專利名稱：抗過敏的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對過敏反應(yīng)的預防和治療有用的抗過敏組合物，特別是以具有高抗過敏活性的乳酸菌為有效成分的抗過敏用組合物，以及該乳酸菌的獲得方法，此外還涉及該抗過敏用組合物作為食品及飲料等的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
過敏是發(fā)達國家中患病率最高的疾病之一。通常將過敏的發(fā)病機制分為I型～IV型4種。I型過敏與IgE抗體有關(guān)，以花粉病、哮喘、蕁麻疹、過敏性休克等為代表。II型過敏與IgG抗體、IgM抗體有關(guān)，是活化補體系統(tǒng)而致的細胞毒性反應(yīng)，胎兒骨髓成紅細胞增多癥和自身免疫性溶血性貧血屬于這一類型。III型過敏是由抗原抗體復合物引起的組織傷害反應(yīng)，以Alex反應(yīng)和血清病、腎小球腎炎為代表。IV型過敏是遲發(fā)性過敏(遲發(fā)型過敏反應(yīng))，與T細胞有關(guān)，以結(jié)核菌素反應(yīng)和和接觸性皮炎為代表。其中，I型、II型及IV型與食物過敏的發(fā)生有關(guān)。另一方面，環(huán)境過敏，即花粉病、特異性皮炎、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎等過敏主要是I型的發(fā)病機制。
上述I型過敏反應(yīng)以過敏原特異的IgE的誘導和組胺、白三烯等化學介質(zhì)的釋放為特征。免疫應(yīng)答是各種細胞間的相互作用而產(chǎn)生的，輔助性T細胞(Th)是與此相關(guān)的細胞中的一種。輔助性T細胞屬于T細胞亞群，其作用是識別抗原，產(chǎn)生各種細胞因子(輔助性因子)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的誘導。根據(jù)其產(chǎn)生細胞因子的能力將輔助性T細胞分為Th1細胞和Th2細胞。IL-4、IL-5、IL-13等Th2細胞因子對引起B(yǎng)細胞的抗體類別轉(zhuǎn)換、產(chǎn)生IgE抗體等是必要的。實際上，已經(jīng)知道過敏患者的淋巴細胞中Th2細胞增加。外源侵入的過敏原由樹突狀細胞、巨噬細胞等抗原呈遞細胞，以其一部分與MHCII分結(jié)合的形式呈遞給T細胞，使Th2細胞活化、分化。Th2細胞釋放的Th2細胞因子可誘導B細胞類別轉(zhuǎn)換、產(chǎn)生IgE抗體，IgE抗體與組織內(nèi)的肥大細胞和血中的嗜堿性細胞表面的FcR結(jié)合。當過敏原第二次侵入機體時，被結(jié)合于肥大細胞和血中嗜堿性細胞表面的IgE抗體識別，與IgE抗體間形成架橋。這種刺激作為一觸發(fā)點，使肥大細胞和嗜堿性細胞爆發(fā)性釋放化學介質(zhì)，呈現(xiàn)各種過敏癥狀。
預防、治療由IgE和化學介質(zhì)介導的過敏的方法有，例如通過拮抗性結(jié)合的方式與組胺受體結(jié)合從而阻礙來源于末梢神經(jīng)的信號傳導的抗組胺劑，通過減弱化學介質(zhì)產(chǎn)生細胞的活性而減輕癥狀的抗過敏劑，通過減弱免疫反應(yīng)性而減輕炎癥的類固醇劑，通過定期注射過敏原誘導耐受的減敏療法等。但是，任何一種都存在副作用，且效果也并不確定。
近年，為抑制IgE調(diào)節(jié)Th2細胞因子產(chǎn)生的方法受到關(guān)注。有報道，結(jié)核菌、溶血性鏈球菌、乳酸菌等某些細菌通過增強Th1免疫、抑制Th2免疫，結(jié)果降低IgE(臨床免疫、1999年、第32卷、454頁；International Archives of Allergy and Immmunology、1998年、第115卷、278頁；特開平9-2959號公報)。
其中，從安全性方面考慮，乳酸菌易于用于食品等，是有用的材料。但是，對于乳酸菌而言，并不是所有的乳酸菌都具有增強Th1免疫的效果，必須選擇有用的菌株。作為抗過敏乳酸菌，鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)LGG株眾所周知，有報道通過孕婦攝取，可抑制胎兒的特異性皮炎(Lancet(柳葉刀)、2001年、第357卷、1076頁)。用乳酸菌作為抗過敏劑的應(yīng)用也有幾篇專利公報。例如，特開平9-2959號公報中公開了用乳酸菌作為抗過敏劑應(yīng)用，其中添加嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、短乳桿菌(L.Brevis)、布氏乳桿菌(L.Buchnerii)、及干酪乳桿菌(L.casei)等乳酸菌培養(yǎng)小鼠淋巴細胞時IgE產(chǎn)量為30ng/ml以下；特開平10-309178號公報中公開了用嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium.infantis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium.breve)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium.longum)及兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium.bifidum)等雙歧桿菌作為特別治療食物過敏的抗過敏劑應(yīng)用，及特開2000-95697號公報中公開了用糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、羅伊乳桿菌(Lactobacillus leuteri)等乳酸菌作為過敏性支氣管哮喘、過敏性鼻炎及特異性皮炎等I型過敏的抑制劑應(yīng)用等。
另一方面，乳酸菌等增強Th1免疫就意味著通過產(chǎn)生IL-12和IFN-γ等活化巨噬細胞和殺傷性T細胞、NK細胞等細胞性免疫，從而對抗病毒和細菌感染、癌的產(chǎn)生等。具體而言，巨噬細胞產(chǎn)生的IL-12可通過促使未分化的輔助性T細胞向Th1細胞分化，活化單核巨噬細胞·NK細胞，而獲得對外源敵、癌的抵抗性。因此，這提示可誘導產(chǎn)生強IL-12的乳酸菌株可作為免疫活性劑使用(Cancer ImmunologyImmunotherapy，vol.49，p.157，2000；特開平7-228536號公報；特開2002-80364號公報)。
另外，由于乳酸菌活著到達腸道才發(fā)揮各種各樣的效果，所以有必要耐受胃酸、膽汁酸等消化液(Symposium on Intestinal Flora 3，“Intestinal Flora and probiotics”，Gakkai Shuppan Center，p.41-55，edited by Tomotari Mitsuoka 1998)。另外，已知對腸道粘附性高的乳酸菌能逗留在腸道充分發(fā)揮其效果。因而，當經(jīng)口攝取乳酸菌時優(yōu)選該乳酸菌不僅功能性高而且能活著到達腸道。
近年認為因特異性皮炎和花粉病等過敏引發(fā)體質(zhì)變化的人很多，成為社會問題。其中尤其對癥狀嚴重的患者使用各種藥劑進行治療。但是，實際情況是，大部分患者治療不到一個完整的療程，為了保證日常生活的基礎(chǔ)上，他們進行包括民間療法在內(nèi)的對癥療法。
鑒于這種狀況，最近在積極開展通過食物抑制過敏的研究。結(jié)果在多種飲食品的成分中，例如日本羅勒油和魚油、特殊的茶多酚等發(fā)現(xiàn)抗過敏效果，用它們來進行治療。
已知具有抗過敏效果的飲食品的成分與上述特定乳酸菌有相似的效果，應(yīng)用該乳酸菌的酸奶和乳酸菌飲料，已作為具有抗過敏效果的飲食物部分進行了開發(fā)。用這類抗過敏用飲食品進行預防或治療可在安全且溫和的條件下攝取，但有必要每日連續(xù)攝取，且有必要以能消化的量每日連續(xù)攝取以發(fā)揮作用。但是，目前為止，由于篩選、獲得具有高抗過敏活性菌株的方法尚未明確，還未獲得滿意的菌株，不能滿足實際應(yīng)用。再者，傳統(tǒng)上乳酸菌的使用中，象酸奶和乳酸菌飲料中那樣，將用乳酸菌發(fā)酵作為主要目的，而將抗過敏作用置于次要地位；再者，對于酸奶和乳酸菌飲料，由于其必須在冷凍條件下運輸，且大多數(shù)不能長期保質(zhì)，可操作的自由度少等問題，所以作為每日可連續(xù)攝取的能有效預防或治療過敏的飲食品并不盡如人意。因而目前迫切需要開發(fā)滿足這些條件、有效的抗過敏用組合物，及應(yīng)用它們的飲食品等。
本發(fā)明的目的在于提供對過敏的預防、治療有用的抗過敏用組合物，特別提供以具有高抗過敏活性的乳酸菌為有效成分的抗過敏用組合物，及該乳酸菌的獲得方法，此外還提供具有抗過敏功能的食品及飲料等。這里所說“具有抗過敏功能”是指能發(fā)揮過敏的預防、治療效果，和/或能改善、緩和過敏癥狀。
本發(fā)明者以預防、治療花粉病、特異性皮炎、支氣管哮喘、過敏性鼻炎等環(huán)境過敏為目的，對其有效成分進行了探索。首先，從安全性方面考慮著眼于乳酸菌，進行了深入研究，結(jié)果通過篩選出能阻礙Th2活化、適當平衡Th1活化的乳酸菌，發(fā)現(xiàn)可獲得具有高抗過敏活性的乳酸菌，由此完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌的獲得方法，其特征在于，它是著眼于Th1/Th2平衡的方法。傳統(tǒng)的方法是通過測定IgE來評價抗過敏活性，雖然IgE與過敏的關(guān)系勿庸置疑，但另一方面，例如正如已知的遺傳性過敏性患者中有IgE高的人也有IgE低的人一樣，IgE的程度并不能說明一切。已知除IgE以外，過敏的發(fā)病與嗜酸性細胞增加和引起淋巴細胞局部浸潤的趨化因子的釋放等多種事件綜合相關(guān)。因此，本發(fā)明以能綜合說明IgE增加、嗜酸性細胞增加和趨化因子的Th1/Th2平衡為著眼點，以該平衡為指標，通過開發(fā)評價、分離抗過敏性菌株的方法，成功獲得了具有高抗過敏活性的乳酸菌。
本發(fā)明的抗過敏用組合物包括能特別平衡作為Th2活化指標的白細胞介素4(IL-4)及作為Th1免疫活化指標的白細胞介素12(IL-12)的生成量的乳酸菌為有效成分的抗過敏用組合物將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌(L.paracasei)KW3110株作為待檢乳酸菌時相同，或是白細胞介素12的產(chǎn)量為用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的60％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的50％。本發(fā)明中，具有上述本發(fā)明的抗過敏活性的乳酸菌包括以與KW3110株相比，白細胞介素12的產(chǎn)量為其70％以上的乳酸菌；白細胞介素12的產(chǎn)量達其70％以上且白細胞介素4的產(chǎn)量不到其40％的乳酸菌為活性成分的乳酸菌。此外，本發(fā)明中獲得的具有抗過敏活性的乳酸菌還包括以與KW4110、KW3925、KW3926的抗過敏活性相比，其抗過敏活性同等或高于KW4110的乳酸菌；抗過敏活性等同或高于KW3925的乳酸菌；抗過敏活性等同或高于KW3926的乳酸菌為活性成分。
本發(fā)明還包括具有高抗過敏活的乳酸菌的獲取方法，該乳酸菌是本發(fā)明的抗過敏用組合物的有效成分。此外，本發(fā)明還包括本發(fā)明的抗過敏用組合物的在飲食品中的利用，及通過制劑化，作為經(jīng)口施用的抗過敏劑的利用。本發(fā)明的抗過敏用組合物的有效成分之一類干酪乳桿菌KW3110株是能耐受消化液、對腸道的附著性高的乳酸菌，作為抗過敏劑經(jīng)口施用時尤能發(fā)揮優(yōu)良效果。
本發(fā)明中作為抗過敏用組合物的有效成分使用的類干酪乳桿菌(Lactobacillus.Paracasei)KW3110，根據(jù)專利程序中微生物保藏的布達佩斯條約，以FERM BP-08634保藏在作為國際保藏單位的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所所特許生物保藏中心。
本發(fā)明的抗過敏用組合物的在飲食品中的利用包括，特別提供本發(fā)明的抗過敏用組合物的有效成分—具有高抗過敏活性的乳酸菌用于茶飲料類的飲料，使之成為具有抗過敏功能的飲料。本發(fā)明的具有抗過敏功能的飲料可以制備成味道好，保質(zhì)期長，可每天連續(xù)攝取的形式，且所述可連續(xù)攝取的量是可以發(fā)揮作用的量。本發(fā)明中具有高抗過敏活性的乳酸菌，可應(yīng)用加熱殺菌等處理進行殺菌，例如可通過將本發(fā)明中的乳酸菌加熱殺菌后添加到已滅菌的密封容器中制備成飲料商品，使保持飲料自身的香味、保持飲料制品的穩(wěn)定性、且具有抗過敏功能。而且，制備裝入密封容器的飲料時，可通過調(diào)整所用乳酸菌的濃度而制備成保持抗過敏功能、且增加飲料保持自身香味的功能、味道好、保質(zhì)期長的飲料。從抗過敏作用及制品的保存、穩(wěn)定性觀點來考慮，本發(fā)明不包括乳成分，也就是說，特別優(yōu)選各種類型的非乳飲料，例如包含果汁的清涼飲料或茶飲料等非乳飲料。
本發(fā)明的抗過敏用組合物在飲食品中的利用，可聯(lián)合應(yīng)用2種以上根據(jù)本發(fā)明而獲得的具有高抗過敏活性的乳酸菌。此時，可根據(jù)各飲食品和乳酸菌而調(diào)配各種組合或配比量。此外，也可配合或聯(lián)合應(yīng)用其它抗過敏用組合物。

發(fā)明內(nèi)容
也就是說，本發(fā)明提供抗過敏用組合物(權(quán)利要求1)，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時同等，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的60％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的50％。權(quán)利要求1的抗過敏用組合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時同等，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的75％以上(權(quán)利要求2)。權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的抗過敏用組合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的40％(權(quán)利要求3)。權(quán)利要求1～3任一權(quán)利要求的抗過敏用組合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與周類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時同等，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的75％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的40％(權(quán)利要求4)。權(quán)利要求1～4任一權(quán)利要求的抗過敏用組合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時同等，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的80％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的30％(權(quán)利要求5)。抗過敏用組合物，其特征在于，所述的如權(quán)利要求1～5任一項中所述的小鼠脾臟由來淋巴細胞的白細胞介素12及白細胞介素4生成量的乳酸菌為類干酪乳桿菌(Lactobacillus.Paracasei)KW3110株、植物乳桿菌(Lactobacillus.plantarum)KW4110株、類干酪乳桿菌KW3925株、類干酪乳桿菌KW3926株或唾液鏈球菌(Streptococcus.salivarius)KW3210(權(quán)利要求6)。提供抗過敏用組合物，其有效成分是類干酪乳桿菌KW3110株，該菌株顯示權(quán)利要求1～5任一項中小鼠脾臟由來淋巴細胞的白細胞介素12及白細胞介素4生成量、且耐受消化液、對腸道的附著性高(權(quán)利要求7)。權(quán)利要求1～7任一項中的抗過敏用組合物，其特征在于，所述的過敏為花粉病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、或特異性皮炎(權(quán)利要求8)。權(quán)利要求8的抗過敏用組合物，其特征在于，所述的抗過敏用組合物為藥物(權(quán)利要求9)。權(quán)利要求8的抗過敏用組合物，其特征在于，所述的抗過敏用組合物為飲食品(權(quán)利要求10)。
另外，本發(fā)明包括具有高抗過敏活性的乳酸菌的獲得方法，其特征在于，分離出具有以下效果的乳酸菌將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時同等，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的60％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的50％(權(quán)利要求11)。具有高抗過敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，用培養(yǎng)基培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11的方法分離出的乳酸菌，使之增殖(權(quán)利要求12)。權(quán)利要求12的具有高抗過敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，確認用培養(yǎng)基培養(yǎng)、增殖了的乳酸菌的抗過敏活性(權(quán)利要求13)。權(quán)利要求13的具有高抗過敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，所述的增殖了的乳酸菌的抗過敏活性的確認是通過將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，測定白細胞介素12及白細胞介素4的產(chǎn)量進行(權(quán)利要求14)。裝入密封容器的藥品或飲食品的制造方法，其特征在于，將根據(jù)權(quán)利要求12～14任一項中具有高抗過敏活性的乳酸菌的制造方法而制備的乳酸菌配合藥品或飲食品，填充到容器中，進行密封(權(quán)利要求15)。過敏疾病的預防和/或治療方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～10任一項中的抗過敏用組合物用于過敏疾病的預防和/或治療的處理(權(quán)利要求16)。權(quán)利要求16的過敏疾病的預防和/或治療方法，其特征在于，所述的過敏性疾病為花粉病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、或特異性皮炎(權(quán)利要求17)。權(quán)利要求1～10中任一項抗過敏用組合物的在過敏性疾病的預防和/或治療中的應(yīng)用(權(quán)利要求18)。權(quán)利要求18的抗過敏用組合物的應(yīng)用，其特征在于，所述的過敏性疾病的預防和/或治療是指花粉病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、或特異性皮炎的預防和/或治療(權(quán)利要求19)。
此外，本發(fā)明還包括具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，添加權(quán)利要求1～7任一項中具有抗過敏活性的乳酸菌作活性成分(權(quán)利要求20)。權(quán)利要求20的具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，每日攝取的飲食品中可含有5×109個以上具有抗過敏活性的乳酸菌(權(quán)利要求21)。權(quán)利要求20或21的具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，所述的飲料或食品不包含成為過敏的原因的成分(權(quán)利要求22)。權(quán)利要求22的具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，所述的飲料或食品是不包含成為過敏原成分的片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊、或飲料劑(權(quán)利要求23)。權(quán)利要求20～21任一項中具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，應(yīng)用滅菌了的乳酸菌(權(quán)利要求24)。具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，添加權(quán)利要求1～7任一項中具有抗過敏活性的乳酸菌作活性成分(權(quán)利要求25)。權(quán)利要求22中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的飲料是不含乳成分的裝入密封容器的飲料(權(quán)利要求26)。權(quán)利要求25或26中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的飲料是裝入密封容器的果汁清涼飲料或茶飲料(權(quán)利要求27)。權(quán)利要求25～27任一項中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的裝入密封容器的飲料中添加的乳酸菌是每100g飲料109～1011個乳酸菌的范圍(權(quán)利要求28)。權(quán)利要求20～28任一項中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的添加的乳酸菌為類干酪乳桿菌KW3110或其突變株(權(quán)利要求29)。權(quán)利要求20～29任一項中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的食品或飲料作為健康食品、功能性食品、特定保健用食品、或病人用食品進行制備(權(quán)利要求30)。具有抗過敏功能的裝入密封容器的飲食品的制造方法，其特征在于，在基本上無菌狀態(tài)下，向滅菌的食品或飲料中配合權(quán)利要求1～7任一項中具有高抗過敏活性的乳酸菌、或其經(jīng)過殺菌的乳酸菌，填充到容器，密封(權(quán)利要求31)。乳酸菌的抗過敏活性的測定方法，其特征在于，將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟由來淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)時產(chǎn)生的白細胞介素12和/或白細胞介素4的量(權(quán)利要求32)。權(quán)利要求32所述的乳酸菌抗過敏活性的測定方法，其特征在于，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)所產(chǎn)生的白細胞介素12和/或白細胞介素4的量，與應(yīng)用類干酪乳桿菌KW3110株的情況進行比較，從而進行評價(權(quán)利要求33)?？惯^敏劑，其特征在于，向權(quán)利要求1～7任一項中所述的具有高抗過敏活性的乳酸菌中添加載體、賦形劑和/或其它輔助劑，制劑化(權(quán)利要求34)。由權(quán)利要求1～7任一項中所述的具有高抗過敏活性的乳酸菌制備的藥品(權(quán)利要求35)。具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，用權(quán)利要求1～7任一項中所述的具有高抗過敏活性的乳酸菌部分和全部代替用乳酸菌制備的或含有乳酸菌的飲料或食品(權(quán)利要求36)。具有抗過敏功能的飲料或食品的制造方法，其特征在于，用權(quán)利要求1～7任一項中所述的具有高抗過敏活性的乳酸菌部分和全部代替用乳酸菌制備的或含有乳酸菌的飲料或食品的乳酸菌(權(quán)利要求37)。
本發(fā)明包括具有高抗過敏活性的乳酸菌作有效成分的抗過敏用組合物，該乳酸菌能特異平衡作為Th2活化指標的白細胞介素4(IL-4)及作為Th1免疫活化指標的白細胞介素12(IL-12)的生成量。
(本發(fā)明的有效成分乳酸菌)本發(fā)明的有效成分-具有高抗過敏活性的乳酸菌是具有以下效果的乳酸菌將用卵清蛋白(以下，簡作“OVA”)致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含OVA的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，作為待檢乳酸菌，其白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時同等或是其60％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的50％。作為更優(yōu)選的本發(fā)明的有效成分，上述乳酸菌的特征為將用OVA致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含OVA的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時等同或是其75％以上。此外，作為優(yōu)選的本發(fā)明的有效成分，上述乳酸菌的特征為將用OVA致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含OVA的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的40％。
本發(fā)明中具有高抗過敏活性的乳酸菌，其最優(yōu)選的實施方案是將用卵清蛋白(以下，簡作“OVA”)致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含OVA的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，作為待檢乳酸菌，其白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時等同或是其80％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的30％。
作為本發(fā)明中有效成分應(yīng)用的具有高抗過敏活性的乳酸菌的獲得方法是分離出具有以下功效的乳酸菌將用過敏原致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含該過敏原的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，作為待檢乳酸菌，其Th1誘導細胞因子產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時等同或是其60％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的50％。也就是說，可通過分離出具有以下功效的乳酸菌而獲得應(yīng)用眾所周知的乳酸菌菌株或新分離出的乳酸菌菌株，將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含OVA的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，基本上，作為待檢乳酸菌，其白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時等同或是其60％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的50％。如前所述，作為本發(fā)明有效成分應(yīng)用的乳酸菌，業(yè)內(nèi)人士可很容易的篩選獲得可通過進行體外評價抗過敏活性的實驗方法，根據(jù)本發(fā)明的指標，從各種公知的或新分離的乳酸菌中獲得。詳細的情況如實施例1中所述。
作為本發(fā)明有效成分應(yīng)用的具有高抗過敏活性的乳酸菌，例如類干酪乳桿菌KW3110株、干酪乳桿菌L14株，可從日本乳業(yè)技術(shù)協(xié)會購入。根據(jù)日本乳業(yè)技術(shù)協(xié)會的所述，L14株即干酪乳桿菌，這是本發(fā)明者們應(yīng)用QUALICON公司制RiboPrinter，用RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)及AFLP(擴增片段長度多態(tài)性)進行分析，該株即為類干酪乳桿菌，所以本發(fā)明中記做類干酪乳桿菌(L.paracasei)。本發(fā)明中作為抗過敏用組合物的有效成分使用的類干酪乳桿菌(Lactobacillus.Paracasei)KW3110，也可如上所述從日本乳業(yè)技術(shù)協(xié)會購入，此外，根據(jù)專利程序中微生物保藏的布達佩斯條約，它以FERM BP-08634保藏在作為國際保藏單位的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所所特許生物保藏中心。
另外，作為本發(fā)明中抗過敏用組合物的有效成分使用的植物乳桿菌KW4110株可作為植物乳桿菌JCM1149株、類干酪乳桿菌KW3926株可作為類干酪乳桿菌JCM8132株從JCM(Japan Collection ofMicroorganisms，RIKEN)購入，以及類干酪乳桿菌KW3925株可作為類干酪乳桿菌NRIC1917株從NRIC(東京農(nóng)業(yè)大學)購入。
篩選作為本發(fā)明有效成分應(yīng)用的乳酸菌時，可篩選除抗過敏作用外，還具有傳統(tǒng)已知的益生菌功能，如對于大多數(shù)乳酸菌而言的調(diào)整腸道作用、降低膽固醇作用、降壓作用等的乳酸菌。另外，經(jīng)口施用本發(fā)明的有效成分乳酸菌時，由于乳酸菌逗留在腸道能充分發(fā)揮其功效，所以將根據(jù)以上述標準選擇獲得的乳酸菌，再對來源于人腸道的細胞系Caco-2進行體外粘附性試驗，篩選出具有更高黏附能力的細胞，從而獲得有效性更高的乳酸菌。本發(fā)明有效成分之一的類干酪乳桿菌KW3110株是對消化液有抗性、對腸道的粘附性高的乳酸菌，作為抗過敏劑經(jīng)口施用時，能特別發(fā)揮上述優(yōu)良效果。
本發(fā)明的有效成分乳酸菌，在M.R.S.(de Man，Rogosa，Sharpe)培養(yǎng)基等業(yè)內(nèi)人士已知的乳酸菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基中進行適當培養(yǎng)、增殖后，活菌或滅菌處理，必要時可進行冷凍干燥或噴霧-烘干粉末化后，可作為本發(fā)明組合物的有效成分使用。另外，為了進行工藝管理，必要時，可測定所得乳酸菌菌體的抗過敏活性。作為該抗過敏活性的測定方法，是將用過敏原致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含過敏原的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，測定所產(chǎn)生的Th1誘導細胞因子和/或Th2誘導細胞因子的量。
本發(fā)明中也可對用本發(fā)明的方法獲得的具有高抗過敏活性的乳酸菌進行突變，制備、應(yīng)用抗過敏活性等高的突變株。作為菌株突變的手段，可應(yīng)用UV等公知的突變手段，例如用突變手段對具有高抗過敏活性的乳酸菌KW3110株進行突變，應(yīng)用本說明書中記載的乳酸菌抗過敏活性的評價方法，而獲得、應(yīng)用抗過敏活性增加或其它特性發(fā)生突變的具有優(yōu)選特性的突變株。另外，也可對KW4110株、KW3210株、KW3925株、及KW3926株等進行突變應(yīng)用。
(衍生株的選擇)本發(fā)明中可將從本發(fā)明獲得的乳酸菌株產(chǎn)生出的特征不同的菌株作為衍生株進行選擇、應(yīng)用。該菌株的選擇方法以KW3110為例進行說明方法如下用MRS培養(yǎng)基樣的培養(yǎng)基培養(yǎng)KW3110株，靜置培養(yǎng)直至到達所定溫度、所定菌數(shù)，用新鮮的MRS培養(yǎng)基希釋培養(yǎng)液后，將本菌體懸浮液以10％的比例懸浮到用鹽酸將pH調(diào)為3.0的PBS(以指定的濃度溶解Dainippoin Pharmacutical制的藥片)中、37℃培養(yǎng)3小時。用PBS希釋經(jīng)酸處理的菌體懸浮液，轉(zhuǎn)入MRS平板培養(yǎng)基中，使之形成菌落。以顏色為指標選擇所形成的菌落，再從根據(jù)顏色選擇出的菌落中選擇1株，用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。用本發(fā)明的抗過敏活性的測定法(實施例2的方法)測定該培養(yǎng)物的抗過敏活性，判定各菌落的抗過敏活性。通過該方法可從試驗菌株中選擇獲得高抗過敏活性的菌株。本發(fā)明的實施例中，將分離出的菌株命名為No.90株，作為KW3110(Lactobacillus.Paracasei)株的衍生株，根據(jù)專利程序中微生物保藏的布達佩斯條約，以FERM BP-08635保藏在作為國際保藏單位的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所所特許生物保藏中心。
(抗體的制備)本發(fā)明中，為了對本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌制品的質(zhì)量管理和制造工藝進行管理，有必要分離、檢測本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌，并進行其乳酸菌的鑒定和含有量的檢查。為了分離、檢測該乳酸菌可制備并應(yīng)用抗體。作為能與本發(fā)明的有高抗過敏活性的乳酸菌特異結(jié)合的抗體，具體的例子包括單克隆抗體、多克隆抗體等免疫特異性抗體。它們均可以上述乳酸菌作抗原用常規(guī)方法進行制備，但從特異性考慮，其中更優(yōu)選單克隆抗體。單克隆抗體和多克隆抗體的產(chǎn)生方法，可根據(jù)已知的方法進行。例如，可參照Koehler，G.及C.Milstein，Nature256,495-497(1975)、及Davis，B.，R.Dulbecco，H.Eisen，H.Ginsberg及W.Wood，Principles of Microbiology andImmunology第2卷、Harper & Row，New York，1973的方法。即，單克隆抗體的產(chǎn)生是，例如用本發(fā)明的乳酸菌免疫小鼠后，將該小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，由所得雜交瘤細胞產(chǎn)生抗體。應(yīng)用與本發(fā)明的乳酸菌特異性結(jié)合的抗體檢測本發(fā)明的乳酸菌時，可通過應(yīng)用公知抗體的免疫學檢測方法實施。作為該免疫學的測定方法，可列舉如RIA法、ELISA法、熒光抗體法等公知的免疫學測定法。
(本發(fā)明的有效成分乳酸菌的抗過敏作用)過敏是，因抗原刺激而產(chǎn)生IgE抗體，IgE抗體與組織內(nèi)的肥大細胞和血中的嗜堿性細胞表面的Fc受體結(jié)合。第二次抗原刺激(過敏原的再侵入)時，被結(jié)合于肥大細胞和血中的嗜堿性細胞表面IgE抗體識別，與IgE抗體間形成架橋。這種刺激作為一觸發(fā)點，使肥大細胞和嗜堿性細胞爆發(fā)性釋放化學介質(zhì)，呈現(xiàn)各種過敏的癥狀。因此，為了進行過敏的治療、預防有必要抑制IgE，為了該目的，有必要增強Th1免疫抑制Th2免疫。
本發(fā)明的乳酸菌，在應(yīng)用小鼠淋巴細胞的體外體系中，能強有力的誘導作為Th1免疫指標的白細胞介素12(IL-12)的產(chǎn)生，且能強有力的抑制作為Th2免疫指標的白細胞介素4(IL-4)的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的乳酸菌，通過增強Th1免疫抑制Th2免疫，而抑制IgE抗體的產(chǎn)生，本發(fā)明的乳酸菌基于此作用機制而具有過敏的治療、預防效果。
因而，本發(fā)明的抗過敏用組合物對花粉病、特異性皮炎、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、支氣管哮喘等環(huán)境過敏發(fā)揮特殊效力。此外，本發(fā)明中的乳酸菌，除具有上述抗過敏作用之外，還同時具備大多數(shù)乳酸菌所具有的調(diào)整腸道作用、降低膽固醇作用、降壓作用等傳統(tǒng)已知的益生菌功能。已確認本發(fā)明有效成分乳酸菌之一的KW3110株，除具有強力抗過敏、免疫刺激活性之外，還有很好的腸道細胞粘附性、對胃酸、膽汁酸的耐受性，再者，從前述的益生菌功能方面考慮，其效果也是令人期待的。
(本發(fā)明的抗過敏用組合物的施用)本發(fā)明的抗過敏用組合物，是將本發(fā)明的有效成分與生理學上許可的載體、賦形劑、結(jié)合劑、希釋劑等混合，制劑化后，作為抗過敏劑應(yīng)用的。本發(fā)明的抗過敏劑，可經(jīng)口或非經(jīng)口施用。作為經(jīng)口服用的制劑，可列舉顆粒劑、粉劑、片劑(包括糖衣片劑)、丸劑、膠囊劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑。作為非經(jīng)口制劑，可列舉注射劑(例如，皮下注射劑、靜脈內(nèi)注射劑、肌肉內(nèi)注射劑、腹腔內(nèi)注射劑)、點滴劑、外用劑(例如，經(jīng)鼻施用制劑、經(jīng)皮制劑、軟膏劑)、栓劑(例如，直腸栓劑、陰道栓劑)。這些制劑，可通過應(yīng)用該領(lǐng)域中通常應(yīng)用的手段，添加藥學上許可的賦形劑、添加劑進行制劑化。進行制劑化時，為了使本發(fā)明的抗過敏組合物能在生物體內(nèi)適時且有效地發(fā)揮其功能，優(yōu)選控制開始溶出的時間、添加作為苦味掩蔽劑的功能、提高對氧和濕度的穩(wěn)定性的形式，例如專利3349677中所述的用以酵母細胞壁為主成分的包被劑進行包被的包被處理物，和按照常規(guī)方法在軟膠囊和硬膠囊中進行膠囊化而得的膠囊劑，在醫(yī)藥制劑和健康食品等可優(yōu)選應(yīng)用。作為藥學上許可的賦形劑和添加劑，可列舉載體、結(jié)合劑、香料、緩沖劑、增粘劑、著色劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、分散劑、懸浮化劑、防腐劑等。作為藥學上許可的載體，包括，例如碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、砂糖、乳糖、膠質(zhì)、糊精、淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低融點石蠟、可可脂等。
制劑可如下制備。即，經(jīng)口劑，作為有效成分，可添加，例如賦形劑(例如、乳糖、白糖、淀粉、甘露醇)、分解劑(例如、碳酸鈣、羧甲基纖維素鈣)、結(jié)合劑(例如、α-淀粉、阿拉伯樹膠、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素)或潤滑劑(例如、滑石、硬脂酸鎂、聚乙二醇6000)、壓縮成形，然后根據(jù)需要，為了掩蔽味道、腸溶性或持續(xù)性等目的，可用公知的方法，通過包被等進行制備。作為包被劑，可應(yīng)用，例如乙基纖維素、羥甲基纖維素、聚乙二醇、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羥丙鄰苯二甲酸纖維素及eudragit(Rhom德國公司制、甲基丙稀酸丙稀酸共聚物)等。
注射劑的制備是，可將有效成分與分散劑(例如、吐溫(Tween)80(Atlas Powder公司制、美國)、HCO60(Nikko Chemicals公司制)、聚乙二醇、羧甲基纖維素、藻酸鈉等)、防腐劑(例如、羥苯甲酯、羥苯丙酯、苯甲醇、氯丁醇、苯酚)、等滲劑(例如、氯化鈉、丙三醇、山梨糖醇、葡萄糖、轉(zhuǎn)化糖)一起溶解、混懸到水性溶劑(例如、蒸餾水、生理鹽水、Ringer溶液等)或油性溶劑(例如、橄欖油、芝麻油、棉子油、玉米油等植物油、丙稀醇)等中進行乳化。此時，根據(jù)所希望的添加溶解輔助劑(例如、水楊酸鈉、醋酸鈉)、穩(wěn)定劑(例如、人血清白蛋白)、無痛化劑(例如、氯化卞烷銨、鹽酸普魯卡因)等添加物。
外用劑的制備，可將有效成分制備成固體狀、半固體狀或液狀的組合物。例如、上述固體狀組合物的制備是，將有效成分直接、或添加賦形劑(例如、乳糖、甘露醇、淀粉、微結(jié)晶纖維素、白糖)、增粘劑(例如、天然樹膠類、纖維素衍生物、丙烯酸聚合物)等，混合，制成粉狀。上述液狀組合物的制備可與注射劑時同樣。半固體狀的組合物可是水性或油性的膠劑、或油膏狀。另外，這些組合物均可包括pH調(diào)節(jié)劑(例如、碳酸、磷酸、檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉)、防腐劑(例如、對羥基苯甲酸丙酯、氯丁醇、氯卞烷銨)等。栓劑，可將有效成分制備成油性或水性的固體狀、半固體狀或液狀的組合物。該組合物中所用的油性基質(zhì)包括，例如高級脂肪酸的甘油酯〔例如、可可脂、ウイテプヅル類(Dynamit Nobel公司制)〕、中級脂肪酸〔例如、Migliores類(Dynamit Nobel公司制)〕、或植物油(例如、芝麻油、大豆油、棉子油)。水性基劑包括聚乙二醇類、丙乙二醇。另外，作為水性膠質(zhì)基劑，包括天然膠類、纖維素衍生物、乙烯基聚合物、丙烯酸聚合物。
(配合飲食品的利用)本發(fā)明的抗過敏用組合物可配合飲食品作為具有抗過敏功能的飲食品應(yīng)用。將本發(fā)明的抗過敏用組合物配合飲食品應(yīng)用時，可在飲食品的制造原料階段或制造出產(chǎn)品階段等添加、配合該有效成分的有效量。這里所述的“有效成分的有效量”是指，對于不同的飲食品，當攝取常規(guī)飲食量時，所攝取的有效成分的含量在下述范圍內(nèi)。
也就是說，本發(fā)明中有效成分在飲食品中的有效量的施用量或攝取量的確定有賴于受試者、受試者的年齡及體重、癥狀、施用時間、劑形、施用方法、藥劑的組合等。例如，當本發(fā)明的有效成分作為藥品經(jīng)口施用時，每個成人0.1～100mg/kg體重(優(yōu)選1～10mg/kg體重)，非經(jīng)口施用時0.01～10mg/kg體重(優(yōu)選0.1～1mg/kg體重)，一日分1～3次施用。與本發(fā)明的有效成分聯(lián)合應(yīng)用的具有其它作用機制的藥劑，也要以其臨床上的用量為基準，適當選擇。
當用乳酸菌的菌數(shù)表示本發(fā)明的有效成分在飲食品中的有效量的施用量或攝取量時，優(yōu)選每日的攝取量為5×109個以上，更優(yōu)選每日1×1010個以上、最優(yōu)選5×1010個以上。因而，要根據(jù)通常每日攝取的飲食品的量，確定各食品中所含有的乳酸菌的菌數(shù)。例如、作為食品(酸奶)攝取時，成人1人每日的攝取量為50～500g、優(yōu)選60～200g的范圍，可根據(jù)這樣的攝取量將本發(fā)明的有效成分配合到食品中。
本發(fā)明中，本發(fā)明的抗過敏用組合物的有效成分可直接或以上述制劑的形式配合到食品中。更具體而言，本發(fā)明的飲食品可采用多種多樣的利用形式可將本發(fā)明的有效成分與適宜原料配合，直接作為飲食品進行制備，或再配合各種蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、微量元素、維生素類等，制備成液狀、半液體狀或固體狀，此外也可添加、配合到一般的飲食品中。
目前，在利用乳酸菌的飲食品的領(lǐng)域中，根據(jù)其實用方案分類，可大致分為乳制品類、肉類、面包類、飲料、及蔬菜類。通過應(yīng)用本發(fā)明的有高抗過敏活性的乳酸菌作為這些利用乳酸菌的飲食品制造中的乳酸菌或其一部分，或作為制造出的飲食品的添加物，可賦予該飲食品抗過敏功能。
作為本發(fā)明的其它實施方案，當有效成分乳酸菌添加到飲食品中時，不必要考慮乳酸菌自身的發(fā)酵，且想保持飲食品自身的香味時，特別優(yōu)選通過例如加熱殺菌等處理對乳酸菌進行殺菌。另外，本發(fā)明的具有高抗過敏功能的飲食品，為了防止其它微生物和異物混入、保持內(nèi)容物的品質(zhì)，優(yōu)選將飲食品病人裝入密封容器中。
作為本發(fā)明的食品，可制備成保持抗過敏功能的健康食品、功能性食品、特定保健用食品、或病人用食品。另外，對食品的形式無特殊限定，也可以是保持抗過敏功能的飲料。由于本發(fā)明的有效成分具有抗過敏作用，所以通過將本發(fā)明的有效成分配合到日常攝取的食品中和作為補充而攝取的健康食品和功能性食品等中，即可提供可連續(xù)攝取、同時保持預防及治療過敏發(fā)生功能的食品。通過將本發(fā)明的有高抗過敏活性的乳酸菌配合到其中不含引發(fā)過敏成分的飲食品中，例如、茶類和飲劑或藥片等，即可提供完全避免了過敏問題的具有抗過敏功能的飲食品。另外，本發(fā)明中，用本發(fā)明的有高抗過敏活性的乳酸菌部分或全部代替用乳酸菌制造的或含乳酸菌的飲料或食品中的乳酸菌，即可得到具有高抗過敏功能的飲料或食品。
(飲食品制劑形式中的利用)本發(fā)明中，作為配合本發(fā)明的有高抗過敏活性乳酸菌的健康食品及功能性食品，可有各種各樣的示例，與這些健康食品及功能性食品的制造相關(guān)的，除常用的食品素材、食品添加物之外，可在應(yīng)用賦形劑、增量劑、結(jié)合劑、分解劑、潤滑劑、分散劑、保存劑、濕潤化劑、溶解輔助劑、防腐劑、穩(wěn)定化材料、膠囊基劑等輔助劑的飲食品制劑形態(tài)中利用。該輔助劑的具體例示，包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明膠、碳酸鎂、合成硅酸鎂、滑石、硬脂酸鎂、碳酸鈣、甲基纖維素、羧甲基纖維素、或其鹽、阿拉伯膠、聚乙二醇、糖漿、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、檸檬酸、氯化鈉、亞硫酸鈉、磷酸鈉、支鏈淀粉、角叉菜膠、糊精、還原巴拉金糖(palatinose)、山梨糖醇、木糖醇、stevia、合成甜味料、檸檬酸、維生素C、酸味料、碳酸氫鈉、蔗糖酯、植物硬化油脂、氯化鉀、紅花油、蜂蠟、大豆卵磷脂、香料等。與這些健康食品、功能性食品的制備相關(guān)的，可參考藥品制劑的參考書，例如“Practical guide of Japanese Pharmacopoeia(General rule onformulation)”(Hirokawa Shoten)等。
本發(fā)明中，特別與健康食品及功能性食品相適合的形狀有，片狀、膠囊狀、顆粒狀、粉末狀、懸浮液狀、乳化液狀等，從本發(fā)明要解決的課題考慮，優(yōu)選配合本發(fā)明的有高抗過敏活性的乳酸菌的健康食品及功能性食品，聯(lián)合應(yīng)用了不含特定過敏原的原材料。
具體例示片狀健康食品及功能性食品的制造法，包括可將配合了本發(fā)明的有高抗過敏活性的乳酸菌的物質(zhì)壓成一定形狀，或?qū)⒂盟蛞掖嫉热軇駶櫫说幕旌衔锕嘧⒌骄哂幸欢ㄐ螤畹哪＞咧?，使之成型。具體例示膠囊狀健康食品及功能性食品的制造法，包括將配合了本發(fā)明的有高抗過敏活性的乳酸菌的物質(zhì)，以液狀、懸浮狀、糊狀、粉末狀或顆粒狀形態(tài)填充到膠囊中，或用膠囊基劑如硬膠囊劑及軟膠囊劑等被包成型。
(向食品中的配合)另外，本發(fā)明中可通過將本發(fā)明的有高抗過敏活性的乳酸菌配合到食品中而制備成持有抗過敏功能食品。具體而言，這樣的食品多種多樣，包括例如布丁、小甜餅、餅干、薯條、小點心、面包、蛋糕、巧克力、油炸圈餅、果凍等西點，煎餅、羊羹、大福(daifuku)、おはぎ、以及饅頭、蛋糕等日本點心，冷點心(糖果等)、口香糖等面包、菓子類和、切面、蕎麥面條、扁面條等的面類和魚糕、火腿、魚肉香腸等的魚肉制品和、火腿、香腸、牛肉餅、牛肉罐頭等的肉類食品和鹽、胡椒、豆醬、大豆醬油、醬油、調(diào)味品、蛋黃醬、番茄醬、甜味佐料、辛味佐料等的調(diào)味類和軟章魚球(akashiyaki)、章魚球(takoyaki)、半熟的黑縐綢樣薄烤餅(monjayaki)開胃薄煎餅(okonomiyaki)等燒烤食品和奶酪、硬型酸奶等的乳制品和發(fā)酵豆、壓制豆腐、豆腐、山藥糊、泡菜飯團、魚醬、餃子、燒麥、炸肉餅、三明治、比薩餅、漢堡包、色拉等各種制品和各種粉末(牛肉、豬肉、雞肉等畜產(chǎn)物，蝦、扇貝、蛤、海帶等水產(chǎn)物，蔬菜水果類，植物、酵母、藻類等)和油脂類、香料類(香草、柑橘類、鰹魚等)的粉末固體制品和粉末飲食品(速溶咖啡、速溶紅茶、速溶奶粉、速溶湯粉、日本豆醬湯等)等各種食品，但并不限定于此。
特別地，乳制品中含有本發(fā)明的有效成分時，將本發(fā)明的有效成分以活菌形式加入到乳原料中，使菌增殖/發(fā)酵，可制成酸奶等發(fā)酵乳酸菌飲食品。
(向飲料中的配合)本發(fā)明的高抗過敏活性的組合物，特別是以飲料形式應(yīng)用，可提供可每日連續(xù)攝取的具有抗過敏功能的飲料，且在連續(xù)攝取的可能攝入量范圍內(nèi)發(fā)揮功效。飲料中配合本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌時，為了制備保持飲料自身香味和穩(wěn)定性的飲料，優(yōu)選應(yīng)用加熱殺菌形式的乳酸菌。
飲料中配合本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌時，可適當決定乳酸菌的配合量，但通常采用的配合量是，作為飲料可連續(xù)攝取的攝入量范圍內(nèi)能充分發(fā)揮乳酸菌的抗過敏活性。用乳酸菌的菌數(shù)表示本發(fā)明有效成分在飲食品中的有效量的施用量或攝取量，優(yōu)選每日的攝取量為5×109個以上，更優(yōu)選每日1×1010個以上，最優(yōu)選5×1010個以上。因此，通常依照每日攝取的飲料量，按照上述指標可確定出各種飲料中所含有的乳酸菌的菌數(shù)。例如，若每日攝取100g飲料，則優(yōu)選每100g飲料中添加109個以上的菌。另一方面，考慮到乳酸菌的添加不破壞飲料的香味和外觀，優(yōu)選其用量在1011個以下。更優(yōu)選5×1010個以下。因此，作為具有抗過敏功能且穩(wěn)定性好，口味、保存性高的飲料的乳酸菌濃度，特別優(yōu)選每100g飲料，109～1011個。乳酸菌菌體數(shù)與干菌重量的關(guān)系是，例如、對于類干酪乳桿菌KW3110株而言，菌體數(shù)為1012個時，相當于1g干菌的重量。
本發(fā)明中，配合本發(fā)明的有高抗過敏活性的乳酸菌的飲料各種各樣，制備這些飲料時，可使用通常的飲料處方設(shè)計中所應(yīng)用的糖類、香料、果汁、食品添加物等任一種。關(guān)于飲料的制造，可參考已有的參考書，例如“Revised new editionsoft drinks”(Kohrin)等。
本發(fā)明中，從抗過敏作用及制品的保存、安定化考慮，作為特別適于配合的飲料，優(yōu)選不含乳成分，即，優(yōu)選例如含果汁的清涼飲料或茶飲料等不含乳成分的飲料。
配合的飲料的具體例示包括，酒精飲料(威士忌酒、波旁酒、烈性酒、利口酒、葡萄酒、果酒、黃酒(清酒)、中國酒、白酒、啤酒、酒精度數(shù)1％以下的非酒精啤酒、發(fā)泡酒、充二氧化碳的白酒等)和非酒精飲料(飲用型酸奶、蘋果、蜜桔、葡萄、香蕉、梨、李子、西瓜等果汁，土豆、胡蘿卜、芹菜、黃瓜等蔬菜汁、清涼飲料、牛乳、豆乳、咖啡、可可粉、紅茶、綠茶、麥茶、糙米茶、煎茶、玉露茶、焙烤茶、烏龍茶、姜黃茶、紅茶、Rooibos茶、玫瑰茶、菊花茶、薄荷茶、茉莉花茶等的各種藥草茶、運動飲料、礦泉水、營養(yǎng)飲料等)等各種飲料。
根據(jù)飲料類別進行例示的話，可列舉綠茶、烏龍茶、紅茶、麥茶、混合茶等茶系飲料和咖啡、果汁飲料、蔬菜飲料、運動飲料、營養(yǎng)飲料等。
本發(fā)明中，將具有抗過敏功能的飲料產(chǎn)品化時，可依照食品衛(wèi)生法規(guī)定的方法，對飲料進行適當?shù)臍⒕?。至于殺菌方法，可根?jù)飲料的pH，使用巴斯德殺菌、熱裝殺菌、UHT殺菌、蒸餾瓶殺菌等方法。
此外，至于產(chǎn)品形式，特別優(yōu)選常規(guī)產(chǎn)品形式中使用的密封容器形式，至于密封容器，可用罐、瓶、PET、紙容器任一種形式。另外，對于體積無特殊限制，通常從消費者對飲料的日常攝取量和、配合的乳酸菌的菌數(shù)和1日的必要菌數(shù)考慮，適當確定。
以下，通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明并不限定于此。
實施例1(本發(fā)明的實施例中應(yīng)用的乳酸菌)本發(fā)明的實施例中應(yīng)用的乳酸菌及獲得如

圖1(No.1)及圖2(No.2)所示。本發(fā)明中所有的菌株均以KW開頭的序號標識。這些試驗株有的是獨自分離的，有的是商品化的乳制品中使用的，有的從公共機關(guān)獲得的，為了方便，統(tǒng)一了其識別名稱。各KW株與獲得來源間的關(guān)系如圖1(No.1)及圖2(No.2)。圖1的“獲得地”中，“JCM”代表Japan Collection of Microorganisms，“IFO”代表前財團法人發(fā)酵研究所(現(xiàn)在的獨立行政法人制品評價技術(shù)機構(gòu)生物資源中心(NBRC))。
實施例2(乳酸菌群體外抗過敏活性的評價)1.樣品在M.R.S.(de Man，Rogosa，Sharpe)培養(yǎng)基(OXOID)中培養(yǎng)乳酸菌的各菌株48小時，用滅菌水洗滌3次，懸浮到滅菌水中后，100℃處理30分鐘，殺菌。將之冷凍干燥，懸浮到PBS中。所使用的乳酸菌參照圖1(No.1)及圖2(No.2)。
2.實驗動物、飼養(yǎng)在第0天和第6天，給7-10周齡BALB/c小鼠(Charles River)腹腔內(nèi)注射卵清蛋白(OVA)1mg和佐劑Alum 2mg。第13天解剖，分離脾臟，制備淋巴細胞。實驗中，n＝6。
3.脾細胞IL-4、IL-12的測定用OptEIA ELISA Set(Becton Dickinson)進行IL-4、IL-12的測定。
4.實驗條件用RPMI1640(SIGMA)+10％FCS(Rosche)+1mg OVA培養(yǎng)基培養(yǎng)“2.實驗動物、飼養(yǎng)”的方法中制備的脾臟淋巴細胞，混懸成2.5×106細胞/ml濃度。再添加0.1或1μg/ml的待試驗的乳酸菌。1周后，回收培養(yǎng)上清，分別檢測Th1型細胞因子IL-12和Th2型細胞因子IL-4。
5.實驗結(jié)果各乳酸菌產(chǎn)生的Th1型細胞因子IL-12量如圖3及表2所示。乳酸菌的添加量為1μg/ml?？梢钥吹疆a(chǎn)量因菌株而異。大約100株菌中，顯示最強Th1誘導能力的為類干酪乳桿菌KW3110株。數(shù)據(jù)都是以KW3110株產(chǎn)生的IL-12產(chǎn)量為100％時的比率表示。為了方便，把產(chǎn)量為KW3110株75％以上的評為A，50％以上～不到75％評為B，25％以上～不到50％評為C，10％以上～不到25％評為D，不到10％的評為E。
各乳酸菌產(chǎn)生的成為過敏原因的Th2型細胞因子IL-4的生成量如圖4及表2所示。乳酸菌的添加量為0.1μg/ml。其抑制效果因菌株而異。約100株中顯示最強的Th2抑制能力的為類干酪乳桿菌KW3110株。數(shù)據(jù)全是以對照(未添加乳酸菌)的IL-4產(chǎn)量為100％時的比率表示。為了方便，將產(chǎn)量為不到對照的30％的評為A，30％以上～50％的評為B，50％以上～不到70％評為C，70％以上～不到100％評為D，100％以上評為E?！翱惯^敏乳酸菌評價結(jié)果”如表1及表2所示，表中總結(jié)了Th1、Th2各自的參數(shù)A～E。
(表1)

(表2)

將Th1參數(shù)為KW3110株的60％以上、Th2參數(shù)為對照的50％以下的菌株作為抗過敏乳酸菌，這樣的菌株有KW3110株、T株、NRIC1917株、JCM8132、JCM1149株共5株。另外，將為KW3110株的75％以上顯示強大的Th1誘導能力的菌株作為免疫激活乳酸菌，這樣的菌株有KW3110株、KW4510株、JCM1149株、T株、NRIC1917株、JCM1059株，共6株。這樣，用本說明書所述的方法可制備免疫激活用組合物(藥品、飲食品)，其中的乳酸菌是具有與KW3110株等同免疫激活活性的乳酸菌，或者具有與KW4510株、JCM1149株、NRIC1917株、JCM1059株等同或其以上免疫激活活性的乳酸菌。此外，作為抗過敏乳酸菌而知的嗜酸乳桿菌L-92株，其IL-12的產(chǎn)量為KW3110株的11.7％左右，對于IL-4的抑制活性，KW3110株為對照(無添加)的26.4％，與此相對L-92株為對照的74.6％，這提示無論哪個參數(shù)，與KW3110株這樣強的抗過敏乳酸菌相比，均呈現(xiàn)絕對的劣勢(圖5)。本發(fā)明的乳酸菌株及對照乳酸菌株的抗過敏活性的測定結(jié)果如表3所示。
(表3)

實施例3(衍生株的選擇)本實施例是從本發(fā)明獲得的乳酸菌株KW3110株衍生出的菌株中選擇具有抗過敏活性的菌株的例子。在MRS培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)KW3110株，直到其OD600值為0.8～1.0。
用新鮮的MRS培養(yǎng)基將培養(yǎng)液稀釋成OD600＝0.5后，將本菌體懸浮液以10％的比例懸浮到用鹽酸將pH調(diào)為3.0的PBS(以指定的濃度溶解Dainippoin Pharmacutical制的藥片)中、37℃培養(yǎng)3小時。用PBS希釋經(jīng)酸處理的菌體懸浮液，轉(zhuǎn)入MRS平板培養(yǎng)基中，使之形成菌落?？梢钥吹剿纬傻木渲杏猩木洹＿x擇該菌落，用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。將該菌株命名為No.90株。用實施例2的方法測定No.90株的抗過敏活性。與野生株比較，No.90株產(chǎn)生IL-12的能力與之相同(圖6)。圖中“比活性(％)”是以KW3110株的IL-12產(chǎn)生能力為100時，衍生株(No.90)的IL-12產(chǎn)生能力。No.90株以FERM BP-08635保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所特許生物保藏中心。
實施例4(體外高抗過敏活性株KW3110株的體內(nèi)評價)1.施用樣品用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)類干酪乳桿菌KW3110株48小時，用滅菌水洗滌3次，懸浮到滅菌水中后100℃、處理30分，殺菌。將之冷凍干燥，按一只小鼠1日攝取1mg的量混合到標準粉末飼料AIN93(按照美國國立營養(yǎng)研究中心的標準組合物)，作成混合飼料。
2.實驗動物、飼養(yǎng)用8周齡BALB/c。1組6只BALB/c小鼠，讓小鼠自由攝取CE-2(日本CLEA)及水，馴化飼養(yǎng)1周。第0天抗原致敏后，對照組用使用純化原料制作的AIN93粉末飼料飼養(yǎng)，KW3110組用向AIN93中混合了KW3110菌的混合飼料飼養(yǎng)。
3.血中IgE、脾細胞IL-4、IL-12的測定用OptEIA ELISA Set(Becton Dickinson)進行IgE、IL-4、IL-12的測定。
4.實驗條件作為實驗組，設(shè)立對照組(AIN93)、向AIN93中添加KW3110株，1mg/只鼠/天的KW3110組。對照組、KW3110組每天給用水調(diào)成糊狀粉末飼料4g直至實驗終了(第98天)。飲水是自由攝取。用卵清蛋白(OVA)的過敏致敏是用100μg OVA和佐劑Alum 2mg一起，于第0、14、42、70、94天共腹腔注射5次。此間，每間隔1周從眼底靜脈取血。實驗終了時取全血并取脾、制備淋巴細胞(圖7)。用RPMI1640(SIGMA)+10％FCS(Rosche)+100μg OVA培養(yǎng)基，37℃、5％CO2的條件下將脾臟淋巴細胞培養(yǎng)1周，回收培養(yǎng)上清。對血液樣品進行IgE量的測定，對脾臟淋巴細胞培養(yǎng)上清樣品進行IL-4、IL-12的測定。
5.實驗結(jié)果98日間的實驗期間中血中IgE的變動如圖8所示。圖中顯示第48天時，與對照組相比KW3110組血中IgE顯著性降低，p＜0.05。第48天及解剖時第98天的血中IgE用斑點顯示于圖9中。圖中顯示第98天同樣與對照組相比KW3110組血中IgE顯著性降低。對照組、KW3110組的98日解剖時脾細胞培養(yǎng)上清中IL-12產(chǎn)量如圖10所示，IL-4產(chǎn)量如圖11所示。與對照組相比KW3110組IL-12產(chǎn)量顯著性增高。對于IL-4沒有顯著性差異，與對照組相比有降低趨勢。以上結(jié)果提示，通過攝取KW3110株可使體內(nèi)的免疫平衡向Th1轉(zhuǎn)換，改善過敏狀態(tài)。另外，如圖12所示，第30天時，對照組無一例外鼻周邊出現(xiàn)脫毛，而KW3110組中無一例外未引起脫毛。此時對照組中可觀察到頻繁的抓鼻行為。第60天前后，KW3110組與對照組同樣可觀察到鼻周邊的脫毛及抓鼻行為。抓鼻行為的觀察結(jié)果提示實際上KW3110組抑制了過敏癥狀。
實施例5(與公知的抗過敏乳酸菌、KW4610株(L.rhamnosus LGG株)的比較)1.施用樣品用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)KW3110株、KW4610株48小時，用滅菌水洗滌3次，懸浮到滅菌水中后100℃、處理30分，殺菌。冷凍干燥，按一只小鼠1日攝取1～10mg的量混合到標準粉末飼料AIN93(按照美國國立營養(yǎng)研究中心的標準組合物)，作成混合飼料。
2.實驗動物、飼養(yǎng)用8周齡BALB/c。1組6只BALB/c小鼠，讓小鼠自由攝取CE-2(日本CLEA)及水，馴化飼養(yǎng)1周。從抗原致敏21天前攝取KW3110株、KW4610株的混合飼料或AIN93粉末飼料。
3.血中IgE的測定用OptEIA ELISA Set(Becton Dickinson)進行IgE的測定。
4.實驗條件實驗組設(shè)立對照組(AIN93)、以10mg/只鼠/天向AIN93中添加KW3110株或KW4610株的KW3110組、KW4610組。每天給予對照組、KW3110組、KW4610組用水調(diào)成糊狀粉末飼料4g直至實驗終了(第133天)。飲水是自由攝取。用卵清蛋白(OVA)的過敏致敏是用100μg OVA和佐劑Alum2mg一起，于第0、14、42、70、98、126天共腹腔注射6次。此間，每間隔1周從眼底靜脈取血(圖13)。對血液樣品進行IgE量的測定。
5.實驗結(jié)果試驗期間中血中IgE量的變動如圖14所示，施用OVA5次、6次后每個個體血中IgE量用斑點表示，如圖15所示?？梢源_認，隨著用OVA抗原致敏，血中IgE水平在所有的組中均上升，但與對照組相比，KW3110組在OVA施用5次后血中IgE量顯著性下降。另一方面、與對照組相比，KW4610組血中IgE量未觀察到顯著性下降，這提示KW3110株的抗過敏活性更強。另外，提示10mg攝取組比1mg攝取組IgE降低效果更強。
實施例6(乳酸菌的耐酸性及膽汁酸耐性)由于乳酸菌活著到達腸道才能發(fā)揮益生菌效果，所以有必要耐受胃酸、膽汁酸等消化液。為了驗證KW3110株是否滿足這樣的條件，體外測定耐酸性及膽汁酸耐性。
1.方法耐酸性的測定是，將乳酸菌培養(yǎng)到對數(shù)增殖期后，用PBS(pH6.5)調(diào)成OD600＝0.5，向菌體中添加1/10量的用鹽酸調(diào)成pH3.0的MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后1小時、2小時、3小時取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基測定活菌率。
2.實驗結(jié)果膽汁酸耐性的測定是，向MRS液體培養(yǎng)基中添加終濃度2％的膽汁酸(OXOID 社 Bile Salts)，接種1％的KW3110株預培養(yǎng)液，用Oriental Instruments公司的BIOPLOTTER測定OD630，以此來測定生長速度。
所有實驗中均用德氏乳桿菌的標準株KW3317株(JCM1012株)作對照。結(jié)果提示，耐酸性試驗(圖16)中3小時有約50％的KW3110株生存。另外，膽汁酸耐性試驗(圖17)中，即便用含2％膽汁酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)，KW3110株也充分生長發(fā)育，提示它對膽汁酸有耐性。另一方面，提示KW3317株對酸、膽汁酸任一種的耐性均低。
實施例7(乳酸菌的腸道粘附性)由于乳酸菌活著到達腸道才能發(fā)揮益生菌效果，所以有必要逗留在腸道。作為乳酸菌逗留在腸道，充分發(fā)揮其效果的指標，人們常經(jīng)常應(yīng)用體外對人腸道來源的細胞系Caco-2的粘附性試驗。于是測定KW3110株對Caco-2細胞粘附能力。
1.方法按照Coconnier等的方法(Applied and EnvironmentalMicrobiology，Vol.58，p.2034，1992)進行Caco-2細胞的培養(yǎng)。在載玻片上培養(yǎng)1.2×104個/cm2的Caco-2細胞大約1～2周，直到鋪滿后。用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)KW3110株，37℃、培養(yǎng)2晚，收集菌株，用PBS洗滌1次后，用PBS調(diào)成OD600＝1.0。在制備的KW3110液2ml中，浸入培養(yǎng)Caco-2細胞的載玻片，37℃、10％二氧化碳存在下接觸1小時，其后用DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基將載玻片洗滌3次。接著用甲醇固定載玻片，用革蘭氏染色法(Medical Technology，Vol.23，p.205，1995)對KW3110株進行染色。顯微鏡下計數(shù)粘附到Caco-2細胞的乳酸菌數(shù)，每4個視野的平均值作為粘附數(shù)。另外，對15株干酪乳桿菌進行了同樣的檢測，類干酪乳桿菌包括KW3913株(JCM8130株)及KW3115株(JCM1134株)為標準株。
2.實驗結(jié)果各乳酸菌對Caco-2細胞的粘附能力的試驗結(jié)果如表3所示。0uwehand等報道了類干酪乳桿菌、干酪乳桿菌對Caco-2細胞的粘附能力低(Food microbiology and safety，vol.66，p.856，2001)，這次的實驗證明KW3110株以外的株粘附能力低。但是，KW3110株在類干酪乳桿菌、干酪乳桿菌菌中，有顯著高的Caco-2細胞粘附能力，提示是一株可期待具有良好益生菌效果的菌株。
(表4)


實施例8(KW3110株對花粉抗原的花粉病·氣道炎癥的改善效果)1.實驗方法(動物種類)購入BDF1雌性小鼠4周齡(Charles River)。
(實驗組)實驗A通過點鼻進行抗原致敏(花粉病模型)對照組施用標準飼料(AIN-76base)的組別KW組施用KW 1mg/小鼠(1mg KW3110/3gAIN-76base)的組別實驗B用噴霧器進行抗原致敏(氣道炎癥模型)對照組施用標準飼料(AIN-76base)的組別KW組施用KW 1mg/小鼠(1mg KW3110/3gAIN-76base)的組別(試劑·儀器)雪松花粉提取物CP(LSL公司)ALUM(Sigma公司)超音波式噴霧器XE-U12(OMRON公司)細胞離心機Cytospin4(ThermoBioAnalysis公司)(評價方法)實驗A
購入BDF-1小鼠后馴化1周，將眼球采血所得的血漿按血中總IgE濃度分組(n＝7)。分組后開始施用實驗食物。從分組后第3周開始腹腔內(nèi)施用CP+ALUM溶液(CP 10μg+ALUM 2mg/小鼠)，周1次/3周。從第3次CP+ALUM溶液施用后第2周開始給小鼠兩鼻點CP溶液(1mg/mI)，每次10μl。另外，還設(shè)定未刺激模型(Basal)小鼠，點鼻時使用生理鹽水。點鼻實施5日，數(shù)點鼻后5分鐘的噴嚏次數(shù)(第1、3、5天)和鼻部搔抓次數(shù)(第3、5天)。
實驗B購入BDF-1小鼠后馴化1周，將眼球采血所得的血漿按血中總IgE濃度分組(n＝7)。分組后開始施用實驗食物。從分組后第3周開始腹腔內(nèi)施用CP+ALUM溶液(CP 10μg+ALUM 2mg/小鼠)，每周1次/3周。從第3次CP+ALUM溶液施用后第2周開始在密閉容器內(nèi)用噴霧器給小鼠噴CP溶液(40μg/ml)，噴15分鐘。另外，設(shè)定未刺激模型(Basal)，給小鼠噴霧生理鹽水。噴霧實施5天。另外，分別在CP腹腔內(nèi)施用時(第0天)、噴霧器開始時(第35天)、解剖時(第40天)進行眼球取血，測定血中總IgE濃度。第5天，麻醉下收集支氣管肺胞洗滌液(BALF)，BALF中的細胞計數(shù)，鑒定BALF中的細胞，測定BALF中的細胞因子。BALF的獲得是，麻醉下切開小鼠頸部，進行氣管插管，用加入0.1％BSA的鹽水Saline0.7ml×3次(共2.1ml)洗滌。離心后收集上清及細胞，計數(shù)細胞數(shù)。還制備圖片標本，通過亮吉姆薩染色鑒定細胞。
2.實驗結(jié)果(實驗A)關(guān)于點鼻后5分鐘噴嚏的次數(shù)，考慮到物理刺激的影響，分為點鼻后0～1分、1～5分，對總次數(shù)進行評價。結(jié)果，與用生理鹽水點鼻幾乎無噴嚏癥狀相對，對照組因反復用抗原點鼻噴嚏頻度增加。另一方面、KW組中觀察到抑制噴嚏癥狀的傾向(圖18a、b、c)。
另外，關(guān)于鼻部搔抓行為，以點鼻后5分鐘的連續(xù)搔抓行為為1點(總點數(shù))。另外，還分為輕度搔抓(連續(xù)1～4次的搔抓行動)和重度搔抓(連續(xù)5次以上的搔抓行動)進行點評價。與對照組相比，KW組能抑制搔抓行動，可以看到對5第天的輕度搔抓點數(shù)有顯著性抑制(圖19a、b)。
(實驗B)與對照組相比，噴霧前及解剖時KW組可顯著性抑制血中總IgE濃度的上升(圖20)。BALF中的細胞的種類通常是單核細胞，以巨噬細胞為主。但是，經(jīng)抗原刺激后，對照組的BALF中嗜酸性細胞占65％左右，單核細胞的比率減少。另一方面，與對照組相比，KW組中可觀察到抑制嗜酸性細胞％上升的傾向(圖21A)。另外，與對照組相比，KW組中同樣可觀察到抑制嗜酸性細胞局所浸潤的傾向(圖21b)。
另外，測定BALF上清中的細胞因子時顯示與對照組相比，KW組中IL-5的值低，IL-5是Th2型細胞因子，參與嗜酸性細胞的增殖、分化(圖22)。
以上的結(jié)果提示，通過攝取KW3110，可抑制因雪松花粉抗原引發(fā)的噴嚏、搔抓行動，這些癥狀與速發(fā)型過敏中花粉病的臨床癥狀相近。另外發(fā)現(xiàn)，KW3110通過抑制IgE上升而抑制針對因抗原暴露而引發(fā)氣道炎癥產(chǎn)生的IL-5，還抑制嗜酸性細胞的浸潤。IL-5與氣道炎癥、嗜酸性細胞的關(guān)系在J.Allergy Clin.Immunol 88(6)935-942，1991中有述，這提示施用KW3110對以氣道炎癥為主要癥狀的過敏性哮喘有效。
實施例9(KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果)應(yīng)用涂抹三硝基氯苯的特異性皮炎模型驗證KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果。(引用文獻·應(yīng)用藥理59(6)123-134，2000)1.實驗方法(動物種類)購買NC/Ng a TndCyj小鼠雄性5周齡(Charles River)(實驗組)對照組施用標準飼料(AIN-76base)11周KW1mg-11wk組施用1mg KW3110/3g AIN-76base11周KW10mg-11wk組施用10mg KW3110/3g AIN-76base11周KW1mg-8wk組施用標準飼料3周后，施用1mg KW3110/3gAIN-76base8周(試劑)
三硝基氯苯PCI(東京化成工業(yè))致敏用溶液5％溶液(乙醇∶丙酮＝4∶1)腹部···100μl，后肢部···兩足25μl攻擊用溶液0.8％溶液(橄欖油)外耳部···兩面·兩耳各10μl(共40μl)，背皮部···50μl(評價方法)購入NC/Nga小鼠后馴化1周，根據(jù)眼球采血所得血清中總IgE濃度進行分組(n＝10)。分組、施用實驗食物3周后，將PCl致敏用溶液涂到脫毛了的腹部和后肢部兩側(cè)，1周后進行攻擊，攻擊時將攻擊用溶液涂到兩外耳部、兩面及脫毛了的背皮部。攻擊每2周進行一次，共進行77次。另外，為了確認攻擊用溶液溶劑未引起耳闊肥厚，在涂布橄欖油后于0、1、4、24、72、96、120、144、168小時用刻度厚度計量器(dial thickness gage)測定耳闊肥厚度。再在第1，3次攻擊后，同樣于0、1、4、24、72、96、120、144、168h用刻度厚度計量器測定耳闊肥厚度，評價浮腫度。另外，致敏后每周眼球采血，致敏后周2次進行臨床得分評價。最終于第7次攻擊1周后屠殺，收集血清及外耳部組織。對血清進行總IgE濃度的測定，對外耳部組織進行HE染色、甲苯胺藍染色。
(臨床得分)對外耳部的搔癢癥、發(fā)紅·出血·糜爛、浮腫、擦傷·組織缺損、痂皮形成、干燥等5項，頭皮部的脫毛、發(fā)紅·出血·糜爛、痂皮形成·干燥等3項共8項進行打分，癥狀無(0分)、輕度(1分)、中度(2分)、重度(3分)，加起來作為評價得分。
(統(tǒng)計)統(tǒng)計采用分散分析以及針對對照組的Dunnett多重比較，各分析中，風險率在5％以下具有顯著性差異。
2.實驗結(jié)果血中總IgE濃度對照組從PCl攻擊后4周開始大幅上升，與此相對，所有KW3110攝取組中均能抑制這種上升，KW 10mg-11wk組與KW1mg-8wk組從第4次攻擊開始，KW1mg-11wk組從第6次攻擊開始顯著性抑制其上升(圖23)。
臨床得分對照組從早期即可觀察到耳部和頭皮的病情惡化，即可確認得分的上升。另一方面，所有KW3110攝取組中可抑制其上升，KW1mg-11wk組、KW10mg-11wk組從第2次攻擊開始，KW1mg-8wk組從第3次攻擊后開始顯著性抑制其上升。對于僅外耳部臨床得分、僅頭皮的臨床得分，同樣可在所有KW3110攝取組中看到顯著性差異(圖24、25、26)。另外，從頭部的照片可確認外耳部的糜爛、組織缺損等在KW攝取組受到抑制(圖27)。
關(guān)于PCI攻擊所致耳闊肥厚未看到致敏階段實施的溶劑造成耳闊的肥厚，但可確認因PCI攻擊造成的耳闊肥厚·發(fā)紅·浮腫。對照組中，第1次攻擊后1、4小時觀察到與速發(fā)型反應(yīng)相關(guān)的1期外耳部肥厚，48小時出現(xiàn)與遲發(fā)型反應(yīng)相關(guān)的2期肥厚，再在120～144小時出現(xiàn)與速發(fā)型反應(yīng)相關(guān)的3期外耳部肥厚。
另一方面，KW3110攝取組3組均發(fā)現(xiàn)顯著性抑制與速發(fā)型反應(yīng)相關(guān)的1、4小時出現(xiàn)的肥厚，KW10mg-11wk組還顯著性抑制144小時、KW1mg-8wk組顯著性抑制24、144小時出現(xiàn)的肥厚。第3次攻擊后，對照組在涂布后繼續(xù)肥厚，而KW3110攝取組出現(xiàn)整體的肥厚抑制傾向，KW1mg-11wk組、KW10mg-11wk組中可確認出現(xiàn)顯著性抑制(圖28、29)。
外耳部的病理學評價結(jié)果是，對照組觀察到真皮及表皮出現(xiàn)肥厚、浮腫等炎癥；所有KW攝取組中均可確認，與對照組相比肥厚整體受到抑制(圖30)。另外，根據(jù)甲苯胺藍染色進行的病理組織評價，可以確認肥大細胞數(shù)KW攝取組比對照組少(圖31)。
以上的結(jié)果確認，通過KW攝取抑制血中總IgE濃度的上升，抑制半抗原刺激誘發(fā)的耳闊肥厚，在臨床水平抑制癥狀惡化。因此，這提示通過KW3110攝取，對NC/Nga小鼠中半抗原誘發(fā)的特異性皮炎的癥狀有改善效果。
實施例10(人體中KW3110株對花粉病的效果)為了驗證KW3110株在人體中的效果，對花粉病志愿者進行下述試驗。
1.試驗方法(試驗樣品)
用實施例2中Th1、Th2兩參數(shù)評價均為E的德氏乳桿菌B株或類干酪乳桿菌KW3110株制作原味酸奶。包含的菌數(shù)是2×108cfu/ml。
(試驗對象)企業(yè)中工作的花粉病患者志愿者28名。本試驗遵照赫爾辛基宣言，事前就與試驗內(nèi)容、方法相關(guān)的內(nèi)容對所有試驗對象進行了充分說明，獲得知情同意書后進行。
(試驗組)將28名試驗對象隨機分為2組。1組攝取對照酸奶德氏乳桿菌B株酸奶，另1組攝取類干酪乳桿菌KW3110株酸奶，一日攝取200ml(相當于KW3110株干燥菌體40mg)。至于分組結(jié)果，由管理信息的第3者進行雙盲試驗，一直到試驗結(jié)束。
(試驗時間)2003年1月20日～4月14日。
(測定項目)于0周(試驗開始時)、4、8、12周目(試驗結(jié)束時)對試驗對象進行采血。在Falco Biosystem公司對血液進行以下項目的測定NK細胞活性、Th1及Th2細胞數(shù)比(Th1/Th2比)、嗜酸性細胞數(shù)、ECP值、血中總IgE量、血中雪松花粉特異的IgE量。
試驗結(jié)束后對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，使之數(shù)據(jù)化。
另外，采血時試驗對象回答表中所示的調(diào)查表，分5個水平(3+高度；2+中等度；+輕度；±輕微；-無)。3+為4分，2+為3分，+為2分，±為1分，-為0分，得分化后進行統(tǒng)計處理。
(表5)

(表6)

2.實驗結(jié)果如圖32所示，試驗開始時與結(jié)束時進行比較時，對照德氏乳桿菌(L.delbrueckii)B株酸奶組(對照組)中Th1/Th2比出現(xiàn)顯著性降低，如圖33所示，ECP值出現(xiàn)顯著性上升。另一方面，類干酪乳桿菌KW3110株酸奶組(KW組)中，無論哪個值試驗前后均未發(fā)現(xiàn)顯著性變化。另外，如圖34所示，至于自覺癥狀的得分化，對于咽喉痛、眼睛痛、眼皮發(fā)沉等，KW組出現(xiàn)比對照組低的傾向。以上的結(jié)果表明KW3110株對人花粉病也表現(xiàn)出有效性。
以下，對本發(fā)明的具有抗過敏活性的乳酸菌用于飲料制造的實施例進行闡述。
實施例11(作為飲料添加原料的乳酸菌菌體的制備方法)制備例1.乳酸菌KW3110株菌體的制備使用培養(yǎng)用培養(yǎng)基(葡萄糖1％、酵母提取物S(Takeda-Kirin公司)1％、MgSO4·7H2O 50ppm、MnSO4·5H2O 50ppm)進行乳酸菌的培養(yǎng)。將乳酸菌KW3110株接種到培養(yǎng)用培養(yǎng)基10ml中，37℃靜置20～24Hr，進行預培養(yǎng)。培養(yǎng)時，將預培養(yǎng)液0.6ml接種到120ml的培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，用200ml的發(fā)酵桶(模型BMJ-25、Able公司)，28℃培養(yǎng)。通氣量為0.12L/min，攪拌速度為500rpm。pH用25％NaOH溶液進行控制，調(diào)到pH4.5以下。培養(yǎng)48小時。
培養(yǎng)結(jié)束后，8500Xg離心10分鐘，收集菌體。懸浮到30ml滅菌蒸餾水中，8500Xg離心10分鐘，收集菌體。反復洗滌3次，除去來源于培養(yǎng)基的成分。將洗滌菌體懸浮到10ml滅菌水中，高壓鍋中100℃、處理30分鐘后，進行冷凍干燥。最后，獲得乳酸菌干燥菌體50～70mg。確認所得乳酸菌菌體的抗過敏活性。
實施例12(茶系飲料的制造)向用85℃熱水提取的烏龍茶、紅茶、綠茶、焙烤茶、茉莉茶的提取液中添加去離子水，使茶葉的使用率為0.8重量％。此時，添加維生素C使其達0.025重量％，然后用碳酸氫鈉將pH調(diào)成適于飲用。再向該調(diào)合液中添加乳酸菌，每100g調(diào)合液添加乳酸菌KW3110株的菌數(shù)為1.5×1010個、3×1010個，然后按常規(guī)方法進行UHT殺菌，填充到350mlPET瓶中。
由專門小組對這10個實施例(5種茶×2種乳酸菌濃度)進行感官評價。結(jié)果對任一種飲料的香味均滿意，并因可每日連續(xù)飲用而得到高評價。但由于添加3×1010個的樣品外觀上出現(xiàn)沉淀，所以更優(yōu)選添加1.5×1010個的飲料。
實施例13(麥茶的制造)用10kg熱水將250g大麥茶煮30分鐘，過濾后，離心分離。向所得提取液中添加乳酸菌KW3110株，最終每100g制品添加8×1010、1.5×1010、3×1010個，然后再添加維生素C和碳酸氫鈉調(diào)味，再度添加去離子水使重量達10kg。然后按常規(guī)方法進行UHT殺菌，無菌填充到500ml的PET瓶中。
進行感觀評價時，均具有滿意的香味，因可每日連續(xù)飲用而得到較高評價。但由于添加3×1010個的樣品外觀上出現(xiàn)沉淀，所以更優(yōu)選低于該數(shù)目的飲料。
實施例14(果汁飲料的制造)向900g混濁蘋果果汁和1g香料中添加規(guī)定量的乳酸菌菌體，再添加去離子水，共達1kg后，按常規(guī)方法熱包裝到180ml玻璃瓶中，制備成蘋果果汁飲料。該調(diào)合液100g中添加乳酸菌KW3110株的菌數(shù)為2×1010個、或4×1010個。
感觀評價的結(jié)果，任何樣品中均未因配合乳酸菌而有任何香味的異常，外觀上也不存在任何問題。
實施例15(運動飲料的制造)向包含砂糖4.5重量％、檸檬酸0.2重量％、檸檬酸鈉0.05重量％、香料0.1重量％的調(diào)合液中添加0.0143重量％(每100g制品添加1.5×1010個)的乳酸菌KW3110株。再將該溶液加熱到90℃殺菌，熱包裝到PET瓶中，制備成運動飲料。感觀評價的結(jié)果，外觀、香味均滿意。離心分離本飲料中的乳酸菌菌體后，用純水洗滌2次后，進行冷凍干燥，得到干燥菌體。用應(yīng)用小鼠淋巴細胞的體外體系評價已完成的制品，結(jié)果保持了規(guī)定的活性(圖35)。
實施例16(土豆汁的制造)向土豆汁中添加規(guī)定量的乳酸菌菌體后，填充到190g罐中，按常規(guī)方法進行蒸餾瓶殺菌。乳酸菌KW3110株的添加是，每100g該調(diào)合液中添加的菌數(shù)達2.5×1010個或5×1010個。
感觀評價的結(jié)果，任何樣品均未因配合乳酸菌而出現(xiàn)異樣感，外觀上也無任何問題。
實施例17(咖啡的制造)用95℃的熱水抽提粉碎了的咖啡焙煎豆(Columbia)，得到咖啡提取液。向其中添加去離子水，將可溶性固體成分稀釋到1.4％。每100g該調(diào)合液中添加的乳酸菌KW3110株的菌數(shù)為2×1010個、4×1010，然后，填充到190g罐中，按常規(guī)方法進行蒸餾瓶殺菌。
感觀評價的結(jié)果，任何樣品均未因配合乳酸菌而出現(xiàn)異樣感。但是，當?shù)沟奖袝r，添加4×1010個的樣品外觀上乳酸菌出現(xiàn)沉淀，更優(yōu)選1.5×1010個。但從罐中直接飲用時沒問題。
以下，對本發(fā)明的具有抗過敏活性的乳酸菌用于食品制造時的實施例進行描述。
實施例18(酸奶的制造)將包括乳的原材料(牛奶、脫脂奶粉、奶油、砂糖液體、穩(wěn)定劑、香料、水)混合均勻，128℃、加熱15秒進行殺菌，冷卻到40℃以下后，添加乳酸菌啟動器W3110，在發(fā)酵罐中維持在37℃開始發(fā)酵。乳酸菌KW3110分解混合液中的乳糖生成乳酸，大約18小時pH成為4.6，通過乳蛋白的等電點凝集，到達膠體化穩(wěn)定點時攪拌冷卻。將經(jīng)攪拌而成膏狀的酸奶填充到紙容器中密封，在10℃以下的冷藏庫中冷卻保管。冷卻后，經(jīng)感觀檢查，可以確認具有酸奶的適當?shù)氖澄镂兜篮吞匦浴Ｋ崮淘牧系呐浜媳壤绫?所示。另外，原材料中的脂肪成分、SNF(無脂固體成分)的比例及甜味度如表8所示。以應(yīng)用小鼠淋巴細胞的體外體系評價已完成的制品，結(jié)果保持了規(guī)定的活性(圖36)。
(表7)

(表8)

以下，對本發(fā)明的具有抗過敏活性的乳酸菌用于健康食品制劑制造時的實施例進行描述。
實施例19(片狀健康食品的制造)將還原巴拉金糖、山梨糖醇、木糖醇及阿拉伯樹膠等糖類適當加入到制備的67g乳酸菌KW3110株干燥粉末中，用水作粘合劑進行加熱造粒，用檸檬酸、stevia、香料等調(diào)味，為了易于成型，加入粉末油脂和蔗糖酯，得到1000g的混合物，用打片機制成片狀。其后，打片，每粒1.5g，制備成香味上乘的片狀健康食品。此時，乳酸菌KW3110株的菌數(shù)是每粒5×1010個。
實施例20(硬膠囊狀健康食品)向制備的100g乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加糊精50g，混合均勻，填充到由支鏈淀粉、植物油、角叉菜膠、氯化鉀組成的硬膠囊原料中，獲得硬膠囊包裹的1膠囊213mg的健康食品。此時，乳酸菌KW3110株的菌數(shù)是每1膠囊5×1010個。
實施例21(硬膠囊狀健康食品)向制備的100g乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加糊精50g，混合均勻，填充到明膠和甘油構(gòu)成的硬膠囊原料中，獲得硬膠囊包裹的1膠囊213mg的健康食品。此時，乳酸菌KW3110株的菌數(shù)是每1膠囊5×1010個。
實施例22(軟膠囊狀健康食品)將制備的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末與紅花油180kg、蜂蠟20kg、大豆卵磷脂5kg的混合物均等混懸，用以角叉菜膠、淀粉、甘油為主成分的膠囊原料包被，制成1膠囊450mg的橢圓狀軟膠囊。此時，乳酸菌KW3110株的菌數(shù)是每1膠囊5×1010個。
實施例23(軟膠囊狀健康食品)將制備的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末與紅花油180kg、蜂蠟20kg、大豆卵磷脂5kg的混合物均等混懸，用以明膠和甘油為主成分的膠囊原料包被，制成1膠囊450mg的橢圓狀軟膠囊。此時，乳酸菌KW3110株的菌數(shù)是每1膠囊5×1010個。
實施例24(顆粒狀健康食品)將制備的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末用棒(stick)狀填充機進行填充，1棒填充1g，獲得每1棒5×1011個乳酸菌KW3110株的健康食品。
實施例25(顆粒狀健康食品)向制備的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加糊精900kg，以水作粘合劑，應(yīng)用流動層造粒機進行勻混和、加熱、造粒，獲得顆粒物1000kg。其后用棒狀填充機對顆粒物進行填充，1棒1g，獲得每1棒5×1010個乳酸菌KW3110株的健康食品。用應(yīng)用小鼠淋巴細胞的體外體系評價已完成的制品，結(jié)果保持了規(guī)定的活性(圖37)。
實施例26(粉末狀健康食品)向制備的100kg乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加糊精900kg，以水作粘合劑，應(yīng)用流動層造粒機進行勻混和、加熱、造粒，獲得顆粒物1000kg。其后粉碎該顆粒物，直到18號篩能全部通過，用棒填充機進行填充，1棒1g，獲得每1棒5×1010個乳酸菌KW3110株的粉末狀健康食品。
實施例27(懸浮液狀健康食品)向制備的100g乳酸菌KW3110株干燥粉末中添加甘藍葉的榨汁液10kg，為了使乳酸菌在液體中易于分散，用藻酸鈉10g調(diào)整粘度，獲得懸浮液狀健康食品。
實施例28(懸浮液狀健康食品)將制備的100g乳酸菌KW3110株干燥粉末與葡萄糖0.7kg、蒸餾水5kg和葡萄香料5g混和，加熱殺菌后，無菌填充1個50ml的密封容器中，獲得糖漿狀的懸浮液狀健康食品。小兒對該食品無討厭感，所以受到好評。
附圖簡述圖1是本發(fā)明的實施例中所用乳酸菌及其購入地的一覽表(No.1)。
圖2是本發(fā)明的實施例中所用乳酸菌及其購入地的一覽表(No.2)。
圖3表示本發(fā)明的實施例中，各種乳酸菌產(chǎn)生的Th1型細胞因子IL-12的生成量。
圖4表示本發(fā)明的實施例中，各種乳酸菌產(chǎn)生的Th2型細胞因子IL-4的生成量。
圖5表示本發(fā)明的實施例中，用本發(fā)明的乳酸菌株(KW3110)和對照株(L-92株)，體外比較IL-12和IL-4產(chǎn)量的結(jié)果。
圖6表示對No.90株進行抗過敏活性測定的結(jié)果，該菌株是由在本發(fā)明的實施例中選擇的KW3110株衍生的。
圖7是本發(fā)明的實施例中體內(nèi)測定KW3110株抗過敏能力的實驗流程圖，該菌株是本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株。
圖8是本發(fā)明的實施例中體內(nèi)測定KW3110株抗過敏能力的實驗中，98天實驗間血中IgE的變動圖，KW3110株是本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株。
圖9是本發(fā)明實施例中體內(nèi)測定KW3110株抗過敏能力的實驗中，用斑點表示第48天及解剖時第98天時血中IgE量，KW3110株是本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株。
圖10是本發(fā)明實施例中體內(nèi)測定KW3110株抗過敏能力的實驗中，對照組及KW3110組的98日解剖時脾細胞培養(yǎng)上清中IL-12的產(chǎn)量，KW3110株是本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株。
圖11是本發(fā)明實施例中體內(nèi)測定KW3110株抗過敏能力的實驗中，對照組及KW3110組的98日解剖時脾細胞培養(yǎng)上清中IL-4的產(chǎn)量，KW3110株是本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株。
圖12是本發(fā)明實施例中體內(nèi)測定KW3110株抗過敏能力的實驗中，觀察到對照組及KW3110組鼻周邊脫毛結(jié)果的照片，KW3110株是本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株。
圖13是本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株KW3110株與作為抗過敏乳酸菌而公知的KW4610株進行比較時，用該乳酸菌株的混合飼料進行預防效果試驗的實驗流程圖。
圖14是本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株KW3110株與作為抗過敏乳酸菌而公知的KW4610株進行比較時，用該乳酸菌株的混合飼料進行預防效果試驗期間血中IgE量的變動。
圖15是本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株KW3110株與作為抗過敏乳酸菌而公知的KW4610株進行比較時，用該乳酸菌株的混合飼料進行預防效果試驗的過程中，施用OVA5次、6次后每個個體的血中IgE量，用圓點表示。
圖16表示本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株KW3110株的耐酸性試驗結(jié)果。
圖17表示本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌株KW3110株的膽汁酸耐性試驗結(jié)果。
圖18表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對應(yīng)用花粉抗原誘發(fā)的花粉病·氣道炎癥的改善效果，圖16a、b、c(圖18a、b、c)是對模型小鼠的噴嚏行為進行試驗的結(jié)果。
圖19表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對應(yīng)用花粉抗原誘發(fā)的花粉病、氣道炎癥的改善效果，圖17a、b(圖19a、b)是對模型小鼠的搔抓行為進行試驗的結(jié)果。
圖20表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對應(yīng)用花粉抗原誘發(fā)的花粉病、氣道炎癥的改善效果，模型小鼠血中總IgE濃度上升的抑制進行試驗的結(jié)果。
圖21表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對應(yīng)用花粉抗原誘發(fā)的花粉病、氣道炎癥的改善效果，是對模型小鼠嗜酸性細胞上升的抑制(圖19a)及嗜酸性細胞局部浸潤的抑制(圖19b)進行試驗的結(jié)果。
圖22表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對應(yīng)用花粉抗原誘發(fā)的花粉病氣道炎癥的改善效果，是對模型小鼠中IL-5的值進行試驗的結(jié)果。
圖23表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果，是對血中總IgE濃度的上升進行試驗的結(jié)果。
圖24表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果，是對模型小鼠總臨床得分進行測定的結(jié)果。
圖25表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果，是對模型小鼠的臨床得分(外耳部)進行測定的結(jié)果。
圖26表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果，是對模型小鼠的臨床得分(頭皮部)進行測定的結(jié)果。
圖27表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果，是抑制模型小鼠頭部外耳部糜爛、組織缺損狀的照片。
圖28表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果，是對模型小鼠的耳闊肥厚(圖26a)及模型小鼠攻擊1次后耳闊肥厚的抑制傾向(圖26b)進行試驗的結(jié)果。
圖29表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果，是對模型小鼠攻擊3次后耳闊肥厚的抑制傾向進行試驗的結(jié)果。
圖30表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果，是針對模型小鼠耳闊肥厚的抑制，用HE染色對外耳部進行病理學評價的結(jié)果。
圖31表示本發(fā)明的實施例中KW3110株對特異性皮炎模型小鼠的改善效果，是針對模型小鼠耳闊肥厚的抑制，用甲苯胺藍染色進行外耳部病理學評價的結(jié)果。
圖32表示本發(fā)明的實施例中KW3110株在人體中對花粉病的效果，應(yīng)用酸奶的試驗中，測定Th1/Th2比值變化的結(jié)果。
圖33表示本發(fā)明的實施例中KW3110株在人體中對花粉病的效果，應(yīng)用酸奶的試驗中，對試驗開始前與開始后ECP的變化進行測定的結(jié)果。
圖34表示本發(fā)明的實施例中KW3110株在人體中對花粉病的效果，應(yīng)用酸奶的試驗中，對試驗開始前與開始后花粉病自覺癥狀的變化進行觀察的結(jié)果。
圖35表示本發(fā)明的實施例中應(yīng)用KW3110株，實施各種加工處理產(chǎn)品化時，對抗過敏活性的維持進行試驗的結(jié)果，及作為清涼飲料水產(chǎn)品化時對IL-12的產(chǎn)量進行試驗的結(jié)果。
圖36表示本發(fā)明的實施例中應(yīng)用KW3110株，實施各種加工處理產(chǎn)品化時，對抗過敏活性的維持進行試驗的結(jié)果，及配合到酸奶中產(chǎn)品化時對IL-12的產(chǎn)量進行試驗的結(jié)果。
圖37表示本發(fā)明的實施例中應(yīng)用KW3110株，實施各種加工處理產(chǎn)品化時，對抗過敏活性的維持進行試驗的結(jié)果，及片劑化時對IL-12及IL-4產(chǎn)量進行試驗的結(jié)果。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明，可獲得有高抗過敏活性的乳酸菌，獲得以該乳酸菌為有效成分的表現(xiàn)高抗過敏效果的組合物。本發(fā)明的抗過敏用組合物尤其對花粉病、特異性皮炎、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎等環(huán)境過敏有效。特別是，正如花粉病數(shù)據(jù)和以花粉作抗原的哮喘治療實驗數(shù)據(jù)中所顯示的，對花粉病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎等粘膜過敏癥疾病的預防、治療有顯著效果。本發(fā)明的抗過敏用組合物的有效成分之一的類干酪乳桿菌KW3110除具有強大的抗過敏、免疫激活活性外，還具有優(yōu)良的腸道細胞的粘附性、胃酸、膽汁酸耐性，所以通過經(jīng)口施用該乳酸菌乃至應(yīng)用該乳酸菌的制品，可期待作為能同時發(fā)揮抗過敏功能及調(diào)整腸道作用、降低膽固醇作用、降壓作用等傳統(tǒng)已知的益生菌功能的藥劑或飲食品利用。本發(fā)明的具有高抗過敏功能組合物，特別以飲料形式應(yīng)用時可每日連續(xù)攝取，且在可能連續(xù)攝取的攝入量內(nèi)能發(fā)揮功效，所以可提供保持抗過敏功能且味道良好、保存性高的飲料。
PCT/RO/134表


受理官廳記入欄


國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約根據(jù)條約7.1頒布的國際保藏單位原始保藏證明保藏人姓名(名稱)麒麟麥酒株式會社社長 荒蒔康一郎先生地址 104-8288東京中央?yún)^(qū)新川2丁目10番1號
國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約根據(jù)條約7.1頒布的國際保藏單位原始保藏證明體藏人姓名(名稱)麒麟走酒株式會社社長 荒蒔康一郎先生地址 104-8288東京中央?yún)^(qū)新川2丁目10番1號


權(quán)利要求
1.一種抗過敏用組合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)KW3110株作為待檢乳酸菌時等同，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的60％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的50％。
2.權(quán)利要求1的抗過敏用組合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時等同，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的75％以上。
3.權(quán)利要求1或2的抗過敏用組合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的40％。
4.權(quán)利要求1～3中任一權(quán)利要求的抗過敏用組合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時等同，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的75％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的40％。
5.權(quán)利要求1～4任一權(quán)利要求的抗過敏用組合物，其特征在于它以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時等同，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的80％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的30％。
6.一種抗過敏用組合物，其特征在于，顯示權(quán)利要求1～5任一項中小鼠脾臟由來淋巴細胞的白細胞介素12及白細胞介素4生成量的乳酸菌為類干酪乳桿菌KW3110株、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KW4110株、類干酪乳桿菌KW3925株、類干酪乳桿菌KW3926株或唾液鏈球菌KW3210。
7.以類干酪乳桿菌KW3110株為有效成分的抗過敏用組合物，該菌株顯示權(quán)利要求1～5任一項中小鼠脾臟由來淋巴細胞的白細胞介素12及白細胞介素4生成量、且耐受消化液、對腸道的附著性高。
8.權(quán)利要求l～7任一項中的抗過敏用組合物，其特征在于，所述的過敏為花粉病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、或特異性皮炎。
9.權(quán)利要求8的抗過敏用組合物，其特征在于，所述的抗過敏用組合物為藥物。
10.權(quán)利要求8的抗過敏用組合物，其特征在于，所述的抗過敏用組合物為飲食品。
11.一種具有高抗過敏活性的乳酸菌的獲得方法，其特征在于，分離出具有以下效果的乳酸菌將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時等同，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的60％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的50％。
12.一種具有高抗過敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，用培養(yǎng)基培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11的方法分離出的乳酸菌，使之增殖。
13.權(quán)利要求12的具有高抗過敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，確認用培養(yǎng)基培養(yǎng)、增殖了的乳酸菌的抗過敏活性。
14.權(quán)利要求13的具有高抗過敏活性的乳酸菌的制造方法，其特征在于，所述的增殖了的乳酸菌的抗過敏活性的確認是通過將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，測定白細胞介素12及白細胞介素4的產(chǎn)量進行。
15.一種裝入密封容器的藥品或飲食品的制造方法，其特征在于，將根據(jù)權(quán)利要求12～14任一項中具有高抗過敏活性的乳酸菌的制造方法制備的乳酸菌配合藥品或飲食品，填充到容器中，進行密封。
16.一種過敏疾病的預防和/或治療方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～10任一項中的抗過敏用組合物用于過敏疾病的預防和/或治療的處理。
17.權(quán)利要求16的過敏疾病的預防和/或治療方法，其特征在于，所述的過敏性疾病為花粉病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、或特異性皮炎。
18.權(quán)利要求1～10中任一項抗過敏用組合物在過敏性疾病的預防和/或治療中的應(yīng)用。
19.權(quán)利要求18的抗過敏用組合物的應(yīng)用，其特征在于，所述的過敏性疾病的預防和/或治療是指花粉病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、或特異性皮炎的預防和/或治療。
20.一種具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，添加權(quán)利要求1～7任一項中具有抗過敏活性的乳酸菌作活性成分。
21.權(quán)利要求20的具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，每日攝取的飲食品中可含有5×109個以上具有抗過敏活性的乳酸菌。
22.權(quán)利要求20或21的具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，所述的飲料或食品不包含成為過敏的原因的成分。
23.權(quán)利要求22的具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，所述的飲料或食品是不包含成為過敏原成分的片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊、或飲料劑。
24.權(quán)利要求20～21任一項中具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，應(yīng)用滅菌了的乳酸菌。
25.一種具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，添加權(quán)利要求1～7任一項中具有抗過敏活性的乳酸菌作活性成分。
26.權(quán)利要求22中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的飲料是不含乳成分的裝入密封容器的飲料。
27.權(quán)利要求25或26中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的飲料是裝入密封容器的果汁清涼飲料或茶飲料。
28.權(quán)利要求25～27任一項中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的裝入密封容器的飲料中添加的乳酸菌是每100g飲料109～1011個乳酸菌的范圍。
29.權(quán)利要求20～28任一項中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的添加的乳酸菌為類干酪乳桿菌KW3110或其突變株。
30.權(quán)利要求20～29任一項中具有抗過敏功能的飲料，其特征在于，所述的食品或飲料作為健康食品、功能性食品、特定保健用食品、或病人用食品進行制備。
31.具有抗過敏功能的裝入密封容器的飲食品的制造方法，其特征在于，在基本上無菌狀態(tài)下，向滅菌的食品或飲料中配合權(quán)利要求1～7任一項中具有高抗過敏活性的乳酸菌、或經(jīng)過殺菌的上述乳酸菌，填充到容器，密封。
32.乳酸菌的抗過敏活性的測定方法，其特征在于，將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟由來淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)時產(chǎn)生的白細胞介素12和/或白細胞介素4的量。
33.權(quán)利要求32的乳酸菌抗過敏活性的測定方法，其特征在于，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)所產(chǎn)生的白細胞介素12和/或白細胞介素4的量，與應(yīng)用類干酪乳桿菌KW3110株時的情況進行比較，從而進行評價。
34.一種抗過敏劑，其特征在于，向權(quán)利要求1～7任一項中所述的具有高抗過敏活性的乳酸菌中添加載體、賦形劑和/或其它輔助劑，制劑化。
35.一種藥品，它包含權(quán)利要求1～7任一項中具有高抗過敏活性的乳酸菌。
36.一種具有抗過敏功能的飲食品，其特征在于，用權(quán)利要求1～7任一項中所述的具有高抗過敏活性的乳酸菌部分和全部代替用乳酸菌制備的或含有乳酸菌的飲料或食品。
37.具有抗過敏功能的飲料或食品的制造方法，其特征在于，用權(quán)利要求1～7任一項中具有高抗過敏活性的乳酸菌部分和全部代替用乳酸菌制備的或含有乳酸菌的飲料或食品的乳酸菌。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供對過敏的預防、治療有用的抗過敏用組合物，其制備法及其作為食品及飲料等的利用。解決手段包含抗過敏用組合物，該組合物以具有以下效果的乳酸菌作為有效成分將用卵清蛋白致敏的小鼠脾臟來源的淋巴細胞懸浮到含卵清蛋白的培養(yǎng)基中，添加待檢乳酸菌進行培養(yǎng)時，白細胞介素12的產(chǎn)量與用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時等同，或是用類干酪乳桿菌KW3110株作為待檢乳酸菌時的60％以上，且白細胞介素4的生成量不到不添加乳酸菌的對照的50％。本發(fā)明包含作為本發(fā)明的抗過敏用組合物的有效成分的有高抗過敏活性的乳酸菌的獲得方法，及本發(fā)明的抗過敏用組合物在食品及飲料等中的應(yīng)用，此外包含通過制劑化，作為經(jīng)口施用的抗過敏劑的應(yīng)用。
文檔編號A61P11/06GK1767839SQ200480006779
公開日2006年5月3日 申請日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月13日
發(fā)明者井上小夜, 藤井敏雄, 藤原大介, 齋木朗, 高橋?qū)? 山內(nèi)浩一郎, 后藤正巳, 西田聰, 出內(nèi)桂二, 若林英行, 米田俊浩 申請人:麒麟麥酒株式會社