。Fab片段包含輕鏈的可變區(qū)(VL)和恒定區(qū)(CL)以及重鏈的可變區(qū)(VH)和第一恒定區(qū)(CH1)。Fab′片段不同于Fab片段，它在CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加了包括來自鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸殘基在內(nèi)的數(shù)個氨基酸殘基。Fd片段只包含VH和CH1結(jié)構(gòu)域，而F(ab′)2片段則作為一對Fab′片段通過二硫鍵或化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生。scFv(單鏈Fv)片段包含通過肽連接物相互連接并因此存在于單一多肽鏈內(nèi)的VL和VH結(jié)構(gòu)域。
具體而言，優(yōu)選作為生理學(xué)活性多肽的是那些施用于個體以治療或預(yù)防疾病時需頻繁給藥的多肽，它們包括人生長激素、干擾素(干擾素-α、-β、-γ等)、粒細胞集落刺激因子、促紅細胞生成素(EPO)和抗體片段。此外，某些衍生物也包括在本發(fā)明生理學(xué)活性多肽的范圍內(nèi)，只要與天然形式的生理學(xué)活性多肽相比，它們具有基本上相同的或更優(yōu)越的功能、結(jié)構(gòu)、活性或穩(wěn)定性即可。在本發(fā)明中，最優(yōu)選的多肽藥物是干擾素-α。
除了多肽藥物之外，其它藥物也在本發(fā)明中可供利用。這些藥物的非局限性例子包括抗生素，選自以下抗生素的衍生物和混合物四環(huán)素、二甲胺四環(huán)素、強力霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、克拉化霉素、紅霉素、氯頭孢菌素、氨噻肟頭孢菌素、亞胺培南、青霉素、慶大霉素、鏈霉素、萬古霉素等；選自以下抗癌劑的衍生物和混合物的抗癌劑氨甲喋呤、碳鉑、紫杉酚、順氯氨鉑、5-氟尿嘧啶、阿霉素、依托泊甙、紫杉醇、camtotecin、阿糖胞苷等；抗炎劑，選自以下試劑的衍生物和混合物消炎痛、布洛芬、酮洛芬、吡氧噻嗪、probiprofen、雙氯芬酸等；抗病毒試劑，選自無環(huán)鳥苷和robavin的衍生物和混合物；以及抗菌劑，選自以下試劑的衍生物和混合物酮康唑、依曲康唑、氟康唑、兩性霉素B和灰黃霉素。
另一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段能形成通過接頭與藥物連接的綴合物。
這樣的接頭包括肽和非肽接頭。優(yōu)選的是非肽接頭，更優(yōu)選的是非肽聚合物。
術(shù)語“肽接頭”用于此處時指氨基酸，優(yōu)選1至20個氨基酸，它們通過肽鍵相互之間線性連接，且可以是糖基化形式的。就本發(fā)明的目的而言，優(yōu)選非糖基化形式的。這樣的肽接頭優(yōu)選具有甘氨酸和絲氨酸重復(fù)單元的肽，它對于T細胞無免疫學(xué)活性。
術(shù)語“非肽聚合物”用于此處時指包含通過除肽鍵之外的共價鍵彼此連接的兩個或多個重復(fù)單元的生物相容性聚合物。非肽聚合物的例子包括聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯醚、諸如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸乙醇酸)等生物可降解性聚合物、脂類聚合物、幾丁質(zhì)和透明質(zhì)酸。最優(yōu)選的是聚乙二醇(PEG)。
本發(fā)明的綴合物、免疫球蛋白Fc片段-藥物或免疫球蛋白Fc片段-接頭-藥物以多種摩爾比率制備。即，與單一多肽藥物連接的免疫球蛋白Fc片段和/或接頭的量是不受限制的。不過，優(yōu)選的，在本發(fā)明的藥物綴合物中，藥物與免疫球蛋白Fc片段以摩爾比率1∶1至10∶1相互綴合，優(yōu)選1∶1至2∶1。
此外，本發(fā)明免疫球蛋白Fc片段、某一接頭和某一藥物的連接包括除了Fc片段和多肽藥物通過遺傳重組以融合蛋白形式表達時形成的肽鍵之外的所有共價鍵，以及所有類型的非共價鍵，諸如氫鍵、離子相互作用、范德華力和疏水相互作用。不過，就藥物的生理學(xué)活性而言，連接優(yōu)選通過共價鍵形成。
此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段、某一接頭和某一藥物可在藥物的某一位點相互連接。另一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段和多肽藥物可彼此在N末端或C末端連接，優(yōu)選在游離基團處連接，免疫球蛋白Fc片段和藥物之間的共價鍵尤其容易在氨基末端、賴氨酸殘基的氨基、組氨酸殘基的氨基或游離的半胱氨酸殘基處形成。
另一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段、某一接頭和某一藥物的連接可能以確定的方向進行。即，接頭可連接于免疫球蛋白Fc片段的N末端、C末端或游離基團，也可連接于蛋白質(zhì)藥物的N末端、C末端或游離基團。當接頭是肽接頭時，連接可能發(fā)生在某一連接位點處。
此外，本發(fā)明的綴合物可以用本領(lǐng)域已知的許多偶聯(lián)劑中的任一種制備。偶聯(lián)劑的非局限性的例子包括1，1-二(疊氮乙?；?-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯，諸如與4-疊氮基水楊酸的酯、包括諸如3，3′-二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)等雙琥珀酰亞胺酯在內(nèi)的亞胺酯和諸如雙-N-馬來酰亞胺-1，8-辛烷等雙功能性馬來酰亞胺類。
另一方面，包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的本發(fā)明藥物組合物可通過多種途徑施用。
術(shù)語“施用”用于此處時指通過某一合適方法將預(yù)定量的物質(zhì)引入患者中。本發(fā)明的綴合物可通過任何常規(guī)途徑施用，只要它能到達預(yù)期組織即可。各種施用方式都在考慮范圍內(nèi)，包括腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、口服、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和直腸內(nèi)施用，但本發(fā)明并不局限于這些例證性的施用方式。不過，由于在口服給藥時肽會被消化，口服給藥組合物的活性成分應(yīng)被包裹或特殊配制以保護其在胃中免于降解。優(yōu)選的，本發(fā)明組合物可能以可注射的形式施用。此外，本發(fā)明的藥物組合物可用能將活性成分轉(zhuǎn)運入靶細胞的設(shè)備施用。
含有依照本發(fā)明的綴合物的藥物組合物可包含藥物可接受載體。對口服給藥而言，藥物可接受載體可包括粘合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、著色劑和芳香劑。對可注射制劑而言，藥物可接受載體可包括緩沖劑、保存劑(preserving agent)、止痛劑、增溶劑、等滲劑和穩(wěn)定劑。對于局部施用的制劑而言，藥物可接受載體可包括基質(zhì)、賦形劑、潤滑劑和保存劑。本發(fā)明的藥物組合物可與前述藥物可接受載體組合配制成各種劑型。例如，就口服而言，藥物組合物可以配制成片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿或干膠片。就可注射的制劑而言，藥物組合物可配制成單位劑型，諸如多劑量容器或單劑量形式的安瓿。藥物組合物也可配制成溶液、懸浮液、片劑、膠囊和長效制劑。
另一方面，適于藥物制劑的載體、賦形劑和稀釋液的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽(酯)、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羥基苯甲酸鹽(酯)、丙基羥基苯甲酸鹽(酯)、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外，藥物組合物可進一步包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、保濕劑、芳香劑、乳化劑和防腐劑。
與作為載體的本發(fā)明免疫球蛋白Fc片段組合的藥物真正劑量可能由數(shù)種相關(guān)因素決定，包括待治療疾病的類型、施用途徑、患者年齡、性別、體重和病情的嚴重程度以及作為活性組分的藥物的類型。由于本發(fā)明的藥物組合物在體內(nèi)具有很長的作用持續(xù)時間，所以它具有極大的降低治療藥物施用頻率的優(yōu)勢。
在另一方面，本發(fā)明的另一目的是提供通過包含免疫球蛋白Fc片段而延長了藥物的體內(nèi)持續(xù)時間的方法。
在本發(fā)明的另一實施方案中，生理學(xué)活性多肽-PEG-免疫球蛋白Fc片段綴合物具有比多肽-PEG復(fù)合物或多肽-PEG-白蛋白綴合物高得多的穩(wěn)定性。藥物代謝動力學(xué)分析顯示，與天然IFNα相比，當與40-kDa PEG連接時(IFNα-40K PEG復(fù)合物)，IFNα的血清半壽期提高了大約20倍，而在IFNα-PEG-白蛋白綴合物中則提高了大約10倍。相反，依照本發(fā)明的IFNα-PEG-Fc綴合物顯示出半壽期顯著增加大約50倍(見表3)。此外，同樣的結(jié)果可在其它靶蛋白、人生長激素(hGH)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和其衍生物(17S-G-CSF)以及促紅細胞生成素(EPO)中觀察到。與蛋白質(zhì)的天然形式以及綴合了PEG或PEG-白蛋白的形式相比，依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)綴合物(其中各包含與PEG-Fc連接的靶蛋白)顯示出平均停留時間(mean residence time，MRT)和血清半壽期延長了大約10倍(見表4至7)。
此外，當PEG-Fc復(fù)合物與接近Fab′C末端或Fab′的N末端的-SH基團連接時，產(chǎn)生的Fab’-PEG-Fc綴合物呈現(xiàn)出比40K PEG-Fab’復(fù)合物長2到3倍的血清半壽期(見圖12)。
此外，當?shù)鞍踪|(zhì)綴合物是用去糖基化免疫球蛋白Fc(DG Fc)(其中糖基部分已被去除)和重組的非糖基化免疫球蛋白Fc(AG Fc)衍生物制備的時候，它們的血漿半壽期和體外活性維持在與用天然Fc制備的蛋白質(zhì)綴合物相似的水平(見表3和圖8和11)。
因此，由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)綴合物具有延長的血清半壽期和平均停留時間(MRT)，當它們被應(yīng)用于包括人生長激素、干擾素、促紅細胞生產(chǎn)素、集落刺激因子或其衍生物和抗體衍生物在內(nèi)的各種生理學(xué)活性多肽時，它們可用于開發(fā)多種生理學(xué)活性多肽的長效制劑。
從以下實施例中可以更好的理解本發(fā)明，這些實施例的提出只是為了舉例說明，而不應(yīng)被認為是對本發(fā)明的限制。
實施例1IFNα-PEG-免疫球蛋白Fc片段綴合物的制備I<步驟1>用免疫球蛋白制備免疫球蛋白Fc片段免疫球蛋白Fc片段制備如下。將溶于10mM磷酸鹽緩沖液中的200mg 150-kDa免疫球蛋白G(IgG)(Green Cross，Korea)用2mg蛋白水解酶——木瓜蛋白酶(Sigma)在37℃溫和攪拌處理2小時。酶反應(yīng)后，對由此再生的免疫球蛋白Fc片段依次用Superdex柱、蛋白A柱和陽離子交換柱進行層析純化。具體的說，就是將反應(yīng)液加到用10mM磷酸鈉緩沖液(PBS，pH 7.3)平衡過的Superdex 200柱(Pharmacia)上，將柱子用同一緩沖液以流速1ml/分鐘洗脫。與免疫球蛋白Fc片段相比具有相對較高分子量的未反應(yīng)免疫球蛋白分子(IgG)和F(ab′)2由于其洗脫早于Ig Fc片段的特性而被除去。分子量近似于Ig Fc片段的Fab片段通過蛋白A柱層析除去(圖1)。將洗脫自Superdex 200柱的含Ig Fc片段的所得級分以5ml/分鐘的流速加到用20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)平衡的蛋白A柱(Pharmacia)上，用同一緩沖液洗柱，以去除未結(jié)合在柱上的蛋白質(zhì)。然后，用100mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0)洗脫蛋白A柱，以獲得高純度的免疫球蛋白Fc片段。最后用陽離子交換柱(polyCAT，PolyLCCompany)純化從蛋白A柱收集的Fc級分，其中上樣了Fc級分的該柱子用10mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)中的0.15-0.4M NaCl線性梯度洗脫，從而提供了高純度的Fc級分。用12％SDS-PAGE分析該高純度的Fc級分(圖2中的泳道2)。
<步驟2>IFNα-PEG復(fù)合物的制備將兩端具有醛反應(yīng)性基團的3.4-kDa聚乙二醇ALD-PEG-ALD(Shearwater)與以5mg/ml的量溶于100mM磷酸鹽緩沖液中的人干擾素α-2b(hIFNα-2b，MW20kDa)以IFNα∶PEG摩爾比率1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10和1∶20混合。向此混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉(NaCNBH3，Sigma)并在溫和攪拌下在4℃反應(yīng)3小時，使PEG與干擾素α的氨基末端連接。為了得到PEG和干擾素α的1∶1復(fù)合物，將反應(yīng)混合物用SuperdexR柱(Pharmacia)進行大小排阻層析。用10mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)作為洗脫緩沖液將IFNα-PEG復(fù)合物從柱上洗脫下來，而未與PEG連接的干擾素α、未反應(yīng)的PEG以及PEG與兩個干擾素α分子連接的二聚體副產(chǎn)物則被去除。將純化的IFNα-PEG復(fù)合物濃縮至5mg/ml。通過此實驗，發(fā)現(xiàn)具有最高反應(yīng)性且產(chǎn)生最小量諸如二聚體等副產(chǎn)物的IFNα∶PEG最佳反應(yīng)摩爾比率是1∶2.5至1∶5。
<步驟3>IFNα-PEG-Fc綴合物的制備為了將上述步驟2中純化的IFNα-PEG復(fù)合物與免疫球蛋白Fc片段的N末端連接，將以上步驟1中制備的免疫球蛋白Fc片段(約53kDa)溶于10mM磷酸鹽緩沖液中并以IFNα-PEG復(fù)合物∶Fc的摩爾比率1∶1、1∶2、1∶4和1∶8與I FNα-PEG復(fù)合物混合。在將反應(yīng)溶液的磷酸鹽緩沖液濃度調(diào)節(jié)到100mM之后，將還原劑NaCNBH3加入反應(yīng)液中，終濃度20mM，在溫和攪拌下于4℃反應(yīng)20小時。通過此實驗，發(fā)現(xiàn)具有最高反應(yīng)性且產(chǎn)生最少量的諸如二聚體等副產(chǎn)物的IFNα-PEG復(fù)合物∶Fc的最佳反應(yīng)摩爾比率是1∶2。
<步驟4>IFNα-PEG-Fc conjugate綴合物的分離和純化在以上步驟3的反應(yīng)之后，對反應(yīng)混合物進行Superdex大小排阻層析，以去除未反應(yīng)的物質(zhì)和副產(chǎn)物，并純化所產(chǎn)生的IFNα-PEG-Fc蛋白綴合物。將反應(yīng)混合物濃縮并加到Superdex柱上之后，使10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)以2.5ml/分鐘的流速通過柱子，以去除未結(jié)合的Fc和未反應(yīng)的物質(zhì)，隨后進行柱子洗脫，收集IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物部分。由于所收集到的IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物級分包含小量的雜質(zhì)、未反應(yīng)的Fc和干擾素α二聚體，進行陽離子交換層析以去除雜質(zhì)。將IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物級分加到用10mM乙酸鈉(pH 4.5)平衡的PolyCAT LP柱(PolyLC)上，并用1M NaCl在10mM乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)中的0-0.5M NaCl線性梯度洗脫柱子。最后，用陰離子交換柱純化IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物。將IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物部分加到用10mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡的PolyWAX LP柱(PolyLC)上，然后用1M NaCl在10mM Tris-HCl(pH 7.5)中的0-0.3M NaCl線性梯度洗脫柱子，從而分離高純度形式的IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物。
實施例2IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物的制備II<步驟1>Fc-PEG復(fù)合物的制備將兩端具有醛反應(yīng)性基團的3.4-kDa聚乙二醇ALD-PEG-ALD(Shearwater)與以15mg/ml的量溶于100mM磷酸鹽緩沖液中的實施例1步驟1中所制備的免疫球蛋白Fc片段按Fc∶PEG摩爾比率1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10和1∶20混合。在此混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉(NaCNBH3，Sigma)，并在溫和攪拌下使之于4℃反應(yīng)3小時。為了得到PEG和Fc的1∶1復(fù)合物，將反應(yīng)混合物用SuperdexR柱(Pharmacia)進行大小排阻層析。用10mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)作為洗脫液將Fc-PEG復(fù)合物從柱上洗脫下來，而未與PEG連接的免疫球蛋白Fc片段、未反應(yīng)的PEG以及PEG與兩個免疫球蛋白Fc片段分子連接的二聚體副產(chǎn)物則被去除。將純化的Fc-PEG復(fù)合物濃縮至大約15mg/ml。通過此實驗，發(fā)現(xiàn)具有最高反應(yīng)性且產(chǎn)生最小量諸如二聚體等副產(chǎn)物的Fc∶PEG最佳反應(yīng)摩爾比率是1∶3至1∶10。
<步驟2>Fc-PEG復(fù)合體和干擾素α的綴合物的形成和純化為了將上述步驟1中純化的Fc-PEG復(fù)合物與IFNα的N末端連接，將Fc-PEG復(fù)合物與溶于10mM磷酸鹽緩沖液的IFNα以Fc-PEG復(fù)合物∶IFNα的摩爾比率1∶1、1∶1.5、1∶3和1∶6混合。在將反應(yīng)溶液中的磷酸鹽緩沖液濃度調(diào)節(jié)到100mM之后，將還原劑NaCNBH3加入反應(yīng)液中，終濃度20mM，使之在溫和攪拌下于4℃反應(yīng)20小時。反應(yīng)完成后，依照實施例1步驟4中同樣的純化方法將未反應(yīng)的物質(zhì)和副產(chǎn)物去除，從而分離高純度形式的Fc-PEG-IFNα蛋白質(zhì)綴合物。
實施例3hGH-PEG-Fc綴合物的制備依照與實施例1相同的方法制備和純化hGH-PEG-Fc綴合物，不同之處在于使用除干擾素α之外的藥物-人生長激素(hGH，MW∶22kDa)，并且hGH∶PEG的摩爾比率是1∶5。
實施例4(G-CSF)-PEG-Fc綴合物的制備依照與實施例1相同的方法制備和純化(G-CSF)-PEG-Fc綴合物，不同之處在于使用干擾素α之外的藥物-人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，并且G-CSF∶PEG的摩爾比率是1∶5。
另一方面，利用在天然hG-CSF的第17位氨基酸殘基處具有絲氨酸取代的G-CSF衍生物17S-G-CSF，依照上述相同的方法制備和純化17S-G-CSF-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物。
實施例5EPO-PEG-Fc綴合物的制備依照與實施例1相同的方法制備和純化EPO-PEG-Fc綴合物，不同之處在于使用了干擾素α之外的藥物-人促紅細胞生成素(EPO)，并且EPO∶PEG的摩爾比率是1∶5。
實施例6用具有不同反應(yīng)性基團的PEG制備蛋白質(zhì)綴合物用兩端具有丙酸琥珀酰亞胺酯(SPA)反應(yīng)性基團的PEG制備IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物，步驟如下。將3.4-kDa聚乙二醇SPA-PEG-SPA(Shearwater)與溶于100mM磷酸鹽緩沖液中的10mg干擾素α以IFNα∶PEG摩爾比率1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10和1∶20混合。然后使混合物在溫和攪拌下于室溫反應(yīng)2小時。為了獲得PEG和干擾素α的1∶1復(fù)合物(IFNα-PEG復(fù)合物)(其中PEG選擇性的與干擾素α的賴氨酸殘基的氨基連接)，對反應(yīng)混合物進行Superdex大小排阻層析。用10mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)作為洗脫緩沖液從柱上洗脫IFNα-PEG復(fù)合物，未連接PEG的干擾素α、未反應(yīng)的PEG以及其中兩個干擾素α分子與PEG兩端連接的二聚體副產(chǎn)物被去除。為了將IFNα-PEG復(fù)合物與免疫球蛋白Fc的賴氨酸殘基的氨基連接，將純化的IFNα-PEG復(fù)合物濃縮至約5mg/ml，并依照實施例1步驟3和4中相同的方法制備和純化IFNα-PEG-Fc綴合物。通過此實驗，發(fā)現(xiàn)具有最高反應(yīng)性且產(chǎn)生最少量諸如二聚體等副產(chǎn)物的最佳IFNα∶PEG反應(yīng)摩爾比例是1∶2.5至1∶5。
另一方面，依照上述相同方法，利用在兩端都具有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應(yīng)性基團的PEG即NHS-PEG-NHS(Shearwater)或兩端都具有丁醛反應(yīng)性基團的PEG即BUA-PEG-BUA(Shearwater)制備另一種IFNα-PEG-Fc綴合物。
實施例7用具有不同分子量的PEG制備蛋白質(zhì)綴合物用兩端具有醛反應(yīng)性基團的10-kDa聚乙二醇即ALD-PEG-ALD(Shearwater)制備IFNα-10K PEG復(fù)合物。依照實施例1步驟2中相同的方法制備和純化此復(fù)合物。通過此實驗，發(fā)現(xiàn)具有最高反應(yīng)性且產(chǎn)生最少量諸如二聚體等副產(chǎn)物的最佳IFNα10-kDa PEG反應(yīng)摩爾比率是1∶2.5至1∶5。將純化的IFNα-10K PEG復(fù)合物濃縮至大約5mg/ml，并用此濃度依照實施例1步驟3和4中相同的方法制備和純化IFNα-10K PEG-Fc綴合物。
實施例8Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物(-SH基團)的制備<步驟1>Fab’的表達和純化將表達抗腫瘤壞死因子αFab’的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株BL21/poDLHF(保藏號KCCM-10511)在100ml LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，接種于5-L的發(fā)酵罐(Marubishi)中，并在30℃以500rpm轉(zhuǎn)數(shù)和20vvm空氣流速進行培養(yǎng)。為了補充發(fā)酵期間細菌生長所需的不足營養(yǎng)物，根據(jù)細菌的發(fā)酵狀態(tài)在培養(yǎng)物中補充葡萄糖和酵母提取物。當培養(yǎng)物達到OD600值為80-100時，在培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)劑IPTG以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達。將培養(yǎng)物進一步培養(yǎng)40到45小時，直至600nm的OD值提高到120至140。將由此獲得的發(fā)酵液以20,000×g離心30分鐘。收集上清，棄沉淀。
對上清液進行以下三步柱層析以純化抗腫瘤壞死因子αFab’。將上清液加到用20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)平衡的HiTrap蛋白G柱(5ml，Pharmacia)上，并用100mM甘氨酸(pH 3.0)洗脫柱子。然后將收集到的Fab’級分加到用10mM磷酸鈉緩沖液(PBS，pH 7.3)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia)上，并用相同的緩沖液洗脫此柱子。最后，將第二步的Fab’級分加到polyCAT 21×250柱(PolyLC)上，并用10mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)中的0.15-0.4M NaCl線性梯度洗脫柱子，從而提供高純度的抗腫瘤壞死因子αFab’級分。
<步驟2>Fc-PEG復(fù)合物的制備和純化為了將PEG接頭連接到免疫球蛋白Fc的N-末端，將依照實施例1步驟1中同一種方法制備的免疫球蛋白Fc溶于100mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，終濃度5mg/ml，并以Fc∶PEG摩爾比率1∶10與NHS-PEG-MAL(3.4kDa，Shearwater)混合，隨后在溫和攪拌下于4℃保溫12小時。
反應(yīng)完成后，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)置換反應(yīng)緩沖液以去除未結(jié)合的NHS-PEG-MAL。然后，將反應(yīng)混合物加到polyCAT柱(PolyLC)上。用20mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的0.15-0.5M線性NaCl梯度洗脫柱子。在洗脫過程中，免疫球蛋白Fc-PEG復(fù)合物早于未反應(yīng)的免疫球蛋白Fc而洗脫下來，而未反應(yīng)的Ig Fc稍后被洗脫，從而除去了未反應(yīng)的Ig Fc分子。
<步驟3>Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物(-SH基團)的制備和純化為了將免疫球蛋白Fc-PEG復(fù)合物連接至Fab’的半胱氨酸基團處，將上述步驟1中純化的Fab’以2mg/ml的濃度溶于100mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.3)中，并與上述步驟2中制備的免疫球蛋白Fc-PEG復(fù)合物以Fab’∶復(fù)合物摩爾比例1∶5混合。將反應(yīng)混合物濃縮至終濃度50mg/ml，并在溫和攪拌下于4℃保溫24小時。
反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加到用10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.3)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia)上，并用同樣的緩沖液以1ml/分鐘的流速洗脫柱子。被偶聯(lián)的Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物由于其高分子量而相對較早地洗脫下來，而未反應(yīng)的免疫球蛋白Fc-PEG復(fù)合物和Fab’則在稍后被洗脫下來，從而除去了未反應(yīng)的分子。為了完全除去未反應(yīng)的免疫球蛋白Fc-PEG，將收集的Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物級分再加到polyCAT 21×250柱(PolyLC)上，并用20mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的0.15-0.5M線性NaCl梯度洗脫柱子，由此得到含有與接近Fab’C末端的-SH基團連接的Fc-PEG復(fù)合物的純Fab’-S-PEG-N-Fc綴合物。
實施例9Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物(N-末端)的制備<步驟1>Fab’-PEG復(fù)合物(N-末端)的制備和純化將實施例8步驟1中純化的40mg Fab’以5mg/ml的濃度溶于100mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)中，以Fab’∶PEG摩爾比率1∶5與丁基ALD-PEG-丁基ALD(3.4kDa，Nektar)混合。將還原劑NaCNBH3加到反應(yīng)混合物中，終濃度20mM，然后在溫和攪拌下使反應(yīng)混合物在4℃反應(yīng)2小時。
在反應(yīng)完成后，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)置換反應(yīng)緩沖液。然后，將反應(yīng)混合物加到polyCAT柱(PolyLC)上。用20mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)中的0.15-0.4M線性NaCl梯度洗脫柱子。在柱洗脫過程中，含有與Fab’N末端連接的PEG的Fab’-PEG復(fù)合物早于未反應(yīng)的Fab’被洗脫下來，而未反應(yīng)的Fab’稍后被洗脫下來，從而除去了未反應(yīng)的Fab’分子。
<步驟2>Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物的制備和純化為了將以上步驟1中純化的Fab’-PEG復(fù)合物與免疫球蛋白Fc的N末端連接，將Fab’-PEG復(fù)合物以10mg/ml的濃度溶于100mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)中，并與溶于相同緩沖液中的免疫球蛋白Fc以Fab’-PEG復(fù)合物∶Fc摩爾比率1∶5混合。在反應(yīng)混合物濃縮至蛋白質(zhì)終濃度50mg/ml后，將還原劑NaCNBH3加入反應(yīng)混合物中，終濃度為20mM，然后在溫和攪拌下使反應(yīng)混合物在4℃反應(yīng)24小時。
反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加到用10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.3)平衡的Superdex 200柱(Phamacia)上，并用相同緩沖液以1ml/分鐘的流速洗脫柱子。被偶聯(lián)的Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物由于其高分子量而被相對較早地洗脫下來，而未反應(yīng)的免疫球蛋白Fc和Fab’-PEG復(fù)合物則在稍后被洗脫下來，從而除去了未反應(yīng)的分子。為了完全除去未反應(yīng)的免疫球蛋白Fc分子，將收集的Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物級分再加到polyCAT 21×250柱(PolyLC)上，并用20mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的0.15-0.5M線性NaCl梯度洗脫柱子，由此得到含有與Fab’N末端連接的免疫球蛋白Fc-PEG復(fù)合物的純Fab’-N-PEG-N-Fc綴合物。
實施例10去糖基化免疫球蛋白Fc的制備和純化將根據(jù)實施例1中的相同方法制備的200mg免疫球蛋白Fc以濃度2mg/ml溶于100mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)中，并與300U/mg去糖基化酶PNGase F(NEB)混合。使反應(yīng)混合物在溫和攪拌下于37℃反應(yīng)24小時。然后，為了純化去糖基化的免疫球蛋白Fc，將反應(yīng)混合物加到SP Sepharose FF柱(Pharmacia)上，然后用1M NaCl在10mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)中的0.1-0.6M線性NaCl梯度洗脫柱子。天然免疫球蛋白Fc較早地洗脫下來，而去糖基化免疫球蛋白Fc(DG Fc)則稍后被洗脫下來。
實施例11IFNα-PEG-DG Fc綴合物的制備為了將實施例10中制備的去糖基化免疫球蛋白Fc與實施例1步驟2中純化的IFNα-PEG復(fù)合物連接，將IFNα-PEG復(fù)合物與溶于10mM磷酸鹽緩沖液中的DG Fc以IFNα-PEG復(fù)合物∶DG Fc摩爾比例1∶1、1∶2、1∶4和1∶8混合。在將反應(yīng)溶液的磷酸鹽緩沖液濃度調(diào)節(jié)到100mM后，將還原劑NaCNBH3以20mM的終濃度加到反應(yīng)溶液中，并在溫和攪拌下使其在4℃反應(yīng)20小時。通過此實驗，發(fā)現(xiàn)具有最高反應(yīng)性且產(chǎn)生最少量諸如二聚體等副產(chǎn)物的最佳反應(yīng)摩爾比例IFNα-PEG復(fù)合物DG Fc是1∶2。
在偶聯(lián)反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物用SuperdexR柱(Pharmacia)進行大小排阻層析，以去除未反應(yīng)的物質(zhì)和副產(chǎn)物，并純化IFNα-PEG-DGFc蛋白質(zhì)綴合物。在將反應(yīng)混合物加到柱子上后，使磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)以2.5ml/分鐘的流速通過柱子，以去除未結(jié)合的DG Fc和未反應(yīng)的物質(zhì)，隨后柱洗脫，以收集IFNα-PEG-DG Fc蛋白質(zhì)綴合物級分。由于所收集到的IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物級分包含小量的雜質(zhì)、未反應(yīng)的DG Fc和IFNα-PEG復(fù)合物，進行陽離子交換層析以去除雜質(zhì)。將IFNα-PEG-DG Fc蛋白質(zhì)綴合物級分加到用10mM乙酸鈉(pH 4.5)平衡的PolyCAT LP柱(PolyLC)上，并用1M NaCl在10mM乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)中的0-0.6M NaCl線性梯度洗脫柱子。最后，用陰離子交換柱純化IFNα-PEG-DG Fc蛋白質(zhì)綴合物。將IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物級分加到用10mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡的PolyWAXLP柱(PolyLC)上，然后用1M NaCl在10mM Tris-HCl(pH 7.5)中的0-0.3M NaCl線性梯度洗脫柱子，從而分離高純度形式的IFNα-PEG-DG Fc蛋白質(zhì)綴合物。
實施例12重組非糖基化免疫球蛋白Fc衍生物的制備和純化<IgG4Fc衍生物1表達載體的制備>
為了制備人免疫球蛋白IgG4重鏈恒定區(qū)，先制備了在天然鉸鏈區(qū)氨基末端具有9個氨基酸缺失的第一種衍生物(IgG4 delta-Cys)和由于鉸鏈區(qū)所有12個氨基酸都被缺失而缺少鉸鏈區(qū)的第二種衍生物(IgG4單體)。利用了本發(fā)明的發(fā)明者在本發(fā)明前研發(fā)的含大腸桿菌分泌序列的表達載體pT14S1SH-4T20V22Q(Korean Pat.No.38061)。
為了得到人免疫球蛋白IgG4重鏈恒定區(qū)，用分離自人血液細胞的RNA作為模板進行RT-PCR，步驟如下。首先，用Qiamp RNA血液試劑盒(Qiagen)從大約6ml血液中分離總RNA，以此總RNA為模板用One-Step RT-PCR試劑盒(Qiagen)進行基因擴增。在此PCR中，使用了SEQ ID Nos.1和2代表的一對合成引物以及SEQ ID Nos.2和3代表的另一對合成引物。SEQ ID NO.1是起始自IgG4鉸鏈區(qū)如下12個氨基酸殘基中的第10個殘基絲氨酸的核苷酸序列。SEQ ID NO.3被設(shè)計成編碼以丙氨酸作為第一個氨基酸殘基的CH2結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。SEQ ID NO.2被設(shè)計成具有含終止密碼的BamHI識別位點。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc ccactc agg ttt ata cca ggg ggt acg ggt agt acg ggtGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro為了將各個已擴增的IgG4恒定區(qū)片段克隆入含大腸桿菌分泌序列衍生物的表達載體中，利用了本發(fā)明的發(fā)明者在本發(fā)明之前研發(fā)的pT14S1SH-4T20V22Q(Korean Pat.No.38061)。此表達載體包含具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的熱穩(wěn)定性腸毒素分泌序列衍生物。為了便于克隆，用SEQ ID Nos.5和6表示的一對引物，通過定位誘變將StuI識別位點插入pT14S1SH-4T20V22Q質(zhì)粒的大腸桿菌熱穩(wěn)定性腸毒素分泌序列衍生物的一端，以引發(fā)誘變，從而在編碼分泌序列最后一個氨基酸殘基的核苷酸序列處引入成功插入了StuI位點。通過DNA測序發(fā)現(xiàn)成功插入了StuI位點。所產(chǎn)生的含StuI位點的pT14S1SH-4T20V22Q質(zhì)粒被稱為pmSTII。用StuI和BamHI處理pmSTII質(zhì)粒并進行瓊脂糖凝膠電泳，純化含大腸桿菌熱穩(wěn)定性腸毒素分泌序列衍生物的大片段(4.7kb)。然后，用BamHI消化已擴增的基因片段，并與線性化的表達載體連接，由此產(chǎn)生了pSTIIdCG4Fc和pSTIIG4Mo。
將最終的表達載體單獨轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體被稱為“BL21/pSTIIdCG4Fc(HM10932)”和“BL21/pSTIIdCG4Mo(HM10933)”，它們在2004年9月15日保藏于韓國微生物培養(yǎng)中心(KCCM)，指定的保藏號分別是KCCM-10597和KCCM-10598。其后，當培養(yǎng)物達到OD600值為80時，將誘導(dǎo)劑IPTG加到培養(yǎng)物中以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。將培養(yǎng)物進一步培養(yǎng)40到45小時，直至600nm的OD值增加到100至120。破碎自發(fā)酵液收集的大腸桿菌細胞，對產(chǎn)生的細胞裂解物進行兩步柱層析，以純化存在于大腸桿菌胞質(zhì)中的重組免疫球蛋白恒定區(qū)衍生物。
用PBS平衡5ml蛋白-A親和柱(Pharmacia)，將細胞裂解物以5ml/分鐘的流速加到柱子上。未被結(jié)合的蛋白質(zhì)用PBS洗出，而已結(jié)合的蛋白質(zhì)則用100mM檸檬酸鹽(pH 3.0)洗脫。對收集到的級分通過HiPrep 26/10脫鹽柱(Pharmacia)用10mM Tris緩沖液(pH8.0)脫鹽。然后，用50ml Q HP 26/10柱(Pharmacia)進行二次陰離子交換柱層析。將初步純化的重組非糖基化免疫球蛋白Fc級分加到Q-Sepharose HP 26/10柱上，用10mM Tris緩沖液(pH 8.0)中的0-0.2M NaCl線性梯度洗脫柱子，從而得到高純度的重組非糖基化免疫球蛋白Fc(AG Fc)衍生物、IgG4 delta-Cys和高純度的IgG4單體級分。
實施例13IFNα-PEG復(fù)合物和重組AG Fc衍生物的綴合體的制備依照與實施例1和11中相同的方法，將IFNα-PEG復(fù)合物與實施例12中作為AG Fc衍生物制備的IgG4 delta-Cys的N末端連接。偶聯(lián)反應(yīng)后，將未反應(yīng)的物質(zhì)和副產(chǎn)物從反應(yīng)混合物中去除，由此產(chǎn)生的IFNα-PEG-AG Fc蛋白質(zhì)綴合物(I)首先用50ml Q HP 26/10柱(Pharmacia)純化，然后進一步用polyCAT 21.5×250柱(polyLC)通過高壓液相層析試驗進行純化，由此高度純化所述綴合物。用10mMTris緩沖液(pH 8.0)通過HiPrep 26/10脫鹽柱(Pharmacia)對偶聯(lián)反應(yīng)溶液進行脫鹽。然后，將反應(yīng)溶液以流速8ml/分鐘加到50ml QHP 26/10柱(Pharmacia)上，并用0-0.2M的線性NaCl梯度洗脫此柱子，以獲得預(yù)期的級分。將收集到的級分以流速15ml/分鐘再加到用10mM乙酸鹽緩沖液(pH 5.2)平衡的polyCAT 21.5×250柱上，用0.1-0.3M的線性NaCl梯度洗脫此柱子，由此提供高度純化的級分。依照與上述相同的方法，用實施例12中制備的另一種AG Fc衍生物IgG4單體制備另一種IFNα-PEG-AG Fc蛋白質(zhì)綴合物(II)。
實施例14EPO-PEG-重組AG Fc衍生物綴合體的制備依照與實施例13中相同的方法，通過將AG Fc衍生物IgG4delta-Cys與EPO-PEG復(fù)合物連接而制備EPO-PEG-重組AG Fc衍生物綴合體。
比較實施例1IFNα-40K PEG復(fù)合物的制備將5mg干擾素α溶于100mM磷酸鹽緩沖液中，達到終體積5ml，并與40-kDa活化的甲氧基-PEG-醛(Shearwater)混合，IFNα∶40-kDa PEG的摩爾比例是1∶4。向此混合物中，加入終濃度20mM的還原劑NaCNBH3，并在溫和攪拌下使其在4℃反應(yīng)18小時。為了滅活不與IFNα反應(yīng)的PEG，將乙醇胺以50mM的終濃度加到反應(yīng)混合物中。
用Sephadex G-25柱(Pharmacia)除去未反應(yīng)的PEG，并用另一種緩沖液置換原緩沖液。首先，用兩倍柱體積(CV)的10mMTris-HCl緩沖液(pH 7.5)平衡此柱子，然后加反應(yīng)混合物上樣。通過用UV分光光度計測定260nm處的吸收值來檢測流過液。當柱子用同一種緩沖液洗脫時，因在N末端加入PEG而被修飾具有較高分子量的干擾素α較早被洗脫下來，而未反應(yīng)的PEG則較晚被洗脫下來，從而可以只分離IFNα-40K PEG。
進行以下層析以進一步從收集的級分中純化IFNα-40K PEG復(fù)合物。用10mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡3ml PolyWAX LP柱(PolyLC)。將收集到的含有IFNα-40K PEG復(fù)合物的級分以流速1ml/分鐘加樣到柱子上，用15ml平衡緩沖液洗脫柱子。然后，用30ml 1M NaCl以0-100％的線性NaCl梯度洗脫柱子，由此順序洗脫與三-、二-和單-PEG綴合的干擾素α。為了進一步純化單-PEG-綴合的干擾素α，對收集到的含有單-PEG-綴合干擾素α的級分進行大小排阻層析。將級分濃縮并加樣到用10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia)上，用相同緩沖液以流速1ml/分鐘洗脫柱子。三和二-PEG-綴合的干擾素α分子由于其早于單-PEG-綴合的干擾素α被洗脫下來的特性而被去除，從而以高純度形式分離出單-PEG-綴合的干擾素α。
依照上述同一種方法，將40-kDa PEG與人生長激素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和G-CSF衍生物的N末端綴合，從而得到hGH-40K PEG、G-CSF-40K PEG和40K PEG-17S-G-CSF衍生物復(fù)合物。
比較實施例2IFNα-PEG-白蛋白綴合物的制備為了將實施例1步驟2中純化的IFNα-PEG復(fù)合物與白蛋白的N末端連接，將IFNα-PEG復(fù)合物與溶于10mM磷酸鹽緩沖液中的人血清白蛋白(HSA，約67kDa，Green Cross)以IFNα-PEG復(fù)合物白蛋白摩爾比例1∶1、1∶2、1∶4和1∶8混合。將反應(yīng)溶液中的磷酸鹽緩沖液濃度調(diào)節(jié)到100mM后，將還原劑NaCNBH3以終濃度20mM加到反應(yīng)液中，并在溫和攪拌下使其在4℃反應(yīng)20小時。通過此實驗，發(fā)現(xiàn)具有最高反應(yīng)性且產(chǎn)生最少量諸如二聚體等副產(chǎn)物的最佳反應(yīng)摩爾比例IFNα-PEG復(fù)合物∶白蛋白是1∶2。
在偶聯(lián)反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物用SuperdexR柱(Pharmacia)進行大小排阻層析，以去除未反應(yīng)的物質(zhì)和副產(chǎn)物，并純化所產(chǎn)生的IFNα-PEG-白蛋白蛋白質(zhì)綴合物。在將反應(yīng)混合物濃縮并加樣到柱子上后，使10mM乙酸鈉緩沖液以2.5ml/分鐘的流速通過柱子，以去除未結(jié)合的白蛋白和未反應(yīng)的物質(zhì)，隨后進行柱洗脫，以僅僅純化IFNα-PEG-白蛋白蛋白質(zhì)綴合物。由于所收集到的IFNα-PEG-白蛋白蛋白質(zhì)綴合物級分包含小量的雜質(zhì)、未反應(yīng)的白蛋白和干擾素α二聚體，故進行陽離子交換層析以去除雜質(zhì)。將IFNα-PEG-白蛋白蛋白質(zhì)綴合物級分加樣到用10mM乙酸鈉(pH 4.5)平衡的SP5PW柱(Waters)上，并用1M NaCl在10mM乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)中的0-0.5M NaCl線性梯度洗脫，從而分離高純度形式的IFNα-PEG-白蛋白蛋白質(zhì)綴合物。
依照上述同一種方法，將白蛋白與人生長激素、G-CSF和G-CSF衍生物綴合，從而提供hGH-PEG-白蛋白、G-CSF-PEG-白蛋白和17S-G-CSF-PEG-白蛋白綴合物。
比較實施例3Fab’-S-40K PEG復(fù)合物的制備通過在活化緩沖液(20mM乙酸鈉(pH 4.0)，0.2mM DTT)中保溫1小時激活實施例8步驟1中純化的Fab’的游離半胱氨酸殘基。用PEG修飾緩沖液置換所述緩沖液后，將50mM磷酸鉀(pH 6.5)、馬來酰亞胺-PEG(MW40kDa，Shearwater)以Fab’40-kDa PEG摩爾比例1∶10加到其中，并在溫和攪拌下在4℃反應(yīng)24小時。
反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液加到用10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.3)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia)上，用相同緩沖液以流速1ml/分鐘洗脫柱子。被Fab’綴合的40-kDa PEG(Fab’-40K PEG)由于其高分子量而相對較早地洗脫下來，而未反應(yīng)的Fab’則稍后洗脫下來，從而去除了未反應(yīng)的Fab’。為了完全去除未反應(yīng)的Fab’，再次將收集到的Fab’-40K PEG復(fù)合物級分加樣到polyCAT 21×250柱(PolyLC)上，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH 4.5)中的0.15-0.5M線性NaCl梯度洗脫此柱，從而提供了含有與Fab’的-SH基團連接的40-kDa PEG的純Fab’-S-40K PEG復(fù)合物。
實驗實施例1蛋白質(zhì)綴合物的鑒定和定量分析<1-1>蛋白質(zhì)綴合物的鑒定用4-20％梯度凝膠和12％凝膠以及ELISA(R&D System)通過非還原性SDS-PAGE分析上述實施例中制備的蛋白質(zhì)綴合物。
SDS-PAGE分析的結(jié)果如圖3中所示，其中生理學(xué)多肽、非肽聚合物、PEG和免疫球蛋白Fc片段的偶聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致成功形成了IFNα-PEG-Fc綴合物(A)、17Ser-G-CSF-PEG-Fc綴合物(B)和EPO-PEG-Fc綴合物(C)。
此外，用非還原性12％SDS-PAGE分析實施例10中制備的DG FG。如圖6b中所示，在與缺乏糖基部分的天然Fc的分子量相應(yīng)的位置處檢測到了DG Fc條帶。
<1-2>蛋白質(zhì)綴合物的定量分析用HiLoad 26/60 Superdex 75柱(Pharmacia)通過大小排阻層析對以上實施例中制備的蛋白質(zhì)綴合物進行定量，其中以10mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)作為洗脫緩沖液，并將其中各蛋白質(zhì)綴合物的峰面積與對照組的峰面積相比較。將先前已定量分析的標準品、IFNα、hGH、G-CSF、17S-G-CSF、EPO和Fc單獨進行大小排阻層析，測定濃度和峰之間的轉(zhuǎn)換因子。對預(yù)定量的各蛋白質(zhì)綴合物進行相同大小排阻層析。通過從由此獲得的峰面積中減去相應(yīng)于免疫球蛋白Fc片段的峰面積，測定存在于各蛋白質(zhì)綴合物中的生理學(xué)活性蛋白質(zhì)的數(shù)量值。圖4顯示了已純化的IFNα-PEG-Fc綴合物的大小排阻層析結(jié)果，其中觀察到了單一的峰。此結(jié)果表明，已純化的蛋白質(zhì)綴合物不包含諸如二聚體、三聚體和更高數(shù)量單體等多聚體雜質(zhì)。
當用特異于生理學(xué)活性多肽的抗體對與Fc綴合的生理學(xué)活性多肽進行定量分析時，抗體與多肽的結(jié)合被阻止，導(dǎo)致了數(shù)值低于由層析計算的真實值。以IFNα-PEG-Fc綴合物為例，ELISA中得到的ELISA數(shù)值相當于真實值的大約30％。
<1-3>蛋白質(zhì)綴合物的純度和質(zhì)量分析對以上實施例中制備的蛋白質(zhì)綴合物進行大小排阻層析，并檢測280nm處的吸收值。結(jié)果顯示，IFNα-PEG-Fc、hGH-PEG-Fc、G-CSF-PEG-Fc和17Ser-G-CSF-PEG-Fc綴合物在70至80-kDa大小的物質(zhì)保持時間處顯示出單一峰。
另一方面，進行反相HPLC，以確定實施例1、11和13中制備的蛋白質(zhì)綴合物IFNα-PEG-Fc、IFNα-PEG-DG Fc和IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物的純度。利用了反相柱(259 VHP54柱，Vydac)。利用配制于0.5％TFA中的40-100％乙腈梯度洗脫柱子，通過檢測280nm處的吸收值分析純度。結(jié)果如圖8所示，樣品中不含有未結(jié)合的干擾素或免疫球蛋白Fc，且發(fā)現(xiàn)所有蛋白質(zhì)綴合物IFNα-PEG-Fc(A)、IFNα-PEG-DG Fc(B)和IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物(C)的純度都高于96％。
為了確定已純化蛋白質(zhì)綴合物的準確分子量，用高通量MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Voyager DE-STR，Applied Biosystems)分析各個綴合物的質(zhì)量。用芥子酸作為基質(zhì)。將0.5μl各待測樣品包被在樣品載玻片上并空氣干燥，再與等體積的基質(zhì)溶液混合并空氣干燥，放入離子源中。用線性模式TOF分析儀以陽性方式進行檢測。離子用通過延遲提取(delayed extraction，DE)操作的分裂提取源加速，在總加速電壓約2.5kV處采用750鈉秒至1500納秒的延遲提取時間。
由MALDI-TOF質(zhì)譜儀觀察到的各實施例中制備的Fc蛋白質(zhì)綴合物的分子量如下表1中所示。圖5顯示了EPO-PEG-Fc綴合物的MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果，而圖7顯示了IFNα-PEG-Fc和IFNα-PEG-DG Fc綴合物的MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPO-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物純度高于95％，且分子量非常接近理論分子量。此外，發(fā)現(xiàn)EPO與免疫球蛋白Fc片段以1∶1的比例偶聯(lián)。
表1

此外，當用MALDI-TOF質(zhì)譜儀測定實施例10中制備的Fc和DG Fc的分子量時，發(fā)現(xiàn)DG Fc是50kDa，這比天然Fc小大約3-kDa(圖6a)。由于這3-kDa分子量相應(yīng)于糖基部分的理論大小，該結(jié)果證實了糖基部分完全被去除了。
下表2顯示了實施例11中制備的IFNα-PEG-DG Fc綴合物和實施例13中所制備的IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物綴合體(I和II)的MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果。發(fā)現(xiàn)IFNα-PEG-DG Fc綴合物比IFNα-PEG-Fc綴合物的75.9kDa小3kDa，而IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物綴合體(I)比IFNα-PEG-Fc綴合物的75.9kDa小大約3-4kDa。與Fc單體偶聯(lián)的IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物綴合體(II)顯示出分子量降低了24.5kDa，這相應(yīng)于Fc單體的分子量。
表2

實驗實施例2藥物代謝動力學(xué)分析I評估天然形式的生理學(xué)活性蛋白質(zhì)(對照)以及實施例和比較實施例中制備的蛋白質(zhì)綴合物-40K PEG復(fù)合物、-PEG-白蛋白綴合物、-PEG-Fc綴合物、-PEG-DG Fc綴合物和-PEG-重組AG Fc衍生物綴合體在SD大鼠(每組5只大鼠)中的血清穩(wěn)定性和藥物代謝動力學(xué)參數(shù)。以100μg/kg的劑量單獨皮下注射對照以及-40K PEG復(fù)合物、-PEG-白蛋白綴合物、-PEG-Fc綴合物、-PEG-DG Fc綴合物和-PEG-重組AG Fc衍生物綴合體(試驗組)。皮下注射后，在0.5、1、2、4、6、12、24、30、48、72和96小時收集對照組的血樣，在1、6、12、24、30、48、72、96、120、240和288小時收集試驗組的血樣。血樣收集在裝有抗凝劑肝素的試管中，用Eppendorf高速小型離心機離心5分鐘以去除血細胞。用特異于所述生理學(xué)活性蛋白質(zhì)的抗體通過ELISA檢測血清蛋白質(zhì)水平。
天然形式的IFNα、hGH、G-CSF和EPO以及它們的-40K PEG復(fù)合物、它們的-PEG-白蛋白綴合物、它們的-PEG-Fc綴合物以及它們的-PEG-DG Fc綴合物的藥物代謝動力學(xué)分析結(jié)果如下表3至7中所示。在以下的表中，Tmax表示達到最大藥物血清濃度所需的時間，T1/2指藥物的血清半壽期，而MRT(平均停留時間)指藥物分子在身體中停留的平均時間。
表3干擾素α的藥物代謝動力學(xué)

表4人生長因子的藥物代謝動力學(xué)

表5G-CSF的藥物代謝動力學(xué)

表617S-G-CSF衍生物的藥物代謝動力學(xué)

表7EPO的藥物代謝動力學(xué)

如表3的數(shù)據(jù)和圖9的藥物代謝動力學(xué)曲線所示，IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物的血清半壽期是90.4小時，這比天然IFNα高大約50倍，而比比較實施例1中制備的IFNα-40K PEG的35.8小時半壽期高大約2.5倍。此外，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的IFNα-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物在血清半壽期上優(yōu)于IFNα-PEG-白蛋白，后者的半壽期為17.1小時。
另一方面，如表3和圖11中所示，IFNα-PEG-DG Fc綴合物的血清半壽期為71.0小時，這幾乎與IFNα-PEG-Fc綴合物相同，表明Fc的去糖基化確實極大影響了IFNα-PEG-DG Fc綴合物的體內(nèi)穩(wěn)定性。此外，發(fā)現(xiàn)用通過重組方法產(chǎn)生的重組AG Fc衍生物制備的綴合物具有與天然形式衍生的DG Fc相同的效應(yīng)。不過，與Fc單體偶聯(lián)的復(fù)合物的血清半壽期大約是與正常Fc二聚體偶聯(lián)的復(fù)合物的血清半壽期的一半。
如表4中所示，人生長激素在依照本發(fā)明與IgG Fc片段綴合時也顯示出了血清半壽期延長。也就是說，與天然形式(1.1小時)相比，hGH-40K PEG復(fù)合物和hGH-PEG-白蛋白綴合物的半壽期稍微延長，分別為7.7小時和5.9小時，而本發(fā)明的hGH-PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物則顯示出半壽期明顯延長至11.8小時。
正如從表5和6中有關(guān)G-CSF和其衍生物的藥物代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)中顯而易見的，G-CSF-PEG-Fc和17S-G-CSF-PEG-Fc綴合物呈現(xiàn)出比-40K PEG復(fù)合物和-PEG-白蛋白綴合物長得多的血清半壽期。發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白Fc片段在血清中延長了天然形式的生理學(xué)活性蛋白質(zhì)的作用持續(xù)時間，而它們的具有某些氨基酸殘基改變的衍生物也呈現(xiàn)出與天然形式相似水平的這種特性。從這些結(jié)果中可很容易的預(yù)計本發(fā)明的方法會對其它蛋白質(zhì)及其它們的衍生物具有類似的影響。
如表7和圖10中所示，天然糖基化EPO與Fc片段的綴合也導(dǎo)致了血清半壽期的延長。也就是說，EPO在天然形式時血清半壽期為9.4小時，當為了提高血清穩(wěn)定性而將其高度糖基化時，其血清半壽期延長至18.4小時。EPO-PEG-Fc綴合物(包含依照本發(fā)明與免疫球蛋白Fc片段偶聯(lián)的EPO)顯示出血清半壽期顯著延長至61.5小時。此外，當與大腸桿菌來源的重組非糖基化(AG)Fc衍生物綴合時，EPO的血清半壽期則延長至87.9小時，表明Fc片段的非糖基化使得蛋白質(zhì)綴合物的制備不影響無抗體功能的蛋白質(zhì)的血清穩(wěn)定性。
正如從以上結(jié)果中顯而易見的，依照本發(fā)明通過非肽聚合物與免疫球蛋白Fc片段共價鍵合的蛋白質(zhì)綴合物呈現(xiàn)出血清半壽期比其天然形式的血清半壽期延長了數(shù)倍至數(shù)十倍。此外，當免疫球蛋白Fc由于在大腸桿菌中產(chǎn)生而為非糖基化形式或由于通過酶處理而去糖基化時，它的延長其蛋白質(zhì)綴合物的血清半壽期的效果保持在相似水平。
特別是，與為了延長蛋白質(zhì)在血清中的持續(xù)作用時間而用PEG分子中具有最長持續(xù)作用時間的40-kDa PEG修飾的蛋白質(zhì)相比，免疫球蛋白Fc蛋白質(zhì)綴合物具有更為優(yōu)越的血清穩(wěn)定性。此外，與偶聯(lián)了白蛋白而非免疫球蛋白Fc的蛋白質(zhì)綴合物相比，本發(fā)明的蛋白質(zhì)綴合物呈現(xiàn)出極高的血清穩(wěn)定性，表明本發(fā)明的蛋白質(zhì)綴合物在研發(fā)長效形式的蛋白質(zhì)藥物中是有效的。這些結(jié)果，即與常規(guī)PEG-或白蛋白-綴合蛋白質(zhì)相比，本發(fā)明的蛋白質(zhì)綴合物對包括點突變的集落刺激因子衍生物在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)的血清穩(wěn)定性以及MRT具有極好的影響，表明本發(fā)明綴合物的穩(wěn)定性提高和持續(xù)時間延長的效果可適用于其它的生理學(xué)活性多肽。
另一方面，當用如上所述的相同方法評估利用非肽聚合物10-kDa PEG制備的IFNα-10K PEG-Fc蛋白質(zhì)綴合物(實施例7)的血清半壽期時，顯示出其血清半壽期為48.8小時，這稍微短于用3.4-kDa PEG制備的蛋白質(zhì)綴合物的血清半壽期(79.7小時)。
此外，蛋白質(zhì)綴合物的血清半壽期隨著非肽聚合物PEG的分子量的增加而降低。這些結(jié)果表明，提高蛋白質(zhì)綴合物的血清穩(wěn)定性并延長其持續(xù)時間的主要因素是被綴合的免疫球蛋白Fc片段，而不是非肽聚合物。
即使當PEG的反應(yīng)性基團被除醛基外的反應(yīng)性基團置換時，含PEG的蛋白質(zhì)綴合物仍然顯示了與偶聯(lián)了具有醛反應(yīng)性基團的PEG的那些綴合物相似模式的表觀分子量和血清半壽期。
實驗實施例3藥物代謝動力學(xué)分析II為了測定實施例8和9中制備的Fab′-S-PEG-N-Fc和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物以及比較實施例3中制備的Fab′-S-40KPEG復(fù)合物的血清半壽期，依照實驗實施例2中相同的方法以Fab′作為對照進行了綴合物和復(fù)合物的藥物代謝動力學(xué)分析。結(jié)果如圖12中所示。
如圖12中所示，F(xiàn)ab′-S-PEG-N-Fc和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物呈現(xiàn)出血清半壽期與Fab′或Fab′-S-40K PEG復(fù)合物相比延長了兩或三倍。
實驗實施例4蛋白質(zhì)綴合物細胞內(nèi)活性的評估<4-1>IFNα蛋白質(zhì)綴合物細胞內(nèi)活性的比較為了比較IFNα蛋白質(zhì)綴合物的細胞內(nèi)活性，用感染了皰疹性口腔炎病毒的Madin Darby牛腎(MDBK)細胞(ATCC CCL-22)通過細胞培養(yǎng)物生物測定法評估IFNα-PEG-Fc(實施例1)、IFNα-PEG-DG Fc(實施例11)、IFNα-PEG-重組AG Fc衍生物(實施例13)、IFNα-40K PEG(比較實施例1)和IFNα-PEG-白蛋白(比較實施例2)的抗病毒活性。以可獲自生物學(xué)標準品和對照國家研究院(NIBSC)的未PEG化干擾素α-2b作為標準物質(zhì)。
在補充了10％FBS和1％青霉素/鏈霉素的MEM(最低基本培養(yǎng)基，JBI)中于37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)MDBK細胞。用培養(yǎng)基將待分析樣品和標準物質(zhì)稀釋至預(yù)定濃度，將100-μl等分試樣加入96孔板的各孔中。分離所培養(yǎng)的細胞，將其加入以100μl的體積含有樣品的平板中，在37℃和5％CO2的條件下培養(yǎng)約1小時。然后，將5-7×103PFU的皰疹性口腔炎病毒(VSV)50μl加入平板的各孔中，細胞在37℃、5％CO2的條件下進一步培養(yǎng)大約16-20小時。將不含樣品或標準物質(zhì)而只包含病毒的孔用作陰性對照，而只含有細胞的孔則用作陽性對照。
去除培養(yǎng)基后，將100μl中性紅溶液加入平板中對存活的細胞染色，隨后在37℃、5％CO2的條件下保溫2小時。去除上清液后，將100μl 100％乙醇和1％乙酸的1∶1混合物加入平板的每個孔中。充分混合以溶解自被染色細胞洗脫的所有中性紅結(jié)晶后，檢測540nm的吸收值。將陰性對照用作空白，計算ED50值(造成50％細胞生長抑制的劑量)，其中陽性對照的細胞生長被設(shè)定為100％。
表8

如表8中所示，IFNα-40K PEG活性降低至天然IFNα的4.8％。尤其是，當PEG部分的大小增加時，蛋白質(zhì)綴合物具有提高的血清穩(wěn)定性，但活性逐漸降低。據(jù)報道，干擾素α在用12-kDa PEG修飾時具有25％的體外活性，而當用40-kDa PEG修飾時則具有大約7％的活性(P.Bailon等，Biocon jugate Chem.12195-202，2001)。也就是說，由于隨著PEG部分分子量的增加，蛋白質(zhì)綴合物的半壽期變長，但生物學(xué)活性急速降低，所以需要研發(fā)具有較長半壽期和較強活性的蛋白質(zhì)綴合物。此外，IFNα-PEG-白蛋白綴合物展示了弱的活性，與天然IFNα相比大約為5.2％。相反，本發(fā)明的IFNα-PEG-Fc和IFNα-PEG-DG Fc綴合物呈現(xiàn)了顯著提高的相對活性，與天然IFNα相比大約為28.1％和25.7％。此外，IFNα與重組AG Fc衍生物的綴合導(dǎo)致了活性的相似提高。從這些結(jié)果預(yù)計，與免疫球蛋白Fc片段綴合的干擾素α具有顯著延長的血清半壽期和極大提高的體內(nèi)藥效。
<4-2>人生長激素蛋白質(zhì)綴合物細胞內(nèi)活性的比較為了比較人生長激素蛋白質(zhì)綴合物的細胞內(nèi)活性，比較了hGH-PEG-Fc、hGH-40K PEG和hGH-PEG-白蛋白的細胞內(nèi)活性。
用大鼠結(jié)節(jié)淋巴瘤細胞系Nb2(歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)#97041101)通過體外試驗檢測hGH綴合物的細胞內(nèi)活性，所說細胞系顯示了人生長激素依賴型有絲分裂。
將Nb2細胞培養(yǎng)于補充了10％FBS(胎牛血清)、0.075％ NaCO3、0.05mM 2-巰基乙醇和2mM谷氨酰胺的Fisher′s培養(yǎng)基中，并進一步在不含10％FBS的相似培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。然后，對所培養(yǎng)的細胞進行計數(shù)，將大約2×104個細胞的等分試樣加至96孔板的各孔中。將hGH-PEG-Fc、hGH-40K PEG、hGH-PEG-白蛋白、可獲自生物學(xué)標準品和對照國家研究院(NIBSC)作為對照的標準品和天然人生長激素(HM-hGH)稀釋，并以多種濃度加入各孔中，隨后在37℃5％CO2的條件下保溫48小時。之后，為了通過測定各孔中的細胞數(shù)目來檢測細胞增殖活性，將25μl Cell Titer 96 Aqueous One SolutionReagent(Promega)加入各孔中，將細胞進一步培養(yǎng)4小時。檢測490nm處的吸收值，計算各樣品的效價。結(jié)果如下表9中所示。
表9

如表9中所示，同樣以人生長激素為例，與40-kDa PEG的綴合(hGH-40K PEG)導(dǎo)致了活性降低至大約為天然形式的7.6％，而hGH-PEG-白蛋白綴合物顯示出大約為天然hGH的5.2％的低體外活性。不過，本發(fā)明的hGH-PEG-Fc綴合物顯著提高了相對活性，達到天然hGH的28％以上。從這些結(jié)果預(yù)計，與免疫球蛋白Fc片段連接的人生長激素具有顯著延長的血清半壽期和極大提高的體內(nèi)藥效。此外，我們認為本發(fā)明免疫球蛋白Fc蛋白質(zhì)綴合物活性的提高是由于血清穩(wěn)定性的提高，而與受體的結(jié)合親和力的保留則歸因于免疫球蛋白Fc或非肽聚合物形成的空間。這些效果預(yù)計可適用于與其它生理學(xué)活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)的免疫球蛋白Fc蛋白質(zhì)綴合物。
<4-3>G-CSF蛋白質(zhì)綴合物的細胞內(nèi)活性比較為了比較具有G-CSF衍生物的蛋白質(zhì)綴合物的細胞內(nèi)活性，比較了天然G-CSF(Filgrastim，Jeil Pharm.Co.，Ltd.)、17Ser-G-CSF衍生物、20K PEG-G-CSF(Neulasta)、40K PEG-17S-G-CSF、17Ser-G-CSF-PEG-白蛋白和17S-G-CSF-PEG-Fc的細胞內(nèi)活性。
首先，將人骨髓細胞系HL-60(ATCC CCL-240，前髓細胞性白血病患者/36歲白種女性)培養(yǎng)于補充了10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)的細胞以大約2.2×105個細胞/ml的密度懸浮，并在其中加入DMSO(二甲亞砜，培養(yǎng)級，Sigma)至終濃度1.25％(v/v)。然后，將90μl細胞懸浮液接種于96孔板(Corning/低蒸發(fā)96孔板)的各孔中，從而密度大約為每孔2×104個細胞，在37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約72小時。
將蛋白質(zhì)濃度用G-CSF ELISA試劑盒(R&D systems)測定過的各樣品用RPMI 1640稀釋至同一濃度10μg/ml，再進一步用RPMI 1640稀釋19次，每次稀釋2倍。將連續(xù)的兩倍稀釋液10μl獨立加到含HL-60細胞的各孔中，從而各樣品濃度起始為1μg/ml。然后，將細胞在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。
用Cell Titer 96TM(Cat.NO.G4100，Promega)檢測HL-60細胞的增殖，通過測量670nm的吸收值確定增加的細胞數(shù)。
表10

如表10中所示，與具有氨基酸取代的G-CSF衍生物17Ser-G-CSF的免疫球蛋白Fc蛋白質(zhì)綴合物同樣呈現(xiàn)出了與天然G-CSF-偶聯(lián)蛋白質(zhì)綴合物相似的效果。先前報道了17Ser-G-CSF-PEG與未PEG化的17Ser-G-CSF(韓國專利公開文件2004-83268)相比具有相對較長的血清半壽期，但活性有所降低。尤其是，當PEG部分的大小增大時，蛋白質(zhì)綴合物的血清穩(wěn)定性增加，但活性逐漸降低。17Ser-G-CSF-40KPEG顯示出非常低的活性，與天然形式相比低于大約10％。也就是說，由于蛋白質(zhì)綴合物隨著PEG部分的分子量增加而具有較長的血清半壽期但活性急速降低，所以需要研發(fā)一種具有長血清半壽期和強活性的蛋白質(zhì)綴合物。17Ser-G-CSF-PEG-白蛋白也顯示出與天然G-CSF相比大約為其23％的低活性。相反，17Ser-G-CSF-PEG-Fc則大大提高了相對活性，其相對活性大于天然G-CSF的51％。從這些結(jié)果中，預(yù)計與免疫球蛋白Fc片段連接的17Ser-G-CSF具有顯著增加的血清半壽期，且極大提高了其體內(nèi)藥效。
<4-4>Fab′綴合物的細胞毒性中和測定用實施例8和實施例9中制備的Fab′-S-PEG-N-Fc和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物以及比較實施例3中制備的Fab′-S-40KPEG復(fù)合物進行體外活性測定。通過基于測量TNFα-介導(dǎo)的細胞毒性的細胞毒性測定，評估Fab′綴合物以確定其是否在小鼠成纖維細胞系L929(ATCC CRL-2148)中中和了TNFα-誘導(dǎo)的凋亡。
按兩倍系列稀釋Fab′-S-PEG-N-Fc和Fab′-N-PEG-N-Fc綴合物以及Fab′-S-40K PEG復(fù)合物，將100-μl等分溶液加到96孔板的孔中。將rhTNF-α(R&D systems)和放線菌素D(Sigma)作為RNA合成抑制劑分別以終濃度10ng/ml和1μg/ml加入各孔中，在37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中保溫30分鐘，再轉(zhuǎn)移到微量滴定板上供檢測。將L929細胞以5×104個細胞/50μl培養(yǎng)基的密度加入各孔中并在37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。去除培養(yǎng)基后，將以5mg/ml濃度溶于PBS中的50μl MTT(Sigma)加入各孔中，細胞進一步在37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約4小時。將150μl DMSO加入各孔中，通過測定540nm的吸收值確定細胞毒性中和的程度。作為對照，使用了實施例8步驟1中純化的Fab′。
如圖13中所示，所有用于此試驗的蛋白質(zhì)綴合物都具有與Fab′相似的效價。這些結(jié)果表明，當將免疫球蛋白Fc通過PEG連接至Fab′的N末端或C末端附近的游離半胱氨酸來制備蛋白質(zhì)綴合物時，F(xiàn)ab′呈現(xiàn)出顯著增高的血清半壽期和高體內(nèi)活性。
<4-5>補體依賴型細胞毒性(CDC)測定為了確定在大腸桿菌轉(zhuǎn)化體表達并純化的實施例中制備的衍生物和相應(yīng)于免疫球蛋白恒定區(qū)的蛋白質(zhì)是否結(jié)合人C1q，進行了如下的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。在試驗組中，使用了HM10932和HM10927轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的免疫球蛋白恒定區(qū)以及以上實施例中制備的衍生物，所說的兩個轉(zhuǎn)化體于2004年9月15日保藏于韓國微生物保存中心(KCCM)，保藏號為KCCM-10597、KCCM-10588。作為標準參照，使用了糖基化的免疫球蛋白(IVIG-球蛋白S，Green Cross PBM)和數(shù)種作為治療抗體的商品化抗體。試驗和標準樣品以濃度1μg/ml配制于10mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中。樣品以每孔200ng的量等分至96孔板(Nunc)中，并將平板在4℃包被過夜。然后，將各孔用PBS-T(137mM NaCl，2mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.05％Tween 20)漂洗三次，用250μl封閉緩沖液(溶于PBS-T中的1％牛血清白蛋白)室溫封閉1小時，再用同樣的PBS-T漂洗三次。將標準和試驗樣品在PBS-T中稀釋至預(yù)定濃度，并添加到抗體包被的孔中，將平板在室溫保溫1小時，并用PBS-T洗三次。之后，將2μg/ml C1q(R&D Systems)加入平板中，并于室溫反應(yīng)2小時，然后將平板用PBS-T洗6次。將200μl 1∶1000稀釋于封閉緩沖液中的人抗人C1q抗體-過氧化物酶綴合物(Biogenesis，USA)加入各孔中，并于室溫反應(yīng)1小時。用PBS-T將各孔漂洗三次后，混合等體積的顯色試劑A和B(顯色劑A穩(wěn)定的過氧化物和顯色劑B穩(wěn)定的色素原；DY 999，R&D Systems)，將200μl混合物加到各孔中，隨后保溫30分鐘。然后，在各孔中加入50μl反應(yīng)終止液，2M硫酸。用微量滴定板讀數(shù)儀(Molecular Device)對平板讀數(shù)。在波長450nm處測量標準和試驗樣品的吸收值，結(jié)果分別參見圖14和15。
在相互比較免疫球蛋白亞型之間其免疫球蛋白Fc片段中的補體活性時，發(fā)現(xiàn)人免疫球蛋白IgG1(Fitzgerald)具有最高的C1q結(jié)合親和力，其次是IgG2(Fitzgerald)，然后是IgG4(Fitzgerald)，表明在亞型之間補體活性存在差異。此試驗中所用的IVIG是IgG亞型的合并物，由于IgG1占了IVIG的大部分，所以IVIG呈現(xiàn)出與純化的IgG1近乎相同的C1q結(jié)合親和力。與這些標準相比，在由于去糖基化而造成的C1q結(jié)合親和力的改變方面，具有最強的補體活性的IgG1 Fc在非糖基化時此活性顯著降低。IgG4 Fc，已知不會誘發(fā)補體的活化，它對C1q幾乎沒有結(jié)合親和力，表明IgG4 Fc可被用作無補體活性的極好重組載體(圖14)。
為了確定載體是否在即使與生理學(xué)活性肽綴合后仍保持了對C1q沒有結(jié)合親和力的特性，用糖基化的Fc、酶促去糖基化的Fc和非糖基化重組Fc作為IFNα的載體制備IFNα-Fc綴合物，并評估其對C1q的結(jié)合親和力。發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)了糖基化Fc的IFNα綴合物(IFNα-PEG-Fc糖基化IgG1Fc)保持了對C1q的高結(jié)合親和力。相反，當將干擾素α與用PNGase F和其他酶去糖基化的Fc偶聯(lián)時，所產(chǎn)生的綴合物(IFNα-PEG-DGFc去糖基化IgG1Fc)展示了明顯降低的C1q結(jié)合親和力，這與大腸桿菌來源的非糖基化Fc綴合物類似。此外，當以IgG4部分替換偶聯(lián)了非糖基化IgG1 Fc的干擾素α綴合物(IFNα-PEG-AGFcG1非糖基化IgG1Fc)的IgG1部分時，發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的干擾素綴合物(IFNα-PEG-FcG4衍生物1非糖基化IgG4Fc)完全喪失了其與C1q的結(jié)合親和力。當IgG1 Fc部分被IgG4 Fc單體替換時，所產(chǎn)生的綴合物(IFNα-PEG-FcG4衍生物2非糖基化IgG4Fc)。這些結(jié)果顯示這樣的IgG4Fc片段形式可用作不具有抗體片段效應(yīng)器功能的極好載體(圖15)。
工業(yè)適用性如上文所描述的，本發(fā)明的藥物綴合物極大的提高了藥物的血漿半壽期。另一方面，所述蛋白質(zhì)綴合物克服了常規(guī)長效制劑最顯著的缺陷，即藥物效價降低，從而使血液循環(huán)時間和體內(nèi)活性超過了原先已知最有效的白蛋白。此外，所述蛋白質(zhì)綴合物沒有誘發(fā)免疫應(yīng)答的風險。由于這些優(yōu)勢，該蛋白質(zhì)綴合物可用于開發(fā)蛋白質(zhì)藥物的長效制劑。依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)藥物長效制劑能減少患者頻繁注射的痛苦，在較長時間內(nèi)保持活性多肽的血清濃度，從而使藥效穩(wěn)定。
此外，本發(fā)明制備蛋白質(zhì)綴合物的方法克服了遺傳操作生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)的缺點，包括表達體系難以建立、糖基化作用不同于天然形式、誘發(fā)免疫應(yīng)答和蛋白質(zhì)融合的方位有限、由于非特異性反應(yīng)造成的低產(chǎn)率以及用作粘合劑的化合物的毒性等化學(xué)偶聯(lián)的問題，從而可以方便且經(jīng)濟的提供血清半壽期延長并具有高活性的蛋白質(zhì)藥物。
國際承認用于專利程序目的的微生物保藏布達佩斯條約INTERNATIONAL FORM
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序列表<110>HanmI Pharm.Co.，Ltd.
<120>包含免疫球蛋白Fc區(qū)作為載體的引物組合物<150>KR10-2003-0080299<151>2003-11-18<160>6<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1cgtcatgccc agcacctgag ttcctggggg gacca 35<210>2<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gggggatcct catttaccca gagacaggga gaggctcttc tg 42<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3cggcacctga gttcctgggg ggaccatca29<210>4<211>69<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>4atgaaaaaga caatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60gcccaggcg 69<210>5<211>45<212>DNA<213>人<400>5tctattgcta caaatgccca ggccttccca accattccct tatcc 45<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>6agataacgat gtttacgggt ccggaagggt tggtaaggga atagg 4權(quán)利要求
1.包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的藥物組合物。
2.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的。
3.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段由選自CH1、CH2、CH3和CH4結(jié)構(gòu)域中的1到4個結(jié)構(gòu)域組成。
4.依照權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段還包含鉸鏈區(qū)。
5.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段選自由來自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它們的組合和雜合體組成的組。
6.依照權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段選自由來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段以及它們的組合和雜合體組成的組。
7.依照權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4 Fc片段。
8.依照權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是人非糖基化IgG4 Fc片段。
9.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段與生理學(xué)活性多肽藥物連接。
10.依照權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述生理學(xué)活性多肽選自激素、細胞因子、酶、抗體、生長因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、凝血因子、疫苗、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、配體蛋白質(zhì)和受體。
11.依照權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述生理學(xué)活性多肽選自人生長激素、生長激素釋放素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、集落刺激因子、胰高血糖素樣肽、G蛋白偶聯(lián)受體、白介素、白介素受體、酶、白介素結(jié)合蛋白、細胞因子結(jié)合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、變態(tài)反應(yīng)抑制物、細胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制物、轉(zhuǎn)移生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、載脂蛋白-E、促紅細胞生成素、高度糖基化的促紅細胞生成素、angiopoietins、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體激活肽、凝血調(diào)節(jié)蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子XIII、纖溶酶原活化因子、纖維蛋白結(jié)合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應(yīng)蛋白、腎素抑制物、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、leptin、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、制管張素、血管緊張素、骨生長因子、骨刺激蛋白質(zhì)、降鈣素、胰島素、心房肽激素、軟骨誘發(fā)因子、依降鈣素、結(jié)締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、黃體生成素、黃體生成素釋放激素、神經(jīng)生長因子、甲狀旁腺素、松弛素、促胰液素、生長調(diào)節(jié)素、胰島素樣生長因子、腎上腺皮質(zhì)激素、胰高血糖素、縮膽囊素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、促甲狀腺素、自分泌運動因子、乳鐵蛋白、筒箭毒堿、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段。
12.依照權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述生理學(xué)活性多肽選自人生長激素、集落刺激因子、α干擾素、人促紅細胞生成素和Fab′抗體片段。
13.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段通過肽或非肽接頭與藥物連接。
14.延長藥物的體內(nèi)作用持續(xù)時間的方法，其特征在于以免疫球蛋白Fc片段作為載體。
15.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的。
16.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述免疫球蛋白Fc片段由選自CH1、CH2、CH3和CH4結(jié)構(gòu)域中的1個到4個結(jié)構(gòu)域組成。
17.依照權(quán)利要求16的方法，其中所述免疫球蛋白Fc片段中還包含鉸鏈區(qū)。
18.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述免疫球蛋白Fc片段選自由來自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它們的組合和雜合體組成的組。
19.依照權(quán)利要求18的方法，其中所述免疫球蛋白Fc片段是選自由來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段以及它們的組合和雜合體組成的組。
20.依照權(quán)利要求19的方法，其中所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4 Fc片段。
21.依照權(quán)利要求20的方法，其中所述免疫球蛋白Fc片段是人非糖基化IgG4 Fc片段。
22.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述免疫球蛋白Fc片段與生理學(xué)活性多肽藥物連接。
23.依照權(quán)利要求22的方法，其中所述生理學(xué)活性多肽選自激素、細胞因子、酶、抗體、生長因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、凝血因子、疫苗、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、配體蛋白質(zhì)和受體。
24.依照權(quán)利要求23的方法，其中所述生理學(xué)活性多肽選自人生長激素、生長激素釋放素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、集落刺激因子、胰高血糖素樣肽、G蛋白偶聯(lián)受體、白介素、白介素受體、酶、白介素結(jié)合蛋白、細胞因子結(jié)合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、變態(tài)反應(yīng)抑制物、細胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制物、轉(zhuǎn)移生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、載脂蛋白-E、促紅細胞生成素、高度糖基化的促紅細胞生成素、angiopoietins、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體激活肽、凝血調(diào)節(jié)蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子XIII、纖溶酶原活化因子、纖維蛋白結(jié)合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應(yīng)蛋白、腎素抑制物、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、leptin、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、制管張素、血管緊張素、骨生長因子、骨刺激蛋白質(zhì)、降鈣素、胰島素、心房肽激素、軟骨誘發(fā)因子、依降鈣素、結(jié)締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、黃體生成素、黃體生成素釋放激素、神經(jīng)生長因子、甲狀旁腺激素、松弛素、促胰液素、生長調(diào)節(jié)素、胰島素樣生長因子、腎上腺皮質(zhì)激素、胰高血糖素、縮膽囊素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、促甲狀腺素、自分泌運動因子、乳鐵蛋白、筒箭毒堿、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段。
25.依照權(quán)利要求24的方法，其中所述生理學(xué)活性多肽選自人生長激素、集落刺激因子、α干擾素、人促紅細胞生成素和Fab′抗體片段。
26.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述免疫球蛋白Fc片段通過肽或非肽接頭與藥物連接。
全文摘要
本發(fā)明公開了免疫球蛋白Fc片段的新用途，更具體而言，本發(fā)明公開了含有免疫球蛋白Fc片段作為載體的藥物組合物。包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的藥物組合物可以在保持該藥物相對高水平的體內(nèi)活性的同時顯著延長藥物的血清半衰期。此外，當所說藥物是多肽藥物時，與免疫球蛋白Fc片段和靶蛋白的融合蛋白相比，所說的藥物組合物引起免疫應(yīng)答的風險較低，因此可用于開發(fā)各種多肽藥物的長效制劑。
文檔編號A61K47/42GK1723220SQ200480001775
公開日2006年1月18日 申請日期2004年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月13日
發(fā)明者金榮民, 宋大海, 鄭圣燁, 金昌煥, 崔仁榮, 權(quán)世昌, 李寬淳 申請人:韓美藥品工業(yè)株式會社