專利名稱：使用otx2基因再生和新生視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有Otx2蛋白或編碼Otx2蛋白的基因的誘導(dǎo)分化視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑，預(yù)防/治療/抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑，和視網(wǎng)膜疾病的診斷試劑。
背景技術(shù)：
視網(wǎng)膜感光細(xì)胞是哺乳動(dòng)物中僅有的一種光感受器，之前在生理學(xué)、生物化學(xué)、解剖學(xué)和臨床方面對(duì)其進(jìn)行過深入的研究(JP-A-2002-325571)。不過，對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的發(fā)育和分化機(jī)制還一無所知。作為由視網(wǎng)膜光感光細(xì)胞異常引起的人遺傳性視網(wǎng)膜變性病變的潛在位點(diǎn)，至少已知145個(gè)位點(diǎn)，但目前還沒有現(xiàn)成的治療該疾病的方法，而患者正遭受嚴(yán)重視力障礙的困擾。因此，需要闡明導(dǎo)致視力喪失或嚴(yán)重視力障礙的視網(wǎng)膜變性病變的起因和建立治療方法。此外，由于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性病變或dyscrasia在很多視網(wǎng)膜疾病中都有發(fā)現(xiàn)，例如色素性視網(wǎng)膜炎，糖尿病性視網(wǎng)膜病和視網(wǎng)膜黃斑變性病變，所以為再生或新生視網(wǎng)膜感光細(xì)胞，重要的是闡明視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)育和分化的分子機(jī)制。
發(fā)明公開本發(fā)明的一個(gè)目的是提供預(yù)防、治療或抑制包括視網(wǎng)膜變性病變的視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可用作藥物的化合物的篩選方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供診斷視網(wǎng)膜疾病的試劑或方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供誘導(dǎo)分化的方法，或誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑，該細(xì)胞適合用于患視網(wǎng)膜疾病患者視網(wǎng)膜移植。
本發(fā)明人關(guān)注與轉(zhuǎn)錄因子Crx屬于相同基因家族的Otx2蛋白，Crx之前被分析作為分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的關(guān)鍵因子，并分析Otx2蛋白在決定視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的命運(yùn)中的作用。小鼠活體水平的分析結(jié)果是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Otx2蛋白對(duì)決定視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的命運(yùn)是非常重要的。即，當(dāng)Otx2基因插入到病毒載體以感染帶有重組載體的小鼠未分化視網(wǎng)膜干細(xì)胞，并在小鼠未分化視網(wǎng)膜干細(xì)胞表達(dá)Otx2蛋白時(shí)，絕大多數(shù)未分化的視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人進(jìn)一步研究完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及(1)預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑，其包括Otx2蛋白或其部分肽或其鹽，(2)上述(1)的藥劑，其中Otx2蛋白是含有與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白，(3)預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑，其包括編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，(4)根據(jù)上述(3)的藥劑，其中DNA含有SEQ ID NO2，SEQID NO4或SEQ ID NO6所示的核苷酸序列，或與這些序列在高度嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列，(5)根據(jù)上述(3)的藥劑，其包括含有編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA的重組載體，(6)誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑，其包括Otx2蛋白或其部分肽或其鹽，(7)誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑，其包括編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，(8)誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的方法，其包括表達(dá)Otx2蛋白或提高Otx2蛋白的表達(dá)量，(9)根據(jù)上述(8)的誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的方法，包括表達(dá)Otx2蛋白，或在來自眼球組織的細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞中提高Otx2蛋白的表達(dá)量，(10)根據(jù)上述(8)的誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的方法，其中編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA被導(dǎo)入到來自眼球組織的細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞中，并培養(yǎng)得到的細(xì)胞，(11)預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的Otx2蛋白或其部分肽或其鹽，(12)預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，(13)再生視網(wǎng)膜的方法，包括移植由Otx2蛋白誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞或其前體細(xì)胞到視網(wǎng)膜中，(14)Otx2蛋白或其部分肽或其鹽在制備預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑中的應(yīng)用，(15)編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA在制備預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑中的應(yīng)用，(16)視網(wǎng)膜疾病的診斷試劑，包括Otx2蛋白或其部分肽或其鹽的抗體，(17)視網(wǎng)膜疾病的診斷方法，包括使用Otx2蛋白或其部分肽或其鹽的抗體，(18)視網(wǎng)膜疾病的診斷方法，包括檢測Otx2蛋白或其部分肽的表達(dá)量或突變，(19)視網(wǎng)膜疾病的診斷試劑，包括(a)編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，或(b)含有與所述DNA或RNA的核苷酸序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的核苷酸序列的反義多核苷酸，(20)視網(wǎng)膜疾病的診斷方法，包括使用a)編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，或(b)含有與所述DNA或RNA的核苷酸序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的核苷酸序列的反義多核苷酸，(21)具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物或其鹽的篩選方法，包括使用作為指示的Otx2蛋白或其部分肽的表達(dá)或其表達(dá)量的增加，(22)根據(jù)上述(21)的篩選方法，其中使用具有表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽的能力的細(xì)胞，(23)具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物或其鹽的篩選試劑盒，其含有具有表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽的能力的細(xì)胞，(24)具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物或其鹽，其可以使用上述(21)或(22)定義的篩選方法，或上述(23)定義的篩選試劑盒得到，(25)藥物，其包括上述(24)定義的化合物或其鹽。
使用本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的DNA，來自眼球組織的細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞可以分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。因此，通過使用本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的DNA再生或新生成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞，可以預(yù)防或治療視網(wǎng)膜疾病如色素性視網(wǎng)膜炎、老年性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜脫落、青光眼和視網(wǎng)膜血管阻塞，或可以抑制這些疾病的發(fā)展。此外，由于Otx2基因的異常，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和功能異常，對(duì)這些視網(wǎng)膜疾病的診斷可以通過檢測Otx2基因的異常，或Otx2蛋白表達(dá)的退化或降低來進(jìn)行。
附圖簡述

圖1顯示對(duì)照病毒載體和Otx2病毒載體的結(jié)構(gòu)。圖中，AP代表來自胎盤的堿性磷酸酶基因，LTR代表病毒啟動(dòng)子。當(dāng)Otx2病毒載體在Otx2和AP之間具有IRES序列時(shí)，載體可以共表達(dá)兩種基因(Otx2和AP)。IRES序列是來自病毒的基因。
圖2顯示病毒感染測試的概述。圖中，“Ratina”代表視網(wǎng)膜，“Pigment Epithelium”代表色素上皮細(xì)胞，“Virus”代表感染有病毒的范圍，“去除視網(wǎng)膜”代表提取視網(wǎng)膜，“固定和染色”代表組織固定和染色，及“切片和分析克隆”代表冷凍切片及其分析。
圖3顯示堿性磷酸酶染色后的視網(wǎng)膜冷凍切片圖像的例子。圖中，“Bi”代表雙極細(xì)胞，“A”代表無長突細(xì)胞，“R”代表視網(wǎng)膜感光細(xì)胞，“M”代表馬勒神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，“R+Bi”代表視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和馬勒神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以及“A+Bi”代表無長突細(xì)胞和雙極細(xì)胞。
圖4顯示感染有對(duì)照病毒載體(LIA)或Otx2病毒載體(Otx2/LIA)的視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化的各細(xì)胞相對(duì)于顯微鏡一個(gè)視野中總細(xì)胞數(shù)目的存活率。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明使用的Otx2蛋白的例子包括含有與SEQ ID NO1，3或5所示相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白。本發(fā)明中，Otx2蛋白不限于具有SEQ ID NO1或3代表的氨基酸序列的來自人的Otx2蛋白，和具有SEQ ID NO5代表的氨基酸序列的來自小鼠的Otx2蛋白，還可以具有來自其他動(dòng)物的氨基酸序列，特別是，溫血?jiǎng)游?如豚鼠、小鼠、雞、兔、豬、羊、牛、猴等)，或與上述序列基本相同的氨基酸序列。
“與SEQ ID NO1，3或5所示基本相同的氨基酸序列”的例子包括具有與SEQ ID NO1，3或5代表的氨基酸序列相比不少于約50％，優(yōu)選不少于約60％，更優(yōu)選不少于約70％，進(jìn)一步優(yōu)選不小于約80％，優(yōu)選不少于約90％，最優(yōu)選不少于約95％的同源性的氨基酸序列。作為含有與本發(fā)明的SEQ ID NO1，3或5所示基本相同的氨基酸序列的蛋白，例如，含有與SEQ ID NO1，3或5所示基本相同的氨基酸序列并具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的蛋白是優(yōu)選的。其中，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄活性和誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的作用與具有SEQ ID NO1，3或5代表的氨基酸序列的蛋白相當(dāng)(如，約0.01到100倍，優(yōu)選約0.5到20倍，更優(yōu)選約0.5到2倍)，而這些活性或如蛋白的分子量的定量元素可以不同?？梢愿鶕?jù)已知的方法測量誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的作用，例如，上述作用可以通過后面描述的篩選方法測量?？梢允褂靡阎姆椒ㄈ鐖?bào)告分析和RT-PCR測量轉(zhuǎn)錄活性。
具體地，使用含有(a)SEQ ID NO1，3或5代表的氨基酸序列中一個(gè)或兩個(gè)或更多(優(yōu)選，約1到30，更優(yōu)選約1到10，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1到5))個(gè)氨基酸被刪除的氨基酸序列，(b)SEQ ID NO1，3或5代表的氨基酸序列中一個(gè)或兩個(gè)或更多(優(yōu)選，約1到30，更優(yōu)選約1到10，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1到5))個(gè)氨基酸被添加的氨基酸序列，(c)SEQID NO1，3或5代表的氨基酸序列中一個(gè)或兩個(gè)或更多(優(yōu)選，約1到30，更優(yōu)選約1到10，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1到5))個(gè)氨基酸被其他氨基酸替換的氨基酸序列，或(d)上述氨基酸序列的組合來作為本發(fā)明使用的Otx2蛋白。(b)中添加的氨基酸和(c)中被替換的氨基酸可以是基因編碼的20種氨基酸之外的非天然氨基酸。更優(yōu)選(a)到(d)描述的蛋白具有誘導(dǎo)分化成感光細(xì)胞的作用。
本發(fā)明的Otx2蛋白中，C末端可以是任何一種羧基(-COOH)，羧酸酯(-COO-)，酰胺(-CONH2)和酯(-COOR)。此處，酯基中的R可以使用C1-6烷基如甲基、乙基、n-丙基、異丙基和n-丁基；C3-8環(huán)烷基如環(huán)戊基和環(huán)己基；C6-12芳基如苯基和α-萘基；和C7-14芳烷基如苯基-C1-2烷基(如芐基和苯乙基)和α-萘基-C1-2烷基(如α-萘基甲基)；和另外，通常用作口服酯(oral ester)的新戊酰氧基甲基。當(dāng)本發(fā)明的Otx2蛋白在C末端以外的位置具有羧基(或羧酸酯)，則在本發(fā)明的Otx2蛋白中也包括羧基被酰胺化或酯化的蛋白。這樣，例如使用上述C末端酯作為酯。此外，本發(fā)明的Otx2蛋白包括N末端甲硫氨酸殘基被保護(hù)基團(tuán)(如C1-6?；?，如包括甲酰基和乙?；腃2-6烷酰基)保護(hù)的蛋白，在活體內(nèi)通過在N末端切割產(chǎn)生的谷氨酰基被轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸的蛋白，分子中氨基酸側(cè)鏈上可取代的基團(tuán)(如-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被合適的保護(hù)基團(tuán)(如C1-6?；绨ɡ缂柞；鸵阴；腃2-6烷?；?保護(hù)的蛋白，和稱作結(jié)合蛋白的蛋白，例如可結(jié)合糖鏈的糖蛋白。
只要是Otx2蛋白的部分肽，任一種都可以用作本發(fā)明的Otx2蛋白的部分肽(下文中一些情況下簡稱部分肽)。關(guān)于本發(fā)明的部分肽的氨基酸數(shù)目，含有Otx2蛋白的組成氨基酸序列中至少約不少于20，優(yōu)選大約不少于50，或更優(yōu)選約不少于100個(gè)氨基酸的肽是優(yōu)選的。
在本發(fā)明的部分肽中，C末端可以是羧基(-COOH)，羧酸酯(-COO-)、酰胺(-CONH2)和酯(-COOR)中的任意一種。此外，本發(fā)明的部分肽包括，像本發(fā)明的Otx2蛋白，N端甲硫氨酸殘基的氨基被保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的部分肽，在活體內(nèi)通過切割N末端側(cè)鏈產(chǎn)生的Gln被轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸的部分肽，分子中氨基酸側(cè)鏈上取代基被合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的部分肽，和如結(jié)合糖鏈的稱作糖肽的結(jié)合肽。
本發(fā)明的Otx2蛋白或其部分肽的鹽的例子包括帶有酸或堿的生理上可接受的鹽。生理上可接受的酸加成鹽是優(yōu)選的。這些鹽的例子包括無機(jī)酸(如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)的鹽，或有機(jī)酸(如乙酸、甲酸、丙酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)的鹽。
本發(fā)明的Otx2蛋白或其鹽可以從動(dòng)物細(xì)胞或組織制備，優(yōu)選從溫血?jiǎng)游?，更?yōu)選人或大鼠，進(jìn)一步優(yōu)選人，特別優(yōu)選人腦神經(jīng)元、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜感光細(xì)胞通過已知的方法純化蛋白，或還可以通過培養(yǎng)下文所述的含有編碼本發(fā)明的Otx2蛋白的DNA或RNA的轉(zhuǎn)化子來制備?；蛘?，這些蛋白可以用與下面描述的蛋白合成方法相同或相似的方式來制備。當(dāng)?shù)鞍讖膭?dòng)物組織或細(xì)胞制備時(shí)，動(dòng)物組織或細(xì)胞被勻漿，用酸抽提，提取物可以通過組合層析如反相層析和離子交換層析來純化和分離。
為合成本發(fā)明的Otx2蛋白或其部分肽或其鹽或其酰胺，通?？梢允褂每缮藤彽牡鞍缀铣蓸渲?。這些樹脂的例子包括氯甲基樹脂，羥甲基樹脂，二苯甲基胺樹脂，氨甲基樹脂，4-芐氧基芐醇樹脂，4-甲基二苯甲基樹脂，PAM樹脂，4-羥甲基甲基苯基乙酰氨基甲基樹脂，聚丙烯酰胺樹脂，4-(2’，4’-二甲氧基苯基-羥甲基)苯氧基樹脂，和4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基乙基)苯氧基樹脂。使用這些樹脂，α-氨基和側(cè)鏈官能團(tuán)被合適地保護(hù)的氨基酸在樹脂上通過已知的各種縮合方法按照所需蛋白的順序縮合。在反應(yīng)最后，蛋白從樹脂上切割同時(shí)除去各種保護(hù)基團(tuán)，另外，在高度稀釋的溶液中進(jìn)行形成分子內(nèi)二硫鍵的反應(yīng)，從而獲得所需的蛋白或其酰胺?？紤]上述對(duì)保護(hù)的氨基酸的縮合，可以使用在蛋白合成中使用的各種活化劑。作為活化劑，碳二亞胺是特別優(yōu)選的。作為使用的碳二亞胺，示例的為DCC，N，N’-二異丙基碳二亞胺，N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺。在這些試劑產(chǎn)生的活化中，保護(hù)過的氨基酸可以在預(yù)先對(duì)保護(hù)的氨基酸進(jìn)行活化后被添加到樹脂上，方法是將保護(hù)的氨基酸與外消旋抑制劑添加劑(如HOBt，HOOBt)一起直接添加到樹脂上，或?qū)⒈Ｗo(hù)的氨基酸轉(zhuǎn)化為對(duì)稱的酸酐或HOBt酯或HOOBt酯。
保護(hù)的氨基酸的活化或與樹脂縮合中使用的溶劑可以合適地從已知用于蛋白縮合反應(yīng)中的溶劑中選取。這些溶劑包括，例如，酰胺如N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，和N-甲基吡咯烷酮；鹵代烴如二氯甲烷，和氯仿；醇如三氟乙醇；亞砜如二甲亞砜；醚如吡啶，二噁烷和四氫呋喃；腈如乙腈和丙腈；酯如乙酸甲酯和乙酸乙酯，及其合適的混合物。反應(yīng)溫度合適地選自己知用于蛋白鍵形成的溫度范圍，通常合適地選自-20℃到50℃?；罨陌被嵫苌锿ǔＲ?.5到4倍過量使用。當(dāng)使用水合茚三酮反應(yīng)的測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)縮合不足時(shí)，有可能通過不去除保護(hù)基團(tuán)重復(fù)縮合反應(yīng)而進(jìn)行充分縮合。當(dāng)即使重復(fù)反應(yīng)后仍未達(dá)到充分縮合時(shí)，未反應(yīng)的氨基酸可以使用乙酸酐或乙酰咪唑進(jìn)行乙?；?。
用作原料的氨基保護(hù)基團(tuán)的例子包括，例如，Z，Boc，t-戊氧基羰基，異冰片基氧基羰基，4-甲氧基苯甲氧基羰基，Cl-Z，Br-Z，金剛烷氧基羰基，三氟乙?；彵蕉柞；?，甲?；?-硝基苯基亞磺?；?，二苯基硫膦基和Fmoc。羧基可以例如通過烷基酯化作用(如線性、分支或環(huán)狀烷基酯化如甲基、乙基、丙基、丁基，t-丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基和2-金剛烷酯)，芳烷基酯化作用(如芐基酯、4-硝基芐基酯、4-甲氧基芐基酯、4-氯芐基酯、二苯甲基酯)，苯甲酰甲基酯化作用，芐氧基羰基酰肼形成，t-丁氧基羰基酰肼形成，或三苯甲基酰肼形成而被保護(hù)。絲氨酸的羥基可以通過例如酯化或醚化來保護(hù)。適合用于這種酯化的基團(tuán)，例如可以使用低級(jí)烷?；缫阴；?、芳?；绫郊柞；蛠碜蕴妓岬幕鶊F(tuán)如芐氧基羰基和乙氧基羰基。此外，適合用于醚化的基團(tuán)是，例如芐基、四氫吡喃基、或t-丁基。作為用于酪氨酸的酚羥基的保護(hù)基團(tuán)，例如使用Bzl，Cl2-Bzl，2-硝基芐基，Br-Z，和t-丁基。作為用于組氨酸咪唑基的保護(hù)基團(tuán)，使用例如Tos，4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基，DNP，芐氧基甲基，Bum，Boc，Trt和Fmoc。
作為原料的活化的羧基，例如，使用對(duì)應(yīng)的酸酐、疊氮化物和活性酯[帶有醇的酯(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、p-硝基酚、HONB、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、HOBt)]。作為原材料的活化的氨基，例如使用對(duì)應(yīng)的磷酰胺。作為去除保護(hù)基團(tuán)(去保護(hù))的方法，使用例如(a)在氫氣流下在催化劑如鈀黑或鈀碳存在下催化還原，(b)用無水氟化氫、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或其混合溶液進(jìn)行酸處理，(c)用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪進(jìn)行堿處理，或(d)用鈉在液氨中還原。上述酸處理去保護(hù)通常在溫度約-20℃到40℃進(jìn)行，但在該酸處理中，優(yōu)選加入陽離子的清除劑(scavenger)，如苯甲醚、苯酚、苯甲硫醚、m-甲酚、p-甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁烷二硫醇，和1，2-乙烷二硫醇。用于組氨酸咪唑保護(hù)基的2，4-二硝基苯基通過苯硫酚處理除去。用作酪氨酸吲哚保護(hù)基的甲?；送ㄟ^酸處理在1，2-乙烷二硫醇或1，4丁烷二硫醇存在的條件下去保護(hù)，也可以通過用稀釋的氫氧化鈉溶液、稀釋的氨水等堿處理除去。
不應(yīng)參與原料反應(yīng)的的官能團(tuán)的保護(hù)，及其保護(hù)基團(tuán)和這些保護(hù)基團(tuán)的去保護(hù)和參與反應(yīng)的官能團(tuán)的活化可以從已知的基團(tuán)或已知的方法中合適地選擇。作為獲得蛋白酰胺的替代方法，例如，通過酰胺化首先保護(hù)羧基末端氨基酸的α-羧基，肽(蛋白)鏈在氨基側(cè)延伸到所需的鏈長度，制備只有肽鏈的N端α-氨基的保護(hù)基團(tuán)被除去的蛋白和只有C端羧基的保護(hù)基團(tuán)被除去的蛋白，和在上述混合溶劑中縮合這兩種蛋白?？s合反應(yīng)的細(xì)節(jié)同上所述。在縮合得到的保護(hù)的蛋白純化后，通過上述方法去除所有保護(hù)基團(tuán)以獲得所需的粗蛋白。該粗蛋白通過使用多種已知的純化方法純化，主要的級(jí)分被凍干，從而產(chǎn)生所需的蛋白酰胺。為獲得蛋白的酯部分，羧基末端氨基酸的α-羧基與所需的醇縮合獲得氨基酸酯，然后可以根據(jù)制備蛋白酰胺相似的方法獲得所需的蛋白的酯。當(dāng)按上述方法獲得的蛋白是自由化合物時(shí)，其可以通過已知的方法轉(zhuǎn)化為合適的鹽，并且反過來，如果獲得的蛋白是鹽的形式，其可以通過已知的方法轉(zhuǎn)化為自由的化合物。
本發(fā)明的Otx2蛋白的部分肽或其鹽可以根據(jù)已知的肽合成方法制備，或通過合適的肽酶切割本發(fā)明的Otx2蛋白而制備。作為合成肽的方法，例如，可以使用任一固相合成方法和液相合成方法。即，所需的肽可以通過將構(gòu)成本發(fā)明Otx2蛋白的部分肽氨基酸與剩余部分縮合，并在產(chǎn)品具有保護(hù)基團(tuán)時(shí)去除保護(hù)基團(tuán)而制備。已知縮合和保護(hù)基團(tuán)去保護(hù)的方法的例子包括例如下列(a)到(d)描述的方法(a)M.Bodanszky和M.A.Ondetti，肽合成，Interscience Publishers，NewYork(1966)，(b)Schroeder和Luebke，肽，Academic Press，New York(1965)，(c)Nobuo Izumiya等，堿和肽合成實(shí)驗(yàn)，Maruzen(1975)，(d)Haruaki Yajima和Shunpei Sakakibara，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程1，蛋白化學(xué)IV，205，(1977)，和(e)藥的發(fā)展，vol.14，Sequel，肽合成，HaruakiYajima，Hirokawashoten主管。
此外，反應(yīng)后，本發(fā)明的部分肽可以通過常規(guī)的純化方法純化和分離，例如組合溶劑抽提/蒸餾/柱層析/液相層析/重結(jié)晶。當(dāng)按上述方法獲得的部分肽是自由化合物，其可以通過已知的方法轉(zhuǎn)化為合適的鹽，并且反過來，如果獲得的部分肽是鹽的形式，其可以通過已知的方法轉(zhuǎn)化為自由的化合物。
作為本發(fā)明使用的編碼Otx2蛋白的DNA，可以使用基因組DNA，基因組DNA文庫，來自上述細(xì)胞/組織的cDNA，來自上述細(xì)胞/組織的cDNA文庫，和合成DNA中的任意一種。文庫中所用的載體可以是噬菌體、質(zhì)粒、粘粒和噬菌粒中的任意一種。此外，DNA可以使用從上述細(xì)胞/組織制備的總RNA或mRNA級(jí)分通過反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下文中簡稱為RT-PCR)直接擴(kuò)增。具體地，編碼Otx2蛋白的DNA的例子包括(a)含有SEQ ID NO2，4或6代表的核苷酸序列的DNA，和(b)含有與SEQ ID NO2，4或6代表的核苷酸序列在高度嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列，并編碼具有與本發(fā)明的Otx2蛋白基本相同的活性性質(zhì)(如轉(zhuǎn)錄活性、視網(wǎng)膜光感受器分化誘導(dǎo)作用等)的Otx2蛋白的DNA。SEQ ID NOS2和4是編碼人Otx2蛋白的DNA(Kastury，K.等，“人EMX和OTX基因的染色體定位”“Chromosome locations of human EMX and OTX genes”，Genomics 22(1)，41-45(1994))，而SEQ ID NO6是編碼小鼠Otx2蛋白的DNA(Simeone，A.等，“發(fā)育的rostral腦四個(gè)同源盒基因的巢式表達(dá)結(jié)構(gòu)域”“Nested expression domains of four homeobox genes in developingrostral brain”，Nature 358(6388)，687-690(1992))。作為能與SEQ ID NO2，4或6代表的核苷酸序列雜交的DNA，例如，可以使用含有與SEQID NO2，4或6代表的核苷酸序列具有不少于70％同源性，優(yōu)選不少于80％同源性，更優(yōu)選不少于90％同源性，最優(yōu)選不少于95％同源性的核苷酸序列。雜交可以根據(jù)已知的方法或其相似的方法進(jìn)行，例如，分子克隆第二版J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989描述的方法)。此外，如果使用可商購的文庫，雜交可以根據(jù)隨附的指導(dǎo)手冊(cè)描述的方法進(jìn)行。更優(yōu)選，所述雜交可以在高度嚴(yán)格條件下進(jìn)行。高度嚴(yán)格條件指，例如，鈉濃度為約19到40mM，優(yōu)選19到20mM，和溫度為約50到70℃，優(yōu)選約60到65℃的條件。具體地，最優(yōu)選的條件是鈉濃度為19mM和溫度為65℃。
作為編碼本發(fā)明所用的部分肽的DNA，可以使用任何含有編碼上述本發(fā)明的部分肽的核苷酸序列的DNA?；蛘?，可以使用基因組DNA，基因組DNA文庫，來自上述細(xì)胞/組織的cDNA，來自上述細(xì)胞/組織的cDNA文庫，和合成DNA中的任意一種。文庫中使用的載體可以是噬菌體、質(zhì)粒、粘粒和噬菌粒。此外，DNA可以使用從上述細(xì)胞/組織制備的mRNA級(jí)分通過反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下文中簡稱為RT-PCR)直接擴(kuò)增。具體地，作為編碼本發(fā)明的部分肽的DNA，例如，待用的多種DNA包括(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示核苷酸序列的DNA的部分核苷酸序列的DNA，和(b)含有在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO2，4或6所示核苷酸序列的DNA雜交的部分核苷酸序列，并編碼具有與本發(fā)明的Otx2蛋白基本相同的活性性質(zhì)(如轉(zhuǎn)錄活性、視網(wǎng)膜光感受器誘導(dǎo)分化作用等)的Otx2蛋白的DNA，和含有(a)或(b)的部分核苷酸序列的DNA。
盡管本發(fā)明使用的編碼Otx2蛋白或其部分肽的RNA不是特別限定的，只要其能通過反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽，其還可以通過已知的方法制備。
作為克隆完整編碼本發(fā)明的Otx2蛋白或其部分肽(下文中一些情況下簡稱本發(fā)明蛋白)的方法，DNA能使用含有本發(fā)明蛋白的部分核苷酸序列的合成的DNA引物通過PCR方法擴(kuò)增，或可以使用編碼標(biāo)記的本發(fā)明蛋白的部分或全部區(qū)域的DNA片段或合成的DNA通過雜交從整合到合適載體的DNA中選擇。雜交的方法可以根據(jù)例如，分子克隆第二版J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989描述的方法進(jìn)行。此外，當(dāng)使用可商購的文庫時(shí)，雜交可以根據(jù)隨附的指導(dǎo)手冊(cè)描述的方法進(jìn)行。
DNA核苷酸序列的置換可以使用PCR或已知的試劑盒例如MutanTM-superExpress Km(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，或MutanTM-K(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)通過已知的方法如ODA-LAPCR方法、缺口雙鏈方法和Kunkel方法或其相似的方法進(jìn)行。編碼本發(fā)明蛋白的克隆的DNA可以使用其原來形式，或根據(jù)需要通過限制性內(nèi)切酶消化或添加接頭(linker)使用。DNA在5’端具有翻譯起始密碼子，并在3’端具有TAA，TGA或TAG作為翻譯終止密碼子。這些翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子可以使用合適的合成DNA連接物添加。
編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA或RNA(以下有時(shí)縮寫成本發(fā)明DNA)，可以根據(jù)下列策略修飾，即，為了使本發(fā)明DNA在細(xì)胞中更穩(wěn)定，提高本發(fā)明DNA的細(xì)胞透性，和減少本發(fā)明DNA的毒性，如果有的話。許多象這樣的修改是現(xiàn)有技術(shù)已知的，并且公開于例如J.kawakami等，Pharm Tech Japan，vol.8，pp.247，1992；vol.8.pp.395，1992；S.T.Crooke等編，Antisense Research and Applications，CRCPress，1993。本發(fā)明DNA可以DNA被膠囊包在脂質(zhì)體或微球體內(nèi)的特殊形式使用。此外，堿以外的其他物質(zhì)可以被加到本發(fā)明DNA。其他物質(zhì)的例子包括糖；酸或堿；例如起中和磷酸根電荷作用的聚賴氨酸的聚陽離子化合物；能夠提高與細(xì)胞膜的相互作用，或增加核酸吸收的疏水性物質(zhì)，如脂類(如磷脂、膽固醇等)。更優(yōu)選的待添加的脂類的例子包括膽固醇和其衍生物(例如膽固醇基氯代甲酸酯，膽酸，等)。如上所述其他的物質(zhì)可以附于核酸3’末端或5’末端，并且可以通過堿、糖或分子內(nèi)的核苷鍵連接。本發(fā)明DNA可以在末端以化學(xué)方法修飾。這樣的末端修飾的基團(tuán)的例子包括具體安排在3’-端或5′-端的核酸上的加帽基團(tuán)，其抑制由于核酸酶例如核酸外切酶和RNase引起的降解作用。這樣的加帽基團(tuán)的例子包括現(xiàn)有技術(shù)已知的羥基保護(hù)基，包括乙二醇例如聚乙二醇和四甘醇，盡管不限制于此。
作為用于本發(fā)明的包含編碼Otx2蛋白或它的部分肽的DNA或RNA的重組載體，能夠表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽的表達(dá)載體是優(yōu)選的。
本發(fā)明蛋白的表達(dá)載體可以通過下列方法制備(i)從例如cDNA切除包含編碼本發(fā)明蛋白的DNA片段和(ii)在合適的表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游方向連接該DNA片段。
作為上述表達(dá)載體，使用了大腸桿菌(Escherichia coli)衍生的質(zhì)粒(例如pCR4，pCR2.1，pBR322，pBR325，pUC12，pUC13)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)-衍生的質(zhì)粒(例如pUB110，pTP5，pC194)，酵母衍生的質(zhì)粒(例如pSH19，pSH15)，噬菌體例如λ噬菌體，病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，慢病毒，痘苗病毒和桿狀病毒和，另外，pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，和pcDNAI/Neo。其中，作為用于本發(fā)明的載體，病毒是優(yōu)選的，并且逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和慢病毒是更優(yōu)選的。
作為如上所述的啟動(dòng)子，任何啟動(dòng)子都可使用，只要其是對(duì)應(yīng)于用于基因表達(dá)的宿主的合適啟動(dòng)子。例如，當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞被用作宿主時(shí)，這樣的啟動(dòng)子的例子包括SRα啟動(dòng)子，SV40啟動(dòng)子LTR啟動(dòng)子時(shí)，CMV啟動(dòng)子，和HSV-TK啟動(dòng)子。其中優(yōu)選的是使用LTR啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子，或SRα啟動(dòng)子。當(dāng)宿主是埃希氏桿菌屬的細(xì)菌時(shí)，trp啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子，recA啟動(dòng)子，λPL啟動(dòng)子，和lpp啟動(dòng)子是優(yōu)選的。當(dāng)宿主是桿菌屬細(xì)菌時(shí)，SPO1啟動(dòng)子，SPO2啟動(dòng)子和penP啟動(dòng)子是優(yōu)選的。當(dāng)宿主是酵母時(shí)，PHO5啟動(dòng)子，PGK啟動(dòng)子，GAP啟動(dòng)子，和ADH啟動(dòng)子是優(yōu)選的。當(dāng)宿主是昆蟲細(xì)胞時(shí)，多角體蛋白啟動(dòng)子，和P10啟動(dòng)子是優(yōu)選的。
作為表達(dá)載體，可用的表達(dá)載體任選包含，除了上述元件之外，增強(qiáng)子，剪接信號(hào)，多聚腺苷酸附加信號(hào)，帽結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)合成起始信號(hào)，選擇性標(biāo)識(shí)物，標(biāo)記標(biāo)識(shí)物，和SV40復(fù)制起點(diǎn)。
選擇性標(biāo)識(shí)物的例子包括二氫葉酸還原酶(以下有時(shí)縮寫成dhfr)基因[氨甲蝶呤(MTX)抗性]，氨芐青霉素抗性的基因(以下有時(shí)縮寫成Ampr)，和新霉素抗性的基因(以下有時(shí)縮寫成Neor，G418抗性)。特別地當(dāng)使用dhfr基因缺陷的中國倉鼠細(xì)胞CHO時(shí)，dhfr基因被用作選擇性標(biāo)識(shí)物，目的基因可以在不包含胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上來選擇。
作為標(biāo)記標(biāo)識(shí)物，堿性磷酸酶(以下有時(shí)縮寫成AP)基因，和綠色熒光蛋白蛋白(GFP)基因可以是優(yōu)選使用的。
此外，適合于宿主的信號(hào)序列可以任選被添加到表達(dá)載體上。當(dāng)宿主是埃希氏桿菌屬屬的細(xì)菌時(shí)，可以使用PhoA信號(hào)序列，和OmpA信號(hào)序列。當(dāng)宿主是桿菌屬的細(xì)菌時(shí)，可以使用α-淀粉酶信號(hào)序列，和枯草蛋白酶信號(hào)序列。當(dāng)宿主是酵母時(shí)，可以使用MFα信號(hào)序列，和SUC2信號(hào)序列。當(dāng)宿主是動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，可以使用胰島素信號(hào)序列，α-干擾素信號(hào)序列和抗體分子信號(hào)序列。
當(dāng)病毒被用作載體時(shí)，為了提高翻譯機(jī)制，優(yōu)選安排IRES(內(nèi)部核糖體結(jié)合部位)序列作為蛋白合成起始信號(hào)。
通過向宿主引入如此構(gòu)建的包含編碼本發(fā)明蛋白的DNA的表達(dá)載體，可以制備轉(zhuǎn)化子。
作為宿主，例如使用埃希氏桿菌屬細(xì)菌，桿菌，酵母，昆蟲細(xì)胞，昆蟲，和動(dòng)物細(xì)胞。作為埃希氏桿菌屬細(xì)菌的具體實(shí)施方式
，使用大腸桿菌K12/DH1(Proc.Natl.Aced.Sci.USA，vol.60，160(1968))，JM103(Nucleic acids Research，vol.9，309(1981))，JA221(Journal of MolecularBiology vol.120，517(1978))，HB101(Journal of Molecular Biology，vol.41，459(1969))，C600(Genetics，vol.39，440(1954))，DH5α((InoueH.，Nojima，H.和Okayama H.，Gene，96，23-28(1990))，和DH10B(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.87，4645-4649(1990)。作為桿菌，例如使用枯草芽孢桿菌MI114(Gene，vol.24，255(1983))，和207-21(Journal of Biochemistry，vol.95，87(1984))。作為酵母，例如使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913，NCYC2036和巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)。
作為昆蟲細(xì)胞，例如當(dāng)病毒是AcNPV時(shí)，使用來自甘藍(lán)夜蛾(cabbage armyworm)幼蟲的現(xiàn)成細(xì)胞(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞；Sf細(xì)胞)，來自粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)中腸的MG1細(xì)胞，來自粉紋夜蛾卵的High FiveTM細(xì)胞，來自甘藍(lán)夜蛾(mamestrabrassicae)的細(xì)胞和來自estigmena acrea的細(xì)胞。當(dāng)病毒是BmNPV時(shí)，使用來自蠶的現(xiàn)成細(xì)胞(家蠶Bombyx mori N；BmN細(xì)胞)。作為所述的Sf細(xì)胞，例如，使用Sf9細(xì)胞(ATCC CRL1711)，和Sf21細(xì)胞(Vaughn，J.L.等In Vivo，13，213-217，(1977))。作為昆蟲，例如，使用蠶幼蟲(Maeda等，Nature，vol.315，592(1985))。作為動(dòng)物細(xì)胞，例如使用猴細(xì)胞(COS-7，Vero，中國倉鼠細(xì)胞CHO(以下縮寫成CHO細(xì)胞)，dhfr基因-缺陷的中國倉鼠細(xì)胞CHO(以下縮寫CHO(dhfr)細(xì)胞，小鼠L細(xì)胞，小鼠AtT-20小鼠骨髓瘤細(xì)胞，大鼠GH3，和人FL細(xì)胞。
為了轉(zhuǎn)化埃希氏桿菌屬細(xì)菌，轉(zhuǎn)化可以根據(jù)例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.69，2110(1972)或Gere，vol.17，107(1982)描述的方法進(jìn)行。為了轉(zhuǎn)化桿菌，轉(zhuǎn)化可以根據(jù)例如在Molecular & GeneralGenetics，vol.168，111(1979)描述的方法進(jìn)行。為了轉(zhuǎn)化酵母，轉(zhuǎn)化可以根據(jù)例如在Methods in Enzymology vol.194182-187(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.75，1929(1978)描述的方法進(jìn)行。為了轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞或昆蟲，轉(zhuǎn)化可以根據(jù)例如在Bio/Technology，vol.6，47-55(1988)描述的方法進(jìn)行。為了轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞，轉(zhuǎn)化可以根據(jù)例如在Cell Technology separate volume 8 New Cell Technology ExperimentalProtocol，263-267(1995)(published by Shujunsha)，Virology，vol.52，456(1973)描述的方法進(jìn)行。象這樣，獲得轉(zhuǎn)化有包含編碼本發(fā)明蛋白的DNA的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子。當(dāng)宿主為埃希氏桿菌或桿菌的轉(zhuǎn)化子被培養(yǎng)，適合的培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，其中包含碳源、氮源、無機(jī)物及其他轉(zhuǎn)化子生長要求的添加劑。碳源的例子包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉和蔗糖，氮源的例子包括無機(jī)物或有機(jī)物例如銨鹽、硝酸鹽，玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆餅粉和馬鈴薯浸出物，和無機(jī)物的例子包括氯化鈣、磷酸二氫鈉、和氯化鎂。此外，可以添加酵母浸出物、維生素，和生長促進(jìn)因子。理想地，培養(yǎng)基pH是大約5到8。
作為培養(yǎng)埃希氏桿菌的培養(yǎng)基，例如，包含葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培養(yǎng)基(Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972)是優(yōu)選的。此處，為了使啟動(dòng)子有效地作用，例如，如果需要，可以添加藥例如3-β吲哚基丙烯酸。當(dāng)宿主是埃希氏桿菌時(shí)，培養(yǎng)通常是在大約15℃到43℃進(jìn)行大約3到24小時(shí)，并且必要時(shí)，可以進(jìn)行通氣或攪拌。當(dāng)宿主是桿菌時(shí)，培養(yǎng)通常在約30-40℃進(jìn)行6-24小時(shí)，并且如果需要，可進(jìn)行通氣或攪拌。當(dāng)培養(yǎng)宿主是酵母的轉(zhuǎn)化子時(shí)，培養(yǎng)基的例子包括Burkholder基本培養(yǎng)基(Bostian，K.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.77，4505(1980))，和包含0.5％酪蛋白氨基酸的SD培養(yǎng)基(Bitter，G.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.81，5330(1984))。優(yōu)選調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH到大約5到8。培養(yǎng)通常在20℃到35℃進(jìn)行大約24到72小時(shí)，并且必要時(shí)可以任選進(jìn)行通氣或攪拌。
當(dāng)培養(yǎng)宿主是昆蟲細(xì)胞或昆蟲的轉(zhuǎn)化子時(shí)，使用其中添加劑例如固定的10％牛血清被適當(dāng)?shù)丶拥紾race氏昆蟲培養(yǎng)基(Grace T.C.C.，Nature，vol.195，788(1962))的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基。優(yōu)選調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH到大約6.2到6.4。培養(yǎng)通常通常在大約27℃進(jìn)行大約3-5天，并且必要時(shí)可以任選進(jìn)行通氣或攪拌。當(dāng)培養(yǎng)宿主是動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化子時(shí)，使用例如包含大約5到20％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(Science，vol.122，501(1952))，DMEM培養(yǎng)基(Virology，vol.8，396(1959))，RPMI 1640培養(yǎng)基(The Journal of the American Medical Association，vol.199，519(1967))，和199培養(yǎng)基(Proceeding of the Society for theBiological Medicine，vol.73，1(1950))。優(yōu)選的pH是大約6到8。培養(yǎng)通常在30℃到40℃進(jìn)行大約15到60小時(shí)，并且必要時(shí)可以進(jìn)行通氣或攪拌。如上所述，本發(fā)明的蛋白可以在轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞，細(xì)胞膜或細(xì)胞外生產(chǎn)。
為了從培養(yǎng)液分離和純化本發(fā)明的蛋白，例如，分離和純化可以通過下列方法完成。當(dāng)本發(fā)明的蛋白從培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞提取時(shí)，通過已知的方法在培養(yǎng)之后適當(dāng)?shù)厥褂檬占?xì)菌細(xì)胞的方法，將這些細(xì)胞懸浮在合適的緩沖液中，通過超聲、溶菌酶和/或凍/融破裂這些懸浮的細(xì)胞，并通過離心作用或過濾獲得蛋白的粗提物，等等。緩沖液中可以包含蛋白變性劑如尿素和鹽酸胍，或表面活性劑如TritonX-100TM。當(dāng)?shù)鞍追置谠谂囵B(yǎng)液中，在培養(yǎng)完成以后，細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞與培養(yǎng)上清液通過已知的方法分離，并且收集培養(yǎng)上清液。包含在所得提出物或培養(yǎng)上清液中的蛋白的純化可以通過與已知分離/純化方法的合適組合來完成。作為已知的分離或純化方法，使用利用溶解度的方法例如鹽析和溶劑沉淀法；主要地利用分子量差異的透析方法，超濾方法，凝膠過濾方法，和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法；利用電荷差異的方法例如離子交換色譜法；利用特異性親合力的方法例如親和色譜法；利用疏水性差異的方法例如反相高效液相色譜法；利用等電點(diǎn)差異的方法例如等電點(diǎn)電泳法。
當(dāng)如此獲得的蛋白以游離態(tài)生產(chǎn)時(shí)，其可以通過已知的方法或類似的方法轉(zhuǎn)化成鹽，并且反之，當(dāng)獲得的蛋白為鹽，其可以通過已知的方法或類似的方法轉(zhuǎn)化成游離態(tài)或其他的鹽。通過在純化前和純化后對(duì)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蛋白用合適的蛋白修飾酶作用，可以進(jìn)行任意的修飾或可以部分地除去多肽。作為蛋白修飾酶，使用胰蛋白酶，糜蛋白酶，精氨酰肽鏈內(nèi)切酶、蛋白激酶和糖苷酶。
通過表達(dá)Otx2蛋白，或通過增加Otx2蛋白的表達(dá)量，可以誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。具體地，例如，在來自眼球組織細(xì)胞，胚胎的干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞中，上述的細(xì)胞可以通過表達(dá)Otx2蛋白或通過增加Otx2蛋白的表達(dá)量而誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。為此，(a)Otx2蛋白或其部分肽、或其鹽，或(b)編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA可以被用作誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑。
“誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞”可以在體內(nèi)或離體發(fā)生。也就是說，本發(fā)明誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑可以對(duì)活體給藥以體內(nèi)誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞?；蛘撸景l(fā)明的誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑可離體適用于，例如，在來自眼球組織細(xì)胞，胚胎的干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞，以及上述細(xì)胞可被誘導(dǎo)組成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。更具體地說，本發(fā)明的DNA被引入來自眼球組織的細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)的前體細(xì)胞，并且培養(yǎng)得到的細(xì)胞從而誘導(dǎo)細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。在引入本發(fā)明DNA時(shí)，可以共同地引入其他的基因。其他基因的例子包括視網(wǎng)膜特異性同源盒基因。視網(wǎng)膜特異性同源盒基因的例子包括在眼區(qū)具有特異的表達(dá)模式，并調(diào)節(jié)該區(qū)域特異的模式形成的基因，和涉及在發(fā)育過程中差異表達(dá)的基因。具體的例子包括Crx，Chx10，Pax6，和Rax。
優(yōu)選的“眼球組織”的例子包括視杯內(nèi)層組織。這樣的組織可以來源于成年人，或可以來源于胚胎期個(gè)體?！皝碜匝矍蚪M織的細(xì)胞”的例子包括胎兒神經(jīng)視網(wǎng)膜，睫狀體細(xì)胞例如睫狀體色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，睫狀體上皮細(xì)胞，和虹膜細(xì)胞。
來自眼球組織的細(xì)胞可以例如通過處理用分散酶或EDTA以合適的方法分離的組織，隨后用胰蛋白酶處理組織分成單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)一步在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞至匯合，并且將獲得的細(xì)胞用胰蛋白酶和膠原酶處理。此處，當(dāng)為收集細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以使用例如，包含堿性成纖維細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基，包含上皮細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基，和包含ILF(白細(xì)胞遷移抑制因子)的培養(yǎng)基。含堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的培養(yǎng)基的例子包括含bFGF的無血清培養(yǎng)基，更具體地說，是含N2補(bǔ)充成分的DMEM/F12。這樣的培養(yǎng)基中bFGF的含量不小于大約10ng/ml，優(yōu)選不少于大約20ng/ml，更優(yōu)選不少于大約40ng/ml。N2補(bǔ)充成分的例子包括大約5μg/ml胰島素，大約100μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，大約20nM黃體酮，大約100μM合適的培養(yǎng)基中趨于匯合的培養(yǎng)細(xì)胞，和大約30nM硒酸鈉。培養(yǎng)條件例如溫度、氧濃度和二氧化碳濃度可以恰當(dāng)?shù)卦O(shè)置，取決于細(xì)胞。
神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞可以源于來自眼球組織的細(xì)胞，或胚胎的干細(xì)胞，或可以源于其他的細(xì)胞或組織。具體的例子包括來自胎兒視網(wǎng)膜的神經(jīng)干細(xì)胞，來自成人睫狀體的視網(wǎng)膜的干細(xì)胞，來自虹膜的視網(wǎng)膜的干細(xì)胞，來自腦的神經(jīng)干細(xì)胞，視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，和來自虹膜的神經(jīng)前體細(xì)胞。
從來自眼球組織的細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞或其他細(xì)胞或組織中誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞的方法可以根據(jù)已知的方法進(jìn)行。例如，從胚胎干細(xì)胞中誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞方法的例子包括在例如，Kawasaki，Sasai等的參考文獻(xiàn)(Kawasaki，H.，Sasai Y.，Neuron.，2000Oct；28(1)31-40)描述的方法。關(guān)于培養(yǎng)和維持胚胎的干細(xì)胞的條件，例如，可以參考“Molecular Biology Protocol”(由Nankodo出版)。有時(shí)候，神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞是作為包含這些細(xì)胞的神經(jīng)球(neural sphere)而獲得的，但是在本發(fā)明中，這樣的神經(jīng)球可以進(jìn)行下列操作。
向來自眼球組織的細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞，優(yōu)選神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞中引入本發(fā)明的DNA和任選的其他基因的方法不是特別限定的，而是可以使用過已知的方法，這樣的方法的例子包括借助于腺病毒載體引入基因的方法，借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入基因的方法，借助于腺伴隨病毒、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔引入基因的方法。從引入效率的角度，優(yōu)選借助于腺病毒載體引入基因的方法和借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入基因的方法。
其中引入有基因的細(xì)胞在適合于分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的分化誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)。由于分化誘導(dǎo)的不同條件取決于其中引入有基因的細(xì)胞種類，該條件起初不能設(shè)定并且是可以恰當(dāng)選擇的。例如，分化誘導(dǎo)條件的例子包括在視黃酸和血清存在下培養(yǎng)。此處，可用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的例子包括上述的含N2補(bǔ)充成分的DMEM/F12培養(yǎng)基。合乎需要是使用的視黃酸量不小于大約0.1μM，優(yōu)選不少于大約0.5μM，和不超過大約10μM，優(yōu)選不超過大約5μM。此外，合乎需要的是誘導(dǎo)分化時(shí)使用的血清量為大約1％。另外，培養(yǎng)條件例如溫度，氧濃度，和二氧化碳濃度可以取決于引入有基因的細(xì)胞而恰當(dāng)?shù)卦O(shè)置。
按照本發(fā)明上述的分化誘導(dǎo)方法獲得的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞可以用于患視網(wǎng)膜退化病例如色素性視網(wǎng)膜炎，老年性黃斑變性，視網(wǎng)膜剝離，青光眼和視網(wǎng)膜血管阻塞病人的細(xì)胞移植。該移植細(xì)胞不但可以是已經(jīng)完全地分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的細(xì)胞，而且可以是分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞前的前體細(xì)胞。
為此，Otx2蛋白其部分肽或其鹽，或編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA可以被用作藥物，例如預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜病發(fā)展的藥劑?！耙暰W(wǎng)膜病”的例子包括來源于系統(tǒng)性疾病如糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化、貧血、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，和結(jié)締組織疾病如硬皮病的視網(wǎng)膜血管失調(diào)和視網(wǎng)膜的炎性和變性損傷；和先天代謝病例如Tay-Sack病和Vogt-Spielmeyer病，及包括視網(wǎng)膜血管失調(diào)的局部視網(wǎng)膜疾病例如視網(wǎng)膜病早熟、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞和視網(wǎng)膜靜脈周炎；來源于視網(wǎng)膜剝離和外傷的視網(wǎng)膜的發(fā)炎和變性；衰老-有關(guān)視網(wǎng)膜變性疾病例如老年的黃斑盤狀變性；和先天的視網(wǎng)膜變性疾病。特別地，本發(fā)明的預(yù)防，治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑可以特別有效地用于先天的視網(wǎng)膜變性病、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜剝離、青光眼或視網(wǎng)膜的血管阻塞。
當(dāng)本發(fā)明蛋白被用作預(yù)防/治療/抑制上述視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑時(shí)，該蛋白可以用常規(guī)的方法配制成制劑。另一方面，當(dāng)本發(fā)明的DNA被用作預(yù)防/治療/抑制視網(wǎng)膜疾病的藥劑時(shí)，本發(fā)明這樣的DNA單獨(dú)，或在DNA被插入到合適的載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體和腺病毒相關(guān)的病毒載體中以后，可以根據(jù)常規(guī)的方法配制成制劑。本發(fā)明DNA利用基因槍或例如水凝膠導(dǎo)管的導(dǎo)管可以按照原樣施用或與促進(jìn)吸收的輔助物一起施用。
例如，本發(fā)明蛋白或本發(fā)明DNA可以作為優(yōu)選有糖衣的藥片、膠囊、酏劑或微膠囊口服，或可以以例如與水或其他藥用液體的無菌溶液或懸浮液的注射劑形式腸胃外施用。本發(fā)明的制劑可以通過，例如將本發(fā)明蛋白或本發(fā)明DNA與生理可接受的已知載體、調(diào)味劑、賦形劑、媒介物、防腐劑、穩(wěn)定劑或粘合劑混合而制備。
可以混合于藥片或膠囊中的添加劑的例子包括粘合劑例如明膠、玉米淀粉、黃芪膠、和阿拉伯樹膠；賦形劑例如晶狀纖維素；膨脹劑例如玉米淀粉、明膠、和藻酸；潤滑劑例如硬脂酸鎂；甜味劑例如蔗糖、乳糖和糖精；調(diào)味劑例如胡椒薄荷、akamono(Gaultheria adenothrix)油、和櫻桃酒。就膠囊而言，可以另外地包含液體載體如油和脂。注射用的無菌組合物可以根據(jù)常規(guī)的劑型例如活性成分在水溶液或油性溶液中形成的溶出或懸浮體系的方法進(jìn)行配制。作為用于注射的水溶液，使用例如，包含生理鹽水、葡萄糖及其他助劑(例如D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化鈉等等)的等滲溶液，并可以共同使用合適的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、和非離子表面活性劑(例如polysorbate 80(商標(biāo))、HCO-50)。作為油性溶液使用，例如，芝麻油和豆油，也可以同時(shí)使用苯甲酸芐酯和芐醇增溶劑。另外，該無菌組合物可以包含，例如緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液)，撫慰劑(例如氯化苯甲烴銨、鹽酸普魯卡因)，穩(wěn)定劑(例如人血清白蛋白、聚乙二醇)，防腐劑(例如苯甲醇、苯酚)，和抗氧化劑。制備的該無菌組合物通常填充到合適的安瓿中，并且作為注射劑提供。
由于如此獲得的制劑是安全的和低毒的，其可以施用到，例如，哺乳動(dòng)物(例如人、大鼠、小鼠、兔、羊、豬、牛、貓、狗、猴等)。由于本發(fā)明蛋白或本發(fā)明DNA的劑量的變化取決于施用的對(duì)象、器官對(duì)象、癥狀和施用途徑，其通常不能確定，但就腸胃外給藥來說，劑量為大約每天0.01到10mg/kg，優(yōu)選大約0.05到5mg/kg。
優(yōu)選的是，本發(fā)明用于預(yù)防/治療/抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑局部地施用到眼。這樣用于局部用藥到眼的制劑劑型的例子包括滴眼劑、眼用軟膏、粉末、顆粒、藥片、膠囊和注射劑。特別地，適合的是該劑型是以滴眼劑(例如水狀滴眼劑、滴眼劑的水懸浮液、非水的滴眼劑、或非水的滴眼劑懸浮液)、眼用軟膏和注射劑的形式。這樣的制劑可以是根據(jù)常規(guī)方法制備的。
用于制備滴眼劑的水溶液或懸浮液稀釋劑的例子包括蒸餾水和生理鹽水。此外，用于非水溶液或懸浮液的稀釋劑的例子是植物油、液體石蠟、礦物油、丙二醇和p-辛基十二醇。此外，各種添加劑例如通常能夠混合在滴眼劑中的緩沖液、等滲劑、防腐劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑和螯合劑可以恰當(dāng)?shù)鼗旌显诒景l(fā)明的滴眼劑中。這樣的滴眼劑制備通過無菌操作或通過滅菌處理在合適的階段進(jìn)行。
添加上述緩沖液是為了維持pH恒定，例如在大約5.0到8.0。例如，使用硼酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液。添加這些緩沖液是為了增加緩沖，也就是說，它們?cè)诰S持pH恒定的范圍內(nèi)添加，例如在上述的范圍之內(nèi)。添加等滲劑是為了與淚液等滲，這樣的等滲劑的例子包括糖類例如葡萄糖、甘露醇和山梨糖醇；多元醇例如甘油、聚乙二醇和丙二醇；以及鹽例如氯化鈉和檸檬酸鈉。這些等滲劑以滴眼劑的滲透壓力相當(dāng)于淚液的量加入。此外，作為防腐劑，使用例如氯化苯甲烴銨、對(duì)羥苯甲酸和氯代丁醇。上述增稠劑的例子包括甘油、羧甲基纖維素和聚羧乙烯。上述穩(wěn)定劑的例子包括亞硫酸鈉，和丙二醇，上述抗氧化劑的例子包括抗壞血酸、抗壞血酸鈉、生育酚和硫代硫酸鈉，上述pH調(diào)節(jié)劑的例子包括鹽酸、檸檬酸、磷酸、乙酸、酒石酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉和碳酸氫鈉，上述螯合劑的例子包括乙二胺四乙酸鈉和檸檬酸鈉。此外，滴眼劑可以凍干成為在使用前溶解于蒸餾水用于注射的形式。
眼用軟膏可以在無菌條件下通過將活性成分混合到正常使用眼用軟膏的基質(zhì)中而制備，隨后根據(jù)常規(guī)方法而制備。用于眼用軟膏的基質(zhì)的例子包括凡士林、zelen 50、plastibase和聚乙二醇，此外，為了增強(qiáng)親水性，可以添加表面活性劑。而且，就眼用軟膏而言，必要時(shí)，也可以混合上述的添加劑，例如防腐劑。
此外，局部的眼科用藥的制劑使用在眼內(nèi)控制Otx2蛋白或其部分肽或編碼它們兩者之一的DNA釋放的緩釋物質(zhì)可以配制成為緩釋制劑、DDS(藥物遞送)制劑或眼內(nèi)植入制劑?？刂漆尫诺奈镔|(zhì)的例子包括通過非催化劑脫水縮聚作用從一種或多種α-羥基羧酸(例如glycholic acid、乳酸、羥丁酸等)、羥基二羧酸(例如蘋果酸等)、和羥基三羧酸(例如檸檬酸等)合成的本身已知的聚合體，共聚物或其混合物，和可生物降解的聚合物例如聚α氰基丙烯酸酯、聚氨基酸(例如聚-γ-苯甲基-L-谷氨酸等)，和基于馬來酐共聚物(例如苯乙烯-馬來酸共聚物等)。
一般而言，不可能建議本發(fā)明用于局部眼科給藥的制劑的劑量和給藥頻率，因?yàn)槠渥兓Q于給藥對(duì)象、癥狀、劑型和治療的時(shí)期。通常，就滴眼劑來說，包含0.001到10.0w/v％，優(yōu)選0.01到1.0w/v％的本發(fā)明蛋白或本發(fā)明DNA的制劑可以每天若干次施用到成人，優(yōu)選每眼每天1到6次，每次數(shù)滴，優(yōu)選每次使用1到4滴。就眼用軟膏來說，含0.001到10.0w/w％，優(yōu)選0.01到1.0w/w％的本發(fā)明蛋白或本發(fā)明DNA的制劑可以數(shù)次施用到成人，優(yōu)選每天1到6次。
在本發(fā)明中，視網(wǎng)膜疾病的診斷可以通過在檢測溶液中檢測Otx2蛋白或其部分肽、或其鹽(以下有時(shí)縮寫成本發(fā)明蛋白)，或測量其量來完成。例如，當(dāng)檢測到本發(fā)明蛋白濃度減少時(shí)，可以診斷出，例如此人存在正患視網(wǎng)膜疾病，或?qū)砜赡芑家暰W(wǎng)膜疾病的高可能性。由于Otx2蛋白或其部分的肽或其鹽的抗體(以下有時(shí)候縮寫成本發(fā)明抗體)可以特異性識(shí)別本發(fā)明蛋白，其可被用于測試溶液中本發(fā)明蛋白的的檢測和定量。也就是說，本發(fā)明抗體能被用作視網(wǎng)膜疾病的診斷試劑。在診斷試劑中，可以使用抗體分子本身，或還可以使用抗體分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。或者，測試溶液中的本發(fā)明蛋白可以通過組織染色而檢測。
本發(fā)明抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，只要它是能夠識(shí)別本發(fā)明蛋白的抗體。本發(fā)明抗體可以使用本發(fā)明蛋白作為抗原根據(jù)已知的制備抗體或抗血清的方法制備。
用于制備本發(fā)明蛋白的單克隆抗體的方法如下所述。
(i)首先描述生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞的制備。本發(fā)明蛋白本身或與載體或稀釋劑一起在可以產(chǎn)生抗體的位置施用到哺乳動(dòng)物。為了增強(qiáng)施用后的抗體生產(chǎn)能力，可以施用完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。給藥通常以每2到6周一次進(jìn)行，總共2到10次。使用的哺乳動(dòng)物的例子包括猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊和山羊，小鼠或大鼠是優(yōu)選的。在制備生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞后，生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤的制備方法是從溫血?jiǎng)游铮缑庖哌^抗原的小鼠選擇識(shí)別抗體滴度的個(gè)體，在最后一次免疫后2-5天收集脾或淋巴結(jié)，并且將其中含有的生產(chǎn)抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合?？贵w血清中抗體滴度的測定可以，例如通過將后面描述的標(biāo)記的蛋白與抗血清反應(yīng)，并且測量結(jié)合到抗體的標(biāo)記試劑的活性而完成。融合操作可以根據(jù)已知的方法進(jìn)行，例如，Kohler和Milstein方法(Nature，vol.256，p.495(1975))。融合促進(jìn)劑的例子包括聚乙二醇(PEG)和仙臺(tái)病毒。優(yōu)選使用PEG。骨髓瘤細(xì)胞的例子包括NS-1、P3U1和SP2/0，其中P3U1是優(yōu)選的?？贵w生產(chǎn)細(xì)胞(脾細(xì)胞)與使用的骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)目比大約1∶1到20∶1，PEG(優(yōu)選，PEG1000到PEG6000)以大約10到80％的濃度添加，并在大約20到40℃，優(yōu)選大約30到37℃保溫大約1到10分鐘，從而有效地制備融合細(xì)胞。
為篩選生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤，可以使用各種方法，包括(a)方法將雜交瘤培養(yǎng)上清液加到其上直接吸附抗原，如本發(fā)明蛋白或與載體一起吸附的固相(例如微量培養(yǎng)板)上，隨后加抗免疫球蛋白抗體(當(dāng)用于細(xì)胞融合的細(xì)胞是小鼠時(shí)，使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)或標(biāo)記有放射性物質(zhì)或酶的蛋白A，并檢測結(jié)合到該固相的單克隆抗體，和(b)方法將雜交瘤培養(yǎng)上清液加到其上吸附了抗免疫球蛋白抗體或蛋白A的固相上，加入標(biāo)記有放射性物質(zhì)或酶的本發(fā)明蛋白，并檢測結(jié)合到該固相的單克隆抗體。單克隆抗體的選擇可以根據(jù)已知的方法或類似的方法完成，這樣的選擇通常在添加了HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基上完成。作為選擇和培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用任何培養(yǎng)基，只要可以生長雜交瘤。例如，可以使用含大約1到20％，優(yōu)選大約10到20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，含大約1到10％胎牛血清(由Wako Pure Chemical Industries Co.，Ltd生產(chǎn))的GIT培養(yǎng)基和雜交瘤培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基(SFM-101，由NissuiPharmaceutical Co.Ltd生產(chǎn))。該培養(yǎng)溫度通常大約20到40℃，優(yōu)選大約37℃。培養(yǎng)時(shí)間為大約5天到3周，優(yōu)選大約1周到2周。培養(yǎng)通常在5％二氧化碳條件下進(jìn)行。雜交瘤培養(yǎng)上清液的抗體滴度可以如上述抗血清的抗體滴度測定方法進(jìn)行測定。
(ii)然后分離和純化單克隆抗體。單克隆抗體的分離和純化可以根據(jù)分離和純化免疫球蛋白的方法[例如鹽析法、醇沉淀法、等電沉淀方法、電泳法、離子交換劑吸附和解吸附方法(例如DEAE)、超離心方法、凝膠過濾方法、和利用結(jié)合到固相的抗原或例如蛋白A或蛋白G的活性吸附劑只收集抗體，然后釋放結(jié)合以獲得抗體的特異性純化方法]像傳統(tǒng)的分離和純化多克隆抗體一樣完成。
下面描述制備本發(fā)明蛋白的多克隆抗體(以下有時(shí)候縮寫成“本發(fā)明多克隆抗體”)。
本發(fā)明多克隆抗體可以根據(jù)已知的方法或其類似的方法制備。例如，抗體的制備方法是制備免疫抗原(本發(fā)明蛋白等)和載體蛋白的復(fù)合物，以上述的方法免疫的制備方法哺乳動(dòng)物制備單克隆抗體，從免疫的動(dòng)物收集含抗本發(fā)明蛋白成分的抗體，并分離和純化抗體。關(guān)于用來免疫哺乳動(dòng)物的免疫抗原與載體蛋白的復(fù)合物，載體蛋白的種類，和載體與半抗原的混合比例不是特別限定的，只要針對(duì)通過交聯(lián)有載體而免疫的半抗原可以有效地生產(chǎn)抗體。例如，使用以相對(duì)于半抗原大約0.1到20，優(yōu)選大約1到5偶聯(lián)牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白的重量比的方法。此外，為使半抗原與載體偶聯(lián)，可以使用各種的縮合劑，包括戊二醛、碳化二亞胺、順丁烯二酰亞胺活性酯、和含硫醇基或二硫代吡啶基的活性酯試劑。來自半抗原和載體本身或與載體和稀釋劑一起的縮合產(chǎn)物在能產(chǎn)生抗體的位置被施用到溫血?jiǎng)游?。為了增?qiáng)給藥后的抗體生產(chǎn)能力，可以施用完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。給藥通常以大約每2到6周一次進(jìn)行，總共大約3到10次。多克隆抗體可以從血液或腹水收集，優(yōu)選從通過上述的方法免疫的哺乳動(dòng)物血液收集?？寡逯卸嗫寺】贵w滴度可以如上述抗血清的抗體滴度測定方法測定。多克隆抗體的分離和純化可以根據(jù)上述分離和純化單克隆抗體相類似的分離和純化免疫球蛋白的方法完成。
使用本發(fā)明的抗體定量測定本發(fā)明蛋白的方法不是特別限定的，但這樣的方法的例子包括在檢測溶液中通過化學(xué)的或物理的方法檢測抗體的量、相當(dāng)于抗原量(本發(fā)明蛋白量，等)的抗原或抗體-抗原復(fù)合物的量，利用含已知量的抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，并基于該標(biāo)準(zhǔn)曲線從檢測值計(jì)算檢測溶液中的抗原量。例如，nephrometry、競爭法、免疫測定法和夾心法是優(yōu)選使用的，但從靈敏度和專一性的角度來看，特別優(yōu)選使用后面描述的夾心法。用于使用標(biāo)記物質(zhì)的定量方法的標(biāo)記試劑包括，例如放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)和發(fā)光物質(zhì)。例如(125I)、(131I)、(3H)和(14C)用作放射性同位素。作為酶，使用穩(wěn)定的和具有大的比活性的酶是優(yōu)選的，例如使用β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶。作為熒光物質(zhì)，使用例如熒光胺和異硫氰酸熒光素。作為發(fā)光物質(zhì)，使用魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素和光澤精。此外，生物素-親和素體系可以被用來結(jié)合帶有標(biāo)記試劑的抗體或抗原。
當(dāng)上述的定量方法中抗原或抗體不溶解時(shí)，可以使用物理吸附方法，或可以使用通常被用來使蛋白或酶不溶/固化蛋白或酶的化學(xué)結(jié)合方法。作為載體，使用例如不溶解的多糖例如瓊脂糖、右旋糖酐和纖維素；合成樹脂例如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅樹脂；以及玻璃。在夾心法中，測試溶液中本發(fā)明蛋白量的定量測定方法是將不溶解的本發(fā)明單克隆抗體與測試溶液反應(yīng)(初級(jí)反應(yīng))，此外反應(yīng)標(biāo)記的本發(fā)明單克隆抗體(次級(jí)反應(yīng))，并測量不溶解的載體上標(biāo)記的試劑活性。初級(jí)反應(yīng)和次級(jí)反應(yīng)可以以相反順序進(jìn)行，或可以同時(shí)進(jìn)行。標(biāo)記試劑和使之不溶解的方法同如上所述。此外，在通過夾心法免疫定量方法中，用于固相抗體或標(biāo)記抗體的抗體不必是一種，當(dāng)改善測量靈敏度的目的可使用兩種或多種抗體的混合物。在通過夾心法定量本發(fā)明蛋白方法中，作為用于初級(jí)反應(yīng)和次級(jí)反應(yīng)的本發(fā)明單克隆抗體，優(yōu)選使用具有與本發(fā)明蛋白不同的結(jié)合位點(diǎn)的抗體。也就是說，用于初級(jí)反應(yīng)和次級(jí)反應(yīng)的抗體是這樣的抗體，例如，當(dāng)用于次級(jí)反應(yīng)的抗體識(shí)別本發(fā)明蛋白的一部分的C末端時(shí)，優(yōu)選在初級(jí)反應(yīng)中使用識(shí)別除了該C末端之外的部分，例如N-末端部分的抗體。
本發(fā)明單克隆抗體還可以用于除了夾心法之外的定量方法，例如競爭法、免疫測定法和nephrometry。在競爭法中，測試溶液中的抗原和標(biāo)記抗原競爭性與抗體反應(yīng)，分離未反應(yīng)的標(biāo)記抗原(F)和結(jié)合有抗體的標(biāo)記抗原(B)(B/F分離)，測量B或者F的標(biāo)記量，從而定量測試溶液中抗原的量。具體地，本發(fā)明方法的例子包括(a)可溶性抗體用作抗體，和使用聚乙二醇和該抗體的第二抗體完成B/F分離的液相方法，和(b)使用固相抗體作為第一抗體，或使用可溶性抗體作為第一抗體，和固相抗體作為抗體的固相方法。在免疫測定方法中，在測試溶液中的抗原和固相抗原競爭性對(duì)恒定量的標(biāo)記抗體反應(yīng)以后，分離固相和液相，或反應(yīng)測試溶液中的抗原和過量的標(biāo)記抗體，然后加入固相抗原以使未反應(yīng)的標(biāo)記抗體結(jié)合到固相，以及分離該固相和液相。然后，為了定量測量測試溶液中的抗原量，對(duì)任何階段的標(biāo)記抗體的量進(jìn)行測量。此外，在nephrometry中，測量凝膠或溶液中作為抗原抗體反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生的不溶性沉淀物的量。如果測試溶液中抗原的量小，并且僅獲得少量的沉淀物，優(yōu)選使用激光散射的激光nephrometry。
當(dāng)個(gè)體免疫定量方法適用于本發(fā)明時(shí)，可以根據(jù)各方法的常規(guī)條件將本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員認(rèn)為的一般技術(shù)加到操作方法中。這些通用技術(shù)方法的細(xì)節(jié)、綜述和書可以參考(例如“Radioimmunoassay”由HiroshiIrie編(Kodansha，1974出版)；分冊(cè)“Radioimmunoassay”由Hiroshi Irie編(Kodansha，1979出版)；“Enzyme Immunoassay”由Eiji Ishikawa等編(Igakushoin，1978出版)；“Enzyme Immunoassay”由Eiji Ishikawa編輯(第二版)(Igakushoin，1982出版)；“Enzyme immunoassay”由EijiIshikawa等編(第三版)(Igakushoin，1987出版)；“Methods inENZYMOLOGY”，Vol.70(Immunochemical Techniques(A部分))；同上Vol.73(Immunochemical Techniques(B部分)；同上Vol.74(Immunochemical Techniques(C部分))；同上Vol.84(ImmunochemicalTechniques(D部分Selected Immunoassays)；同上Vol.92(Immunochemical Techniques(E部分Monoclonal antibodies and GeneralImmunoassay Methods))；同上Vol.121(Immunochemical Techniques(I部分Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(全部由Academic Press出版)。
本發(fā)明抗體還可以用于制備用來純化本發(fā)明蛋白的抗體柱，在純化的各級(jí)分檢測本發(fā)明蛋白，或分析本發(fā)明蛋白在測試細(xì)胞中的行為。
由于本發(fā)明DNA，或含與本發(fā)明DNA的核苷酸序列互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的反義多核苷酸能被用作探針，因而可以在活體內(nèi)檢測編碼本發(fā)明蛋白或其部分肽的DNA或mRNA的異常(基因異常)，特別地在哺乳動(dòng)物的活體(例如人、大鼠、小鼠、兔、羊、豬、牛、貓、狗、猴等)，它們用作例如DNA或mRNA損害，或突變或表達(dá)減少的遺傳診斷的試劑。使用本發(fā)明DNA或反義多核苷酸的遺傳診斷可以通過例如已知的Northern雜交或PCR-SSCP方法(Genomics，vol.5，p.874-879(1989)，Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA，vol.86，p.2766-2770(1989))完成。例如，當(dāng)通過Northern雜交檢測到編碼本發(fā)明蛋白或其部分肽的mRNA表達(dá)減少時(shí)，可以診斷出對(duì)象有患視網(wǎng)膜疾病，或?qū)砘家暰W(wǎng)膜疾病的高可能性。
“反義多核苷酸”是具有與本發(fā)明DNA的核苷酸序列至少部分互補(bǔ)的核苷酸序列，并能夠與本發(fā)明DNA雜交的多核苷酸。因此，反義多核苷酸不但是包括與本發(fā)明DNA的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的部分，而且是與本發(fā)明DNA的核苷酸序列基本互補(bǔ)的核苷酸序列的部分。反義多核苷酸的例子包括的部分包含與本發(fā)明DNA在高度嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。這些反義多核苷酸的例子包括除該上述多核苷酸之外的其他類型多核苷酸，比如包含2-脫氧-D-核糖的多脫氧核苷酸，含D-核糖的多核苷酸，和包含嘌呤或嘧啶堿基的N-葡糖苷的部分；其他具有非核苷酸骨架的聚合物(例如，可商購的蛋白核酸，和具有特定合成序列的核酸聚合物)；和其他具有特定鍵的核酸聚合物(假定該聚合物含允許DNA或RNA中發(fā)現(xiàn)的堿基配對(duì)或堿基插入的序列安排的核苷酸)。這些可以是雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA或DNA/RNA雜合體，并可以是未修飾的多核苷酸(或未修飾的寡核苷酸)，或添加修飾的已知的修飾多核苷酸(或修飾的寡核苷酸)。修飾的多核苷酸的例子包括在現(xiàn)有技術(shù)中已知的具有標(biāo)記物的多核苷酸、有帽多核苷酸、甲基化的多核苷酸、其中一個(gè)或多個(gè)天然的核苷酸被類似物置換的多核苷酸、分子內(nèi)的核苷酸修飾的多核苷酸、具有非電荷鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、亞磷酰胺、氨基甲酸酯等)的多核苷酸、帶有電荷的鍵或含硫的鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯)的多核苷酸、具有蛋白(核酸酶、核酸酶抑制劑、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L-賴氨酸)或糖類(例如單糖)作為側(cè)基的多核苷酸、具有嵌入(intercalent)化合物(例如吖啶、solarene等)的多核苷酸、包含螯合物(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化的金屬等)的多核苷酸、包含烷化劑的多核苷酸和具有修飾的鍵(例如-異頭物類型的核酸)的多核苷酸。此處，“核苷”、“核苷酸”和“核酸”可以不僅包含嘌呤和嘧啶堿基，而且可以包含其他修飾的雜環(huán)堿基。這些修飾的部分可以包含甲基化的嘌呤和甲基化的嘧啶，?；泥堰屎王；泥奏せ蚱渌s環(huán)。具有糖作為側(cè)鏈基團(tuán)的修飾的多核苷酸可以是側(cè)鏈的糖部分進(jìn)一步被修飾，例如，糖的一個(gè)或多個(gè)羥基被鹵素或脂肪族基置換，或轉(zhuǎn)化為例如醚和胺官能團(tuán)。
也就是說，本發(fā)明的反義多核苷酸是RNA、DNA、或修飾的核酸(RNA、DNA)。該修飾的核酸的例子包括核酸的硫衍生物和硫代磷酸鹽衍生物，和抗多核苷酸氨化物或寡核苷酸氨化物的降解的核酸，其不限定于此。
使用Otx2蛋白或其部分肽的表達(dá)或表達(dá)量的增長作為指數(shù)，可以篩選具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物或其鹽。該篩選例如，利用具有表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽能力的細(xì)胞來進(jìn)行。
具體地，這樣的篩選的例子包括用于篩選具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物或其鹽的方法，特征在于具有表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽能力的細(xì)胞在存在測試化合物的情況下培養(yǎng)，并檢測Otx2蛋白或其部分肽的表達(dá)，或測量它們的表達(dá)量?！熬哂斜磉_(dá)Otx2蛋白或其部分肽能力的細(xì)胞”的例子包括具有上述的本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞?；蛘?，該細(xì)胞可以是原來具有而不是根據(jù)基因重組方法表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽能力的細(xì)胞。本發(fā)明蛋白的表達(dá)量可以通過從培養(yǎng)的細(xì)胞以上述的方法分離并純化本發(fā)明蛋白，再使用上述定量本發(fā)明蛋白的方法進(jìn)行測量。
此外，本發(fā)明篩選法的其他方面包括用于篩選具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的化合物或其鹽的方法，特征在于具有表達(dá)otx2蛋白或其部分肽的能力的細(xì)胞在存在測試化合物的情況下培養(yǎng)，使用編碼本發(fā)明蛋白的DNA或其互補(bǔ)DNA或其部分DNA來測量編碼Otx2蛋白的mRNA(以下有時(shí)候縮寫成Otx2 mRNA)的量。更具體地說，提供用于篩選具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物或其鹽的方法，特征在于在以下兩者之間進(jìn)行比較(a)當(dāng)培養(yǎng)具有表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽能力的細(xì)胞時(shí)，Otx2 mRNA的表達(dá)量，和(b)在存在測試化合物的情況下培養(yǎng)具有表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽能力的細(xì)胞時(shí)，Otx2mRNA的量。
為了完成通過雜交方法進(jìn)行mRNA表達(dá)量的比較，這樣的比較可以根據(jù)已知的方法或其類似的方法完成，例如，在MolecularCloning，第二版，J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989中描述方法。具體地，編碼Otx2蛋白的mRNA的量的測量方法是將根據(jù)已知的方法從細(xì)胞提取的mRNA與編碼本發(fā)明蛋白的DNA或其互補(bǔ)DNA或其部分DNA接觸，并測量與編碼本發(fā)明蛋白的DNA或其互補(bǔ)DNA或其部分DNA結(jié)合的mRNA的量。結(jié)合到編碼本發(fā)明蛋白的DNA或其互補(bǔ)DNA或其部分DNA的Otx2 mRNA的量可以通過用例如，放射性同位素或色素標(biāo)記編碼本發(fā)明蛋白或其互補(bǔ)DNA或其部分DNA而容易地測量。作為放射性同位素，使用例如，32P和3H，和作為色素，使用熒光色素例如熒光素、FAM(PE Biosystems生產(chǎn))、JOE(PE Biosystems生產(chǎn))、TAMRA(PE Biosystems生產(chǎn))、ROX(PEBiosystems生產(chǎn))、Cy5(Amershan生產(chǎn))和Cy3(Amershan生產(chǎn))。或者，Otx2m RNA的量的測量方法還可以用反轉(zhuǎn)錄酶將從細(xì)胞提取的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，并測量通過PCR已擴(kuò)增的cDNA的量，該P(yáng)CR使用編碼本發(fā)明蛋白的DNA或其互補(bǔ)DNA或其部分DNA作為引物。
提供用于篩選具有調(diào)控編碼Otx2蛋白的DNA的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子活性作用的化合物或其鹽的方法，進(jìn)一步用于篩選具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物或其鹽的方法，特征在于編碼Otx2蛋白的已知啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域是從基因組DNA克隆的，轉(zhuǎn)化有上游連接合適的報(bào)告基因的重組DNA的細(xì)胞在存在測試化合物的條件下培養(yǎng)，用檢測報(bào)告基因的表達(dá)代替檢測Otx2蛋白的表達(dá)。作為報(bào)告基因，使用著色標(biāo)記基因例如lacZ(β-半乳糖苷酶基因)。通過使用已知的方法測量報(bào)告基因產(chǎn)物的量(例如mRNA、蛋白)，報(bào)告基因產(chǎn)物量增加的測試化合物可以被選為具有Otx2基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的促進(jìn)活性作用的化合物，那就是說，具有促進(jìn)Otx2蛋白或其部分肽表達(dá)活性的化合物。
上述的篩選法中測試化合物的例子包括肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞抽提物、植物浸出液和動(dòng)物組織提出物，這些化合物可以是新的化合物或已知的化合物。
為了完成上述的篩選法，本發(fā)明篩選試劑盒包含(a)具有表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽的能力的細(xì)胞，(b)編碼本發(fā)明蛋白的DNA或其互補(bǔ)DNA或其部分DNA，或(c)轉(zhuǎn)化有DNA的細(xì)胞，其中編碼Otx2蛋白的DNA的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子連接到報(bào)告基因。
使用本發(fā)明篩選法或篩選試劑盒獲得的化合物，或其鹽可用作藥物，例如上述用于預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展的藥劑，和用于誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑?；衔锘蚱潲}，包含其的用于預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑，或包含其的用于誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑可以在本發(fā)明蛋白或DNA中進(jìn)行。
實(shí)施例如圖1所示，小鼠Otx2cDNA被插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LIA載體中。來自人胎盤的堿性磷酸酶基因被摻入到LIA載體(對(duì)照病毒載體)，而感染有來自該載體的病毒細(xì)胞表達(dá)作為標(biāo)識(shí)物的堿性磷酸酶。感染來自其中包括Otx2基因的LIA載體的病毒的細(xì)胞表達(dá)Otx2蛋白和同時(shí)共表達(dá)堿性磷酸酶作為標(biāo)識(shí)物。
使用用于生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)細(xì)胞(Phoenix細(xì)胞系)，制備對(duì)照病毒載體和Otx2病毒載體，得到的病毒分別通過超速離心法(懸掛轉(zhuǎn)子，21,000rpm，4℃，2小時(shí))濃縮制備感染效率為1×107pfu(空斑形成單位)/ml的病毒溶液。
然后如圖2所示，幼大鼠在出生后立即(出生后0天)接受低溫麻醉，用手術(shù)剪切除覆蓋眼睛部分的皮膚。5μl對(duì)照病毒載體或Otx2病毒載體的病毒溶液使用注射器(Hamilton生產(chǎn))注射在幼大鼠的視網(wǎng)膜下。注射后，幼大鼠在37℃保溫20分鐘以恢復(fù)體溫，返回到母大鼠的飼養(yǎng)籠，隨后飼養(yǎng)4到6周。
長大成年的大鼠通過施用戊巴比妥鈉接受安樂死。從該大鼠取出眼，除去視網(wǎng)膜。視網(wǎng)膜在4℃用4％多聚甲醛溶液固定過夜。4％多聚甲醛溶液用PBS(磷酸鹽緩沖液)替換，并洗滌固定的視網(wǎng)膜。該固定/洗滌操作重復(fù)三次。然后，用4％多聚甲醛溶液固定的視網(wǎng)膜在65℃熱處理，并滅活內(nèi)源的堿性磷酸酶。熱處理的視網(wǎng)膜用堿性磷酸鹽染色液染色(室溫，3小時(shí))以使只感染有上述病毒的視網(wǎng)膜細(xì)胞在品藍(lán)中染色。染色的視網(wǎng)膜再次用4％多聚甲醛溶液固定過夜，用PBS洗滌，然后在30％蔗糖/PBS中浸泡過夜，轉(zhuǎn)移到OTS化合物(SakuraFinetek)液體，并在干冰上制備視網(wǎng)膜的冷凍塊。從冷凍塊使用冷凍切片制備儀器(Karl Zeis)制備大約30μm冷凍切片，并在光學(xué)顯微鏡(KarlZeis)下觀察。
通過其形式和位置(參見圖3)識(shí)別視網(wǎng)膜的各種細(xì)胞。獨(dú)立進(jìn)行三次試驗(yàn)。一個(gè)視野中各細(xì)胞相對(duì)于全部細(xì)胞數(shù)量的存活率如圖4所示。當(dāng)Otx2病毒載體被引入到視網(wǎng)膜干細(xì)胞(或視網(wǎng)膜前體細(xì)胞)時(shí)，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的數(shù)量與引入對(duì)照病毒載體的情況比較增加大約10％。由此可見，通過Otx2基因的表達(dá)，強(qiáng)烈地抑制從視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化成兩極神經(jīng)細(xì)胞，無長突細(xì)胞和Muller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以及幾乎所有的視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。
根據(jù)上述結(jié)果，其證實(shí)通過引入Otx2基因到未分化的視網(wǎng)膜干細(xì)胞中，和Otx2基因在該細(xì)胞的表達(dá)，有可能有效地將大鼠未分化的視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明蛋白或本發(fā)明DNA可以用于預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥物，所述視網(wǎng)膜疾病例如色素性視網(wǎng)膜炎、老年性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜剝離、青光眼和視網(wǎng)膜血管阻塞。此外，由于Otx2基因的異常導(dǎo)致視網(wǎng)膜感光細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能異常，通過檢測Otx2基因的異?；蜃冃曰騉tx2蛋白表達(dá)的減少，這些可以用于診斷上述的疾病。
序列表<110>獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)(Japan Science and Technology Agency)<110>Osaka Bioscience Institute(財(cái)團(tuán)法人大阪生命科學(xué)研究所)<120>使用OTX2基因再生和新生視網(wǎng)膜感光細(xì)胞(Regeneration and neogenesis of retinal photoreceptor cell using Otx2homeobox gene)<130>SCT052830-47<160>6<210>1<211>297<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Met Ser Tyr Leu Lys Gln Pro Pro Tyr Ala Val Asn Gly Leu Ser1 5 10 15Leu Thr Thr Ser Gly Met Asp Leu Leu His Pro Ser Val Gly Tyr Pro20 25 30G1y Pro Trp Ala Ser Cys Pro Ala Ala Thr Pro Arg Lys Gln Arg Arg35 40 45Glu Arg Thr Thr Phe Thr Arg Ala Gln Leu Asp Val Leu Glu Ala Leu50 55 60
Phe Ala Lys Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Phe Met Arg Glu Glu Val Ala65 70 75 80Leu Lys Ile Asn Leu Pro Glu Ser Arg Val Gln Val Trp Phe Lys Asn85 90 95Arg Arg Ala Lys Cys Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Asn Gly Gly100 105 110Gln Asn Lys Val Arg Pro Ala Lys Lys Lys Thr Ser Pro Ala Arg Glu115 120 125Val Ser Ser Glu Ser Gly Thr Ser Gly Gln Phe Thr Pro Pro Ser Ser130 135 140Thr Ser Val Pro Thr Ile Ala Ser Ser Ser Ala Pro Val Ser Ile Trp145 150 155 160Ser Pro Ala Ser Ile Ser Pro Leu Ser Asp Pro Leu Ser Thr Ser Ser165 170 175Ser Cys Met Gln Arg Ser Tyr Pro Met Thr Tyr Thr Gln Ala Ser Gly180 185 190Tyr Ser Gln Gly Tyr Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Phe Gly Gly Met Asp
195 200 205Cys Gly Ser Tyr Leu Thr Pro Met His His Gln Leu Pro Gly Pro Gly210 215 220Ala Thr Leu Ser Pro Met Gly Thr Asn Ala Val Thr Ser His Leu Asn225 230 235 240Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Ser Leu245 250 255Gly Phe Ash Ser Thr Thr Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ala260 265 270Ser Trp Lys Leu Asn Phe Asn Ala Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln275 280 285Thr Ser Ser Trp Lys Phe Gln Val Leu290 295<210>2<211>2209<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2gagagcggga ccggcctcag ctccaacaca gcctccactg tgattaaaaa taaaaattgc 60
tagagcagcc ctcactcgcc acatctactt tgatagctgg ctatttggaa tttaaaggat 120atttgacttt ttctaacctc ccatgaggct gtaagttcca ctgctccaaa cccacccacc 180aaggactctg aacctgtcca ccccgggcgc atcaagatct tccagctggg tacccccgat 240ttgggccgac tttgcacctc caaacaacct tagcatgatg tcttatctta agcaaccgcc 300ttacgcagtc aatgggctga gtctgaccac ttcgggtatg gacttgctgc acccctccgt 360gggctacccg gggccctggg cttcttgtcc cgcagccacc ccccggaaac agcgccggga 420gaggacgacg ttcactcggg cgcagctaga tgtgctggaa gcactgtttg ccaagacccg 480gtacccagac atcttcatgc gagaggaggt ggcactgaaa atcaacttgc ccgagtcgag 540ggtgcaggta tggtttaaga atcgaagagc taagtgccgc caacaacagc aacaacagca 600gaatggaggt caaaacaaag tgagacctgc caaaaagaag acatctccag ctcgggaagt 660gagttcagag agtggaacaa gtggccaatt cactcccccc tctagcacct cagtcccgac 720cattgccagc agcagtgctc ctgtgtctat ctggagccca gcttccatct ccccactgtc 780agatcccttg tccacctcct cttcctgcat gcagaggtcc tatcccatga cctatactca 840ggcttcaggt tatagtcaag gatatgctgg ctcaacttcc tactttgggg gcatggactg 900tggatcatat ttgaccccta tgcatcacca gcttcccgga ccaggggcca cactcagtcc 960catgggtacc aatgcagtca ccagccatct caatcagtcc ccagcttctc tttccaccca1020gggatatgga gcttcaagct tgggttttaa ctcaaccact gattgcttgg attataagga1080ccaaactgcc tcctggaagc ttaacttcaa tgctgactgc ttggattata aagatcagac1140atcctcgtgg aaattccagg ttttgtgaag acctgtagaa cctctttttg tgggtgattt1200ttaaatatac tgggctggac attccagttt tagccaggca ttggttaaaa gagttagatg1260ggatgatgct cagactcatc tgatcaaagt tccgagaggc atagaaggaa aaacgaaggg1320ccttagaggg gcctacaaac cagcaacatg aaatggacaa accaatctgc ttaagatcct1380gtcatagttt tagatcattg gttatcctga tttgcaaagt gatcaaaagc attctagcca1440tgtgcaacca aacaccacca aaaataaaat caaacaaaac taagttgtga aggaagggag1500ggaaggtcat agccttctta agcagaggtg ttccattgtt ttagccaatc cttggttgaa1560tcttaggaat gaacagtgtc tcaagctcat tcacgtttea tgaccaaetg gtagttggca1620
ctgaaaaaac ttttcagggc tgtgtgaatt gtgtgactga ttgtcctaga tgcactactt1680tatttaaaaa ataatgttca taaggagtca atatgtagtt taagagacaa tcagtgtgtg1740tcttataaat ggtacatctg tggtttttaa tctgtgctag acttcaaaac tgtgatctcc1800tgttattgta tgcaaccttg aactccacct ctgcaggggt tcttctgtga ttaaataggt1860tataattata agcaaaattc agagcaactg agtactgatc taaaaagatt acctttggct1920ggaggtgagc tgcactgaaa ctttacgaca aaatgtctct ggacaaagag agtcagagaa1980gagaagcaaa aggacactaa ttcatctgta atttactgtt ggtaagccta gcagtaaaga2040gacattggtc aattgctctg accctgatga attattaaac tgagatcatt gtcgtttatg2100cttgcagatg ttaaatggaa aagttatata tgcataaacc ttttcttcct ggatttggca2160gatatgtata attatattaa aatggttcta gcacaaaaaa aaaaaaaaa2209<210>3<211>289<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Met Met Ser Tyr Leu Lys Gln Pro Pro Tyr Ala Val Asn Gly Leu Ser15 10 15Leu Thr Thr Ser Gly Met Asp Leu Leu His Pro Ser Val Gly Tyr Pro2025 30Ala Thr Pro Arg Lys Gln Arg Arg Glu Arg Thr Thr Phe Thr Arg Ala35 40 45Gln Leu Asp Val Leu Glu Ala Leu Phe Ala Lys Thr Arg Tyr Pro Asp
50 55 60Ile Phe Met Arg Glu Glu Val Ala Leu Lys Ile Asn Leu Pro Glu Ser65 70 75 80Arg Val Gln Val Trp Phe Lys Asn Arg Arg Ala Lys Cys Arg Gln Gln85 90 95Gln Gln Gln Gln Gln Asn Gly Gly Gln Asn Lys Val Arg Pro Ala Lys100 105 110Lys Lys Thr Ser Pro Ala Arg Glu Val Ser Ser Glu Ser Gly Thr Ser115 120 125Gly Gln Phe Thr Pro Pro Ser Ser Thr Ser Val Pro Thr Ile Ala Ser130 135 140Ser Ser Ala Pro Val Ser Ile Trp Ser Pro Ala Ser Ile Ser Pro Leu145 150 155 160Ser Asp Pro Leu Ser Thr Ser Ser Ser Cys Met Gln Arg Ser Tyr Pro165 170 175Met Thr Tyr Thr Gln Ala Ser Gly Tyr Ser Gln Gly Tyr Ala Gly Ser180 185 190
Thr Ser Tyr Phe Gly Gly Met Asp Cys Gly Ser Tyr Leu Thr Pro Met195 200 205His His Gln Leu Pro Gly Pro Gly Ala Thr Leu Ser Pro Met Gly Thr210 215 220Asn Ala Val Thr Ser His Leu Asn Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr225 230 235 240Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gly Phe Asn Ser Thr Thr Asp Cys245 250 255Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ala Ser Trp Lys Leu Asn Phe Asn Ala260 265 270Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ser Ser Trp Lys Phe Gln Val275 280 285Leu<210>4<211>2082<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4cctccgaagc agtaaaccag cccctctgtt tgtttgtttg ctttgccctt agttccactg 60
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1.一種藥劑，用于預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展，其包含Otx2蛋白或其部分肽，或其鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，其中該Otx2蛋白是包含與SEQ IDNO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5代表的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的蛋白。
3.一種藥劑，用于預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展，其包含編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥劑，其中該DNA包含SEQ ID NO 2、SEQID NO4或SEQ ID NO6代表的核苷酸序列，或與所述序列在高度嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的藥劑，其包括的重組載體含有編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。
6.一種藥劑，用于誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜感光細(xì)胞，其包含Otx2蛋白或其部分肽，或其鹽。
7.一種藥劑，用于誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞，其包含編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。
8.一種用于誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的方法，其包括表達(dá)Otx2蛋白，或增加Otx2蛋白的表達(dá)量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用于誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的方法，其包括在來自眼球組織的細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)Otx2蛋白，或增加Otx2蛋白的表達(dá)量。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的用于誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的方法，其中編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA被引入到來自眼球組織的細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞，并培養(yǎng)得到的細(xì)胞。
11.一種方法，用于預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的Otx2蛋白或其部分肽或其鹽。
12.一種方法，用于預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。
13.一種方法，用于再生視網(wǎng)膜，其包括向視網(wǎng)膜移植被Otx2蛋白分化誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞或其前體細(xì)胞。
14.Otx2蛋白或其部分肽、或其鹽在制備用于預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑中的應(yīng)用。
15.編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA在制備用于預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的藥劑中的應(yīng)用。
16.一種視網(wǎng)膜疾病的診斷試劑，其包括Otx2蛋白或其部分肽的或其鹽的抗體。
17.一種診斷視網(wǎng)膜疾病的方法，其包括使用Otx2蛋白或其部分肽或其鹽的抗體。
18.一種診斷視網(wǎng)膜疾病的方法，其包括檢測Otx2蛋白或其部分肽的表達(dá)量或突變。
19.一種用于視網(wǎng)膜疾病的診斷試劑，其包括(a)編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，或(b)含有與所述的DNA或RNA互補(bǔ)的或基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的反義多核苷酸。
20.一種用于診斷視網(wǎng)膜疾病的方法，其包括使用(a)編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA，或(b)包括與所述DNA或RNA互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的的核苷酸序列的反義多核苷酸。
21.一種具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物或其鹽的篩選方法，其包括使用Otx2蛋白或其部分肽的表達(dá)或表達(dá)量的增加作為指標(biāo)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的篩選方法，其中使用具有表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽的能力的細(xì)胞。
23.一種試劑盒，用于篩選具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物或其鹽，其包括具有表達(dá)Otx2蛋白或其部分肽的能力的細(xì)胞。
24.一種具有誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞作用的化合物其鹽，其可使用權(quán)利要求21或22的篩選方法，或權(quán)利要求23的篩選試劑盒獲得。
25.一種藥物，其包括權(quán)利要求24的化合物或其鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供一種藥物，包括(a)Otx2蛋白或其部分肽、或其鹽，或(b)編碼Otx2蛋白或其部分肽的DNA或RNA。本藥物用作預(yù)防、治療或抑制視網(wǎng)膜疾病包括視網(wǎng)膜變性的發(fā)展的藥劑。此外，本藥物用作，例如，在患視網(wǎng)膜疾病的病人移植細(xì)胞到視網(wǎng)膜內(nèi)時(shí)，誘導(dǎo)從視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的藥劑。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1747744SQ20048000346
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月3日
發(fā)明者古川貴久 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu), 財(cái)團(tuán)法人大阪生命科學(xué)研究所