專利名稱：治療性多肽,其同源物、其片段及其在調節(jié)血小板介導的聚集方面的應用的制作方法
背景技術：
血管受損時，內(nèi)皮下結構裸露，其通過與馮德勒布蘭德因子(vWF)相互作用介導血小板粘附。VWF在受損血管壁內(nèi)的膠原蛋白與血小板受體糖蛋白Ib(gpIb)間形成橋，該相互作用在高切應力(shear)狀態(tài)下尤其重要，導致形成止血栓，因而防止流血過多(Bennett S，Thromb Haemost(2001)Mar；85(3)395-400)。正常止血過程中，這些過程導致受損血管壁的傷口愈合。而在病理情況下，過分的血小板功能可導致形成血栓。vWF亞基由幾個同源結構域組成，每個具有不同功能。vWF通過其A3結構域與纖維狀膠原蛋白纖維相互作用，通過其A1結構域與血小板受體gpIb作用。正常情況下，血小板和vWF不相互作用。然而，當vWF在高切應力速率下與膠原蛋白結合時，認為其經(jīng)歷構象改變，允許其與血小板受體gpIb結合。該可逆的粘附使血小板翻越受損區(qū)，然后通過血小板上的膠原蛋白受體(gpIa/IIa，gpVI，gpIV，p65，TIIICBP)形成穩(wěn)定粘附，導致血小板活化。這導致gpIIb/IIIa受體活化，纖維蛋白原結合，最終產(chǎn)生血小板聚集。
已經(jīng)從吸血生物體如水蛭中分離出血小板聚集抑制劑。源自藥用醫(yī)學屬水蛭的乳清酸在WO 02/15919A2和Cruz CP等人文獻中描述。乳清酸作為馮德勒布蘭德因子依賴的血小板粘附抑制劑，減少大鼠頸動脈內(nèi)膜切除模型中的血小板聚集和內(nèi)膜增生。Journal of Vascular Surgery，2001，34724-729和Smith TP等人文獻，乳清酸，膠原蛋白-血小板相互作用抑制劑，在犬透析通路模型中減少靜脈吻合內(nèi)膜增生，Vasc Endovascular Surg，2003Jul-Aug；37(4)259-69。
基于抗體的治療已得到發(fā)展，其中有些已用于當前治療。
阿昔單抗(嵌合7E3Fab；ReoPro；US6,071,514，EP 0 882 453)，抑制配體結合血小板gpIIb/IIIa受體的小鼠人嵌合抗體7E3的Fab片段，于1994年12月獲準作為輔助治療應用于人類，以防止經(jīng)皮冠脈介入的局部缺血并發(fā)癥。gpIIb/IIIa抑制劑的主要安全問題是流血風險，因為這些藥物強烈的抗血小板效應可能不利于影響止血。
開發(fā)了抗vWF A1結構域(US 2002/0028204 A1；US6,280,731和WO00/10601)和抗其活性構象(US6,251,393)的鼠源單克隆抗體。體內(nèi)效應見Kageyama S等人所述“Effect of a humanized monoclonal antibody to馮維勒布蘭德因子in a canine model of coronary arterial thrombosis”，Eur J Pharmacol.2002May 17；443(1-3)143-9，和“Anti-human vWF monoclonal antibody，AjvW-2Fab，Inhibits repretitive coronary artery thrombosis without bleeding timeprolongation in dogs”，Thromb Res，2001 Mar 1；101(5)395-404及“Anti-human馮維勒布蘭德因子monoclonal antibody AJvW-2prevents thrombus deposition andneointima formation after balloon injury in guinea pigs”，Arterioscler Thromb VascBiol，2000 Oct；20(10)2303-8。AJvW-2抑制高切應力誘導的人血小板聚集，對低切應力誘導的血小板聚集沒有作用。
抗人vWF A3結構域的鼠源抗體82D6A3在狒狒內(nèi)的效應公開于WO02/051351及Dongmei Wu等人，“Inhibition of the von Willebrand(VWF)-collagen interaction by an antihuman VWF monoclonal antibody results inabolition of in vivo arterial platelet thrombus formation in baboons”，Hemostasis，thrombosis and vascular biology，2002，993623-3628。
抗體6B4是抗純化的人gpIb的單克隆抗體(MoAb)。MoAb 6B4能夠抑制利托菌素和美洲矛頭蝮毒蛋白誘導的依賴vWF的人血小板凝集。MoAb 6B4還能阻止切應力誘導的人血小板與膠原蛋白I的粘附。注射入狒狒體內(nèi)時，完整IgG和其F(ab’)(2)片段幾乎立即導致血小板減少，原因是二價F(ab’)(2)介導血小板交聯(lián)，或FcFc受體相互作用介導血小板聚集活化(WO 0110911；Cauwenberghs N.等人，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular biology，2000，201347，及見如Cadroy Y等人，Blood，1994，833218-3224，Becker BH等人，Blood，1989，74690-694，Ravanat C.等人，Thromb.Haemost.1999，82528a摘要)。在血栓產(chǎn)生前將Fab片段注射入狒狒體內(nèi)，能夠抑制血小板在膠原蛋白富集的牛心包上沉積。但當在允許血栓形成后注射Fab片段，看不到進一步的血栓抑制。所述Fab分子表達產(chǎn)量很低，產(chǎn)生方法耗費巨大人力。
發(fā)明目的本發(fā)明目標是提供多肽、所述多肽同源物和/或所述多肽功能部分，該多肽包括針對vWF、vWF A1結構域、活化vWF的A1結構域、vWF A3結構域、gpIb和/或膠原蛋白的一個或多個單結構域抗體，用于治療需要對血小板介導的聚集進行調節(jié)的疾病并克服現(xiàn)有技術問題。本發(fā)明另一目標是提供產(chǎn)生所述多肽的方法、用多肽包被用于醫(yī)學程序(如PCTA，放置斯坦特印模)的的裝置的方法、篩選調節(jié)血小板介導的聚集的試劑的方法和試劑盒，以及診斷與血小板介導的聚集相關的疾病的試劑盒。
發(fā)明概述已經(jīng)制備出特異性識別參與血小板聚集的第一步及隨后步驟的靶分子的單結構域抗體。這使得抗血栓形成試劑更有效、更安全。
本發(fā)明一個實施方案是多肽構建體，包括至少一種針對vWF、vWF A1結構域、活化的vWF A1結構域、vWF A3結構域、gpIb或膠原蛋白的任一種的單結構域抗體。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，其中針對活化vWF A1結構域的單結構域抗體特異性識別血栓形成部位活化的vWF構象，而不結合循環(huán)的非活化形式的vWF。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，還包括至少一種針對一種或多種血清蛋白的單結構域抗體。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，其中所述至少一種血清蛋白是任一血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、轉鐵蛋白(transferring)或纖維蛋白原或其片段。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，其中針對一種或多種血清蛋白的至少一種單結構域抗體對應SEQ ID NO16到19和49到61任一個所示序列。
本發(fā)明另一實施方案是對應SEQ ID NO13到15和42到45任一個所示序列的上述多肽構建體。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體是人源化的序列。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體對應SEQ ID NO38到41和42到45任一個所示序列。
本發(fā)明另一實施方案是對應SEQ ID NO8到12、20到22、32到34和42到47任一個所示序列的上述多肽構建體。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體是駱駝科VHH抗體。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體對應SEQ ID NO1到7、23到31、35到37和62到65任一個所示序列。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，其中所述單結構域抗體是全長單結構域抗體的同源序列、功能部分或同源序列的功能部分。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，其中所述多肽構建體是所述多肽構建體同源序列、其功能部分或其功能部分的同源序列。
本發(fā)明另一實施方案是編碼上述多肽構建體的核酸。
本發(fā)明另一實施方案是組合物，其包括上述多肽構建體和至少一種溶解血栓試劑，用于同時、分別或順序向受試者給藥。
本發(fā)明另一實施方案是組合物，其中所述溶解血栓試劑是葡萄球菌激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、單鏈鏈激酶、尿激酶和?；w溶酶原鏈激酶復合物的任何一種。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，或上述核酸或上述組合物，用于治療、預防和/或緩解與血小板介導的聚集或其功能失調相關的疾病。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體，或上述核酸或上述組合物的用途，用于制備治療、預防和/或緩解與血小板介導聚集或其功能失調相關的疾病的藥物。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體、核酸或組合物，或上述多肽構建體、核酸或組合物的用途，其中所述疾病是短暫腦局部缺血性發(fā)作、不穩(wěn)定或穩(wěn)定型心絞痛、心絞痛、腦梗塞、心肌梗塞、周圍動脈閉塞性疾病、再狹窄、冠脈旁路移植，或冠狀動脈瓣膜換置和冠脈介入如血管成形術、放置斯坦特印模、頸動脈內(nèi)膜切除術或粥樣斑切除術(atherectomy)的任何一種。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體、核酸或組合物，或上述多肽構建體、核酸或組合物的用途，其中所述疾病是非閉塞性血栓形成、閉塞性血栓形成、動脈血栓形成、急性冠脈閉塞、再狹窄、PCTA或放置斯坦特印模后再狹窄、狹窄的動脈內(nèi)血栓形成、血管成形術、粥樣斑切除術或動脈斯坦特印模后的增生、血管系統(tǒng)的閉塞綜合征或患病動脈的開放缺陷中的任何一種。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體、核酸或組合物，或上述多肽構建體、核酸或組合物的用途，其中所述疾病是高切應力環(huán)境中斑塊或血栓形成。
本發(fā)明另一實施方案是上述多肽構建體、核酸或組合物，或上述多肽構建體的用途，其中所述多肽構建體是靜脈內(nèi)、皮下、口服、舌下、局部、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入給藥。
本發(fā)明另一實施方案是一種組合物，其包括上述多肽構建體或編碼所述多肽構建體的核酸，或上述組合物和藥用載體。
本發(fā)明另一實施方案是生產(chǎn)上述多肽的方法，包括(a)在允許所述多肽表達的條件下，培養(yǎng)包括能編碼上述多肽的核酸的宿主細胞，和(b)從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的多肽。
本發(fā)明另一實施方案是上述方法，其中所述宿主細胞為細菌或酵母。
本發(fā)明另一實施方案是處理侵入性醫(yī)療裝置的方法，以防止在侵入部位周圍形成血小板介導的積聚，包括用上述多肽構建體包被所述裝置。
本發(fā)明另一實施方案是防止在侵入部位周圍形成血小板介導的積聚的侵入性醫(yī)療裝置，其中所述裝置包被有上述多肽構建體。
本發(fā)明另一實施方案是鑒定調節(jié)血小板介導的聚集的試劑的方法，包括(a)在允許所述多肽間結合的條件下，在存在和不存在候選調節(jié)劑的條件下，使上述多肽構建體與對應其靶目標的多肽接觸，和(b)測量(a)步驟的多肽間的結合，相對于不存在所述候選調節(jié)劑，存在所述候選調節(jié)劑時結合的降低將所述候選調節(jié)劑鑒定為調節(jié)血小板介導的聚集的試劑。
本發(fā)明另一實施方案是試劑盒，其用于根據(jù)上述方法篩選調節(jié)血小板介導的聚集的試劑。
本發(fā)明另一實施方案是根據(jù)上述方法鑒定的未知試劑，其調節(jié)血小板介導的聚集。
本發(fā)明另一實施方案是診斷疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥的特征在于血小板介導的聚集的機能障礙，所述方法包含步驟(a)使樣品與上述多肽構建體接觸，和(b)檢測所述多肽構建體與所述樣品的結合，和(c)將步驟(b)中檢測的結合與標準進行比較，其中相對于所述樣品而言結合的差異診斷為以血小板介導的聚集的機能障礙為特征的疾病或病癥。
本發(fā)明另一實施方案是篩選試劑盒，其用于根據(jù)上述方法，對以血小板介導的聚集的機能障礙為特征的疾病或疾患進行診斷。
本發(fā)明另一實施方案是包括上述多肽構建體的上述試劑盒。
詳述本發(fā)明涉及包括一個或多個單結構域抗體的多肽構建體，每個單結構域抗體針對靶目標，涉及所述構建體對血小板介導的聚集具有調節(jié)作用的發(fā)現(xiàn)。靶目標根據(jù)本發(fā)明，靶目標是任一vWF、vWF A1結構域、活化的vWF的A1結構域、vWF A3結構域、gpIb或膠原蛋白。所述靶目標是哺乳動物的，源自物種如兔、山羊、小鼠、大鼠、奶牛、小牛、駱駝、美洲駝、猴子、驢、豚鼠、豬、雞、綿羊、狗、貓、馬，和優(yōu)選地人。人vWF序列見表30，SEQ IDNO48。
靶目標也是能夠引發(fā)免疫反應的vWF、vWF A1結構域、活化的vWF的A1結構域、vWF A3結構域、gpIb或膠原蛋白的片段。靶目標也是能夠與抗“親本”全長靶目標的產(chǎn)生的單結構域抗體結合的vWF、vWF A1結構域、活化的vWF A1結構域、vWF A3結構域、gpIb或膠原蛋白的片段。
此處應用的片段指少于100％序列(如99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％等)。但包括5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多氨基酸。片段應足夠長。使得感興趣的相互作用維持在親和力1×10-6M或更高水平。
此處應用的片段還指任選插入、缺失和替換一個或多個氨基酸，其不實質上改變該靶目標與針對野生型靶目標產(chǎn)生的單結構域抗體的結合能力。插入、缺失和替換的氨基酸數(shù)目優(yōu)選為高達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個氨基酸。
針對靶目標的單結構域抗體是指與其靶目標結合的親和力超過10-6M的單結構域抗體。
單結構域抗體單結構域抗體是指其互補決定區(qū)為部分單結構域多肽的抗體。實施例包括但不限于，重鏈抗體、天然缺乏輕鏈的抗體、源自常規(guī)四鏈抗體的單結構域抗體、工程抗體和不同于那些源自抗體的單結構域支架。單結構域抗體可以是現(xiàn)有技術的任何抗體，或任何未來的單結構域抗體。單結構域抗體可以來自任何物種，包括但不限于，小鼠、人、駱駝、美洲駝、山羊、兔和牛。根據(jù)本發(fā)明一個方面，此處所應用的單結構域抗體是天然存在的單結構域抗體，已知為無輕鏈的重鏈抗體。此類單結構域抗體公開于如WO 9404678。為清楚起見，源自天然無輕鏈的重鏈抗體的可變結構域在此稱為VHH或nanobody，以便與四鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH區(qū)別開。此類VHH分子可源自在駱駝科物種中產(chǎn)生的抗體，例如，在駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝和駝馬中。除駱駝科外其他物種可產(chǎn)生天然無輕鏈的重鏈抗體；此類VHHs也屬于本發(fā)明范圍。
VHHs，根據(jù)本發(fā)明，正如技術人員所知，是源自天然無輕鏈的免疫球蛋白的重鏈可變結構域，如WO 9404678所述的源自駱駝科的那些(下文稱為VHH結構域或nanobody)。VHH分子比IgG分子約小10倍。其為單一多肽，非常穩(wěn)定，耐受極端pH和溫度條件。另外，它們抗蛋白酶的作用，常規(guī)抗體沒有這個能力。此外，VHHs體外表達產(chǎn)生高產(chǎn)量、正確折疊的功能VHHs。另外，Camelids產(chǎn)生的抗體識別的表位與體外通過使用抗體文庫或通過免疫非Camelids的哺乳動物產(chǎn)生的抗體所識別表位不同(WO 9749805)。同樣，抗清蛋白VHHs可以更有效的方式與已知作為載體蛋白的血清清蛋白相互作用。作為載體蛋白，血清清蛋白的一些表位難以被結合的蛋白、多肽和小的化合物接近。由于已知VHHs結合“不尋?！被蚍浅Ｒ?guī)表位如腔(WO 9749805)，此類VHHs與循環(huán)清蛋白的結合親和力得以提高。
VHH的類別本發(fā)明還涉及多肽構建體，其中單結構域抗體是針對此處所提靶目標的VHH，其中VHH屬于具有類似人的序列的類別。按照Kabat編號，其類別特征在于VHHs在第45位攜帶的氨基酸選自由甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺組成的組，例如L45群體。結合vWF的SEQ IDNO1和SEQ ID NO3所示VHH序列屬于這種類似人的類別的VHH多肽。同樣，屬于此類的肽與人VH框架區(qū)氨基酸序列高度同源，所述肽可以向人類直接給藥而不預期由此產(chǎn)生不需要的免疫反應，而且無需進一步人源化的負擔。
因此，本發(fā)明一方面允許直接向所需受試者給予多肽構建體，所述多肽構建體包括一個或多個對應SEQ ID NO1和3任一個所示序列的單結構域抗體。
SEQ ID NO16和18所示另一類類似人的駱駝科單結構域抗體已描述于WO 03/035694，包含人源或其他物種來源的常規(guī)抗體中典型發(fā)現(xiàn)的疏水FR2殘基，但通過在103位以一些殘基如帶電荷的精氨酸殘基、絲氨酸或不帶電殘基如甘氨酸替換雙鏈抗體VH上的保守色氨酸殘基，彌補了其親水性損失。同樣，屬于這兩類的肽與人VH框架區(qū)氨基酸序列高度同源，將所述肽向人類直接給藥無預期的不需要的免疫反應，并且無進一步人源化的負擔。
本發(fā)明應用的任一VHHs可以是傳統(tǒng)類別或類似人的駱駝科抗體類別。所述抗體可以針對整個靶目標或其片段。這些多肽包括全長駱駝科抗體，即Fc和VHH結構域，駱駝科抗體重鏈與人Fc結構域的嵌合形式。
針對靶目標的多肽構建體的一個或多個單結構域抗體可以是相同序列。備選地，它們不都具有相同序列。多肽構建體包括不都具有相同序列、但針對相同靶目標的抗靶目標單結構域抗體，或其片段、其一個或多個抗原，這也隸屬本發(fā)明范圍。
本發(fā)明另一方面是包括兩個或多個單結構域抗體的多肽構建體，其中任何兩個單結構域抗體針對不同靶目標，即針對vWF、vWF A1結構域、活化的vWF的A1結構域、vWF A3結構域、gpIb和膠原蛋白任何一種。
本發(fā)明另一方面是雙特異性多肽構建體，包括抗vWF A1結構域、活化的vWF的A1結構域的單結構域抗體，及抗vWF A3結構域的另一單結構域抗體。該雙特異性多肽構建體抑制vWF與膠原蛋白之間及vWF與血小板之間的相互作用。
依照本發(fā)明另一方面，可包括兩個或多個已連接的單結構域抗體的多肽構建體。該單結構域抗體可以具有相同序列，針對相同靶目標或抗原。根據(jù)連接的VHHs數(shù)量，多價VHHs可以是二價(2VHHs)、三價(3VHHs)、四價(4VHHs)或具有更高效價的分子。
本發(fā)明也涉及一種發(fā)現(xiàn)，即此處公開的還包括一個或多個單結構域抗體，每個針對受試者的血清蛋白的多肽構建體，與非所述構建體部分的抗靶目標單結構域抗體的半衰期相比，在所述受試者循環(huán)中的半衰期令人驚訝地顯著延長。此外，發(fā)現(xiàn)所述構建體顯示相同的VHHs優(yōu)良性質，如在小鼠內(nèi)保持完整的高穩(wěn)定性，耐受極端pH、高溫穩(wěn)定性和高的靶目標親和力。
此類構建體的實例由SEQ ID NO.13到15所示，其包括抗vWF VHH和抗小鼠血清清蛋白VHH。
因此，本發(fā)明另一實施方案是對應SEQ ID NO.13到15任一個所示序列的多肽構建體。
此類構建體的其他實例由SEQ ID NO.42到45所示，其包括人源化抗vWF VHH和抗小鼠血清清蛋白VHH。
因此，本發(fā)明另一實施方案是對應SEQ ID NO.42到45任一個所示序列的多肽構建體。
血清蛋白可以是受試者血清內(nèi)發(fā)現(xiàn)的任一合適蛋白，或其片段。在本發(fā)明一個方面，該血清清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、轉鐵蛋白或纖維蛋白原。按照意向用途例如進行有效治療所需的半衰期和/或靶抗原的區(qū)分，VHH配偶體可以針對上述血清蛋白中的一種。
針對血清清蛋白的單結構域抗體的實例是由對應于SEQ ID NOs16到19和SEQ ID NOs49到61任一個的序列所示的序列。
因此，本發(fā)明另一方面是還包括一個或多個抗血清單結構域抗體的多肽構建體，其中抗血清單結構域抗體的序列對應于SEO ID NOs16到19和49到61任一個所示序列。
此類構建體可以在受試者血清內(nèi)循環(huán)數(shù)日，減少治療頻率和給受試者帶來的不便，使得降低治療成本。此外，本發(fā)明一個方面是，此處公開的多肽構建體的半衰期可以通過構建體中抗血清蛋白單結構域抗體的數(shù)目來控制。在幾種情況下可控的半衰期是理想的，如采用定時給藥治療性多肽構建體的情況。
本發(fā)明另一實施方案是此處提及的多肽構建體，還包括溶解血栓試劑。
該溶解血栓試劑可以通過共價或非共價方式而非共價或共價結合到單結構域抗體上。此類共價方式見下述。非共價方式包括通過蛋白相互作用如生物素/鏈親和素，或通過免疫綴合物。
備選地，溶解血栓試劑可以與本發(fā)明多肽構建體同時、分別或順序給藥。
本發(fā)明另一方面是組合物，其包括至少一種此處公開的多肽構建體和至少一種溶解血栓試劑，用于同時、分別或順序向受試者給藥。
本發(fā)明一個方面是治療自身免疫疾病的方法，包括向個體同時、分別或順序給予有效劑量的至少一種本發(fā)明多肽構建體和至少一種溶解血栓試劑。
本發(fā)明另一方面是試劑盒，其包含至少一種本發(fā)明的多肽構建體和至少一種溶解血栓試劑，用于同時、分別或順序向受試者給藥。本發(fā)明一個方面是該試劑盒可按照本發(fā)明來使用。本發(fā)明一個方面是該試劑盒可用于治療此處所提及的疾病。
同時給藥意味著將多肽和溶解血栓試劑在相同時間給予受試者。例如，作為混合物或包括該成分的組合物。實例包括，但不限于，靜脈給藥的溶液、片劑、液體、外用霜劑等，其中每一制劑包括目的組分。
分別給藥意味著將多肽和溶解血栓試劑同時或實質上同時給藥。組分在試劑盒中作為分開的、未混合的制劑存在。例如，多肽和溶解血栓試劑作為單獨的片劑存在于試劑盒內(nèi)。可通過同時吞咽片劑或一個片劑接著另一個片劑吞咽對受試者給藥。
順序給藥意味著將多肽和溶解血栓試劑依次給予受試者。多肽和溶解血栓試劑在試劑盒中作為分開的、未混合的制劑存在。劑量之間有時間間隔。例如，一種組分可在另一組分給藥后高達336、312、288、264、240、216、192、168、144、120、96、72、48、24、20、16、12、8、4、2、1或0.5小時給藥。
順序給藥時，在給予另一組分之前和/或之后，可以一次或多次以不同劑量給藥一種組分。順序給藥可以與同時或順序給藥聯(lián)合應用。
下述多肽構建體的醫(yī)學用途，也適用于包括此處公開的多肽構建體和至少一種多肽溶解血栓試劑的組合物，用于如上所述同時、分別或順序向受試者給藥。
根據(jù)本發(fā)明溶解血栓試劑可包括，例如葡萄球菌激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、單鏈鏈激酶、尿激酶和?；w溶酶原鏈激酶復合物。
采用本領域已知方法或任何未來方法，可以將單結構域抗體連接起來形成此處公開的包括多于一個單結構域抗體的任一多肽構建體。例如，可以通過氨基酸殘基與有機衍生劑反應通過化學交聯(lián)使之融合，如Blatter等人，Biochemistry，24，1517-1524；EP294703所述。備選地，利用遺傳方法在DNA水平使單結構域抗體發(fā)生融合，即形成多核苷酸構建體，其編碼包括一個或多個抗靶目標單結構域抗體和一個或多個抗血清蛋白單結構域抗體的完整多肽構建體。產(chǎn)生二價或多價VHH多肽構建體的方法公開于PCT專利申請WO 96/34103。連接多個單結構域抗體的一個方法是通過遺傳途徑直接或利用肽連接物連接單結構域抗體編碼序列。例如，第一單結構域抗體C末端可以連接至下一個單結構域抗體的N末端。如要連接額外的單結構域抗體來構建和生產(chǎn)三聯(lián)、四聯(lián)等功能性構建體，也可擴展該連接模式。
可按照本領域已知方法或任一未來方法，由技術人員制備此處公開的多肽構建體。例如，VHHs可利用本領域已知方法獲得，比如通過免疫駱駝然后從其獲得雜交瘤，或通過利用本領域已知的分子生物學技術克隆單結構域抗體文庫然后利用噬菌體展示進行篩選。
本發(fā)明一個方面涉及一種發(fā)現(xiàn)，即表30中SEQ ID NOs1到7所示源自駱駝科VHHs的多肽結合vWF并抑制其與膠原蛋白相互作用。
因此，本發(fā)明一個實施方案是多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體對應于SEQ ID NOs1到7任一個所示序列。
本發(fā)明另一實施方案是對應于SEQ ID NOs8到12任一個所示序列的多肽構建體。該序列對應于針對vWF的單特異性多肽構建體(如SEQ ID NO8和11)或包括不同序列VHHs的異種特異性多肽構建體(如SEQ ID NO9，10和12)。
本發(fā)明另一實施方案是包括針對vWF的一個或多個單結構域抗體的多肽構建體。
血小板聚集是非常復雜的現(xiàn)象，體內(nèi)環(huán)境下，vWF和膠原蛋白的相互作用只在小動脈內(nèi)高切應力狀態(tài)下觀察得到。為評估高切應力狀態(tài)下血小板聚集情況，發(fā)明者進行了灌注試驗。實施例16代表利用特異性vWF-A3結合物SEQ ID NO1到12獲得的切應力數(shù)據(jù)。該實驗代表了小動脈內(nèi)血管壁受損時(如血管成形術過程中)發(fā)生的相互作用。
令人驚訝的是，在高切應力下單價VHHs在血小板聚集實驗中表現(xiàn)良好在0.08至0.3μg/ml之間的濃度對血小板聚集的抑制率達50％。相比而言，抑制與膠原蛋白的相互作用的IgG vWF特異性抗體，82D6A3，對血小板聚集抑制50％則需要約20倍更高的濃度(Vanhoorelbeke K.等人，Journal of BiologicalChemistty，2003，27837815-37821)。在ELISA中單價VHHs的IC50比82D6A3IgG的IC50差高達7倍的條件下，這些結果出人意料。
這清楚證明，該大分子量抗體不適合與啟動聚集或在其過程中的大分子發(fā)生相互作用，比如那些參與血小板介導的聚集的大分子。vWF形成多達60個單體的多聚體(最終多聚體分子量高達兩千萬道爾頓)。事實上，已發(fā)現(xiàn)不是所有的A3結構域都易于接近82D6A3(Dongmei WU，Blood，2002，99，3623-3628)。另外，大分子量常規(guī)抗體的限制組織滲透，例如在受損血管壁部位發(fā)生血小板介導的聚集過程中。
Nanobody具有獨特結構，由單可變結構域組成。源自駱駝科抗體的VHH分子是已知最小的完整抗原結合結構域之一(約15kDa，或比常規(guī)IgG小10倍)，因此非常適于運送至致密組織，及進入到參與或啟動血小板介導的聚集過程的大分子之間的有限空間內(nèi)。
據(jù)我們所知，這是首次實驗表明，小分子nanobody對此類大分子之間相互作用的抑制優(yōu)于大分子完整抗體。
盡管Nanobody分子量小、因而有利于滲透，還令人驚訝地是，這種小分子能夠抑制大的多聚體例如vWF(高達60個單體)與膠原蛋白之間的相互作用，并具有很高效率。已描述了只有大的多聚體形式的vWF具有止血活性(Furlan，M.，1996，Ann.Hematol.72341-348)。與單聚體vWF片段相比，多聚體vWF與膠原蛋白結合的親和力高～100倍。
高切應力實驗結果表明，可以給患者更低劑量。因此，期待副作用更低(例如免疫原性或出血問題)。
本發(fā)明還涉及一種發(fā)現(xiàn)，即來自美洲駝單結構域抗體的對應SEQ ID NOs23到31任一個所示序列的多肽，與vWF A1結構域結合。
因此，本發(fā)明另一實施方案是包括一個或多個單結構域抗體的多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體對應SEQ ID NOs 23到31任一個所示序列。
本發(fā)明另一實施方案是對應SEQ ID NOs32到34任一個所示序列的多肽構建體。該序列對應包括同樣序列的VHHs的二價多肽構建體，二者都抗vWFA1結構域。
發(fā)明者進行了在流腔中的灌注實驗，研究高切應力條件下，包括SEQ IDNOs23到31所示序列的多肽構建體對血小板聚集的效應。實施例25提供了利用特異性vWF-A1結合物SEQ ID NOs 23到31獲得的切應力數(shù)據(jù)。
本發(fā)明還涉及一種發(fā)現(xiàn)，即來自美洲駝單結構域抗體的對應SEQ ID NOs62到65任一個所示序列的多肽，選擇性結合vWF活性構象(比如與膠原蛋白結合后)的A1結構域，而不是自由循環(huán)的非活性vWF。這使得抗血栓形成試劑更安全有效。此處應用的“選擇性結合”vWF A1結構域是指美洲駝抗體對vWF活性構象的親和力比非活性構象高至少10倍，優(yōu)選100倍。
因此，本發(fā)明另一實施方案是包括一個或多個單結構域抗體的多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體對應SEQ ID NOs62到65任一個所示序列。
本發(fā)明另一實施方案中，多肽構建體包括針對相同靶目標的一個或多個單域抗體，還包括針對相同靶目標但是相同結構域的不同表位的一個或多個單結構域抗體。
例如，SEQ ID NOs9、10和12所示序列是異種特異性多肽構建體，包括針對vWF A3結構域不同表位的VHHs。因此，本發(fā)明另一實施方案是對應SEQID NOs9、10和12任一個所示序列的多肽構建體。
本發(fā)明另一實施方案是多肽構建體，其中針對相同靶目標的單結構域抗體數(shù)是兩個或更多。
SEQ ID NOs8和11所示序列是包括針對vWF A3結構域中相同表位的VHHs的多肽構建體，其中VHH均具有相同序列。因此，本發(fā)明另一實施方案是對應SEQ ID NOs8和11任一個所示序列的多肽構建體。
本發(fā)明另一實施方案中，多肽構建體包括針對相同靶目標的一個結構域的一個或多個單結構域抗體，及針對相同靶目標但是相同靶目標的另一個結構域的一個或多個單結構域抗體。不同結構域的實例可以是vWF的A1和A3結構域。
另一實施例中，SEQ ID NOs20、21和22所示序列是異種特異性多肽構建體，包括針對vWF不同結構域，即vWF的A1和A3結構域上表位的VHHs。因此，本發(fā)明另一實施方案是對應SEQ ID NOs20、21和22任一個所示序列的多肽構建體。
本發(fā)明一個方面是，異種特異性多肽構建體中至少一種抗A1結構域的VHH識別vWF活性構象。該VHH對應SEQ ID NOs62到65任一個所示序列。
與單聚VHHs相比，該多肽構建體可具有優(yōu)越的抗血栓形成效應。在流腔中進行灌注實驗，研究高切應力下血小板聚集狀況，來研究這些多肽構建體的效應。實施例30表示利用包括抗vWF-A1 VHH和抗vWF-A3 VHH的異種特異性多肽構建體獲得的切應力數(shù)據(jù)。
本發(fā)明還涉及一種發(fā)現(xiàn)，即來自美洲駝單結構域抗體的對應SEQ ID NOs35到37所示序列的多肽，與I型和/或III型膠原蛋白結合。
因此，本發(fā)明另一實施方案是多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體對應SEQ ID NOs35到37任一個所示序列。
本發(fā)明另一實施方案中，多肽構建體包括針對I型和/或III型膠原蛋白的一個或多個單結構域抗體，及針對相同靶目標但是相同結構域中不同表位的一個或多個單結構域抗體。3P1-31_3P2-31和3L-41_3P2-31所示序列是異種特異性多肽構建體，包括針對I型膠原蛋白中不同表位的VHHs。因此，本發(fā)明另一實施方案是對應SEQ ID NOs46和47任一個所示序列的多肽構建體。
本發(fā)明另一方面是包括針對血小板糖蛋白Ib的一個或多個單結構域抗體的多肽構建體。
開發(fā)了鼠抗人vWF單抗，AJvW-2(lgG)，其抑制利托菌素或美洲矛頭蝮毒蛋白誘導的人血小板聚集過程中血小板糖蛋白Ib(gpIb)和馮維勒布蘭德因子(vWF)之間的相互作用(PCT申請?zhí)朩O 00/10601)。AJvW-2Fab，抑制狗冠狀動脈反復性血栓形成而不延長流血時間(Kageyama S等人，Thromb Res.，2001Mar 1；101(5)395-404)，防止豚鼠泡沫化損傷后血栓沉積和neointima形成(Kageyama S.等，Arterioscler Thromb Vasc Biol)2000Oct；20(10)2303-8)。
6B4抗體是抗純化的人gpIb的單克隆抗體(MoAb)(PCT申請?zhí)朩O01/10911 A2)。注射入狒狒體內(nèi)時，完整IgG和其F(ab’)(2)片段幾乎立即導致血小板減少，原因是二價F(ab’)(2)介導血小板交聯(lián)，或FcFc受體相互作用介導血小板聚集的活化(Cauwenberghs N等人，Arteriosclerosis，Thrombosis andVascular biology)2000，201347，及見如Cadroy Y等人，Blood，1994，833218-3224，Becker BH等人，Blood，1989，74690-694，Ravanat C.等人，Thromb.Haemost.1999，82528a摘要)。在血栓產(chǎn)生前，將Fab片段注射入狒狒體內(nèi)，抑制血小板在膠原蛋白富集的牛心包上沉積。但在血栓形成后注射Fab片段，看不到進一步的血栓形成抑制。
發(fā)現(xiàn)Fab片段對血小板上gpIb受體的親和力比完整IgG或F(ab’)2弱10倍(KD分別是49.2nM，4.7nM和6.4nM)。同樣，對利托菌素誘導的血小板聚集IC50值，對于Fab而言比IgG或F(ab’)2差高達10倍(IC50分別是40nM，4.5nM和7.7nM)。
可以預料的是，當利用完整IgG或F(ab’)2進行體內(nèi)治療所觀察到的FcFc受體介導的血小板聚集的活化和/或F(ab’)2介導的血小板交聯(lián)所致的意外的血小板減少，可通過應用VHH加以避免，因為VHH不含F(xiàn)c，也不是二價。如用6B4的Fab片段所觀察的一樣，不會損失親和力和活性，因為nanobody已經(jīng)是單結構域分子。
人源化抗體在美洲駝、單峰駱駝和駱駝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然存在的單結構域抗體展示了一類新型治療用分子，它們既具有單克隆抗體的優(yōu)點如特異性、低毒性，又具備小分子的優(yōu)點如組織滲透和穩(wěn)定性。不幸的是，基于這些蛋白開發(fā)合適的治療用產(chǎn)品時遇到了麻煩，因為這些產(chǎn)品源自駱駝科而非人類。非人類蛋白質所含的氨基酸殘基注射入人患者體內(nèi)時具有免疫原性。雖然研究已表明，源自駱駝科的VHH注射入小鼠體內(nèi)沒有免疫原性，但優(yōu)選用人類殘基替代駱駝科殘基。這些人源化多肽在人體內(nèi)應實質上沒有免疫原性，但仍保持野生多肽的親和力與活性。
人源化是指突變，這樣向人類患者給藥時免疫原性達最小或消失。根據(jù)本發(fā)明，將多肽人源化包括將一個或多個駱駝科氨基酸由人類共有序列中發(fā)現(xiàn)的人類相對應物所置換的步驟，多肽不會喪失其典型特性，即人源化不會顯著影響所產(chǎn)生多肽的抗原結合能力。
發(fā)明者已確定可修飾的抗體可變區(qū)(VHH)的氨基酸殘基，而不減小結構域與抗原的天然親和力但降低其對異源種系的免疫原性；在確定殘基發(fā)生修飾的VHH的應用，其用于對異源種系給藥；如此修飾的VHH。更具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng)過修飾用于人類給藥的VHHs的制備，所產(chǎn)生的VHH自身，及此類“人源化”VHHs在治療人類疾病中的用途。
發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)VHH多肽的人源化需在單個多肽鏈中插入或誘變僅有限數(shù)量的氨基酸，而不顯著喪失結合和/或抑制活性。這與scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化相反，后者需要在雙鏈，輕鏈和重鏈中導入氨基酸變化，并保留二條鏈的組裝。
人源化技術可通過一種方法實施，包括單獨或聯(lián)合置換以下任一殘基FR1的1、5、28和30位、FR2中37、44、45和47位標志氨基酸、FR3的殘基74、75、76、83、84、93和94及FR4中103、104、108和111位；按照Kabat編號法進行編號。此類人源化序列的實例見表30，SEQ ID NO.2、38到41。
實例63和64所示多肽與人種系VH DP-47高度同源。進一步的人源化需要在單個多肽鏈中導入和誘變有限數(shù)量的氨基酸。這不同于scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化，后者需要在雙鏈，輕鏈和重鏈中導入氨基酸變化，并保留二條鏈的組裝。
該多肽在FR2中包含與人類似的殘基。人源化需要對FR1的1和5位殘基進行誘變，該誘變通過利用所有組成成分克隆的引物插入，天然美洲駝序列不存在該突變。那些殘基突變不導致喪失結合和/或抑制活性。FR1人源化也需要28和30位發(fā)生誘變。那些殘基的突變同樣不導致喪失結合和/或抑制活性。
人源化也需要FR3中的74、75、76、83、84、93、94位殘基發(fā)生突變。那些殘基的突變不導致喪失結合和/或抑制活性。
人源化也需要FR4中104、108和111位殘基發(fā)生突變。Q108L突變導致在大腸桿菌中更低的生產(chǎn)水平。Camelid VHH 108位是暴露于溶劑的，而在人抗體中該位置隱藏于VH-VL界面(Spinelli，1996；Nieba，1997)。在分離的VH中，108位是暴露于溶劑的。插入非極性疏水Leu而不是極性不帶電Gln對分子固有的可折疊性/穩(wěn)定性有重大影響。
本發(fā)明一個實施方案是人源化VHH的方法，包括步驟(a)單獨或聯(lián)合置換以下任一殘基FR1的1、5、28和30位，
FR2中37、44、45和47位標志氨基酸，F(xiàn)R3的參見74、75、76、83、84、93和94，及FR4中103、104、108和111位；按照Kabat編號法進行編號。
該人源化序列的實例見表30，SEQ ID NO 2，38到41。
應用源自如小鼠、綿羊、山羊、兔等來源的抗體及其人源化衍生物來治療需對血小板相關聚集進行調節(jié)的疾病時，因幾個原因而存在問題。傳統(tǒng)抗體室溫下不穩(wěn)定，對于制備和儲存、儲存和運輸必須冷藏，需要必需的冷凍實驗設備、這導致費時費錢。有時在發(fā)展中國家冷凍不是切實可行的。該Fab分子表達產(chǎn)量很低，生產(chǎn)方法耗費大量人力。而且，制造或小規(guī)模生產(chǎn)所述抗體非常昂貴，因為表達完整和活性抗體所需的哺乳細胞系統(tǒng)需要時間和設備的高水平支撐，且產(chǎn)量很低。另外，傳統(tǒng)抗體結合活性依賴于pH，因此不適用于一般生理pH范圍以外的環(huán)境應用，例如，在治療胃出血、胃外科手術的情況下。此外，傳統(tǒng)抗體在低或高pH下不穩(wěn)定，因此不適于口服。然而已證實，Camelid抗體耐受苛刻條件，如極端pH、變性劑和高溫(Ewert S等人，Biochemistry，2002，Mar 19；41(11)3628-36)，因此使得它們適于口服遞送。另外，傳統(tǒng)抗體結合活性依賴于溫度，因此不適用于在生物活性溫度范圍外的溫度下(如37±20℃)用于分析或試劑盒。
SEQ ID NOs1到47和49到65所示多肽構建體及其衍生物不僅具有傳統(tǒng)抗體的優(yōu)良特性，如低毒性和高選擇性，而且它們還顯示其他特性。它們的可溶性更佳，意味著與傳統(tǒng)抗體相比，它們可以以更高的濃度儲存和/或給藥。它們在室溫下穩(wěn)定，意味著它們無需使用冷凍設備而制備、儲存和/或運輸，節(jié)省成本、時間，也環(huán)保(如實施例61所述)。與常規(guī)抗體相比，其他優(yōu)越的特性包括循環(huán)半衰期短，這一點可以按照本發(fā)明進行調節(jié)，例如通過清蛋白偶聯(lián)，一種雙特異性nanobody，其具有針對清蛋白的一個特異性，另一個針對靶目標、Fc偶聯(lián)、VHH偶聯(lián)(二價VHHs)或通過pegylation(如實施例41到54所述)。對于外科手術程序需要短且能夠控制的半衰期，例如，需要在有限時間內(nèi)抑制血小板介導的聚集。同樣，出現(xiàn)出血問題或其他并發(fā)癥時，可立即降低劑量。本發(fā)明多肽在通常生理范圍之外的pH和溫度下仍保持結合活性，這意味著其可在調節(jié)血小板介導的聚集需要的極端pH和溫度條件下進行應用，如胃外科手術、胃出血控制，室溫進行的分析等。本發(fā)明多肽還在極端pH下顯示延長的穩(wěn)定性，意味著其適于口服遞送。本發(fā)明多肽可通過在方便的重組宿主生物體如大腸桿菌和酵母這發(fā)酵來成本有效的生產(chǎn)，可獲得高的表達水平，不像常規(guī)抗體還需要昂貴的哺乳細胞培養(yǎng)裝置。本發(fā)明多肽產(chǎn)量的實例是1到10mg/ml(大腸桿菌)和高達1g/l(酵母)。本發(fā)明多肽與廣譜的不同抗原類型具有高結合親和力，結合常規(guī)抗體無法識別的表位的能力；例如，它們具有基于長CDR的環(huán)形結構，具有滲透到腔中的潛能，顯示酶抑制功能。另外，由于結合常常僅通過CDR3環(huán)路發(fā)生，可以設想源自CDR3的肽可用于治療(Desmyter等人，J Biol Chem，2001，27626285-90)。該肽制備方法見實施例65所述。本發(fā)明多肽還保持與酶或毒素作為融合蛋白的完全的結合能力。另外，可以預料的是，當利用完整IgG或F(ab’)2進行體內(nèi)治療時所觀察到的，F(xiàn)cFc受體介導的血小板聚集的活化和/或F(ab’)2介導的血小板交聯(lián)所致的意外的血小板減少(見Cauwenberghs N等人，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular biology，2000，201347)，可通過應用VHH加以避免，因為VHH不含F(xiàn)c，也不是二價。因此，SEQ ID NOs1到15、20到47、62到65所示多肽、其同源物或功能部分提供了治療和診斷與血小板介導的聚集相關疾病時相當可觀的節(jié)省成本和時間，并且需要該多肽的患者會較少遇到與常規(guī)試劑有關的問題。
在血小板介導的聚集過程中，結合有vWF的膠原蛋白粘附到血小板和/或血小板受體(二者的實例是gpIa/IIa、gpIb或膠原蛋白)上，最后導致血小板活化。血小板活化導致纖維蛋白原結合，最后血小板聚集。本發(fā)明范圍涵蓋提供多肽，其調節(jié)包括血小板介導的聚集的過程，比如vWF-膠原蛋白結合、vWF-血小板受體粘附、膠原蛋白-血小板受體粘附、血小板活化、纖維蛋白原結合和/或血小板聚集。該多肽源自駱駝科抗體，針對vWF、vWF A1、活化vWF A1結構域或A3結構域、gpIb或膠原蛋白，并如上所述具備與SEQ IDNOs1到15、20到47和62到65所示多肽相同的優(yōu)點。
根據(jù)本發(fā)明一個方面，多肽構建體可以是全長多肽構建體的同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構建體可以是全長多肽構建體的功能部分。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構建體可以是全長多肽構建體的同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構建體可以是全長多肽構建體的同源序列的功能部分。根據(jù)本發(fā)明一個方面，多肽構建體可包括多肽構建體序列。
根據(jù)本發(fā)明一個方面，用于形成多肽構建體的單結構域抗體可以是完整的單結構域抗體(如VHH)或其同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，用于形成多肽構建體的單結構域抗體可以是完整單結構域抗體的功能部分。根據(jù)本發(fā)明另一方面，用于形成多肽構建體的單結構域抗體可以是完整單結構域抗體的同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，用于形成多肽構建體的單結構域抗體可以是完整單結構域抗體的同源序列的功能部分。
本發(fā)明另一方面是對應SEQ ID NOs1到7、16到19、23到31、35到41和49到65任一個的單結構域抗體、其同源序列、和/或其功能部分。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構建體可以是親本序列的同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構建體可以是親本序列的功能部分。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構建體可以是親本序列的同源序列的功能部分。
正如此處應用的，同源序列可包括添加、缺失或替換一個或多個氨基酸，而實質上不改變該多肽的功能特性。缺失和替換的氨基酸數(shù)目優(yōu)選為高達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的同源序列包括通過添加氨基酸以形成人重鏈抗體和人單個結構域重鏈抗體而擴展的多肽，其不實質上改變未修飾多肽的功能特性。
本發(fā)明的同源序列可包括SEQ ID NOs1到47和49到65任一個所示已被人源化的多肽(如實施例63和64所述)。
本發(fā)明的同源序列可包括對應SEQ ID NOs1到47和49到65任一個所示序列的序列，其存在于其他駱駝科物種比如駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝、駝馬等。
同源序列表示序列的一致性，表示與親本序列具有高度序列一致性(超過70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％序列一致)的序列，優(yōu)選特征在于與親本序列的類似特性，即親和力，所述一致性利用已知方法計算。
備選地，同源序列還可以是根據(jù)下式在親本序列的任何數(shù)目位置進行允許的替換所產(chǎn)生的任一氨基酸序列絲氨酸由絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和天冬酰胺取代；精氨酸由精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和谷氨酸之一取代；亮氨酸由亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和纈氨酸之一取代；脯氨酸由脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和蘇氨酸之一取代；蘇氨酸由蘇氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸和谷氨酰胺之一取代；丙氨酸由丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和脯氨酸之一取代；纈氨酸由纈氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸之一取代；甘氨酸由甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和絲氨酸之一取代；異亮氨酸由異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸之一取代；苯丙氨酸由苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸之一取代；酪氨酸由酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸之一取代；
組氨酸由組氨酸、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸和精氨酸之一取代；谷氨酰胺由谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、組氨酸、蘇氨酸和精氨酸之一取代；天冬酰胺由天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和絲氨酸之一取代；賴氨酸由賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和精氨酸之一取代；天冬氨酸由天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺之一取代；谷氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸和精氨酸之一取代；蛋氨酸由蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和酪氨酸之一取代。
根據(jù)本發(fā)明，同源物可指超過50、100、200、300、400、500、600、800或1000個核苷酸、在嚴格雜交條件下(比如SAMBROOK等人所述，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗出版社，紐約)能與編碼多肽的核苷酸序列的反向互補鏈雜交的核苷酸序列。
正如此處應用的，功能部分指足夠長度的單結構域抗體使得感興趣的相互作用的親和力保持在1×10-6M或更高。
備選地，本發(fā)明單結構域抗體的功能部分包括完整氨基酸序列的部分缺失，但仍保持結合靶目標并與之相互作用所需的結合位點和蛋白結構域。
備選地，SEQ ID NO1到7任一個的功能部分是多肽，包括完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持抑制vWF與膠原蛋白結合所需的結合位點和蛋白結構域。
備選地，SEQ ID NOs23到31和62到65任一個的功能部分是多肽，包括完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持結合vWFA1結構域并與之相互作用所需的結合位點和蛋白結構域。
備選地，SEQ ID NOs35到37任一個的功能部分是多肽，包括完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持結合膠原蛋白并與之相互作用所需的結合位點和蛋白結構域。
備選地，功能部分包括多肽的完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持結合其所針對的抗原并與之相互作用所需的結合位點和蛋白結構域。其包括但不限于VHH結構域。
正如此處應用的，表示多肽序列的功能部分是指少于100％序列(如99％、90％、80％、70％、60％、50％等)，但包括5個或更多個氨基酸。
如同其表示編碼多肽序列的核苷酸序列的部分是指少于100％序列(如99％、90％、80％、70％、60％、50％等)，但包括15個或更多個核苷酸。
本發(fā)明一個方面是根據(jù)本發(fā)明多肽構建體的給藥可避免注射?；诔Ｒ?guī)抗體進行的治療具有作為藥物的顯著效力，因為它們對其靶目標有精確的特異性且很低固有毒性，但它們有一個重要的缺點相對不穩(wěn)定，對蛋白酶降解敏感。這意味著常規(guī)抗體藥物不能通過口服、舌下、局部、經(jīng)鼻、陰道、直腸或通過吸入給藥，因為它們無法耐受這些部位的低pH及這些部位和血液內(nèi)蛋白酶的作用，和/或者它們分子量太大。必須通過注射給藥(靜脈內(nèi)、皮下等)才能克服部分這些問題。注射給藥需要專業(yè)訓練以便正確并安全使用皮下注射器或針。還需要無菌設備、治療性多肽的液體制劑、該多肽的無菌且穩(wěn)定形式的安剖包裝及，對受試者而言，合適的入針部位。另外，受試者在注射前和接受注射時一般會有生理和心理壓力。
本發(fā)明一個方面通過提供本發(fā)明多肽構建體，克服了這些現(xiàn)有技術中的問題。該構建體足夠小、耐受力強并穩(wěn)定，可以口服、舌下、局部、經(jīng)鼻、陰道、直腸或吸入給藥而實質上不喪失活性。本發(fā)明多肽構建體避免了注射，不僅省錢省時，而且更方便和使受試者更舒適。
本發(fā)明一個實施方案是此處公開的多肽構建體，用于治療、預防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受一種物質調節(jié)，所述物質控制血小板介導的聚集，其可通過胃環(huán)境而該物質不被滅活。
正如本領域的技術人員所知，一旦擁有該多肽構建體，可應用制劑技術以在合適部位(如胃、結腸等)釋放最大量多肽。這種遞送方法對治療、預防和/或緩解靶目標位于腸道系統(tǒng)的疾病的癥狀非常重要。
本發(fā)明一個方面是通過給受傷者口服此處公開的多肽構建體來治療、預防和/或緩解疾病癥狀的方法，該疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，該物質可通過胃環(huán)境而不被滅活。
本發(fā)明另一實施方案是在此公開的多肽構建體的用途，用以制備治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，該物質可通過胃環(huán)境而不被滅活。
本發(fā)明一個方面是，通過給受試者口服在此公開的多肽構建體來遞送物質到腸道系統(tǒng)而不被滅活的方法，所述物質控制血小板介導的聚集。
本發(fā)明一個方面是，通過給受試者口服在此公開的多肽構建體來遞送物質到受試者的血液而不被滅活的方法，所述物質控制血小板介導的聚集。
本發(fā)明另一實施方案是在此公開的多肽構建體，用來治療、預防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，該物質被遞送到陰道和/或直腸道。
一個非限制性實施例是，根據(jù)本發(fā)明的制劑，其包含在此公開的多肽構建體，所述制劑是凝膠、霜劑、栓劑、薄膜的形式，或海綿狀的形式，或作為陰道環(huán)，其隨著時間緩慢釋放活性成分(此類制劑見EP 707473，EP 684814，US 5629001所述)。
本發(fā)明一個方面是，通過向受試者陰道和/或直腸給予在此公開的多肽構建體來治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質的調節(jié)，所述該物質被遞送到陰道和/或直腸道。
本發(fā)明另一實施方案是在此公開的多肽構建體的用途，用于制備治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的藥物的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質的調節(jié)，所述該物質被遞送到陰道和/或直腸道。
本發(fā)明一個方面是，通過向受試者陰道和/或直腸道給予在此公開的多肽構建體將物質遞送到陰道和/或直腸道而所述物質不被滅活的方法，所述物質控制血小板介導的聚集。
本發(fā)明一個方面是，通過向受試者陰道和/或直腸道給予在此公開的多肽構建體將物質遞送到受試者的血液而所述物質不被滅活的方法，所述物質控制血小板介導的聚集。
本發(fā)明另一實施方案是在此公開的多肽構建體，用于治療、預防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，所述物質被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。
在非限制性實施例中，根據(jù)本發(fā)明的制劑，其包含在此公開的多肽構建體，所述制劑是鼻噴霧劑(如氣溶膠)或吸入劑的形式。由于該多肽構建體很小，它可以比治療性IgG分子更有效地到達其靶目標。
本發(fā)明一個方面是通過經(jīng)口或鼻吸入向受試者給予在此公開的多肽構建體來治療、預防和/或緩解疾病癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，所述物質被遞送到上呼吸道和肺。
本發(fā)明另一實施方案是在此公開的多肽構建體的用途，用于制備治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，所述物質被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺而所述多肽不被滅活。
本發(fā)明一個方面是通過向受試者鼻、上呼吸道和/或肺給予在此公開的多肽將物質遞送到鼻、上呼吸道和肺而不滅活的方法，所述物質控制血小板介導的聚集。
本發(fā)明一個方面是通過向受試者鼻、上呼吸道和/或肺給予在此公開的多肽將物質遞送到受試者的血液而不滅活的方法，所述物質控制血小板介導的聚集。
本發(fā)明一個實施方案是在此公開的多肽構建體，用于治療、預防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，所述物質被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜通透性。由于它們分子量小，在此公開的多肽構建體可更有效地通過受試者腸粘膜，到達血液，這些受試者患有導致腸粘膜通透性增加的疾患。
本發(fā)明一個方面是通過給受試者口服在此公開的多肽構建體來治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，所述物質被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜通透性。
還可通過本發(fā)明另一方面-應用活性轉運載體促進該過程。在本發(fā)明該方面，VHH與載體融合，后者可促進從腸壁到血液的轉移過程。在非限制性實施例中，該“載體”是融合到治療性VHH上的第二個VHH。應用本領域已知方法制備該融合構建體。該“載體”VHH與腸壁上的受體特異性結合，后者誘導經(jīng)腸壁的活性轉移。
本發(fā)明另一實施方案是在此公開的多肽構建體的用途，用于制備治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，所述物質被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜通透性。
本發(fā)明一個方面是通過受試者口服本發(fā)明的多肽構建體，將控制血小板介導的聚集的物質遞送到腸粘膜而不使之失活的方法。
本發(fā)明一個方面是通過受試者口服本發(fā)明多肽構建體，將控制血小板介導聚集的物質運送到受試者的血液而不使之失活的方法。
還可通過本發(fā)明另一方面-應用活性轉運載體進一步促進該過程。在本發(fā)明該方面，此處描述的多肽構建體與載體融合，后者可促進從腸壁到血液的轉移過程。在非限制性實施例中，該“載體”是融合到該多肽上的VHH。應用本領域已知方法制備該融合構建體。該“載體”VHH與腸壁上的受體特異性結合，后者誘導經(jīng)腸壁的活性轉移。
本發(fā)明一個實施方案是此處描述的多肽構建體，用于治療、預防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，該物質能有效通過舌下組織。將在此公開的該多肽構建體制劑，例如片劑、噴霧劑、滴劑置于舌下，經(jīng)粘膜吸收到舌下毛細血管網(wǎng)。
本發(fā)明一個方面是，通過舌下給予受試者在此公開的多肽構建體來治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，該物質能有效通過舌下組織。
本發(fā)明另一實施方案是在此公開的多肽構建體的用途，用于制備治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，該物質能通過舌下組織。
本發(fā)明一個方面是通過舌下給予受試者在此公開的多肽構建體，遞送控制血小板介導的聚集的物質到舌下組織而不使之失活的方法。
本發(fā)明一個方面是通過給受試者口服在此公開的多肽構建體，遞送控制血小板介導的聚集的物質到受試者血液而不使之失活的方法。
本發(fā)明一個實施方案是在此公開的多肽構建體，用于治療、預防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，該物質能有效通過皮膚。
將所述多肽構建體的制劑例如，霜劑、薄膜、噴霧劑、滴劑、貼片劑置于皮膚，經(jīng)皮吸收。
本發(fā)明一個方面是通過局部給予受試者此處公開的多肽構建體來治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質的控制，所述物質能有效通過皮膚。
本發(fā)明另一實施方案是在此公開的多肽構建體的用途，用于制備治療、預防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導的聚集的物質調節(jié)，該物質能有效通過皮膚。
本發(fā)明一個方面是通過對受試者局部給予在此公開的多肽構建體，將物質遞送到皮膚而不被滅活的方法，所述物質控制血小板介導的聚集。
本發(fā)明一個方面是通過對受試者具有給予在此公開的多肽構建體，將物質遞送到受試者的血液的方法，所述物質控制血小板介導的聚集。
在本發(fā)明另一實施方案中，在此公開的多肽構建體還包括載體單結構域抗體(如VHH)，其作為活性轉運載體轉運該多肽構建體經(jīng)肺腔至血液。
多肽構建體還包括特異性結合粘膜表面(支氣管上皮細胞)上存在的受體的載體，導致該多肽從肺腔到血液活性轉移。該載體單結構域抗體可與該多肽構建體融合。應用本領域已知及本文描述的方法制備該融合構建體?！拜d體”單結構域抗體與粘膜表面上的受體特異性結合，后者誘導經(jīng)表面的活性轉移。
本發(fā)明另一方面是確定哪種單結構域抗體(如VHHs)經(jīng)鼻給藥活性轉運到血液內(nèi)的方法。類似地，將首次用于實驗或免疫VHH噬菌體文庫經(jīng)鼻給藥，并于給藥后不同的時間點，分離血液或器官，拯救(rescue)已被活性轉移到血液中的噬菌體。用于從肺腔到血液活性轉移的受體的非限制性實例是Fc受體N(FcRn)。本發(fā)明一個方面包括根據(jù)該方法鑒別的VHH分子。隨后該VHH可用作載體VHH，用于經(jīng)鼻給藥將治療性VHH轉運到血液內(nèi)相應靶目標。
本發(fā)明一個實施方案是在此公開的多肽構建體，用于治療、預防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀涉及血小板介導的聚集或其機能障礙。所述疾病包括血栓形成血小板減少性紫癜(TTP)，短暫腦局部缺血性發(fā)作、不穩(wěn)定或穩(wěn)定型心絞痛、腦梗塞、心肌梗塞、周圍動脈閉塞性疾病、再狹窄。該疾患還包括冠脈旁路移植、或冠狀動脈瓣膜換置和冠脈介入治療如血管成形術、放置斯坦特印模、或動脈粥樣斑塊旋切引發(fā)的癥狀。
其他疾病為非閉塞性血栓形成、閉塞性血栓形成、動脈血栓形成、急性冠脈閉塞、再狹窄、PCTA或放置斯坦特印模后再狹窄、狹窄的動脈內(nèi)血栓形成、血管成形術、動脈粥樣斑塊旋切或動脈斯坦特印模后的增生、血管系統(tǒng)的閉塞綜合征或患病的動脈開放缺陷中的任何一種。
本發(fā)明一個方面是在此公開的多肽構建體，用于治療、預防和/或緩解疾病或病癥，所述疾病或病癥與血小板介導的聚集或其機能障礙相關，其中該多肽構建體被靜脈內(nèi)、皮下、口服、舌下、局部、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入給藥。
本發(fā)明另一方面是在此公開的多肽構建體用途，用于制備治療、預防和/或緩解疾病或病癥的藥物，所述疾病或病癥與血小板介導的聚集或其機能障礙相關，其中該多肽構建體被靜脈內(nèi)、皮下、口服、舌下、局部、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入給藥。
本發(fā)明另一方面是治療、預防和/或緩解疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥與血小板介導的聚集或其機能障礙相關，包括將在此公開的多肽構建體給予受試者，其中該異種特異性多肽構建體被靜脈內(nèi)、皮下、口服、舌下、局部、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入給藥。
本發(fā)明另一方面是在此公開的多肽構建體，用于治療、預防和/或緩解疾病或病癥，所述疾病或病癥與血小板介導的聚集或其機能障礙相關。
本發(fā)明另一方面是在此公開的多肽的用途，用于制備治療、預防和/或緩解與血小板介導的聚集或其機能障礙相關的疾病或病癥。
利用本發(fā)明多肽構建體篩選調節(jié)多肽與vWF(或gpIb或膠原蛋白)結合的試劑。在測量結合力或該多肽單獨置換的分析中一旦確定試劑，對試劑進行功能測試，以確定其是否為血小板介導的聚集的調節(jié)劑。
在一個置換實驗的實施例中，表達vWF或其片段的噬菌體或細胞在結合緩沖液中與例如，已被標記的SEQ ID NO1所示多肽溫育，加上或不加濃度升高的候選調節(jié)劑。為了驗證和校準測試，可利用濃度升高的未標記的該多肽進行對照競爭反應。溫育后，充分洗滌細胞，根據(jù)標記物用恰當方法測量結合的標記多肽(如閃爍計數(shù)、熒光等)。有候選調節(jié)劑的情況下結合的標記多肽量減少至少10％，說明候選調節(jié)劑置換了結合。若候選調節(jié)劑在1μM或更低濃度置換50％標記多肽(亞飽和多肽劑量)，則認為其在本文描述的該測試和其它測試中結合是特異性的。當然，可輕松利用上述方法篩選候選調節(jié)劑，所述候選調節(jié)劑改變SEQ ID NOs2到15、20到47和62到65所示多肽或在此公開的多肽構建體與參與血小板介導的聚集的大分子比如vWF、gpIb或膠原蛋白或其片段之間的結合。
備選地，結合或結合置換可通過表面胞質團共振(SPR)監(jiān)測。表面胞質團共振分析可作為定量方法測量兩種分子之間的結合，所述測量是通過固定的傳感器附近質量的變化進行，所述質量的變化是由來自液相的例如SEQ IDNO1所示多肽與固定于傳感器膜上的vWF或其片段之間的結合或結合損失所致。該質量變化被測量為在注射或去除所述多肽或候選調節(jié)劑后相對于時間的共振單位，用Biacore生物傳感器測量(Biocore AB)。根據(jù)Salamon等人(Salamon等人，1996，Biophys J.71283-294；Salamon等人，2001，BiophysJ.801557-1567；Ssalamon等人，1999，Trends Biochem.Sci.24213-219，每一篇都在此引用以供參考)所述方法，可將如vWF或其片段固定在薄膜脂質膜中的傳感器芯片上(例如，研究級CM5芯片；Biocore AB)。Sarrio等人證明SPR可用于檢測結合固定到芯片上脂質層內(nèi)的GPCR A(1)腺苷受體的配體(Sarrio等人，2000，Mol.Cell.Biol.205164-5174，在此引用以供參考)。本發(fā)明多肽構建體在SPR分析中的結合條件可由本領域技術人員利用Sarrio等人報道的條件作為起點進行精調。當然，可輕松利用上述方法篩選候選調節(jié)劑，其改變在此公開的多肽構建體與參與血小板介導的聚集的大分子比如vWF、gpIb或膠原蛋白或其片段之間的結合。
SPR至少有兩種方式分析結合的調節(jié)劑。首先，例如，可將SEQ ID NO1所示多肽與固定的vWF或其片段預結合，然后注射候選調節(jié)劑，濃度范圍是0.1nM到1μM?？梢远克Y合多肽的置換，允許檢測調節(jié)劑結合。備選地，膜結合的vWF或其片段可與候選調節(jié)劑預溫育，并被例如SEQ ID NO1所示多肽競爭。與不加調節(jié)劑的所述多肽和vWF或其片段之間的結合親和力相比，所述多肽和預溫育了調節(jié)劑的vWF或其片段的結合親和力的差別證明，有調節(jié)劑情況下所述多肽的結合或置換。另一個分析中，與不加候選調節(jié)劑所結合的所述多肽量相比，加上候選調節(jié)劑所結合的該多肽量減少10％或更多，說明候選調節(jié)劑抑制vWF或其片段與該多肽之間的相互作用。當然，可輕松利用上述方法篩選候選調節(jié)劑，其改變SEQ ID NOs2到15、20到47和62到65所示多肽或在此公開的多肽構建體與參與血小板介導的聚集的大分子比如vWF、gpIb或膠原蛋白或其片段之間結合。
另一種檢測抑制如SEQ ID NOs1到15、20到34、38到45或62到65所示多肽與vWF或其片段結合的方法采用熒光共振能量轉移法(FRET)。FRET是一種量子力學現(xiàn)象，其發(fā)生在彼此緊密接近(一般＜100_)的熒光供體(D)和熒光受體(A)之間，條件是D發(fā)射光譜和A的激發(fā)光譜重疊。待測分子如SEQ ID NO1所示多肽和vWF或其片段用供體和受體的互補熒光團對進行標記。當通過vWF多肽相互作用一起緊密結合時，供體熒光團受激發(fā)而發(fā)射的熒光波長與當所述多肽未與vWF或其片段結合時激發(fā)波長發(fā)射的波長不同，準備通過測量每一波長的發(fā)射強度可以對結合與未結合的分子進行定量。標記vWF或其片段的供體熒光團為本領域熟知。特別引起人們興趣的是A的變異體。維多利亞GFP已知為青色FP(CFP，供體(D))和黃色FP(YFP，受體(A))。作為一個實例，YFP變體可與vWF或其片段形成融合蛋白。GFP變體作為融合物的表達載體(Clontech)以及熒光團標記試劑(Molecular Probes)為本領域熟知。將候選調節(jié)劑加入到熒光標記的多肽與YFP-vWF混合物中可抑制能量轉移，這通過如，相對沒有候選調節(jié)劑的樣品，YFP熒光減弱得到證明。在用FRET檢測vWF多肽相互作用的分析中，相對不含候選調節(jié)劑的樣品而言，含有該候選調節(jié)劑的樣品中在受體波長發(fā)射的熒光強度減弱10％或更多，說明該候選調節(jié)劑抑制vWF多肽相互作用。當然，可輕松利用上述方法篩選候選調節(jié)劑，其改變SEQ ID NOs2到15、20到47和62到65所示多肽或在此公開的多肽構建體與參與血小板介導的聚集的大分子比如vWF、gpIb或膠原蛋白或其片段之間的結合。
FRET的變體利用熒光淬滅來監(jiān)測分子相互作用。相互作用對中的一個分子用熒光團標記，另一個用當緊密靠近時能淬滅熒光團熒光的分子標記。激發(fā)時熒光的變化提示標記有熒光團淬滅劑對的分子聯(lián)系的變化。一般而言，標記vWF或其片段熒光增強說明攜帶淬滅劑的多肽分子(如本發(fā)明多肽構建體)已被置換。對于淬滅分析，相對于沒有候選調節(jié)劑的樣品而言，含有該候選調節(jié)劑的樣品熒光發(fā)射強度增加10％或更多，說明該候選調節(jié)劑抑制vWF多肽相互作用。當然，可輕松利用上述方法篩選候選調節(jié)劑，其改變在此公開的多肽構建體與參與血小板介導的聚集的大分子比如vWF、gpIb或膠原蛋白或其片段之間的結合。
除表面胞質團共振和FRET方法外，熒光偏振測量可用于定量結合。熒光標記分子的熒光偏振值有賴于轉動相關時間(rotational correlation time)或翻轉率(tumbling rate)。復合體，比如那些通過vWF或其片段與熒光標記的多肽(如熒光標記的SEQ ID NOs1到15、20到34、38到45和62到65任一個所示多肽)所形成的復合體，偏振值要高于未復合的標記多肽。若候選抑制劑破壞或抑制vWF或其片段與所述多肽之間的相互作用，那么相對于無候選抑制劑的混合物而言，vWF多肽相互作用的包含候選抑制劑導致熒光偏振值降低。熒光偏振充分適合于鑒定破壞vWF多肽復合體形成的小分子。與沒有候選調節(jié)劑的樣品的熒光偏振相比，含有該候選調節(jié)劑的樣品的熒光偏振下降10％或更多，說明該候選調節(jié)劑抑制vWF多肽相互作用。當然，可輕松利用上述方法篩選候選調節(jié)劑，其改變在此公開的多肽構建體與參與血小板介導的聚集的大分子比如vWF、gpIb或膠原蛋白或其片段之間的結合。
另一種監(jiān)測vWF多肽相互作用的備選方案采用生物傳感器分析。ICS生物傳感器已在本領域有述(澳大利亞膜生物技術研究所；Comell B，Braach-Maksvytis V，King L，Osman P，Raguse B，Wieczorek L，和Pace R.“Abiosensor that uses ion-channel switches”Nature，1997，387，580)。在該技術中，將vWF或其片段與多肽(如SEQ ID NOs1到15、20到34、38到45和62到65任一個所示多肽)的聯(lián)系，與懸浮的雙層膜內(nèi)gramacidin促進的離子通道閉合偶聯(lián)一起，并從而與生物傳感器的導納(admittance)(類似于impedence)的可測量的變化偶聯(lián)。該方法在導納變化的6個數(shù)量級內(nèi)是線性的并且非常適于小分子組合文庫的大規(guī)模、高通量篩選。相對于沒有候選調節(jié)劑的樣品的導納，含有候選調節(jié)劑的樣品中導納的10％或更大的變化(增加或減小)表明候選調節(jié)劑抑制vWF或其片段與所述多肽的相互作用。重要的是注意到在檢測vWF或其片段與多肽(比如，SEQ ID NOs1到15、20到34、38到45和62到65任一個所示多肽)的相互作用的測定中，可能相互作用的調節(jié)劑不必一定直接與在生理上與所述多肽相互作用的蛋白質的結構域相互作用。還可能調節(jié)劑在從相互作用部位除去的位置相互作用并導致，例如，vWF中的構象變化。以該方式作用的調節(jié)劑(抑制劑或激動劑)仍然可以作為調節(jié)血小板介導的聚集。當然，可輕松利用上述方法篩選候選調節(jié)劑，其改變于在此公開的多肽構建體與參與血小板介導的聚集的大分子比如vWF、gpIb或膠原蛋白或其片段之間結合。
所描述的任一種結合測定法都可用于確定樣品(例如，組織樣品)中試劑的存在，該試劑結合vWF或其片段，或者影響例如SEQ ID NO1到15、20到34、38到45或62到65任一個所示多肽與vWF結合。為此，在樣品的存在或缺乏時，將vWF或其片段與所述多肽反應，并且用對所使用的結合測定適宜的方法測量多肽結合。所述多肽的結合減小10％或者更多表明該樣品含有調節(jié)所述多肽與vWF或其片段結合的試劑。當然，上面的一般化方法可容易地應用于篩選候選調節(jié)劑，該候選調節(jié)劑改變此處公開的多肽構建體與參與血小板介導的聚集的大分子比如vWF、gpIb或膠原蛋白或其片段之間結合。
細胞根據(jù)本發(fā)明有用的細胞優(yōu)選選自細菌細胞例如大腸桿菌、酵母細胞例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)、畢赤巴斯德酵母(P.pastors)、昆蟲細胞，或哺乳動物細胞。
根據(jù)本發(fā)明使用的細胞可以是任一細胞，依照本發(fā)明編碼含有SEQ IDNOs1到47和49到65任一個的多肽，或根據(jù)本發(fā)明的多肽構建體的核酸序列可被導入該細胞，從而該多肽可以以如文中定義的天然水平或者高于天然水平表達。優(yōu)選地，在細胞中表達的本發(fā)明的多肽顯示出如文中定義的正常的或者接近正常的藥理學。最優(yōu)選地，在細胞中表達的本發(fā)明的多肽包括核苷酸序列，該核苷酸序列能夠編碼表30中給出的氨基酸序列或者能夠編碼與表30中給出的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，細胞選自COS7-細胞、CHO細胞、LM(TK-)細胞、NIH-3T3細胞、HEK-293細胞、K-562細胞或者1321N1星形細胞瘤細胞(astrocytoma cell)以及其他可被轉染的細胞系。
通常，“治療有效量”、“治療有效劑量”和“有效量”指實現(xiàn)所希望的一個或多個結果(治療或預防血小板聚集)所需的量。本領域技術人員將認識到潛能和因此“有效量”將隨著用于本發(fā)明中抑制血小板聚集的多種化合物而變。本領域技術人員將容易評估該化合物的潛能。
如文中所用的，術語“化合物”指此處公開的多肽構建體、或能夠編碼所述多肽的核酸、或者依照此處描述的篩選方法鑒定的試劑或包含一個或多個衍生化的氨基酸的所述多肽。
“藥學上可接受的”指不是生物學上的材料或者不是不希望的材料，即，該材料可以與該化合物一起施用于個體而不導致任何不希望的生物學效應或不與藥物組合物中所含有的其他組分的任一種以有害的方式相互作用。
在此公開的發(fā)明對受試者有助于治療或預防血小板介導的聚集的疾病，包括給予藥物有效量的化合物或組合物，抑制BTK及抑制血小板介導的聚集。
在此公開的發(fā)明對受試者有助于治療或預防血栓形成的第一步，包括給予藥物有效量的根據(jù)本發(fā)明的化合物或組合物。
在此公開的發(fā)明對受試者有助于治療或預防再狹窄，包括給予藥物有效量的根據(jù)本發(fā)明的化合物或組合物。
本發(fā)明一個方面是本發(fā)明化合物的用途，用于治療或預防受試者血小板介導的聚集的疾病，包括聯(lián)合另一種例如阿司匹林給予藥物有效量的化合物。
本發(fā)明一個方面是本發(fā)明化合物的用途，用于治療或預防受試者血小板介導的聚集的疾病，包括聯(lián)合另一種例如溶解血栓試劑給予藥物有效量的化合物。
本發(fā)明另一方面是本發(fā)明化合物的用途，用于治療或預防個體斑塊或血栓。所述斑塊或血栓可在高切應力條件下形成。在血栓形成和再閉塞中，血小板在高切應力速率下發(fā)生可逆的粘附或栓縛，然后通過血小板上的膠原蛋白受體形成牢固粘附，導致血小板活化；血小板通過vWF栓縛到受損血管壁內(nèi)裸露的膠原蛋白上，這在高切應力條件下尤為重要。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多肽構建體在高切應力條件下出人意料的表現(xiàn)良好(例如，實施例16)。
本發(fā)明并不限于給藥包括本發(fā)明單一化合物的制劑。本發(fā)明范圍還包括聯(lián)合治療，其中將包括超過一種本發(fā)明化合物的制劑給予所需患者。
血小板介導的聚集的疾病包括，但不限于，不穩(wěn)定型心絞痛、穩(wěn)定型心絞痛、心絞痛、栓子形成、深靜脈血栓形成、溶血性尿毒癥綜合征、溶血性貧血、急性腎衰竭、溶解血栓并發(fā)癥、血栓形成血小板減少性紫癜、彌散性血管內(nèi)comgelopathy、血栓癥、冠心病、血栓栓塞并發(fā)癥、心肌梗塞、再狹窄和心房纖維性顫動中的血栓形成、慢性不穩(wěn)定型心絞痛、短暫局部缺血性發(fā)作和中風、周圍血管疾病、動脈血栓形成、子癇前期、栓塞、再狹窄和/或血管成形術、頸動脈內(nèi)膜切除術、血管移植物的接合及慢性接觸心血管裝置后的血栓形成。該疾病也可產(chǎn)生自溶栓治療過程中和治療后、血管成形術后及冠脈旁路(術)后的血栓栓塞和再閉合。
如何應用本文所述標準測試或應用其他類似測試方法確定血小板介導的聚集的抑制，為本領域熟知。優(yōu)選地，該方法導致血小板介導的聚集減少至少10％，包括，例如，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，或任何中間數(shù)值，最優(yōu)選90％。
類似地，該方法導致細胞內(nèi)鈣動員下降至少10％，包括，例如，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。類似地，該方法導致磷酸化PLCg2水平下降至少10％，包括，例如，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。
例如可通過比較時序血小板凝集計(chronology platelet aggregometer)中的光阻(optical impedence)來測量這種減少。也可使用任何其他已知測量方法。例如，(1)膠原蛋白刺激時，膠原蛋白誘導的細胞內(nèi)鈣動員的水平隨時間增加，因此測量可包括測量膠原蛋白誘導的細胞內(nèi)鈣水平，或(2)膠原蛋白刺激時，磷酸化PLCg2水平隨時間增加，因此測量可包括測量磷酸化PLCg2水平。
可體外接觸細胞，例如通過將本發(fā)明化合物加到培養(yǎng)基中(通過持續(xù)輸注、通過丸劑運送或通過將培養(yǎng)基更換為含有化合物的培養(yǎng)基)，或將化合物加到體內(nèi)細胞外流體(通過局部運送、全身運送、吸入、靜脈內(nèi)注射、丸劑運送或持續(xù)輸注)進行。根據(jù)化合物在浸泡細胞或細胞群的培養(yǎng)基或胞外流體中以有效生理水平或推斷的有效生理水平存在的時間，來確定與細胞或細胞群“接觸”的持續(xù)時間。優(yōu)選地，接觸的持續(xù)時間是1-96小時，更優(yōu)選地，是24小時，但該時間會隨化合物的半衰期而變，本領域技術人員可應用常規(guī)實驗對其進行優(yōu)化。
可將用于本發(fā)明的化合物配制成藥用組合物，并通過適于選擇的給藥途徑的各種形式施用于哺乳動物宿主，如人類患者或家畜，所述給藥途徑即口服或胃腸外，通過鼻內(nèi)或吸入、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、局部或皮下路徑。
本發(fā)明化合物也可應用運送的基因治療方法給藥。見如美國專利號No5,399,346，在此全文引用以供參考。應用運送的基因治療方法，轉染有本發(fā)明化合物的基因的原代細胞還可另外轉染組織特異性啟動子以定位特異性器官、組織、移植物、腫瘤或細胞。
因此，本發(fā)明化合物可聯(lián)合藥用載體如惰性稀釋液或可同化的食用載體全身給藥，如口服。它們可封入硬或軟殼明膠膠囊內(nèi)，可壓縮成片劑或直接摻入到患者食物內(nèi)?？诜o藥治療的話，活性化合物可聯(lián)合一種或多種賦形劑，以可吸收的片劑、口含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸液、糖漿、糯米紙囊劑等等形式使用。此類組合物和制劑應包含至少0.1％活性化合物。當然，組合物和制劑的百分比可發(fā)生變化，可便利地介于所給單位劑量形式的約2％到約60％重量之間。該治療有用組合物中活性化合物的數(shù)量應獲得有效劑量水平。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等等還可以含有下面的結合劑，如黃蓍樹膠、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或者明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等等；潤滑劑如硬脂酸鎂；和甜味劑如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦或者增香劑如歐薄荷、冬青油，或者櫻桃香料。當單位劑型是膠囊劑時，其除了上面類型的物質，還可以含有液態(tài)載體，如植物油或者聚乙二醇。可以存在多種其他材料作為包衣或者另外改變固態(tài)單位劑型的物理形式。例如，用明膠、蠟、蟲膠或者糖等等可以將片劑、丸劑或者膠囊劑包衣。糖漿劑或者酏劑可以含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或者果糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料和香料如櫻桃或者桔子香料。當然，用制備任一單位劑型中的任一材料都應該是藥學上可接受的并且在用量內(nèi)實質上無毒。此外，活性化合物可被摻入緩釋制劑和裝置。
活性化合物也可通過輸注或注射而靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)給藥?；钚曰衔锶芤夯蚱潲}可在水中制備，并隨意與無毒表面活性劑混和。分散相也可在甘油、液體聚乙二醇、醋酸甘油和其混合物以及油中制備。在普通儲存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑，防止細菌滋生。
還可以通過灌注或注射，靜脈內(nèi)或者腹膜內(nèi)地施用活性化合物?？梢栽谒兄苽浠钚曰衔锘蛘咂潲}的溶液，其任選與無毒表面活性劑混合。還可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇、三醋精，和它們的混合物和油中制備分散劑。在保存和使用的通常條件下，這些制劑含有用于防止微生物生長的防腐劑。
適于注射或灌注的藥學劑型可包括含有活性成分的無菌水性溶液或者分散劑或者無菌粉劑，其適于臨時制備無菌注射液或者灌注液或分散劑，任選封裝在脂質體中。在所有情況中，最終劑型在生產(chǎn)和保存條件下必須是無菌的、液態(tài)和穩(wěn)定的。
液態(tài)載體或賦形劑可以是溶劑或者液態(tài)分散介質，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇，等等)、植物油、無毒甘油酯，和它們的適宜的混合物。通過例如，形成脂質體，對于分散劑的情況，通過保持所需要的顆粒大小或者通過使用表面活性劑可以保持適當流動性。通過多種抗細菌和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，等等可以防止微生物的作用。在許多情況中，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖、緩沖劑或者氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠可以延長可注射組合物的吸收。
將適當溶劑中的所需要的量的活性化合物與上面列舉的多種其他成分(如果需要)合并，然后過濾除菌可以制備無菌注射液。對于用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況，優(yōu)選制備方法是真空干燥和冰凍干燥技術，這些技術產(chǎn)生前面無菌過濾溶液中存在的活性成分加上額外的所希望的成分的粉末。
對于局部施用，本化合物可以以純的形式應用(即，當它們是液體時)。然而，通常希望將它們作為組合物或者制劑，聯(lián)合皮膚病學上可接受的載體施用于皮膚，這些載體可以是固體或者液體。
可用的固態(tài)載體包括細分的固體，如滑石、粘土、微晶纖維素、硅土、礬土，等等?？捎玫囊簯B(tài)載體包括水、羥烷基或二元醇或者水-乙醇/二元醇摻合物，其中本化合物可以任選通過無毒表面活性劑的幫助以有效水平溶解或者分散?？梢约尤胱魟┲T如芳香劑或者抗微生物劑以優(yōu)化給定用途的性質。所得液態(tài)組合物可以從吸收墊應用，用于浸漬繃帶或者其他包扎用品，或者使用泵型或者氣溶膠噴霧器噴到受侵襲的區(qū)域。
增稠劑如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或者改性礦物材料可以與液態(tài)載體一起使用以形成可涂抹的膏劑、凝膠劑、軟膏劑、皂劑，等等，以直接應用于使用者的皮膚。
可用于將該化合物遞送到皮膚的有用的皮膚病學組合物的實例是本領域中公知的；例如，見Jacquet等人(美國專利號4,608,392)、Geria(美國專利號4,992,478)、Smith等人(美國專利號4,559,157)和Wortzman(美國專利號4,820,508)。
通過比較化合物的體外活性和動物模型中的體內(nèi)活性可以確定該化合物的有用劑量。將小鼠，和其他動物中的有效劑量外推到人的方法是本領域中公知的；例如，見美國專利號4,938,949。
通常，液態(tài)組合物如洗劑中化合物的濃度將為約0.1-25wt-％，優(yōu)選約0.5-10wt-％。半固態(tài)或者固態(tài)組合物如凝膠劑或者粉劑中的濃度將為約0.1-5wt-％，優(yōu)選約0.5-2.5wt-％。
用于治療所需的化合物，或者其活性鹽或者衍生物的量將不僅隨著所選的具體鹽而且隨著施用途徑、被治療的病癥的性質和患者的年齡和狀況而變，并且將最終由主治醫(yī)生或者臨床醫(yī)生的判斷決定。而且該化合物的劑量將根據(jù)靶細胞、腫瘤、組織、移植物，或者器官而變。
所希望的劑量可便利地作為單劑給出或者作為分開的劑量給出，該分開的劑量以適宜的間隔施用，例如，作為每天2、3、4或多個亞劑量。該亞劑量本身還可以被分成例如，許多離散的松散隔開的施用；諸如吹入器的多次吸入或者通過應用于眼睛的多次滴劑。
施用方案可以包括長期的、每日治療?！伴L期”指至少兩周，優(yōu)選數(shù)周、數(shù)月或者數(shù)年持續(xù)時間。本領域普通技術人員僅使用此處教導中的常規(guī)實驗法就可以確定該劑量范圍中必要的修飾。見Remington′s Pharmaceutical Sciences(Martin，E.W.，第四版)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。如果發(fā)生任何并發(fā)癥，個別醫(yī)生還可以調節(jié)劑量。
本發(fā)明提供血小板介導的聚集的調節(jié)劑。
候選試劑可以是合成試劑，或者試劑的混合物，或者可以是天然產(chǎn)物(例如，植物提取物或者培養(yǎng)上清液)。根據(jù)本發(fā)明的候選試劑包括可以合成的小分子、天然提取物、肽、蛋白質、糖類、脂質等。
可以從合成的或天然試劑的大文庫中篩選候選調節(jié)劑。當前利用多種方法隨機和定向合成糖、肽、和基于核酸的試劑?？梢酝ㄟ^商業(yè)途徑從許多公司得到合成試劑文庫，這些公司包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，NJ)、Brandon Associates(Merrimack，NH)、和Microsource(New Milford，CT)。從Aldrich(Milwaukee，WI)可以得到稀有化學品文庫?？梢缘玫讲⑶铱梢灾苽浣M合文庫。備選地，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然試劑的文庫可以從例如，Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)得到，或者通過本領域中熟知的方法容易地制備。此外，通過常規(guī)化學、物理和生物化學方法容易修飾天然的和合成產(chǎn)生的文庫和試劑。
在多種化學品類別中可以發(fā)現(xiàn)有用的試劑。有用的試劑可以是有機試劑，或者小有機試劑。小有機試劑的分子量大于50但是小于約2,500道爾頓，優(yōu)選小于約750，更優(yōu)選小于約350道爾頓。代表性類別包括雜環(huán)類、肽、糖、類固醇，等等?？梢孕揎椷@些試劑以增強效能、穩(wěn)定性、藥物相容性，等等。試劑的結構鑒定可用于鑒定、產(chǎn)生或者篩選額外試劑。例如，當鑒定了肽試劑時，可將它們以各種方法修飾以增強它們的穩(wěn)定性，諸如使用非天然氨基酸，如D-氨基酸，尤其D-丙氨酸，通過功能化氨基或者羧基末端，例如，對于氨基，?；蛘咄榛瑢τ隰然?，酯化或者酰胺化，等等。
對于初步篩選，根據(jù)本發(fā)明的候選試劑的有用濃度為約10mM到約100μM或以上(即，1mM、10mM、100mM、1M等)。初步篩選濃度將用作上限，以及9種額外的濃度，其中通過將初步篩選濃度以半對數(shù)間隔(例如，對于9種額外的濃度)減小用于二次篩選或者用于產(chǎn)生濃度曲線來確定額外的濃度。
高通量篩選試劑盒根據(jù)本發(fā)明的高通量篩選試劑盒含有實施試劑的檢測所有必要的方法和介質，該試劑通過在存在多肽(例如，SEQ ID NOs1到15、20到34、38到45、62到65所示多肽或多肽構建體)，優(yōu)選濃度范圍為1μM到1mM，與本發(fā)明靶目標例如vWF或其片段發(fā)生相互作用來調節(jié)血小板介導的聚集。該試劑盒包括下列組分。本發(fā)明的重組細胞，包括和表達編碼vWF或其片段的核苷酸序列，根據(jù)本領域的技術人員熟知的方法，特別如WO 00/02045所述，根據(jù)試劑盒在固體載體上，例如微量滴定板，更優(yōu)選96孔微量滴定板上生長細胞。備選地，以純化形式提供vWF或其片段，由本領域技術人員將其固定于例如96孔微量滴定板上。備選地，提供試劑盒內(nèi)預固定于，例如96孔微量滴定板上的vWF或其片段。備選地，在進行針對gpIb、gpIa/IIa或膠原蛋白的大分子篩選時，上述實施方案可分別用gpIb、gpIa/IIa或膠原蛋白多肽或多聚核酸來取代vWF。試劑盒中可含有一個以上的大分子(例如vWF、gpIb或膠原蛋白大分子和/或多聚核酸)。將濃度約為1μM-1mM或更高的本發(fā)明調節(jié)劑加入到存在適宜濃度多肽構建體的特定孔中，所述多肽的所述濃度優(yōu)選范圍是1μM到1mM。試劑盒可含有一個以上的多肽。
根據(jù)在此已公開的方法進行結合分析，將此結果與例如沒有加入調節(jié)劑時vWF或其片段與多肽的結合的基線水平進行比較，該多肽是例如，SEQ ID No2到15、20到34、38到45或62到65任一個所示多肽。選擇與不存在調節(jié)劑的活性水平相比，vWF-多肽結合能力(例如)升高或降低至少2倍、優(yōu)選5倍、更優(yōu)選10倍、最優(yōu)選100倍或更高的培養(yǎng)孔進行進一步的分析。
根據(jù)本發(fā)明使用的其它試劑盒本發(fā)明提供用于篩選血小板介導的聚集的調節(jié)劑的試劑盒，以及用于診斷以血小板介導的聚集失調為特征的疾病或疾患的試劑盒。本發(fā)明采用的試劑盒可包括分離的vWF或其片段。備選地，或另外，試劑盒可包括表達vWF或其片段的轉化細胞。在另一實施方案中，本發(fā)明試劑盒可包括編碼vWF或其片段的多聚核苷酸。在更進一步實施方案中，本發(fā)明試劑盒可包括用于擴增vWF或其片段的特異引物。備選地，在進行針對gpIb或膠原蛋白的大分子篩選時，上述實施方案可分別采用gpIb、gpIa/IIa或膠原蛋白多肽或多聚核酸或其片段來取代vWF。試劑盒可含有一個以上的大分子(例如，vWF、gpIb或膠原蛋白大分子或多聚核酸或其片段)。本發(fā)明所采用的試劑盒可包括SEQID NOs1到15、20到47或62到65任一個所示分離的多肽，其同源物，或其功能部分，或本發(fā)明的多肽構建體。本發(fā)明試劑盒可包括表達所述多肽的轉化細胞。試劑盒可包含一種以上的多肽。在進一步實施方案中，本發(fā)明試劑盒可包括編碼大分子，例如vWF、gpIb或膠原蛋白，或其片段的多聚核苷酸。在更進一步實施方案中，本發(fā)明試劑盒可包括用于擴增大分子，例如vWF、gpIb或膠原蛋白、或其片段的特異引物。根據(jù)本發(fā)明的所有試劑盒將含有所陳述的物品或者物品的組合和包裝材料。試劑盒將還包括使用說明書。
醫(yī)學裝置本發(fā)明還提供由本發(fā)明多肽構建體或根據(jù)本發(fā)明篩選方法所得試劑包被的侵入性醫(yī)學裝置，所述多肽構建體或試劑用于需要其的裝置。非限制性裝置實例包括外科導管、閉塞裝置、假體裝置(prosthetic devices)。上述裝置的應用包括需要在侵入部位周圍調節(jié)血小板介導的聚集的外科手術程序。
本發(fā)明一個實施方案是處理侵入性醫(yī)學裝置的方法，以防止在侵入部位周圍的血小板介導的聚集，所述方法包括用本發(fā)明多肽構建體或試劑包被該裝置的步驟。
本發(fā)明另一實施方案是防止侵入部位周圍發(fā)生血小板介導的聚集的侵入性醫(yī)學裝置，其中所述裝置包被有本發(fā)明多肽構建體或試劑。
實施例通過下列非限制性實施例對本發(fā)明進行說明。
實施例圖例實施例1.免疫美洲駝002實施例2.所有組成成分的克隆實施例3.文庫拯救，噬菌體制備抑制與膠原蛋白相互作用的vWF結合物的篩選實施例4.抑制與膠原蛋白相互作用的vWF結合物的篩選，第一輪和第二輪淘洗實施例5.vWF結合物通過VHH抑制vWF與膠原蛋白結合的功能特征實施例6.VHH的表達及純化實施例7.vWF結合性ELISA實施例8.VHHs的特異性實施例9.純化的VHH抑制ELISA實施例10.克隆的測序實施例11.表位作圖實施例12.二價和雙特異性VHHs的表達及純化實施例13.在ELISA中結合vWF
實施例14.純化的VHH抑制ELISA實施例15.人類血漿中二價或雙特異性構建體的穩(wěn)定性實施例16.在高切應力下評估VHH的抑制作用抑制與血小板相互作用的vWF結合物的選擇實施例17.抑制與血小板相互作用的vWF結合物的選擇淘洗實施例18.與vWF的A1結構域結合的篩選實施例19.抑制與血小板相互作用的vWF結合物的選擇MATCHM實施例20.純化的VHH與vWF結合性ELISA實施例21.純化的VHH的抑制性ELISA實施例22.克隆的測序實施例23.評估高切應力條件下VHH的抑制作用實施例24.二價VHH的表達和純化實施例25.評估高切應力條件下VHH的抑制作用制備vWF-特導性VHH的雙特異性構建體實施例26.雙特異性構建體的構建及序列實施例27.雙特異性構建體的表達及純化實施例28.vWF結合試驗實施例29.通過雙特異性構建體抑制vWF與膠原蛋白的結合，并與單價VHH的作用進行比較實施例30.評估高切應力下VHH的抑制作用篩選I型和III型膠原蛋白的結合物實施例31.I型膠原蛋白結合物的選擇實施例32.應用ELISA方法檢測VHH與I型和III型膠原蛋白的結合實施例33.克隆的測序實施例34.純化VHH與I型和III型膠原蛋白的結合實施例35.抑制與vWF相互作用的I型膠原蛋白結合物的選擇實施例36.應用ELISA方法檢測VHH與I型和III型膠原蛋白的結合實施例37.克隆的測序實施例38.純化的VHH與I型和III型膠原蛋白的結合實施例39.應用ELISA方法檢測膠原蛋白-特異性VHH抑制vWF與膠原蛋白的結合實施例40.檢測低和高切應力下膠原蛋白-特異性VHH抑制血小板聚集改良的VHH半衰期實施例41.免疫美洲駝(llamas)實施例42.所有組成成分的克隆實施例43.文庫拯救，噬菌體制備實施例44.噬菌體ELISA實施例45.第一和第二輪生物淘洗的選擇實施例46.篩選生物淘洗后的單個克隆實施例47.HinfI圖譜及測序實施例48.檢測不同物種清蛋白的交叉反應性實施例49.表達及純化實施例50.純化的nanobodies在MSA上的ELISA實施例51.雙特異性構建體的構建及序列實施例52.雙特異性構建體的表達及純化實施例53.雙特異性構建體中兩種VHH的功能作用實施例54.比較單價VHH及雙特異性構建體抑制vWF與膠原蛋白的結合抑制與vWF相互作用的gpIb結合物的選擇實施例55.rgpIb結合物的選擇實施例56.應用ELISA篩選結合物實施例57.純化的VHH與rgpIb的結合實施例58.克隆的測序實施例59.檢測gpIb特異性的VHH的抑制性能實施例60.評估高切應力下VHH的抑制作用應用VHH包被斯坦特印模、套管、氣囊、導管和移植材料實施例61.VHH的穩(wěn)定性實施例62.VHH固定于聚合物上C37的人源化實施例63.進行C37與DP-47的比對實施例64.C37的誘變抗VWF VHHs的片段實施例65.vWF-C37的VHH-CDR3片段的表達實施例66.通過第一和第二輪生物淘洗進行重組體A1(rA1)的選擇實施例67.生物淘洗后進行單個克隆的篩選實施例68.HinfI圖譜及測序實施例69.抑制性ELISA實施例實施例1免疫美洲駝002應用vWF和I型和III型膠原蛋白混合物對一只美洲駝進行免疫。那些抗原均參與了第一次相互作用，導致血小板聚集(

圖1)。在表1中對免疫方案進行了簡要介紹。
實施例2所有組成成分的克隆通過密度梯度離心方法(FicoII-Paque Plus Amersham Biosciences)分離外周血淋巴細胞(PBLs)。將PBLs用于提取總RNA(Chomczynski and Sacchi1987)。用100μg總RNA及MMLV逆轉錄酶(Gibco BRL)和寡聚d(T)寡核苷酸制備cDNA。應用苯酚/氯仿進行cDNA純化，然后進行乙醇沉淀，隨后用作擴增VHH所有組成成分的模板。
在首輪PCR 反應中，用特異性先導引物(5’-GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT-3’)及寡聚d(T)引物(5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)擴增保守(1.6kb)及重鏈(1.3kb)抗體基因片段的所有組成成分。應用瓊脂糖膠電泳分離所產(chǎn)生的DNA片段，從瓊脂糖凝膠中純化編碼重鏈抗體片段的1.3kb片段。應用FRI反向引物及相同寡聚d(T)正向引物的混合物進行第二輪PCR反應。應用SfiI(加入FR1引物內(nèi))和BstEII(FR4中天然存在)消化PCR產(chǎn)物。進行凝膠電泳后，從凝膠中純化長度約為400個堿基對的DNA片段，并連接到噬菌粒pAX004相應限制性酶切位點，電穿孔大腸桿菌TG1后獲得VHHs克隆文庫。文庫大小為1.4×107cfu，且所有克隆均含有正確大小的插入片段。
實施例3文庫拯救，噬菌體制備該文庫在37℃、含有2％葡萄糖及100μg/ml氨芐青霉素的10ml 2×TY培養(yǎng)基中進行生長，直到OD600nm值達到0.5。加入M13KO7噬菌體(1012)，37℃條件下溫育混合物2×30分鐘，開始時不進行振蕩，然后以100rpm振蕩。室溫下4500rpm離心細胞10分鐘。將細菌沉淀重懸于含有100μg/ml氨芐青霉素及25μg/ml卡那霉素的50ml 2×TY培養(yǎng)基，37℃、250rpm劇烈振蕩條件下溫育過夜。過夜培養(yǎng)物在4℃下10000rpm離心15分鐘。PEG(20％聚乙二醇和1.5M NaCl)沉淀噬菌體，10000rpm離心30分鐘。用20ml PBS重懸沉淀物。再次進行噬菌體PEG沉淀，4℃，20000rpm離心30分鐘。用5ml PBS-1％酪蛋白溶解沉淀物。通過感染OD600nm＝0.5的TG1細胞，將其接種于含100μg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖的LB瓊脂平板上，進行噬菌體滴定。轉化體的數(shù)目表示噬菌體的數(shù)目(＝pfu)。用15％甘油-80℃保存噬菌體。
抑制與膠原蛋白相互作用的vWF結合物的選擇(圖2)實施例4抑制與膠原蛋白相互作用的vWF結合物選擇第一輪及第二輪淘洗用2μg/ml vWF或含有1％酪蛋白的PBS包被微量滴定板上的孔。4℃溫育過夜后，在室溫條件下應用含有1％酪蛋白的PBS對孔封閉3小時。將200μl噬菌體加入孔中。室溫溫育2小時后，用PBS-吐溫及PBS分別沖洗10次培養(yǎng)孔。用100μl濃度為100μg/ml的III型膠原蛋白進行噬菌體的特異性洗脫。在室溫過夜條件下進行洗脫。將洗脫的噬菌體感染指數(shù)生長的TG1細胞，然后將其接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖的LB瓊脂平皿上。如上在上述相同條件下，重復進行此實驗進行第二輪淘洗。淘洗結果見表2。
實施例5vWF結合物的功能表征通過VHH抑制vWF與膠原蛋白的結合用含25μg/mlIII型膠原蛋白的PBS 4℃下包被微量滴定板過夜。應用PBS-吐溫沖洗培養(yǎng)板5次，用含有1％酪蛋白的PBS室溫下封閉2小時。PBS-吐溫漂洗平板5次。將100μl濃度為2μg/ml的vWF(vWF于37℃預溫育15分鐘)與20μl含有VHH抗體(如實施例6所述)的胞質提取物混合，在微量滴定板培養(yǎng)孔中室溫下溫育90分鐘。用PBS-吐溫沖洗平板5次。用PBS將抗-vWF-HRP單克隆抗體(DAKO)稀釋3,000-倍并溫育1小時。用PBS-吐溫沖洗平板5次，用ABTS/H2O2進行vWF-結合的檢測。30分鐘后405nm波長下進行信號的測定。結果見表3，顯示經(jīng)過第一輪和第二輪淘洗后獲得的抑制劑。
實施例6VHH的表達及純化制備抑制與III型膠原蛋白相互作用的vWF的結合物的質粒，轉化到WK6電穿孔細胞。選取單個集落，用于起始在含有2％葡萄糖及100μg/ml氨芐青霉素的LB中培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物用含有100μg/ml氨芐青霉素的300ml TB培養(yǎng)液稀釋100倍，并在37℃條件下進行溫育直到OD 600nm＝0.5。加入1mMIPTG，37℃溫育培養(yǎng)物3個多小時或28℃過夜。
培養(yǎng)物于10000rpm 4℃離心20分鐘。在-20℃條件下冰凍沉淀過夜或1小時。然后，室溫下解凍沉淀40分鐘，用20ml PBS再懸沉淀，冰上振蕩1小時。通過4℃，20000rpm離心20分鐘分離胞質級分。將含VHH的上清液上樣到Ni-NTA進行純化至同質。根據(jù)消光系數(shù)計算VHH產(chǎn)量。結果歸納于表4。
實施例7ELISAvWF結合試驗用2μg/ml vWF包被微量滴定板，4℃過夜。用300μl含有1％酪蛋白的PBS室溫下封閉微量滴定板2小時。用PBS-吐溫沖洗滴定板3次。所有純化樣品的系列稀釋物在室溫下溫育2小時。用PBS-吐溫沖洗滴定板6次，然后檢測VHH結合，方法是與用PBS 1/2000稀釋的小鼠抗-myc mAB室溫溫育1小時，再用PBS 1/1000稀釋的抗小鼠-HRP結合物室溫下再溫育1小時。用底物ABTS/H2O2進行染色，30分鐘后在405nm波長檢測信號。作為純化的VHH濃度的函數(shù)的結合力見圖3所示。
實施例8VHHs的特異性用2μg/ml vWF和其它3種不參與血小板聚集但還在美洲駝002中免疫的抗原包被微量滴定板。根據(jù)實施例7所述方法采用670，67及6.7nM VHH進行ELISA試驗。結果簡要總結于表5。該結果顯示VHH具有特異性抑制vWF的作用。
實施例9應用純化的VHH的抑制ELISA試驗根據(jù)實施例5所述方法進行抑制性ELISA試驗，不同點是VHH濃度遞減并采用1/60稀釋的人類血漿替代純化vWF或人類非稀釋血漿。結果見圖4。抑制50％(IC50)的VHH濃度見表6。
實施例10克隆的測序應用M13通用反向引物進行克隆測序。氨基酸序列見表30(SEQ ID號1、3、4、5、6和7)。
實施例11表位作圖在pBAD-OprI-ss中克隆vWF的A3結構域將pBAD-OprI-strep-spec載體用于在UT5600大腸桿菌細胞表面上展示作為與OprI的融合物的vWF A3結構域(F-ara-14 IeuB6 azi-6 lacY1 proCl4tsx-67 entA403 trpE38 rfbD1 rpsL109 xyl-5 mtl-1 thil DompT fepC266)(Cote-Sierra等人，1998，Gene，22125-34)。應用A3for及A3back PCR引物通過PCR反應擴增編碼vWF A3結構域(201個氨基酸)的基因。
A3forCTG GTG CTG CAG AGG TGA AGC TTC GGA GAG GGG CTGCAG ATCA3backATC CAT GCA AAT CCT CTA GAA TCC AGA GCA CAG TTTGTG GAG應用HindIII及Xba1消化片段及載體，將其連接并轉化UT5600(＝pBAD-vWFA1/pBAD-vWFA3)。將轉化細胞接種于含有20μg/ml鏈霉素、50μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂板上。
在UT5600F-細胞中轉化pBAD-vWFA3質粒并接種含有20μg/ml鏈霉素、50μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂平板中。將單個集落接種于含有20μg/ml鏈霉素、50μg/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中。細胞在37℃200rpm條件下生長過夜。次日，應用0.2％阿拉伯糖進行細胞誘導，并在37℃150rpm條件下溫育1個多小時。總細胞裂解液在還原性樣品緩沖液中煮沸，上樣于12％SDS-PAGE膠中，硝基纖維膜轉膜進行Western印跡。轉移的蛋白質應用抗-OprI單克隆抗體(SH2.2)(CoteSierra等人，1998，Gene，22125-34)檢測。采用綴合堿性磷酸酶的抗小鼠IgG(Sigma)，印跡采用BCIP/NBT進行顯影(圖5)。
將pBAD-vWFA3質粒轉化UT5600F-細胞并接種于含有20μg/ml鏈霉素、50μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂平板中。將單個集落接種于含有20μg/ml鏈霉素、50μg/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中。細胞在37℃200rpm條件下生長過夜。次日，應用0.2％阿拉伯糖進行細胞誘導，并在37℃150rpm條件下溫育1個多小時。應用PBS 1/1000稀釋的抗-OprI單克隆抗體(SH2.2)4℃包被微量滴定板過夜，并在室溫下用含有1％酪蛋白的PBS封閉2小時。誘導后，室溫下使所有細胞與該滴定板結合1小時。用PBS-吐溫沖洗滴定板5次。室溫下使單個集落的噬菌體制品結合2小時。用PBS-吐溫沖洗滴定板5次。抗M13-HRP綴合物用于檢測結合表達A3結構域的大腸桿菌細胞或它們表面上無關抗原的噬菌體。應用PBS-吐溫沖洗滴定板5次。采用ABTS/H2O2進行染色，30分鐘后在405nm檢測信號。結果歸納于表7。
實施例12二價和雙特異性VHH表達及純化設計了大腸桿菌生成載體pAX11(圖6)，其可以兩步克隆二價或雙特異性VHH。
應用PstI和BstEII首先克隆VHH羧基端，第二步通過SfiI和NotI插入其它VHH，其在第一基因片段中不切割。該程序避免了通過擴增所致新位點的產(chǎn)生，因此避免了插入性PCR錯誤的風險。序列見表30(SEQ ID號8、9、10、11和12)。
根據(jù)實施例6所述方法進行蛋白的表達和純化。需要在superdex 75上進行額外的純化步驟以去除某些單價降解產(chǎn)物(5-10％)。每升大腸桿菌中表達和純化的二價蛋白的產(chǎn)量歸納于表8。
實施例13vWF結合的ELISA檢測應用實施例7所述的方法在ELISA中進行vWF結合的檢測，并與單價VHH的結合進行比較。結果見圖7。結果明顯顯示二價和雙特異性VHH與單價VHH相比顯示對vWF的結合能力更強。
實施例14純化VHH的抑制性ELISA根據(jù)實施例5中所述的方法，與二價VHHs相比，檢測單價VHH對vWF與膠原蛋白結合的抑制。應用1/60稀釋的人、狒狒和豬血漿替代純化的vWF進行平行試驗。IC50值歸納于表9。
實施例15二價或雙特異性構建體在人血漿中的穩(wěn)定性通過37℃條件下在人類血漿中溫育來檢測二價構建體的穩(wěn)定性。將濃度為38μg/ml的AM-4-15-3/AM2-75在人類血漿中于37℃溫育。溫育后1、2、3、6和24小時移除樣品。將樣品稀釋10倍，進行Western blot分析。結果歸納于圖8，顯示二價構建體在人類血漿中37℃下至少保持24小時的穩(wěn)定性。
實施例16評估高切應力條件下VHH的抑制作用應用chromosulfuric acid(2％三氧化鉻)溶液清洗玻璃蓋玻片(18×18mm，Menzel Gl_ser)過夜，在噴灑前用蒸餾水沖洗。III型膠原蛋白單體溶于50mmol/L乙酸中，用retouching airbrush(Badger model 100，Badger Brush Go)以30μg/cm2的密度向玻璃蓋玻片上進行噴灑。噴灑程序后，用含有1％人清蛋白的PBS(10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，和0.15mol/L NaCl)封閉該膠原蛋白表面1小時，以防止在后續(xù)灌注過程中結合非特異性蛋白質。在特殊設計的小型平行板灌注腔內(nèi)進行III型膠原蛋白的灌注研究，該灌注腔具有很好設計的流變學特征，能容納一張玻璃蓋玻片。通過靜脈穿刺方法獲取志愿者全血。在Harvard輸注泵(泵22，型號2400-004；哈佛大學，Natick，MA)的作用下血液流經(jīng)灌注腔。灌注時間為5分鐘。將三重蓋玻片插入灌注腔內(nèi)。5ml全血37℃預熱5分鐘，加入或不加VHH，然后在5分鐘內(nèi)使血液重新流過灌注腔，壁面切變率(wall shear rate)為300s-1或1600s-1。去除并沖洗蓋玻片，0.05％戊二醛固定，甲醇脫水，May-Grünwald/Giemsa染色。通過連接到計算機圖像分析儀(AMS 40-10，Saffron Walden，UK)的光學顯未鏡(放大倍數(shù)，1,000×)進行血小板粘附的定量分析。血小板粘附用表面血小板覆蓋百分比表示。結果歸納于表10和表11。
抑制與血小板相互作用的vWF結合物的選擇(圖9)。
實施例17抑制與血小板相互作用的vWF結合物的選擇淘洗用2μg/ml vWF或含有1％酪蛋白的PBS包被免疫管。4℃溫育過夜后，用含有1％酪蛋白的PBS室溫封閉管3小時。將200μl噬菌體加入免疫管中，在PBS中終體積為2ml。室溫溫育2小時后，用PBS-吐溫和PBS沖洗免疫管各10次。用2ml 0.2M pH＝2.4的甘氨酸緩沖液洗脫結合的噬菌體。在室溫下洗脫20分鐘。用洗脫噬菌體感染指數(shù)生長的TG1細胞，然后將細胞鋪到含有100μg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖的LB瓊脂平板中。淘洗結果見表12。
實施例18與vWF的A1結構域結合的篩選將pBAD-OprI-strep-spec載體用于在UT5600大腸桿菌細胞表面上展示作為與OprI融合物的vWF A1結構域(F-ara-14 IeuB6 azi-6lacY1 proCl4 tsx-67entA403 trpE38 rfbD1 rpsL109 xyl-5 mtl-1 thil DompT fepC266)(Cote-Sierra等人，1998，Gene，22125-34)。應用A1for和A1back PCR引物通過PCR進行vWF A1結構域(219個氨基酸)編碼基因的擴增。
A1forCCG GTG AGC CCC ACC ACT CTA AGC TTG GAG GAC ATCTCG GAA CCGA1backCCC CAG GGT CGA AAC CCT CTA GAG CCC CGG GCC CACAGT GAG應用HindIII和Xbal消化片段和載體，連接并轉化UT5600(＝pBAD-vWFA1/pBAD-vWFA3)。將轉化細胞鋪到含有20μg/ml鏈霉素、50μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂平板中。
將pBAD-vWFA1質粒轉化UT5600F-細胞，將其鋪于含有20μg/ml鏈霉素、50μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂平板中。挑選單集落接種于含有20μg/ml鏈霉素、50μg/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中。細胞在37℃、200rpm條件下生長過夜。次日，應用0.2％阿拉伯糖誘導細胞，37℃、150rpm溫育1個多小時。將總細胞裂解物在還原性樣品緩沖液中煮沸，上樣于12％SDS-PAGE膠中，轉移到硝基纖維膜，進行Western印跡。轉移蛋白用抗-OprI單克隆抗體(SH2.2)(Cote-Sierra等人，1998，Gene，22125-34)檢測。施用綴合堿性磷酸酶的抗小鼠IgG(Sigma)，印跡用BCIP/NBTas顯影，結果見圖10。
根據(jù)實施例11所述方法進行ELISA試驗。結果歸納于表13。
結果表明得到了vWF-A1結構域特異性VHH。
實施例19抑制與血小板相互作用的vWF結合物的選擇MATCHM表達vWF A1結構域的大腸桿菌細胞(實施例18)用于MATCHM試驗培養(yǎng)轉化有pBAD-OprI-A1的UT5600細胞，并用0.2％阿拉伯糖進行誘導。沖洗細胞，在常溫下將細胞與噬菌體一起溫育1小時。用PBS-吐溫沖洗混合物7次，用指數(shù)生長的TG1細胞洗脫噬菌體。我們進行了第一輪和第二輪篩選。結果歸納于表14。
實施例20ELISA純化的VHH與vWF的結合采用實施例6所述方法進行vWF A1結構域特異性VHH的表達和純化。采用實施例7所述方法進行ELISA中與vWF的結合的檢測。結果見圖11。
實施例21純化的VHH的抑制ELISA4℃條件下用在PBS中的5μg/ml血小板受體gpIb的特異抗體包被微量滴定板過夜。PBS-吐溫沖洗滴定板5次，用300μl PBS-1％酪蛋白室溫下封閉2小時。PBS-吐溫沖洗滴定板3次。將濃度為1μg/ml的血小板受體gpIb(gpIb)施加到微量滴定板的孔中，室溫結合2小時。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。加入遞減濃度的VHH(A38(陰性對照)及A50(vWF A1結合物))。在37℃條件下預溫1/128稀釋的含vWF的血漿5分鐘。加入終濃度為760μg/ml的利托菌素(Risto)并加至VHH。室溫下將此混合物溫育30分鐘。然后將100μl該混合物加到微量滴定板孔中，并在室溫下溫育90分鐘。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。在PBS中將抗vWF-HRP單克隆抗體稀釋3000倍，溫育1小時。用PBS-吐溫沖洗滴定板5次，并用ABTS/H2O2檢測vWF-結合。30分鐘后在405nm波長檢測信號。結果歸納于圖12。
實施例22克隆的測序應用M13通用反向引物進行克隆測序。氨基酸序列見表30(SEQ ID號碼23、24、25、26、27、28、29、30和31)。
實施例23評估高切應力條件下VHH的抑制作用按照實施例16所述方法進行切應力實驗。血小板粘附被表示為血小板覆蓋表面的百分比。結果歸納于表15和表16。
實施例24二價VHHs表達及純化根據(jù)實施例12所述的方法構建二價分子。序列見表30(SEQ ID號碼32、33和34)。
根據(jù)實施例6所述方法進行蛋白質的表達和純化。需要在superdex 75上進行額外的純化步驟以去除一些單價降解產(chǎn)物(5-10％)。
實施例25評估高切應力條件下VHH的抑制作用根據(jù)實施例16所述方法進行切應力實驗。將血小板粘附表示為血小板覆蓋的表面百分比。結果歸納于表17和表18。
制備vWF特異性VHH的雙特異性構建體(圖13)實施例26雙特異性構建體的構建和序列根據(jù)實施例12所述方法制備構建體，其中一個vWF特異性的VHH，抑制與膠原蛋白的相互作用，另一個VHH同樣對vWF特異性但抑制與血小板受體gpIb相互作用序列見表30(SEQ ID號碼20、21和22)。
實施例27雙特異性構建體的表達及純化根據(jù)實施例6所述方法表達和純化蛋白質。需要在superdex 75上進行額外的純化步驟以去除一些單價降解產(chǎn)物(5-10％)。每升大腸桿菌中雙特異性蛋白質的表達及純化產(chǎn)量歸納于表19。
實施例28與vWF結合根據(jù)實施例7所述方法在ELISA中檢測與vWF的結合。結果見圖14。
實施例29與單價VHHs相比，雙特異性構建體對vWF與膠原蛋白結合的抑制根據(jù)實施例5所述方法，與雙特異性構建體相比，檢測單價構建體對vWF與膠原蛋白結合的抑制。IC50值歸納于表20。
實施例30評估高切應力條件下VHH的抑制根據(jù)實施例16所述方法進行切應力實驗。將血小板粘附表示為覆蓋血小板的表面積百分比。結果歸納于表21和22。
I型和III型膠原蛋白結合物的篩選(圖15)實施例31I型膠原蛋白結合物的選擇應用25μg/ml I型膠原蛋白包被微量滴定板。根據(jù)實施例3所述方法制備噬菌體，使其與封閉的微量滴定板孔結合2小時。經(jīng)過沖洗后，用pH＝4.5的0.1M甘氨酸緩沖液洗脫噬菌體。結果歸納于表23。
實施例32在ELISA中檢測VHH與I型和III型膠原蛋白的結合根據(jù)實施例7所述方法，但在用溶解于PBS中的25μg/ml的I型或III型膠原蛋白包被的孔中檢測在ELISA中的結合克隆。結果歸納于表24。
實施例33克隆的測序應用M13通用反向引物進行克隆測序。氨基酸序列見表30(SEQ ID號碼35、36和37)。
實施例34純化的VHH與I型和III型膠原蛋白的結合根據(jù)實施例6所述方法，表達和純化VHH。用25μg/ml I型或III型膠原蛋白包被微量滴定板并將其封閉。2倍稀釋結合物，根據(jù)實施例7所述方法檢測結合。結果歸納于圖16。
實施例35抑制與vWF相互作用的I型膠原蛋白結合物的選擇用25μg/ml I型膠原蛋白包被微量滴定板。根據(jù)實施例3所述的方法制備噬菌體，使其與封閉的微量滴定板上的孔結合2小時。經(jīng)過沖洗后，應用300μg/ml vWF洗脫噬菌體。采用同樣方法進行第2輪和第3輪篩選。
實施例36在ELISA中檢測VHH與I型和III型膠原蛋白的結合根據(jù)實施例34所述方法在ELISA中檢測克隆與I型和III型膠原蛋白的結合。
實施例37克隆的測序應用M13通用反向引物進行克隆的測序。
實施例38純化的VHH與I型和III型膠原蛋白的結合根據(jù)實施例6所述方法表達和純化VHH。用25μg/ml I型或III型膠原蛋白包被微量滴定板并進行封閉。2倍稀釋結合物，根據(jù)實施例34所述方法進行結合的檢測。
實施例39在ELISA中檢測膠原蛋白特異性VHH對vWF與膠原蛋白結合的抑制根據(jù)實施例5所述方法檢測抑制作用。
實施例40檢測低切應力及高切應力條件下膠原蛋白特異性VHH對血小板聚集的抑制根據(jù)實施例16所述方法進行切應力實驗。將血小板粘附表示為覆蓋血小板的表面百分比。
改良的VHH半衰期實施例41免疫美洲駝用人血清清蛋白(HSA)對一只美洲駝進行免疫。免疫方案歸納于表25。
實施例42所有組成成分的克隆根據(jù)實施例2所述方法制備文庫。文庫大小為2×107cfu，所有克隆均含有正確大小的插入片段。
實施例43文庫拯救，噬菌體制備根據(jù)實施例3所述方法制備噬菌體。
實施例44噬菌體ELISA在4℃條件下，應用PBS-1％酪蛋白或5μg/ml HSA(人血清清蛋白)包被微量滴定板(Maxisorp)過夜。用PBS-吐溫(0.05％吐溫20)沖洗滴定板3次，并在室溫條件下，用200μl PBS-1％酪蛋白封閉2小時。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。根據(jù)上述方法制備噬菌體，以連續(xù)2倍稀釋濃度加到孔中。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。采用1/2000PBS稀釋的綴合辣根過氧化物酶(HRP)的小鼠抗M13單克隆抗體檢測結合的噬菌體。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。用ABTS/H2O2進行染色，30分鐘后在405nm波長檢測信號。結果見圖17，表明文庫中存在HSA-特異性nanobody。
實施例45篩選第1輪和第2輪生物淘洗應用10μg/ml小鼠血清清蛋白(MSA)或含有1％酪蛋白的PBS包被微量滴定板孔。4℃溫育過夜后，用含1％酪蛋白的PBS室溫封閉孔3小時。向孔中加入200μl噬菌體。室溫下溫育2小時后，將孔用PBS-吐溫和PBS沖洗10次。用100μl 0.2M pH 2.4的甘氨酸緩沖液洗脫已結合的噬菌體。室溫條件下洗脫20分鐘。將洗脫得到的噬菌體感染指數(shù)生長的大腸桿菌TG1細胞，然后將其鋪于含100μg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖的LB瓊脂平板中。在上述相同條件下進行第2輪。結果歸納于表26。
實施例46生物淘洗后單個克隆的篩選ELISA與人血清清蛋白(HSA)及小鼠血清清蛋白(MSA)的結合根據(jù)實施例6所述的方法制備周質提取物。
用5μg/ml HSA、5μg/ml小鼠血清清蛋白(MSA)或PBS-1％酪蛋白包被微量滴定板4℃過夜。室溫下用300μl PBS-1％酪蛋白封閉滴定板2小時。用PBS-吐溫沖洗滴定板3次。經(jīng)過第1輪和第2輪篩選后從23個單個克隆中制備周質級分，使其與滴定板孔結合。用PBS-吐溫沖洗滴定板6次，然后檢測nanobody的結合，方法是通過室溫下與PBS稀釋的小鼠抗組氨酸單克隆抗體Serotec MCA 1396(1/1000稀釋)溫育1小時后，再與PBS稀釋的抗小鼠堿性磷酸酶綴合物(1/2000稀釋)同樣室溫溫育1小時。用底物PNPP(2mg/mlp-硝苯基磷酸鹽溶于1M二乙醇胺、1mM Mg2SO4，pH9.8)進行染色，30分鐘后在405nm波長檢測信號。結果歸納于表27。
實施例47HinfI圖譜及測序第2輪淘洗后，采用與載體序列結合的一套引物進行陽性克隆PCR反應。應用限制性酶HinfI酶切PCR產(chǎn)物，并上樣于瓊脂糖凝膠上。篩選4個具有不同HinfI圖譜的克隆進行進一步評估。對那些克隆進行了測序，結果歸納于表30(SEQ ID號16、17、18和19)。
實施例48檢測不同物種中與清蛋白的交叉反應性對不同物種(狒狒、豬、倉鼠、人、大鼠、小鼠和兔)的血漿(1/10稀釋)進行SDS-PAGE電泳，并印跡于硝基纖維膜上。如實施例3所述制備MSA21、MSA24、MSA210、MSA212克隆和非相關nanobody的噬菌體。使噬菌體與印跡有血清清蛋白的硝基纖維素膜結合，洗脫未結合噬菌體。應用偶聯(lián)HRP的抗M13多克隆抗體檢測結合。DAP用作檢測底物。結果見圖18。
由這些結果我們可以得出結論，所有4種結合物在豬、人、小鼠(對MSA212交叉反應較小)和倉鼠血清清蛋白間均具有交叉反應。MSA 21也與兔血清清蛋白具有交叉反應。非相關nanobody未發(fā)現(xiàn)結合(未顯示)。
作為對照實驗，對用PBS進行1/100稀釋的不同血漿樣品進行SDS-PAGE電泳。應用考馬斯藍染色凝膠。由圖19我們可以得出結論除兔血漿清蛋白的水平較低外，其它所有血漿樣品中清蛋白水平均較高。
實施例49表達及純化根據(jù)實施例6所述方法表達和純化蛋白質。
實施例50純化的nanobodies在MSA上的ELISA用5μg/ml MSA包被微量滴定板4℃過夜。沖洗后，用PBS-1％酪蛋白室溫封閉滴定板2小時。成對加入樣品，起始濃度為2500nM，以1/3稀釋，使樣品室溫結合2小時。加入1/1000稀釋的多克隆兔抗nanobody血清(K208)室溫下1小時。用1/1000稀釋的抗兔堿性磷酸酶綴合物進行檢測，用PNPP染色。結果見圖20。
實施例51雙特異性構建體的構建與序列用對清蛋白特異性的第一VHH(MSA21)和對vWF特異性的第二VHH制備雙特異性構建體(圖21)。如實施例12所述方法制備構建體。序列見表30所示(SEQ ID號13、14和15)。
實施例52雙特異性構建體的表達與純化根據(jù)實施例6所述方法表達和純化蛋白質。需要在superdex75上進行額外的純化步驟以去除一些單價降解產(chǎn)物(5-10％)。
實施例53雙特異性構建體中兩種VHH的功能性用5μg/ml小鼠血清清蛋白4℃包被微量滴定板過夜。沖洗滴定板后，用PBS-1％酪蛋白封閉滴定板孔2小時。使雙特異性蛋白與滴定板孔在室溫下結合2小時。沖洗后，加入不同稀釋度的人、狗和豬血漿，使其在室溫下結合2小時。用1/3000稀釋的來自DAKO的抗vWF-HRP檢測vWF的結合。用ABTS/H2O2染色。結果如圖22所示，表明雙特異性構建體保留了兩種VHH的功能性。
實施例54與單價VHHs相比，雙特異性構建體對vWF與膠原蛋白結合的抑制根據(jù)實施例5所述方法，與雙特異性構建體相比，檢測單價VHH對vWF與膠原蛋白結合的抑制。IC50值歸納于表28。結果表明雙特異性構建體保留了VHH的抑制特性。
抑制與vWF相互作用的gpIb結合物的選擇(圖23)根據(jù)實施例1、2和3所述方法進行免疫、所有組成成分的克隆和噬菌體制備。
實施例55rgpIb結合物的選擇用抗rgpIb的小鼠mAb包被微滴定板。封閉該板，使5μg/ml rgpIb室溫下結合2小時。沖洗該板。如上所述制備噬菌體并使其與微滴定板孔結合。沖洗后，用0.1M pH 4.5甘氨酸緩沖液洗脫噬菌體。同樣方式進行第二輪淘洗。
實施例56在ELISA中篩選結合物根據(jù)實施例6所述方法制備胞質提取物。
如實施例55所述，將上清加到包被有mAb和隨后的gpIb的滴定板孔內(nèi)。系列稀釋的所有純化樣品在室溫下溫育2小時。用PBS-吐溫沖洗6次滴定板，然后檢測VHH的結合，方法是與在PBS中1/2000稀釋的小鼠抗His-HRP mAB室溫溫育1小時后用底物ABTS/H2O2染色。30分鐘后在405nm檢測信號。
實施例57純化的VHH與rgpIb的結合如實施例6所述方法制備胞質級分。將含VHH的上清加到Ni-NTA上以純化成均質。VHH產(chǎn)量根據(jù)消光系數(shù)計算。根據(jù)實施例55所述方法進行ELISA。
實施例58克隆的測序應用M13通用反向引物進行克隆測序。
實施例59檢測gpIb特異性VHH的抑制性能如實施例21所述方法，在ELISA中檢測VHHs的抑制功能。
實施例60評估高切應力下VHH的抑制作用根據(jù)實施例16所述方法進行切應力實驗。將血小板粘附表示為覆蓋血小板的表面的百分比。
應用VHH包被斯坦特印模、套管、氣囊、導管和移植材料實施例61VHH的穩(wěn)定性VHH C37在37℃溫育，如實施例7所述通過ELISA測量不同時間點其對vWF與膠原蛋白結合的抑制作用。結果與儲存于-20℃的VHH進行比較，見圖24。進行比較的是抗B3抗原的scFv的活性(Reiter等人，Protein Engineering，1994，7697-704)，該scFv發(fā)生了修飾，在框架殘基44和105之間插入了一個二硫鍵以增加其穩(wěn)定性(dsFv)。37℃溫育60小時后dsFv損失了其40％活性。37℃溫育1年后，分析C37抑制性能并與儲存于冷藏機中的C37進行比較。根據(jù)實施例5所述方法，用1/200最終稀釋的人血漿進行ELISA。結果見圖25所示，表明該功能性得以完全保留(儲存在37℃和-20℃的C37的IC50值分別是0.085和0.1μg/ml)。因此預計VHH具有長的半衰期。
實施例62VHH固定于聚合物上制備0.5ml 30％丙烯酰胺；1ml 1M Tris pH＝7.5；3.5ml H2O；35μl 10％APS；3.5μl TEMED的混合物。在一些孔中，加入VHH C37，終濃度為10μg/ml。使混合物在96孔板內(nèi)室溫聚合3小時。加入不同稀釋度的人血漿，起始濃度為未稀釋的血漿。室溫溫育1小時，沖洗該板，加入1/2000稀釋的抗vWF-HRP(DAKO)，室溫溫育1小時。沖洗該板后，加入底物(ABTS/H2O2)并在OD405nm處檢測。結果見圖26所示。結果表明固定在聚合物上的VHH保留功能性。
C37人源化實施例63進行C37與DP-47的比對比較C37nanobody(SEQ ID 1號)和人VH3種系(DP-47)發(fā)現(xiàn)二者高度同源ο FR1中1、5、28和30位4個氨基酸改變ο FR3中74、75、84和94位4個氨基酸改變ο FR4中104、108和111位3個氨基酸改變見圖27所示。
實施例64C37的誘變根據(jù)Chen和Ruffner所述(Chen和Ruffner，Amplification of closed circularDNA in vitro，Nucleic Acids Research，1998，1126-1127)和由Stratagene所商業(yè)化的(Quickchange site-directed mutagenesis)，應用不是以PCR為基礎的定點誘變方法對C37進行突變。
用質粒DNA作為模板，用兩個突變引物(表29)引入所需突變。兩引物每個與模板質粒DNA的相反鏈互補。在應用pfu DNA多聚酶進行的聚合酶反應中，每一鏈在循環(huán)過程中通過有限數(shù)量的循環(huán)從引物序列延伸。產(chǎn)生野生鏈和突變鏈的混合物。用DpnI酶切來篩選體外合成的突變DNA。沉淀DNA，使之轉化大腸桿菌，通過序列分析來分析所需突變。將正確序列的克隆命名為C37-hum，氨基酸序列見表30SEQ ID2號。
根據(jù)實施例6所述方法表達和純化C37-hum。如實施例5所述，比較C37和C37-hum對vWF和膠原蛋白結合的抑制作用。結果見圖28。其清晰表明人源化的C37完全保留功能。
需要人源化的位點是Q1、Q5、D104、Q108和I111。我們可以對1和5位進行人源化而無損其抑制功能，因為這些氨基酸通過FR1引物引入，而不存在于天然美洲駝序列中。我們也可人源化111位，因為我們分離出了除I111V外與C37等同的VHH(AM-2-75SEQ ID 3號)，仍具有同樣的功能(實施例9和表6)。
108位在Camelid VHH中是溶劑暴露的，但在人類抗體中該位點隱藏于VH-VL界面(Spinelli，1996；Nieba，1997)。在分離的VH中，108位是溶劑暴露的。引入非極性疏水Leu而不是極性不帶電Gln對分子固有的可折疊性/穩(wěn)定性有重大影響。
抗VWF VHHs的片段實施例65vWF-C37的VHH-CDR3片段的表達通過使用位于框架4區(qū)中的正義引物(正向CCCCTGGTCCCAGTTCCCTC)和位于框架3區(qū)中的反義引物(反向TGTGCTCGCGGGGCCGGTAC)對C37的CDR3區(qū)進行擴增。
為了將CDR3片段克隆到pAX10中，用以下引入所需限制位點的引物進行第二輪PCR擴增反向引物Sfi1GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCTCGCGGGGCCGGTAC正向引物Not1GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGTCCCAGTTCCCTC用50pmol每種引物在50ml反應體積中進行PCR反應。初級PCR反應條件為94℃11分鐘，然后是在94/55/72℃30/60/120秒，循環(huán)30次，最后是72℃5分鐘。所有反應體系含2.5mM MgCl2，200mM dNTP和1.25U AmpliTaqGod DNA多聚酶(Roche Diagnostics，Brussels，Belgium)。
用Sfil和Not1切開后將PCR產(chǎn)物克隆到pAX10中。
構象特異性抗vWF VHHs的分離實施例66通過第一和第二輪生物淘洗進行重組體A1(rA1)的選擇用5μg/ml重組vWF A1結構域(rA1)或含1％酪蛋白的PBS包被微量滴定板的孔。4℃溫育過夜后，用含1％酪蛋白的PBS室溫封閉滴定板孔3小時。將200μl噬菌體加到滴定板孔內(nèi)。室溫溫育2小時后，滴定板孔用PBS-吐溫和PBS各沖洗10次。用100μl 0.2M pH 2.4甘氨酸緩沖液洗脫已結合的噬菌體。室溫條件下洗脫20分鐘。將洗脫得到的噬菌體感染指數(shù)生長的大腸桿菌TG1細胞，然后將其鋪于含100μg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖的LB瓊脂平板中。如上所述在相同條件下進行第2輪，但將噬菌體重懸于10μg/mlvWF。用10μg/ml vWF沖洗滴定板孔7次，時間30分鐘。結果歸納于表31。
實施例67生物淘洗后進行單個克隆的篩選ELISA與rA1和vWF結合將單個集落用于起始在含2％葡萄糖和100μg/ml氨卞青霉素的LB中培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物用含100μg/ml氨卞青霉素的TB培養(yǎng)基稀釋100倍，在37℃條件下進行溫育直到OD 600nm＝0.5。加入1mMIPTG，培養(yǎng)物37℃溫育3個多小時或28℃過夜。將培養(yǎng)物于10,000rpm 4℃離心20分鐘。沉淀冰凍過夜或在-20℃條件下放置1小時。然后，室溫下解凍沉淀40分鐘，用PBS再懸沉淀，冰上振蕩1小時。通過在4℃20,000rpm離心20分鐘分離胞質級分。用含VHH的上清液作進一步分析。
用2μg/ml rA1或1μg/ml vWF包被微量滴定板，4℃過夜。用300μl含有1％酪蛋白的PBS室溫下封閉微量滴定板2小時。PBS-吐溫沖洗滴定板3次。經(jīng)過第二輪篩選后，對于192個獨立克隆制備胞質級分，使之與滴定板孔結合。用PBS-吐溫沖洗滴定板6次，然后檢測nanobody的結合，方法是與PBS中的兔多克隆抗-nanobody抗體(1/2000稀釋)室溫溫育1小時，再用PBS中1/2000稀釋的山羊抗兔-HRP綴合物室溫下溫育1小時。用底物ABTS/H2O2進行染色，30分鐘后在405nm檢測信號。結果歸納于表32。我們得出結論50個克隆與rA1而非vWF結合。
實施例68HinfI圖譜及測序第二輪淘洗后，用一套結合載體序列的引物對rA1陽性克隆和vWF陰性克隆進行PCR。PCR產(chǎn)物用限制性酶HinfI酶切，上樣于瓊脂糖凝膠。選擇30個具有不同HinfI圖譜的克隆作進一步評估。那些克隆用實施例67所述ELISA進行更細致的檢測。30個克隆中有4個顯示明顯對于rA1比對于vWF更高的親和力。該數(shù)據(jù)見圖29(結合rA1)和30(結合vWF)所示。對這些克隆進行測序，結果歸納于表30(SEQ ID 62到65號)。
實施例69抑制性ELISA通過ELISA確定nanobody對vWF與gpIb結合的抑制作用。用5μg/ml在PBS中的對血小板受體gpIb特異性抗體4℃過夜包被滴定板。PBS-吐溫沖洗滴定板5次，用300μl PBS-1％酪蛋白室溫下封閉2小時。PBS-吐溫沖洗滴定板3次。將1/2稀釋的血漿加到滴定板孔內(nèi)，使之在37℃結合1.5小時。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。加入遞減濃度的VHH。含vWF的血漿以1/50稀釋，在37℃預溫5分鐘。將終濃度為1mg/ml的利托菌素加到VHH中。在37℃溫育該混合物1小時。然后將50μl該混合物加到滴定板孔內(nèi)，37℃溫育90分鐘。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。將抗vWF-HRP單克隆抗體用PBS稀釋3000倍，溫育1小時。PBS-吐溫沖洗滴定板5次，用ABTS/H2O2檢測vWF的結合。30分鐘后在405nm測量信號。
1.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。
圖2.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。VHH被表示抑制vWF與膠原蛋白之間的相互作用。
圖3.如實施例7所述用純化的VHH，通過ELISA確定與vWF的結合。
圖4.如實施例9所述用ELISA檢測VHH對vWF與膠原蛋白結合的抑制作用。
圖5.如實施例11所述，Western印跡顯示vWF A3結構域作為與OprI的融合物表達于大腸桿菌表面。
圖6.用于構建二價或雙特異性nanobody的PAX011多克隆位點的限制性圖譜。
圖7.如實施例13所述，ELISA中單價相對二價和雙特異性VHH與純化vWF的結合狀況。
圖8.如實施例15所述，雙特異性VHH在人血漿中37℃溫育高達24小的穩(wěn)定性。
圖9.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。VHH被表示抑制vWF與血小板之間的相互作用。
圖10.如實施例18所述，Western印跡顯示vWF A1結構域與OprI作為融合物表達于大腸桿菌表面。
圖11.如實施例20所述，用純化的VHH，通過ELISA確定與vWF的結合狀況。
圖12.實施例21所述，A50和A38(陰性對照)對gpIb與vWF結合的抑制作用。
圖13.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。雙特異性構建體中的一個VHH為vWF特異性并抑制vWF與膠原蛋白之間的相互作用，另一個VHH為vWF特異性但抑制vWF與血小板之間的相互。
圖14.如實施例28所述，在ELISA中對vWF的結合。
圖15.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。VHH被表示為膠原蛋白特異性，抑制vWF與膠原蛋白之間的相互作用。
圖16.如實施例34所述，在ELISA中純化的VHH與I型和III型膠原蛋白結合狀況。
圖17.如實施例44所述，表明文庫中存在HSA特異性nanobody的噬菌體ELISA。
圖18.如實施例48所述，表達清蛋白結合物的噬菌體與印跡到硝酸纖維素膜上的血漿的結合狀況。
圖19.如實施例48所述，SDS-PAGE上血漿樣品的考馬斯染色。
圖20.如實施例50所述，通過ELISA確定純化的nanobody與小鼠清蛋白結合狀況。
圖21.如實施例51所述，用于改善半衰期的雙特異性構建體，所述雙特異抗體的一個VHH結合清蛋白，第二個VHH結合vWF。
圖22.如實施例53所述，三明治ELISA表明雙特異性構建體中兩種VHH的功能性。
圖23.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。將VHH表示為gpIb特異性并抑制vWF與血小板之間的相互作用。
圖24.儲存于-20℃的C37與37℃溫育高達194小時的C37殘留活性的比較。如實施例61所述，C37穩(wěn)定性與B3抗原特異性scFv的穩(wěn)定性和穩(wěn)定形式dsFv(通過2個二硫鍵穩(wěn)定)的穩(wěn)定性比較。
圖25.如實施例61所述，儲存于-20℃的C37與在37℃溫育一年的C37抑制活性比較。
圖26.如實施例62所述，人血漿vWF與固定于丙烯酰胺上的C37結合狀況。
圖27.如實施例63所述，C37與人種系序列DP-47氨基酸比對。
圖28.如實施例64所述，通過ELISA確定C37和C37-hum對vWF與膠原蛋白結合的抑制作用。
圖29.ELISA測量的A11、A12、A13、A14、A15和A16克隆與rA1結合狀況。
圖30.ELISA測量的A11、A12、A13、A14、A15和A16克隆與vWF結合狀況。
表表1.根據(jù)實施例1免疫美洲駝002的方案。
表2.如實施例4所述，與PBS-酪蛋白相比，一或兩輪淘洗后vWF蝕斑形成單位(pfu)。Pfu vWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結合)＝豐度。
表3.如實施例5所述，一或兩輪淘洗后抑制劑數(shù)目與檢測克隆數(shù)目比值。
表4.如實施例6所述，生長于WK6大腸桿菌細胞的VHH表達和純化后的產(chǎn)量(mg/升培養(yǎng)物)。
表5.依照實施例8，ELISA中VHH與vWF和美洲駝002免疫的3種抗原結合的OD405nm值。
表6.如實施例9所述，抑制vWF與膠原蛋白結合達50％(IC50)所需的VHH的濃度(nM)。
表7.如實施例11所述，結合vWF并抑制其與膠原蛋白相互作用的VHH表位作圖。
表8.如實施例12所述，每升培養(yǎng)物中二價和雙特異性VHHs純化蛋白產(chǎn)量(mg)。
表9.單價與二價和雙特異性VHHs的IC50值比較。如實施例14所述，用人、豬和狒狒血漿檢測抑制狀況。
表10.如實施例16所述，高切應力狀態(tài)下(1600s-1)血小板聚集的抑制狀況。
表11.如實施例16所述，低切應力狀態(tài)下(300s-1)血小板聚集的抑制狀況。
表12.如實施例17所述，經(jīng)過一輪淘洗后vWF蝕斑形成單位(pfu)。PfuvWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結合)＝豐度。
表13.如實施例18所述，結合vWF和vWF A1結構域的單個克隆的ELISA篩選結果。
表14.如實施例19所述，一輪MATCHM后pBAD-OprI-A1細胞上的結果。
表15.如實施例23所述，高切應力狀態(tài)下(1600s-1)血小板聚集的抑制狀況。
表16.如實施例23所述，低切應力狀態(tài)下(300s-1)血小板聚集的抑制狀況。
表17.如實施例25所述，高切應力狀態(tài)下(1600s-1)血小板聚集的抑制狀況。
表18.如實施例25所述，低切應力狀態(tài)下(300s-1)血小板聚集的抑制狀況。
表19.如實施例27所述，雙特異性構建體表達和純化后的產(chǎn)量。
表20.如實施例29所述，vWF A1和A3結構域的雙特異性nanobody的IC50值。
表21.如實施例30所述，高切應力狀態(tài)下(1600s-1)血小板聚集的抑制狀況。
表22.如實施例30所述，低切應力狀態(tài)下(300s-1)血小板聚集的抑制狀況。
表23.如實施例31所述，經(jīng)過一輪淘洗后I型膠原蛋白蝕斑形成單位(pfu)。Pfu vWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結合)＝豐度。
表24.如實施例32所述，經(jīng)過一輪選擇后結合I型和III型膠原蛋白的克隆數(shù)。
表25.根據(jù)實施例41人血清清蛋白免疫方案。
表26.如實施例45所述，經(jīng)過一輪和二輪淘洗后小鼠血清清蛋白的結果。
表27.經(jīng)過一輪和二輪篩選后選擇克隆并制備周質提取物。如實施例46所述，在ELISA中分析這些克隆與人和小鼠清蛋白結合狀況。
表28.如實施例54所述，抗清蛋白和抗vWF的雙特異性nanobody的IC50值。
表29.如實施例64所述用于C37人源化的引物序列。
表30.本發(fā)明肽和人馮維勒布蘭德因子(vWF)的氨基酸序列表。人vWF序列分別用粗體字母表示A1和A3結構域。
表31.如實施例66所述，經(jīng)過兩輪淘洗后對vWF rA1結構域的結果。
表32.如實施例67所述，所選克隆與rA1和vWF結合的ELISA分析。
表1依照實施例1美洲駝002免疫接種方案
表2如實施例4所述，與PBS-酪蛋白相比，一或兩輪淘洗后vWF蝕斑形成單位(pfu)。Pfu vWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結合)＝豐度。
表3如實施例5所述，經(jīng)過第1輪和第2輪淘洗后，抑制劑數(shù)目與檢測克隆數(shù)目比值。
表4如實施例6所述，生長于WK6大腸桿菌細胞的VHH表達和純化后的產(chǎn)量(mg/升培養(yǎng)物)。
表5依照實施例8，ELISA中VHH與vWF和美洲駝002免疫的3種抗原結合的OD405nm值。
表6如實施例9所述，抑制vWF與膠原蛋白結合達50％(IC50)所需的VHH的濃度(nM)。
表7如實施例11所述，結合vWF并抑制其與膠原蛋白相互作用的VHH表位作圖
表8如實施例12所述，每升培養(yǎng)物中二價和雙特異性VHHs純化蛋白的產(chǎn)量(mg)
表9與二價和雙特異性VHHs相比，單價VHH的IC50值。如實施例14所述，用人、豬和狒狒血漿檢測抑制狀況。
表10如實施例16所述，高切應力狀態(tài)下(1600s-1)下血小板聚集的抑制狀況
表11如實施例16所述，在低切應力狀態(tài)下(300s-1)血小板聚集的抑制狀況
表12如實施例17所述，經(jīng)過一輪淘洗vWF的蝕斑形成單位(pfu)。Pfu vWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結合)＝豐度
表13如實施例18所述，在ELISA中篩選個體克隆結合vWF和vWF A1結構域的結果。
表14如實施例19所述，一輪MATCHM后pBAD-OprI-A1細胞的結果
表15如實施例23所述，在高切應力狀態(tài)下(1600s-1)血小板聚集的抑制狀況
表16如實施例23所述，在低切應力狀態(tài)下(300s-1)血小板聚集的抑制狀況
表17如實施例25所述，在高切應力狀態(tài)下(1600s-1)血小板聚集的抑制狀況
表18如實施例25所述，在低切應力狀態(tài)下(300s-1)血小板聚集的抑制狀況
表19如實施例27所述，雙特異性構建體表達和純化后的產(chǎn)量
表20如實施例29所述，vWF A1和A3結構域的雙特異性nanobody的IC50值
表21如實施例30所述，在高切應力狀態(tài)下(1600s-1)血小板聚集的抑制狀況
表22如實施例30所述，在低切應力狀態(tài)下(300s-1)血小板聚集的抑制狀況
表23如實施例31所述，經(jīng)一輪淘洗I型膠原蛋白的蝕斑形成單位(pfu)。PfuvWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結合)＝豐度
表24如實施例32所述，經(jīng)過一輪選擇結合I型和III型膠原蛋白的克隆數(shù)
表25根據(jù)實施例41人血清清蛋白的免疫方案
表26如實施例45所述，經(jīng)過一輪和二輪淘洗后小鼠血清清蛋白上的結果
表27經(jīng)過一輪和二輪篩選后選擇克隆并制備周質提取物。如實施例46所述，在ELISA中分析這些克隆與人和小鼠清蛋白結合狀況
表28如實施例54所述針對清蛋白和針對vWF的雙特異nanobides的IC50值
表29如實施例64所述，用于人源化C37的引物序列
表30本發(fā)明的肽和人馮維勒布蘭德因子(vWF)的氨基酸序列表。
人VWF的序列 分別以黑體字母表示A1和A3結構域
表31如實施例66所述經(jīng)過兩輪淘洗vWFrA1上的結果。
表32如實施例67所述所選克隆與rA1和vWF結合的ELISA分析。
序列表<110>埃博靈克斯股份有限公司<120>治療性多肽，其同源物，其片段和其用于調節(jié)血小板介導的聚集<130>ABL-005-PCT3<140>PCT/BE2004/000002<141>2004-01-09<150>EP 03447005.4<151>2003-01-10<150>PCT/EP03/06581<151>2003-06-23<150>PCT/EP03/07313<151>2003-07-08<150>PCT/BE03/00193<151>2003-11-07<150>PCT/BE03/00189<151>2003-11-07<150>PCT/BE03/00190<151>2003-11-07<150>PCT/BE03/00192<151>2003-11-07<150>PCT/BE03/00194<151>2003-11-07<150>PCT/BE03/00206<151>2003-12-01
<150>PCT/BE03/00191<151>2003-12-02<160>85<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>121<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>1Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr20 25 30Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp100 105 110Gln Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser115 120<210>2<211>121<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>2Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
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Asp Lys Val Cys Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln2420 2425 2430Phe Trp Glu Glu Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu2435 2440 2445Asp Ala Val Met Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro2450 2455 2460Cys Glu Asp Ser Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu2465 2470 2475Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val2480 2485 2490Thr Gly Ser Pro Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val2495 2500 2505Gly Ser Gln Trp Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu2510 2515 2520Cys Val Arg Val Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val2525 2530 2535Ser Cys Pro Gln Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln2540 2545 2550Leu Ser Cys Lys Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu2555 2560 2565Arg Met Glu Ala Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly2570 2575 2580Lys Thr Val Met Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val2585 2590 2595Gln Val Gly Val Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr2600 2605 2610Thr Cys Asn Pro Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr2615 2620 2625Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln2630 2635 2640Leu Arg Gly Gly Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu2645 2650 2655Gln Asp Gly Cys Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly2660 2665 2670Glu Tyr Phe Trp Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp2675 2680 2685Glu His Lys Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro2690 2695 2700
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85 90 95Ala His Arg Gln Thr Val Val Arg Gly Pro Tyr Leu Leu Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>52<211>123<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>52Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Lys Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val35 40 45Ala Gly Ser Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Asn Tyr Tyr Ser Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Ala Ser Thr Asn Leu Trp Pro Arg Asp Arg Asn Leu Tyr Ala Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>53<211>125<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>53Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Gly Ile Tyr20 25 30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val35 40 45Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Arg Tyr Leu Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Lys Asn Ala Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Val Asp Ser Ser Gly Arg Leu Tyr Trp Thr Leu Ser Thr Ser Tyr100 105 110Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>54<211>125<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>54Gln Val Gln Leu Val Glu Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Gly Ile Tyr20 25 30Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val35 40 45Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Arg Tyr Ile Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Val Asp Ser Ser Gly Arg Leu Tyr Trp Thr Leu Ser Thr Ser Tyr100 105 110Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>55<211>124<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)
<400>55Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Pro Tyr20 25 30Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu35 40 45Ala Gly Val Thr Trp Ser Gly Ser Ser Thr Phe Tyr Gly Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Thr65 70 75 80Leu Glu Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Gly Leu Tyr Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Asp100 105 110Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>56<211>131<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>56Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ala Trp20 25 30Pro Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val35 40 45Ser Cys Ile Arg Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly50 55 60Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Asn Asn Thr Val Tyr Leu Gln65 70 75 80Thr Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala85 90 95Pro Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ser Ser His Thr Phe Gly Ile Tyr Trp100 105 110
Asn Leu Arg Asp Asp Tyr Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr115 120 125Val Ser Ser130<210>57<211>126<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>57Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp His Tyr20 25 30Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val35 40 45Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Thr Leu Glu Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Ala Gly Gly Leu Leu Leu Arg Val Glu Glu Leu Gln Ala Ser Asp100 105 110Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>58<211>128<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>58Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr20 25 30Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45Ala Cys Ile Ser Asn Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Thr Ala Asp Arg His Tyr Ser Ala Ser His His Pro Phe Ala Asp100 105 110Phe Ala Phe Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>59<211>120<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>59Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Tyr Gly Leu Thr Phe Trp Arg Ala20 25 30Ala Met Ala Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val35 40 45Val Ala Arg Asn Trp Gly Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Ala Val Arg Thr Tyr Gly Ser Ala Thr Tyr Asp Ile Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>60<211>123<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)
<400>60Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Asp Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ala Asn Tyr20 25 30Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val35 40 45Ala Ala Ile Asn Arg Asn Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Leu50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Ala Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Ala Arg Glu Trp Pro Phe Ser Thr Ile Pro Ser Gly Trp Arg Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>61<211>125<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>61Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Ala Ser Ser His20 25 30Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val35 40 45Val Gly Ile Asn Arg Gly Gly Val Thr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Ile Cys85 90 95Ala Ala Arg Pro Glu Tyr Ser Phe Thr Ala Met Ser Lys Gly Asp Met100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>62<211>126<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>62Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Ala Gly Ala1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Leu20 25 30Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val35 40 45Ala Phe Ile Gly Ser Asp Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Ser Ser Val Arg50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Met Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Ala Arg Ser Ser Ala Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Gly Ser100 105 110Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>63<211>125<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>63Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Ile35 40 45Ala Val Ile Tyr Trp Arg Asp Gly Ser Ser Leu Tyr Ser Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Asn Arg His Asp Ser Arg Gly Thr Tyr Tyr Ser Ser Arg Gly Tyr100 105 110Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>64<211>122<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>64Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Lys Asp Met Ala20 25 30Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Val Ile35 40 45Tyr Ser Ser Asp Gly Ser Thr Leu Val Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg50 55 60Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met65 70 75 80Thr Ser Leu Lys Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser85 90 95Arg Gly Tyr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser Arg Tyr Asp Tyr Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>65<211>122<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>65Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Lys Asp Met Ala20 25 30Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Val Ile35 40 45Tyr Ser Ser Asp Gly Ser Thr Leu Val Ala Ala Ser Val Thr Gly Arg50 55 60Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met65 70 75 80Thr Ser Leu Lys Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser85 90 95Arg Gly Tyr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser Arg Tyr Asp Tyr Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>66<211>23<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>66ggctgagctc ggtggtcctg gct 23<210>67<211>45<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>67aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt ttttttttttttttt45<210>68<211>42<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>68ctggtgctgc agaggtgaag cttcggagag gggctgcaga tc 42<210>69
<211>42<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>69atccatgcaa atcctctaga atccagagca cagtttgtgg ag 42<210>70<211>45<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>70ccggtgagcc ccaccactct aagcttggag gacatctcgg aaccg 45<210>71<211>42<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>71ccccagggtc gaaaccctct agagccccgg gcccacagtg ac 42<210>72<211>20<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>72cccctggtcc cagttccctc 20<210>73<211>20<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>73tgtgctcgcg gggccggtac 20<210>74<211>47<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)
<400>74gtcctcgcaa ctgcggccca gccggcctgt gctcgcgggg ccggtac 47<210>75<211>42<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>75gtcctcgcaa ctgcgcggcc gccccctggt cccagttccc tc 42<210>76<211>60<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>76agagacaact ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg 60<210>77<211>20<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>77Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg1 5 10 15Ala Glu Asp Thr20<210>78<211>30<212>DNA<213>美洲駝(Lama glama)<400>78attactgtgc taaaggggcc ggtactagtt30<210>79<211>9<212>PRT
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1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Gly Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu20 25 30Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu35 40 45Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His50 55 60<210>84<211>98<212>PRT<213>人<400>84Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys<210>85<211>121<212>PRT<213>美洲駝(Lama glama)<400>85Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp100 105 110Gln Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser115 120
權利要求
1.一種多肽構建體，其包含-至少一種針對vWF、vWF A1結構域、活化的vWF的A1結構域、vWF A3結構域、gpIb或膠原蛋白的任一種的單結構域抗體。
2.根據(jù)權利要求1的多肽構建體，還包含至少一種針對一種或多種血清蛋白的單結構域抗體。
3.根據(jù)權利要求2的多肽構建體，其中所述至少一種血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、轉鐵蛋白或纖維蛋白原或其片段中的任何一種。
4.根據(jù)權利要求2和3的多肽構建體，其中針對一種或多種血清蛋白的至少一種單結構域抗體對應SEQ ID NO16到19和49到61任一個所示序列。
5.根據(jù)權利要求2到4任一項的多肽構建體，其對應SEQ ID NO13到15和42到45任一個所示序列。
6.根據(jù)權利要求1到5的多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體是人源序列。
7.根據(jù)權利要求6的多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體對應SEQ ID NO38到41和42到45任一個所示序列。
8.根據(jù)權利要求1的多肽構建體，其對應SEQ ID NO8到12、20到22、32到34和46到47任一個代表的序列。
9.根據(jù)權利要求1到8任一項的多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體是駱駝科VHH抗體。
10.根據(jù)權利要求1到9任一項的多肽構建體，其中至少一種單結構域抗體對應SEQ ID NO1到7、23到31、35到37和62到65任一個代表的序列。
11.根據(jù)權利要求1到10任一項的多肽構建體，，其中所述單結構域抗體是全長單結構域抗體的同源序列、功能部分或同源序列的功能部分。
12.根據(jù)權利要求1到11任一項的多肽構建體，其中所述多肽構建體是所述多肽構建體的同源序列、其功能部分或其功能部分的同源序列。
13.核酸，其編碼根據(jù)權利要求1到12任一項的多肽構建體。
14.組合物，其包括權利要求1到12任一項的多肽構建體和至少一種溶解血栓試劑，用于同時、分別或順序向受試者給藥。
15.根據(jù)權利要求14的組合物，其中所述溶解血栓試劑是葡萄球菌激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、單鏈鏈激酶、尿激酶和酰基纖溶酶原鏈激酶復合物的任何一種。
16.根據(jù)權利要求1到12任一項的多肽構建體，或根據(jù)權利要求13的核酸，或根據(jù)權利要求14和15的組合物在治療、預防和/或緩解與血小板介導的聚集或其機能障礙相關的疾病中應用。
17.根據(jù)權利要求1到12任一項的多肽構建體，或根據(jù)權利要求13的核酸，或根據(jù)權利要求14和15的組合物在制備制備治療、預防和/或緩解與血小板介導的聚集或其機能障礙相關的疾病的藥物中的應用。
18.根據(jù)權利要求16的多肽構建體、核酸或組合物，或根據(jù)權利要求17的多肽構建體、核酸或組合物的應用，其中所述疾病是產(chǎn)生自短暫腦局部缺血性發(fā)作、不穩(wěn)定或穩(wěn)定型心絞痛、心絞痛、腦梗塞、心肌梗塞、周圍動脈閉塞性疾病、再狹窄、冠脈旁路移植，或冠狀動脈瓣膜換置和冠脈介入如血管成形術、放置斯坦特印模、頸動脈內(nèi)膜切除術或粥樣斑切除術的任何一種。
19.根據(jù)權利要求16的多肽構建體、核酸或組合物，或根據(jù)權利要求17的多肽構建體、核酸或組合物的應用，其中所述疾病是非閉塞性血栓形成、閉塞性血栓形成、動脈血栓形成、急性冠脈閉塞、再狹窄、PCTA或放置斯坦特印模后再狹窄、狹窄的動脈內(nèi)血栓形成、血管成形術、粥樣斑切除術或動脈斯坦特印模后的增生、血管系統(tǒng)的閉塞綜合征或患病動脈的開放缺陷中的任何一種。
20.根據(jù)權利要求16的多肽構建體、核酸或組合物，或根據(jù)權利要求17的多肽構建體、核酸或組合物的應用，其中所述疾病是在高切應力環(huán)境下斑塊或血栓形成。
21.根據(jù)權利要求16、18到20任一項的多肽構建體、核酸或組合物，或根據(jù)權利要求17到20的多肽構建體的應用，其中所述多肽構建體通過靜脈內(nèi)、皮下、口服、舌下、局部、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入給藥。
22.組合物，其包括權利要求1到12、16、18到21任一項的多肽構建體或編碼所述多肽構建體的核酸，或根據(jù)權利要求14和15的組合物，和藥用載體。
23.一種生產(chǎn)權利要求1到12、16、18到21任一項的多肽的方法，包括(a)在允許表達所述多肽的條件下，培養(yǎng)包括能編碼根據(jù)權利要求1到12、16、18到21任一項的多肽的核酸的宿主細胞，和(b)自培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的多肽。
24.根據(jù)權利要求23的方法，其中所述宿主細胞為細菌或酵母。
25.一種處理侵入性醫(yī)學裝置以防止在侵入部位周圍的血小板介導的聚集的方法，包括用根據(jù)權利要求1到12的多肽構建體包被所述裝置的步驟。
26.一種防止在侵入部位周圍的血小板介導的聚集的侵入性醫(yī)學裝置，其中所述裝置包被有根據(jù)權利要求1到12的多肽構建體。
27.一種鑒定調節(jié)血小板介導的聚集的試劑的方法，包括(a)在允許所述多肽間結合的條件下，在存在和不存在候選調節(jié)劑的條件下，使根據(jù)權利要求1到12的多肽構建體與對應其靶目標的多肽或其片段接觸，和(b)測量(a)步驟的多肽間的結合，其中與不存在所述候選調節(jié)劑的結合相比，存在所述候選調節(jié)劑時結合的下降將所述候選調節(jié)劑鑒定為調節(jié)血小板介導的聚集的試劑。
28.試劑盒，用于根據(jù)權利要求27的方法篩選調節(jié)血小板介導的聚集的試劑。
29.根據(jù)權利要求27的方法鑒定的未知試劑，其調節(jié)血小板介導的聚集。
30.一種診斷以血小板介導的聚集的機能障礙為特征的疾病或病癥的方法，包括步驟(a)使樣品與根據(jù)權利要求1到12的多肽構建體接觸，和(b)檢測所述多肽構建體與所述樣品的結合，和(c)將步驟(b)中檢測的結合與標準進行比較，其中相對所述樣品而言結合的差異是以血小板介導的聚集的機能障礙為特征的疾病或病癥的診斷特征。
31.試劑盒，用于根據(jù)權利要求30的方法篩選診斷以血小板介導的聚集的機能障礙為特征的疾病或病癥。
32.根據(jù)權利要求28或31的試劑盒，其包括根據(jù)權利要求1到12任一項的多肽構建體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療需要對血小板介導的聚集進行調節(jié)的疾病并克服現(xiàn)有技術問題的多肽、所述多肽的同源物和/或所述多肽的功能部分，該多肽包括針對vWF、vWF A1結構域、活化的vWF的A1結構域、vWF A3結構域、gpIb和/或膠原蛋白的至少一個單結構域抗體。本發(fā)明另一方面是產(chǎn)生所述多肽的方法，用所述多肽包被用于醫(yī)學程序(如PCTA，放置斯坦特印模)的裝置的方法，篩選調節(jié)血小板介導的聚集的試劑的方法和試劑盒，以及診斷與血小板介導的聚集相關疾病的試劑盒。
文檔編號A61P7/02GK1735630SQ200480002090
公開日2006年2月15日 申請日期2004年1月9日 優(yōu)先權日2003年1月10日
發(fā)明者卡倫·西萊恩克 申請人:埃博靈克斯股份有限公司