專利名稱：可逆性永生化的嗅鞘神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其促進(jìn)神經(jīng)元再生的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)元再生。特別地，本發(fā)明提供特定類型的細(xì)胞，即，可逆性永生化并且在培養(yǎng)物中生長的嗅鞘神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(olfactoryensheathing glia，OEG)，它是功能性的并且可安全用于移植。本發(fā)明在針對(duì)神經(jīng)區(qū)域，例如人的腦、脊椎和/或外周神經(jīng)的移植中具有特別的應(yīng)用，以幫助外科手術(shù)或創(chuàng)傷后急性和慢性神經(jīng)損傷的恢復(fù)。
背景技術(shù)：
嗅鞘神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(OEG)由Ramón y Cajal的研究已知成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元再生的能力極度有限。相反，來自外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的神經(jīng)元具有值得注意的再生能力，這可能歸因于將PNS軸突置于鞘中的施旺細(xì)胞(Schwanncell，SC)的特定特性等因素。這一事實(shí)刺激了外周神經(jīng)和SC移植物的應(yīng)用以培育CNS中的再生，得到了有希望的結(jié)果(在Jones LL等，″Neurotrophic factors，cellular bridges and gene therapy for spinal cordinjury″，J.Physiol 2001；53383-89中進(jìn)行綜述)。盡管如此，用SC實(shí)現(xiàn)的不完全CNS再生還是使得有必要尋找更有效的再生介質(zhì)。
由于它們的特殊特性，近年來使用OEG細(xì)胞進(jìn)行CNS再生已經(jīng)受到很多注意。嗅覺系統(tǒng)在成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有顯著不同的特性。在生物的整個(gè)生命期中，嗅覺感覺神經(jīng)元由存在于嗅覺神經(jīng)上皮上的祖細(xì)胞進(jìn)行更新。新生的感覺神經(jīng)元延伸新的軸突，其生長并進(jìn)入CNS以便在嗅球的小球?qū)由伤鼈兊倪m當(dāng)連接。這些嗅覺軸突被一種特殊類型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞所包圍，稱作嗅鞘神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(OEG)。
在體內(nèi)OEG細(xì)胞表達(dá)幾種已經(jīng)用于在分離和培養(yǎng)后鑒定它們的標(biāo)記(見Ramon-Cueto A，Avila J.″Olfactory ensheathing gliaproperties andfunction″，Brain Res.Bull.1998；46175-187以及其中的參考文獻(xiàn))。OEG細(xì)胞與施旺細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共有一些特性，盡管它們呈現(xiàn)將它們分類為不同類別的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的不同模式的標(biāo)記和特性。
在培養(yǎng)物中已經(jīng)鑒定出兩種OEG細(xì)胞變體。在無血清的培養(yǎng)基中Barnett與合作者(Franceschini IA，Barnett SC.″Low-affinity NGF-receptorand E-N-CAM expression define two types of olfactory nerve ensheathingcells that share a common lineage″.Dev.Biol.1996；173327-343)已經(jīng)于OEG細(xì)胞培養(yǎng)物中鑒定了兩種極端形態(tài)學(xué)類型，一種星形膠質(zhì)細(xì)胞樣的扁平細(xì)胞，其表達(dá)GFAP(纖維狀染色)和PSA-NCAM，并且對(duì)于p75-NGFr是陰性的，以及第二種類型，施旺細(xì)胞樣的紡錘形細(xì)胞，表達(dá)p75-NGFr，具有對(duì)于GFAP的彌散染色并且對(duì)于PSA-NCAM是陰性的。所有的中間表型都是有可能的并且甚至在已建立的克隆細(xì)胞系中也觀察到這些表型支持了這樣的觀點(diǎn)，即它們能夠源自一種共同的前體細(xì)胞。在我們的來自成年大鼠和人供體的OEG細(xì)胞培養(yǎng)物中，我們也已檢測到兩種形態(tài)學(xué)類型的細(xì)胞以及中間表型。
由從我們實(shí)驗(yàn)室和其他實(shí)驗(yàn)室所獲得的數(shù)據(jù)，顯然OEGs顯著有別于星形膠質(zhì)細(xì)胞或施旺細(xì)胞，與鼠或人供體的年齡無關(guān)。
OEG細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)突增生的能力可以用于在培養(yǎng)物中建立神經(jīng)突發(fā)生和/或再生模型。當(dāng)使用胚胎性或新生的神經(jīng)元時(shí)，培養(yǎng)物中神經(jīng)突的增生可以簡單地指示神經(jīng)突發(fā)生。不過，來自成年CNS神經(jīng)元的神經(jīng)突延伸可以被看作CNS再生的培養(yǎng)模型。因而，Wigley和Berry已經(jīng)利用成年視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(從現(xiàn)在起稱為RGC)在單層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上建立起共培養(yǎng)模型。培養(yǎng)在新生皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞匯合單層上的成年RGC能夠遠(yuǎn)距離再生神經(jīng)突(Wigley CB，Berry M.″Regeneration of adult rat retinalganglion cell processes in monolayer culturecomparisons between cultures ofadult and neonatal neurons″，Brain Res.1988；47085-98)。在最近的研究中，Wigley與合作者利用同一模型將單層的成年大鼠OEG與新生星形膠質(zhì)細(xì)胞和SC相比較。他們證明了成年大鼠OEG細(xì)胞是培養(yǎng)物中成年RGC神經(jīng)突再生的最佳基質(zhì)，并且這種作用主要依賴于細(xì)胞間連接和鈣。如Sonigra與合作者(Sonigra RJ，Brighton PC，Jacoby J，Hall S，Wigley CB.″Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adultcentral nervous system neurite outgrowth in coculture″.Glia 1999；25256-269)所證明的，細(xì)胞表面分子(進(jìn)行粘連、軸突引導(dǎo)等的因子)對(duì)于成年RGC是重要的，但是必須對(duì)它們的確切身份進(jìn)行定義。
通過使用PNS施旺細(xì)胞(SC)移植物已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了CNS中的初始再生。CNS再生性軸突能夠穿入這種允許環(huán)境中但問題是在遠(yuǎn)離損傷的CNS組織中再進(jìn)入的低效性。以往的實(shí)驗(yàn)顯示OEG細(xì)胞能夠在rizhotomy后于脊髓CNS環(huán)境中介導(dǎo)外周感覺軸突的再進(jìn)入。當(dāng)放置具有SC和OEG細(xì)胞的橋管(bridge tube)時(shí)，在脊髓的完全橫切后也觀察到再生性軸突再進(jìn)入到CNS中。OEG細(xì)胞的存在減少了神經(jīng)膠質(zhì)創(chuàng)傷(scar)的形成并且在移植物-宿主界面上構(gòu)成軸突通道。這種方法提供了一種在CNS宿主組織中提高再生性軸突再進(jìn)入效率的途徑。利用大鼠脊髓完全橫切模型，也證明了CNS再生影響到脊髓中幾種通路的非凡程度，伴隨著由行為學(xué)試驗(yàn)所測量的功能性恢復(fù)(Ramon-Cueto A等，″Functional recovery of paraplegic rats andmotor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia″，Neuron 2000；25425-435)。OEG細(xì)胞似乎能夠在宿主CNS組織中遷移并且沿著生長的軸突前進(jìn)，因而為CNS再生提供了有利的微環(huán)境。
所有這些數(shù)據(jù)都支持這樣的觀點(diǎn)，即OEG細(xì)胞在功能上不同于其它的神經(jīng)細(xì)胞，諸如星形膠質(zhì)細(xì)胞或施旺細(xì)胞。
使用這些細(xì)胞的一個(gè)最重要的必要條件是完全了解它們的生長需要。OEG細(xì)胞的某些促分裂原最初被鑒定為像存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(ACM)中的因子，其并不結(jié)合肝素并且能夠用抗神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(NRG-1)抗體進(jìn)行抑制。而且，半純化的牛垂體提取物，其是幾種神經(jīng)膠質(zhì)促分裂原包括GGF a NRG-1的粗制來源，對(duì)于OEG是有活性的。
盡管在嚙齒動(dòng)物中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)提示OEG細(xì)胞移植物有利于脊髓傷害后的功能性恢復(fù)，這些研究必須延伸到靈長動(dòng)物，其中運(yùn)動(dòng)功能脊椎上的控制對(duì)于評(píng)估功能性恢復(fù)是基礎(chǔ)性的。在這一方面最重要的是可以獲得移植入患者體內(nèi)的人OEG細(xì)胞的易得的和無限制的來源。我們利用營養(yǎng)因子、生物化學(xué)化合物和介質(zhì)的特定混合物已經(jīng)明確了延長成年大鼠OEG細(xì)胞傳代培養(yǎng)的條件。這一組合還允許人OEG細(xì)胞的生長。不過，長時(shí)期之后OEG細(xì)胞喪失它們支持由成年CNS神經(jīng)元的軸突再生的能力，盡管它們保持支持來自幼神經(jīng)元(young neuron)的軸突延伸的能力。因而OEG細(xì)胞的長期培養(yǎng)似乎并非獲得足夠移植群的可取方法。
WO 02/088337公開了一種獲得大量OEG細(xì)胞的方法，其包括用反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染初級(jí)(primary)OEG細(xì)胞，所述載體包含端粒末端轉(zhuǎn)移酶催化亞基Tert，以便獲得經(jīng)修飾的OEG細(xì)胞。不過，卻未提及有關(guān)所述細(xì)胞支持由成年CNS神經(jīng)元的軸突再生的能力。
生成保留初級(jí)OEG細(xì)胞培養(yǎng)物的軸突再生促進(jìn)特性的永生化非致瘤克隆細(xì)胞系是獲得無限量的OEGs的可取方法。利用表達(dá)自組成型細(xì)胞啟動(dòng)子的SV40大T抗原、通過永生化作用已經(jīng)發(fā)展出克隆的大鼠OEG細(xì)胞系(Moreno-Flores MT等，″Immortalised olfactory ensheathing glia promoteaxonal regeneration of rat retinal ganglion neurons″，J.Neurochem.2003；85861-871)。在成熟RGN軸突再生的促進(jìn)中，發(fā)現(xiàn)一些這些永生化的大鼠OEGs可與初級(jí)的大鼠OEG細(xì)胞和SC相比。不過，這些細(xì)胞中癌基因(在此種情況下為編碼SV40大T抗原的基因)的持續(xù)存在令人擔(dān)心，因?yàn)樗梢蕴岣咭浦埠髳盒赞D(zhuǎn)化的危險(xiǎn)。
因而仍然需要人OEG細(xì)胞的易得的和無限性的來源，所述人OEG細(xì)胞保留促進(jìn)軸突再生的特性并且同時(shí)避免腫瘤的生成。
發(fā)明概述我們發(fā)明的目的是基于OEG細(xì)胞在體外和體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生的能力，在此程度上這種能力到目前為止尚未被任何其它初級(jí)或遺傳修飾的細(xì)胞類型所共享。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種通過可逆轉(zhuǎn)遺傳修飾和選擇獲得無限量的保留其軸突再生能力的OEG細(xì)胞的途徑。
在我們研究的過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一種逆轉(zhuǎn)(reverse)永生化初級(jí)細(xì)胞并由人供體獲得OEGs的永生化克隆細(xì)胞系的方法。我們已經(jīng)測試所有這些細(xì)胞系在其分子標(biāo)記上都近似于初級(jí)OEGs。值得注目的是，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞系中的一些保留了其促進(jìn)由成年神經(jīng)元的軸突再生的能力，即使是在所述永生化過程被逆轉(zhuǎn)時(shí)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供功能性可逆轉(zhuǎn)永生化的或逆轉(zhuǎn)-永生化嗅鞘神經(jīng)膠質(zhì)(OEG)細(xì)胞系。所述細(xì)胞系可以用于治療方法中，如用于通過將所述細(xì)胞移植入中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷區(qū)而促進(jìn)神經(jīng)元再生的方法中。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞系是人細(xì)胞系。
在本發(fā)明的另一方面，提供制備用于移植入患者體內(nèi)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群(population)的方法。所述方法包括(a)提供初級(jí)OEG的樣品；(b)通過用一種載體轉(zhuǎn)化所述OEG細(xì)胞而使所述OEG細(xì)胞永生化，由此產(chǎn)生永生化的OEG細(xì)胞，所述載體包括包含癌基因(或癌基因的組合)的可去除的DNA片段；(c)培養(yǎng)所述永生化的OEG細(xì)胞；(d)選擇保持親本OEG細(xì)胞的功能特性(即，促進(jìn)由成年CNS神經(jīng)元的軸突再生的能力)的那些OEG克隆細(xì)胞系，和(e)從所述永生化的OEG細(xì)胞中去除癌基因(或癌基因的組合)，所述去除導(dǎo)致產(chǎn)生用于移植入患者體內(nèi)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群。優(yōu)選地，由人供體中獲得OEG細(xì)胞并且所述癌基因是任何能夠避免進(jìn)入衰老的基因，包括編碼SV40大T抗原、端粒末端轉(zhuǎn)移酶催化亞基、Bmi-1蛋白的基因或這些基因的任何組合。
本發(fā)明的另一方面提供一種藥物組合物，其包含所述功能性嗅鞘神經(jīng)膠質(zhì)(OEG)細(xì)胞以及藥用載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中所述細(xì)胞是逆轉(zhuǎn)-永生化的OEG細(xì)胞。
優(yōu)選通過將所述癌基因(或癌基因的組合)置于重組酶靶位點(diǎn)的側(cè)翼而使它可去除，并且通過將表達(dá)來產(chǎn)生重組酶的基因?qū)胨鲇佬曰?xì)胞而實(shí)現(xiàn)所述去除，所述重組酶特異性識(shí)別重組酶靶位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述重組酶是Cre重組酶并且所述重組酶靶位點(diǎn)是loxP位點(diǎn)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可去除的DNA片段還包含自殺基因，其編碼能夠通過一種外源試劑破壞所述永生化細(xì)胞的基因產(chǎn)物，如果所述可去除的DNA片段未從細(xì)胞中去除的話。所述自殺基因優(yōu)選是編碼單純皰疹病毒胸苷激酶的基因，并且通過暴露于9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤(gancyclovir)而破壞所述細(xì)胞，如果所述可去除的DNA片段未從細(xì)胞中去除的話。
本發(fā)明的另一方面提供制備用于移植入患者體內(nèi)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群的方法。所述方法包括(a)提供初級(jí)OEG的樣品；(b)通過用一種載體轉(zhuǎn)化所述OEG細(xì)胞而使所述OEG細(xì)胞永生化，由此產(chǎn)生永生化的OEG細(xì)胞，所述載體包含含有癌基因(或癌基因的組合)、可選擇的標(biāo)記基因和編碼單純皰疹病毒胸苷激酶基因的可去除的DNA構(gòu)建體，所述基因一起排列于loxP位點(diǎn)的任何一側(cè)；(c)培養(yǎng)所述永生化的OEG細(xì)胞；(d)選擇保持親本OEG細(xì)胞的功能特性的那些OEG克隆細(xì)胞系，和(e)通過從永生化的OEG細(xì)胞中去除所述DNA構(gòu)建體來逆轉(zhuǎn)OEG細(xì)胞的永生化作用，所述去除是通過將編碼Cre重組酶的基因?qū)胨鲇郎腛EG細(xì)胞，以進(jìn)行DNA構(gòu)建體在loxP位點(diǎn)上的切除而實(shí)現(xiàn)的，所述切除導(dǎo)致產(chǎn)生用于移植入患者體內(nèi)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群。
還與治療患者神經(jīng)元損害的方法一起提供由前述方法生產(chǎn)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群，所述方法包括將所述OEG細(xì)胞以足夠量的那些OEG細(xì)胞移植入患者的損害或損傷的神經(jīng)區(qū)，例如，腦、脊柱和/或外周神經(jīng)，以修復(fù)患者中的所述神經(jīng)元損害或損傷或幫助恢復(fù)外科手術(shù)或創(chuàng)傷后急性和慢性的神經(jīng)損害。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供可逆轉(zhuǎn)永生化的OEG細(xì)胞，其包含用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的初級(jí)OEG細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建體包含在癌基因(或癌基因的組合)側(cè)翼的兩個(gè)重組酶靶位點(diǎn)，所述癌基因賦予OEG細(xì)胞永生化作用，其中當(dāng)靶位點(diǎn)暴露于特異性識(shí)別所述靶位點(diǎn)的重組酶時(shí)，所述永生化作用可以由通過在重組酶靶位點(diǎn)上的剪切來切除DNA構(gòu)建體而成為可逆的。優(yōu)選地，所述重組酶靶位點(diǎn)是loxP位點(diǎn)并且所述永生化作用可以通過在loxP位點(diǎn)上的Cre重組酶剪切而成為可逆的。所述DNA構(gòu)建體可以還包括可選擇的標(biāo)記基因，并且可以還包含自殺基因，其編碼能夠通過一種外源試劑破壞所述永生化OEG細(xì)胞的基因產(chǎn)物，如果所述DNA構(gòu)建體未從細(xì)胞中去除的話。優(yōu)選地，所述自殺基因是編碼單純皰疹病毒胸苷激酶的基因，并且所述外源試劑是9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤。
在一個(gè)實(shí)施方案中，初級(jí)的OEG細(xì)胞獲自人供體，并且提供可逆性永生化的細(xì)胞系。
按照本發(fā)明的另一方面，提供在移植入患者體內(nèi)后具有功能的逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞，它是通過將上述永生化OEG細(xì)胞中的DNA構(gòu)建體暴露于重組酶而產(chǎn)生的，所述重組酶在重組酶靶位點(diǎn)通過剪切而切除所述DNA構(gòu)建體。還提供一種治療神經(jīng)元損害患者的方法，包括將足量的所述逆轉(zhuǎn)-永生化的OEG細(xì)胞移植入患者的受傷區(qū)域以便促進(jìn)患者體內(nèi)的神經(jīng)元再生。
附圖簡述

圖1顯示在解離和培養(yǎng)一周后(DIV 1)或在五次連續(xù)傳代后(DIV 2)人OEG細(xì)胞的一般形態(tài)。
圖2顯示用針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記，諸如神經(jīng)配蛋白(Neuroligin)、APP(22C11)、S100和GFAP的抗體染色的人OEGs的免疫熒光。
圖3顯示EGF-R家族成員的表達(dá)。用針對(duì)Erb B2、Erb B3和Erb B4的抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析從不同介質(zhì)中的人OEGs中獲得的細(xì)胞提取物。將微管蛋白用作加樣對(duì)照。該圖包含來自用平行培養(yǎng)基進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，所述培養(yǎng)基來自己建立的大鼠OEGs細(xì)胞系。
圖4顯示用針對(duì)神經(jīng)元蛋白的抗體染色的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元的軸突再生能力，所述神經(jīng)元蛋白如神經(jīng)元特異性微管蛋白(334)、軸突蛋白諸如MAP1B-SMI31(SMI31)或MAP2(305)，或體-樹蛋白MAP2(514)。
圖5顯示包含編碼SV40大T抗原的基因作為癌基因的慢病毒(lentiviral)構(gòu)建體pLOX-Ttag-Ires-TK的圖示。
圖6顯示包含編碼端粒末端轉(zhuǎn)移酶催化亞基的基因作為癌基因的慢病毒構(gòu)建體pLOX-HTERT-Ires-TK的圖示。
圖7顯示包含編碼Bmi-1蛋白的基因作為癌基因的慢病毒構(gòu)建體pLOX-CWBmil的圖示。
發(fā)明詳述本發(fā)明的某些方面采用本領(lǐng)域公知的常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。見，例如，Sambrook et al.，“Molecular CloningALaboratory Manual”(1989)；“DNA CloningA Practical Approach”，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait ed.1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames & S.Higgins eds.(1985)]；“Transcription and Translation”[B.D.Hames & S.J.Higginseds.(1984)]；“Animal Cell Culture[R.I.Freshney，ed.(1986)]；“ImmobilizedCells And Enzymes”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“A Practical Guide ToMolecular Cloning”(1984)；或“Current Protocols in Molecular Biology“，eds.Frederick M.Ausubel et al.，John Wiley & Sons，1999。
術(shù)語“核酸構(gòu)建體”或“DNA構(gòu)建體”有時(shí)用于指編碼序列或可操作性連接于適當(dāng)調(diào)控序列并插入載體用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的序列。這一術(shù)語可以與術(shù)語“轉(zhuǎn)化性DNA”相互交換使用。這種核酸構(gòu)建體包含目標(biāo)基因產(chǎn)物的編碼序列，以及可選擇的標(biāo)記基因和/或報(bào)告基因。
術(shù)語“可操作性連接的”或“可操作性插入的”在此意為對(duì)編碼序列的表達(dá)必需的調(diào)控序列在相對(duì)于編碼序列適當(dāng)?shù)奈恢帽恢糜诤怂岱肿又幸员隳軌虮磉_(dá)所述編碼序列。這一相同定義有時(shí)被用來在表達(dá)載體中排列其它轉(zhuǎn)錄控制元件(例如增強(qiáng)子)。
術(shù)語“可選擇的標(biāo)記基因”指一種基因，當(dāng)它表達(dá)時(shí)賦予一種可選擇的表型如在轉(zhuǎn)化細(xì)胞上的抗生素抗性。
“載體”是另一種核酸片段可以可操作地插入其中以便引起片段的復(fù)制或表達(dá)的復(fù)制子，諸如質(zhì)粒、噬菌體、粘?；虿《?。更具體地，術(shù)語“病毒性載體”指能夠向宿主細(xì)胞傳遞外源或異源遺傳信息的病毒。這種外源遺傳信息可以翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物，但這并非外源信號(hào)的必要要求。
術(shù)語“永生化作用”或“永生化的”意指一種細(xì)胞或一種產(chǎn)生細(xì)胞的過程，所述細(xì)胞將在培養(yǎng)中無限地增殖由此避免進(jìn)入衰老。在本發(fā)明中，永生化作用指以這樣一種方式轉(zhuǎn)化初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物的過程，即引發(fā)細(xì)胞在某些方面表現(xiàn)像腫瘤細(xì)胞一樣；具體地，在腫瘤細(xì)胞的增殖特性上。
術(shù)語“選擇”指對(duì)永生化的OEG克隆細(xì)胞系各個(gè)測定其支持神經(jīng)元存活和促進(jìn)軸突由成年CNS神經(jīng)元再生的能力以便排除性地選擇那些保留這一功能特性的克隆細(xì)胞系的過程。
術(shù)語“逆轉(zhuǎn)-永生化作用”指通過一種方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行永生化使得它們能夠在以后恢復(fù)非永生化狀態(tài)的過程。
“可逆性永生化的”細(xì)胞是目前處于永生化狀態(tài)，但以后能夠利用本文所述的逆轉(zhuǎn)-永生化作用恢復(fù)為非永生化狀態(tài)的細(xì)胞。
“逆轉(zhuǎn)-永生化的”細(xì)胞是已經(jīng)進(jìn)行過完整過程的逆轉(zhuǎn)-永生化作用，并且現(xiàn)在以非永生化狀態(tài)存在的細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“功能性的”，意即逆轉(zhuǎn)-永生化的OEG細(xì)胞能夠在共培養(yǎng)系統(tǒng)中于體外促進(jìn)由成年CNS神經(jīng)元的軸突再生，并且因此在移植入患者的神經(jīng)受損區(qū)域后仍然具有體內(nèi)促進(jìn)軸突再生的能力。
術(shù)語“自殺基因”指賦予可逆性永生化細(xì)胞致死性表型的基因。用更常用的術(shù)語，“自殺基因”可以被認(rèn)為陰性可選擇標(biāo)記基因。其基因產(chǎn)物的表達(dá)能夠使細(xì)胞被殺死，即，通過外源試劑如抗生素或抗病毒劑處理細(xì)胞。
術(shù)語“重組酶/重組酶靶”指相互作用的分子的配對(duì)，一個(gè)是重組酶而另一個(gè)則是被該重組酶特異性識(shí)別和剪切的DNA位點(diǎn)。所述重組酶/重組酶靶由于二者之間的特異性相互作用而進(jìn)行配對(duì)，即重組酶結(jié)合其關(guān)聯(lián)DNA結(jié)合序列并于該位點(diǎn)剪切所述DNA。
本文所用的術(shù)語“神經(jīng)元損害”指由任何急性或慢性外傷性損害或任何退行性疾病狀況產(chǎn)生的任何損傷，其導(dǎo)致任何功能性神經(jīng)學(xué)失能作為神經(jīng)元細(xì)胞死亡、神經(jīng)通道結(jié)構(gòu)破壞、軸突退化或突觸消除的結(jié)果。因而促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生可以有助于在多種情況下存活的神經(jīng)元回路的修復(fù)，所述多種情況包括腦和脊髓的外傷性損害，軸突退行性疾病包括多發(fā)性硬化和神經(jīng)元退行性疾病包括特別是阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨延頓病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)。
按照本發(fā)明，已有一種方法最小化或消除移植的OEG細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)，所述OEG細(xì)胞是通過初級(jí)OEG細(xì)胞的永生化和在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖而產(chǎn)生的。發(fā)明人利用重組病毒可逆性地使得OEG細(xì)胞永生化，所述重組病毒如包含癌基因或癌基因組合的慢病毒，所述癌基因或癌基因組合能夠誘導(dǎo)致瘤性生長，側(cè)翼為重組酶靶位點(diǎn)。通過將編碼重組酶的基因?qū)爰?xì)胞中接著進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組而實(shí)現(xiàn)將癌基因或癌基因組合從永生化的細(xì)胞中切除，所述重組酶特異性識(shí)別所述重組酶靶位點(diǎn)。在位點(diǎn)特異性重組和癌基因切除后，細(xì)胞增殖停止并且細(xì)胞形成初級(jí)OEG細(xì)胞的特性。而且，所述細(xì)胞具有最小的致癌可能性。
上述的逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞的顯著特征是它們?cè)谝浦不颊咧袗盒赞D(zhuǎn)化的危險(xiǎn)大大減小了。通過將“自殺”基因添加到用于永生化細(xì)胞的起始病毒構(gòu)建體中，按照本發(fā)明甚至進(jìn)一步增強(qiáng)了這些細(xì)胞進(jìn)行OEG移植的安全應(yīng)用。在一個(gè)示范性的實(shí)施方案中，所述自殺基因是單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，在兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間并入慢病毒載體中。如果通過上述機(jī)制由Cre重組酶將癌基因(或癌基因的組合)成功地切除，也切除了HSV-tk基因。如果它未被切除，則能夠通過用9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤處理來破壞細(xì)胞，所述9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤是一種靶向HSV-tk基因產(chǎn)物的抗病毒劑。
因而，本發(fā)明的可逆轉(zhuǎn)性永生化的OEG細(xì)胞是包含含有可選擇性標(biāo)記基因和癌基因或癌基因的組合的異源性DNA構(gòu)建體的OEG細(xì)胞，所述癌基因或癌基因的組合能夠使細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖，所述可選擇性標(biāo)記基因和癌基因(癌基因的組合)一起排列于重組酶DNA結(jié)合位點(diǎn)的側(cè)翼。任選地，所述DNA片段還包含“自殺”基因，也排列于重組酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)。通過用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化初級(jí)OEG細(xì)胞，在適于擴(kuò)殖轉(zhuǎn)化的OEG細(xì)胞集群的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的OEG細(xì)胞，隨后將轉(zhuǎn)化的OEG細(xì)胞暴露于識(shí)別所述DNA構(gòu)建體上結(jié)合位點(diǎn)的重組酶(例如通過用包含編碼重組酶基因的病毒載體感染轉(zhuǎn)化的OEG細(xì)胞)來實(shí)施本發(fā)明。如果所述DNA構(gòu)建體還包含“自殺”基因，將所述OEG細(xì)胞進(jìn)一步置于會(huì)殺死任何仍包含所述DNA構(gòu)建體的細(xì)胞的條件下，隨后用重組酶進(jìn)行處理。
初級(jí)OEG細(xì)胞可以獲自任何供體或來源。優(yōu)選地，所述供體或來源是哺乳動(dòng)物，諸如小鼠或大鼠，最優(yōu)選地，所述供體或來源是人。獲得初級(jí)OEG細(xì)胞并起始初級(jí)OEG細(xì)胞的培養(yǎng)的方法是本領(lǐng)域所公知的。例如，初級(jí)OEG可以獲自形成嗅球的患者或供體，這承擔(dān)了顯而易見的困難和危險(xiǎn)，或獲自嗅粘膜固有層(Lamina Propria)。我們用本發(fā)明解決了完全從有限供應(yīng)的嗅粘膜固有層中獲得足夠OEG細(xì)胞進(jìn)行移植的問題。人嗅粘膜相對(duì)易于通過簡單內(nèi)鏡操作或局部麻醉進(jìn)行活檢(Feron等.″newtechniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons，Arch.Otorlaryngol.Head Neck Surg.1998；124861-866)。
任何癌基因或癌基因的組合都可以用來使初級(jí)OEG細(xì)胞可逆地永生化，并且其中許多是本領(lǐng)域已知的。編碼SV40大T抗原的基因(SV40Tag)，一種用來使得初級(jí)細(xì)胞永生化的已知癌基因，是其中一種，但是可以使用其它的。這些特別包括，但不限于，如本領(lǐng)域已知的病毒癌基因，以及細(xì)胞癌基因如Bmi-1，端粒末端轉(zhuǎn)移酶催化亞基，c-myc，或編碼生長因子受體的基因。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述DNA片段只包含一個(gè)癌基因。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述DNA片段包含兩個(gè)或更多癌基因的組合；在這種情況下，所述癌基因可以是串聯(lián)的或在任何其它的合適的位置上。
可以通過多種方法遞送所述癌基因，例如，在任何適于向細(xì)胞遞送遺傳物質(zhì)的載體中。在此示范慢病毒載體。其它的合適載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體，具體地為致癌反轉(zhuǎn)錄病毒，以及腺伴隨病毒和腺病毒。慢病毒載體的實(shí)例包括人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)，從其中已經(jīng)發(fā)展了許多合適的載體。其它適于用作載體的慢病毒包括靈長類慢病毒組，包括人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、人免疫缺陷病毒3型(HIV-3)、猿免疫缺陷病毒(SIV)，猿AIDS反轉(zhuǎn)錄病毒(SRV-1)，人T-細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒4型(HTLV4)，以及牛慢病毒，馬慢病毒，貓慢病毒，和綿羊/山羊慢病毒組。除了通過以上指出的方法遞送癌基因之外，還可以通過其它本領(lǐng)域已知的方法遞送癌基因，例如，通過以與EP 235113中所教導(dǎo)的相似方式電穿孔入細(xì)胞中。
類似地，任何可選擇的標(biāo)記基因都可以用在攜帶癌基因的DNA構(gòu)建體中，并且其中許多是本領(lǐng)域已知的。在″Current Protocols in MolecularBiology″，編輯.Frederick M.Ausubel等，John Wiley & Sons，2001中描述了幾種可選擇的標(biāo)記系統(tǒng)以及將癌基因送入細(xì)胞中的載體和其它方法。
此外，許多合適的“自殺”基因的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選使用HSV-tk基因，但是可以使用其它的。Ausubel等，2001，同上給出了許多實(shí)例。
除了永生性的癌基因或癌基因的組合、可選擇的標(biāo)記基因以及自殺基因之外，DNA構(gòu)建體還可以包含一種或多種諸如促進(jìn)生長的所需的基因。
如本領(lǐng)域已知的，可以將前述基因可操作性地連接于一個(gè)或多個(gè)5′和/或3′表達(dá)控制區(qū)。關(guān)于啟動(dòng)子，也如本領(lǐng)域已知的，可以使用組成型的或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。
適用于本發(fā)明的DNA重組酶系統(tǒng)也是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選使用cre/lox系統(tǒng)(Cre重組酶，LoxP結(jié)合位點(diǎn))，但還可以使用其它系統(tǒng)，包括，但不限于來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP/FRT系統(tǒng)。將理解如果DNA構(gòu)建體包含特定重組酶的靶結(jié)合位點(diǎn)，則在逆轉(zhuǎn)OEG細(xì)胞的永生化作用中使用該重組酶。
US 5,629,159描述了多種DNA構(gòu)建體，其被示范用于胰島細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的永生化和去永生化?？梢匀炕虿糠值夭捎眠@些變體的一種或多種，以便利用本文所述的方法逆轉(zhuǎn)按照本發(fā)明的OEG細(xì)胞的永生化作用。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括(1)用包含側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的SV40Tag基因，HSV-tk基因和適合的可選擇標(biāo)記基因(例如，編碼熱穩(wěn)定抗原的neo或HSA)的慢病毒載體使得初級(jí)OEG細(xì)胞永生化；(2)選擇轉(zhuǎn)化子并使它們?cè)谂囵B(yǎng)物中生長；(3)通過用適合的載體，如腺病毒載體感染細(xì)胞而逆轉(zhuǎn)永生化作用，所述載體攜帶可表達(dá)的Cre重組酶基因以便切除癌基因；和，任選地，(4)用9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤處理破壞細(xì)胞，在所述細(xì)胞中沒有成功地刪去癌基因。已經(jīng)發(fā)展出這種類型的載體和系統(tǒng)用于各種初級(jí)細(xì)胞的可逆性永生化作用(Westerman & Leboulch，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938971-8976，1996)，但是尚未用于逆轉(zhuǎn)初級(jí)OEG細(xì)胞的永生化作用。更重要的是，在本發(fā)明之前，這種系統(tǒng)是否能夠用于生產(chǎn)OEG細(xì)胞是未知的，所述OEG細(xì)胞在移植后于體內(nèi)發(fā)揮作用，保持其軸突再生特性，并且致癌可能性足夠低從而可以安全用于這種用途。
如實(shí)施例中所詳細(xì)描述的，已經(jīng)對(duì)優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了試驗(yàn)。簡言之，按照Dr.Trono實(shí)驗(yàn)室所描述的方案，利用包含側(cè)翼為loxP重組靶位點(diǎn)的編碼SV40Tag的基因的重組慢病毒將來自人嗅球的OEG細(xì)胞永生化(實(shí)施例1)。隨后可以用Cre重組酶進(jìn)行點(diǎn)特異性重組而完成從永生化細(xì)胞上切除SV40Tag。用這種重組病毒永生化的細(xì)胞表達(dá)癌基因[(在此情況下為SV40Tag)或任何其它癌基因或其組合]，并且它們不會(huì)停止分裂。用Cre重組酶切除編碼SV40Tag的基因后，細(xì)胞停止生長并且DNA合成下降而且細(xì)胞在有限的時(shí)期后衰老。
總之，這些結(jié)果表明通過上述方法生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)-永生化的OEG細(xì)胞在移植后于體內(nèi)作為OEG細(xì)胞而起作用。而且，所述細(xì)胞的致癌可能性足夠低從而可以安全用于移植入需要這種治療的患者體內(nèi)。盡管對(duì)于其它的細(xì)胞類型已經(jīng)采用過類似的反永生化作用方案，但是成功逆轉(zhuǎn)永生化作用而在體內(nèi)產(chǎn)生功能性O(shè)EG細(xì)胞是意想不到的結(jié)果。事實(shí)上，反永生化作用后獲得的OEG細(xì)胞能夠促進(jìn)神經(jīng)元再生(實(shí)施例2)。
因而，本發(fā)明表明，通過用整合了癌基因(或癌基因的組合)、自殺基因和重組酶/重組酶靶系統(tǒng)的重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)初級(jí)OEG細(xì)胞，生成了一種充分分化的可逆性永生化非腫瘤原性O(shè)EG細(xì)胞系。在按照本發(fā)明所描述的結(jié)果之前，成功生成這種細(xì)胞系將會(huì)是不可預(yù)測的。
OEG細(xì)胞移植具有作為備選方法的很大潛力以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)、神經(jīng)元再生和對(duì)受到所述損害、損傷或病損的患者治療神經(jīng)元損害，損傷或SNC病損包括腦和脊髓的創(chuàng)傷性損害，軸突退行性疾病包括多發(fā)性硬化和神經(jīng)退行性疾病包括特別是阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨延頓病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)。發(fā)展這種療法的一種顯著限制已被本發(fā)明所克服，所述限制與用于移植的OEG細(xì)胞的受限的可獲得性有關(guān)。
所以，在一個(gè)方面本發(fā)明還涉及通過用有效量的包含以上定義的逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞的組合物處理而進(jìn)行的對(duì)患神經(jīng)元損害的人患者的治療方法。應(yīng)用的細(xì)胞數(shù)將依賴于病灶的大小和被治療患者的狀況。所述應(yīng)用一般通過外科手術(shù)暴露病損位點(diǎn)，從而能夠直接應(yīng)用本發(fā)明的細(xì)胞。
所述治療可以是自體的，因而利用由來自患者的OEG細(xì)胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞。這減小了不利的免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)，盡管它具有缺陷，即從患者體內(nèi)取樣品之時(shí)直到生成足夠的逆轉(zhuǎn)-永生化細(xì)胞用于治療為止需要一些時(shí)間?；蛘撸鲋委熆梢允钱愒吹?，使用易于獲得的可逆性永生化或逆轉(zhuǎn)-永生化的OEG細(xì)胞庫。這種細(xì)胞庫包含根據(jù)本文所述的本發(fā)明的方法制備的可逆性永生化或逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞的集合，并且選擇那些特征為在促進(jìn)軸突再生中具有大的組織相容性和有效性的細(xì)胞。這種細(xì)胞集合的可獲得性將顯著減少治療所需的時(shí)間，例如在CNS損傷之后，盡管可能需要使用免疫抑制性化合物。
包含可逆性永生化或逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞的用于移植的細(xì)胞庫也是本發(fā)明的目的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞庫包含人可逆性永生化或逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞系的文庫或多種人可逆性永生化或逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞系，其中每種都對(duì)至少一種或多種關(guān)鍵抗原基因，即，編碼組織相容性抗原的基因是純合的優(yōu)選每個(gè)細(xì)胞系對(duì)于至少一種存在于人群中的MHC(主要組織相容性復(fù)合物)等位基因是純合的，其中相對(duì)于多種OEG細(xì)胞系的剩余成員所述多種細(xì)胞系的每個(gè)成員對(duì)于不同組的MHC等位基因都是純合的。優(yōu)選地，所述文庫的每個(gè)成員對(duì)于組織相容性的不同組合或者M(jìn)HC抗原等位基因都是純合的?？梢詫⒈Ａ羲黾喜⒗鋬龇植嫉綉?yīng)用位點(diǎn)上。利用本發(fā)明的方法，可逆性永生化的或逆轉(zhuǎn)-永生化的OEG細(xì)胞系可以選自這些細(xì)胞的庫，對(duì)于與需要移植的患者的MHC等位基因匹配的MHC等位基因而言，所述細(xì)胞對(duì)于一種或多種組織相容性抗原等位基因是純合的。
本發(fā)明的治療方法可以組合以其它療法，諸如神經(jīng)營養(yǎng)因子或生長因子、模擬神經(jīng)遞質(zhì)作用的藥劑、抗凋亡劑、干擾生長軸突的抑制劑的試劑的應(yīng)用，以及身體復(fù)原和訓(xùn)練。可以使用聚合物支架以便允許再生性軸突的定向生長。
還要求包含本發(fā)明細(xì)胞的藥物組合物。所述細(xì)胞優(yōu)選包含于生理上合適的載體中，如生理上相容的媒介物，包括但不限于，培養(yǎng)基，諸如Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，RPMI 1640，F(xiàn)isher′s，Iscove′s，或McCoy′s培養(yǎng)基；或者優(yōu)選地，固體、半固體、凝膠狀或粘性支持介質(zhì)，諸如膠原蛋白、膠原糖胺聚糖、血纖蛋白、聚氯乙烯、聚氨基酸諸如聚賴氨酸或聚鳥氨酸、水凝膠、瓊脂糖、硫酸葡聚糖或硅氧烷。在特定的實(shí)施方案中，所述支持介質(zhì)可以包含生長因子或其它如上所述的試劑。
如果將固體、半固體或膠質(zhì)的支持物用作媒介物，可以將細(xì)胞導(dǎo)入媒介物的液相，隨后對(duì)其進(jìn)行處理，從而使它變得更加堅(jiān)固。在所述媒介物具有固體結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以將所述媒介物塑造成這樣的形狀，其可以與病損的形狀一致。
提供下列實(shí)施例以便更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。它們意在說明，但并非限定本發(fā)明。
實(shí)施例1利用Cre/Lox系統(tǒng)的人初級(jí)OEG細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)永生化作用在本實(shí)施例中所述的方案中，利用重組慢病毒將人OEG細(xì)胞永生化，所述慢病毒包含編碼SV40Tag的基因，側(cè)翼為Loxp位點(diǎn)。在用能夠傳遞編碼Cre重組酶的基因的重組腺病毒處理之前和之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特征鑒定，以便確定這種方法是否能夠產(chǎn)生對(duì)于移植在臨床上有用的OEG細(xì)胞系。
從來自死后(post-mortem)的成年供體人組織中獲得人細(xì)胞。所述組織屬于男性和女性供體，來自溴球；用0.1％胰蛋白酶解離并消化外層。供體的年齡似乎對(duì)于培養(yǎng)的成功沒有限制。用含有抗生素(青霉素/鏈霉素)和抗真菌素(Primocin)的無菌磷酸緩沖鹽(PBS)溶液洗滌組織。隨后用胰蛋白酶溶液于37℃將所述組織進(jìn)行控制性蛋白質(zhì)水解20分鐘。此后，通過將消化物質(zhì)經(jīng)過減小直徑的Pasteur移液管進(jìn)行機(jī)械破壞并培養(yǎng)于對(duì)這種細(xì)胞類型特別設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中。這種成分半確定的培養(yǎng)基包含來自牛垂體的提取物、弗司扣林、小量熱滅活的胎牛血清，組合以如在Moreno-Flores MT，Lim F，Martin-Bermejo MJ，Diaz-Nido J，Avila J，Wandosell F.″Immortalised olfactory ensheathing glia promote axonalregeneration of rat retinal ganglion neurons″J.Neurochem.2003；85861-871中所述的Dulbeco′s改良培養(yǎng)基(DMEM)。
將人細(xì)胞于37℃在7％CO2中維持于所述培養(yǎng)基中，并且隨后遵照Ramon-CuetoA，Avila J.″Olfactory ensheathing gliaproperties and function″.Brain Res.Bull.1998；46175-187中所示的通用標(biāo)準(zhǔn)將其鑒定為OEG細(xì)胞。結(jié)果顯示于圖1-3中。表1總結(jié)了由鼠OEG細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、施旺細(xì)胞和oligodendocite O2星形膠質(zhì)細(xì)胞系和人OEG細(xì)胞所分析的不同細(xì)胞標(biāo)記。
表1分析的細(xì)胞標(biāo)記
(f)纖維染色；(d)彌漫性染色；n.d.未測為了將這些人OEG細(xì)胞永生化，利用包含編碼SV40大T抗原的基因作為癌基因的表示為pLOX-Ttag-Ires-TK(圖5)的慢病毒構(gòu)建體，我們使用了由Dr.D.Trono′的實(shí)驗(yàn)室所描述的一種可逆性系統(tǒng)(Naldini L，Blomer U，Gage FH，Trono D，Verma IM.“Efficient transfer，integration，and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injectedwith a lentiviral vector”.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1996；9311382-11388；Salmon P，Oberholzer J，Occhiodoro T，Morel P，Lou J，Trono D.″Reversibleimmortalization of human primary cells by lentivector-mediated transfer ofspecific genes″.Mol.Ther.2000；2404-414)。或者，也可以利用包含編碼端粒末端轉(zhuǎn)移酶催化亞基的基因作為癌基因的表示為pLOX-HTERT-Ires-TK(圖6)或包含編碼Bmi-1蛋白的基因作為癌基因的表示為pLOX-CWBmil(圖7)的慢病毒構(gòu)建體。
由這些感染，在那些具有最高生長速率的人細(xì)胞之后獲得了建立的克??；并且最初，獲得了一些克隆并且鑒定為OEG細(xì)胞。例如用pLOX-Ttag-Ires-TK永生化的細(xì)胞，表達(dá)T抗原(＞85％)，S100和3-PDGH。
實(shí)施例2成年視網(wǎng)膜軸突再生分析將由成年大鼠視網(wǎng)膜節(jié)神經(jīng)元(RGN)的軸突再生的促進(jìn)作用用作測定細(xì)胞培養(yǎng)物中再生能力的標(biāo)準(zhǔn)方法。這種方法比其它神經(jīng)突發(fā)生(neuritogenic)分析更接近地反映OEG細(xì)胞的體內(nèi)修復(fù)性能。
簡言之，所用的方法如下將視網(wǎng)膜從P60大鼠眼中解剖出來，用0.1％胰蛋白酶解離并進(jìn)行消化。用2mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制劑停止消化，并通過將消化物質(zhì)經(jīng)過減小直徑的Pasteur移液管而獲得細(xì)胞的精細(xì)懸浮液。將細(xì)胞離心并重懸于成分確定的培養(yǎng)基中(Moreno-Flores等，2003)。將RGN鋪于單層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞初級(jí)OEG上或在建立的細(xì)胞系中。
為了進(jìn)行免疫組化分析，培養(yǎng)七天后，將神經(jīng)元-人OEG細(xì)胞混合培養(yǎng)物用4％的低聚甲醛進(jìn)行固定。圖4顯示用針對(duì)神經(jīng)元蛋白諸如神經(jīng)元特異性微管蛋白(334)、軸突蛋白諸如MAP1B-SMI31或MAP2(305)，或體-樹蛋白MAP2(514)的抗體染色的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元的軸突再生能力。
我們的數(shù)據(jù)顯示可逆性永生化的人OEG細(xì)胞在與初級(jí)OEG或來自大鼠OEG細(xì)胞的克隆細(xì)胞系相似的程度上促進(jìn)由成年RGN的軸突再生。
考慮到最近的幾個(gè)研究已經(jīng)證明了OEG細(xì)胞促進(jìn)體內(nèi)CNS軸突再生的能力(Li Y，F(xiàn)ield PM，Raisman G.“Repair of adult rat corticospinal tractby transplants of olfactory ensheathing cells”.Science 1997；2772000-2002；Li Y，F(xiàn)ield PM，Raisman G.″Regeneration of adult rat corticospinal axonsinduced by transplanted olfactory ensheathing cells″.J.Neurosci.1998；1810514-10524；Ramon-Cueto A，Plant GW，Avila J，Bunge MB.“Long-distance axonal regeneration in the transected adult rat spinal cord ispromoted by olfactory ensheathing glia transplants”.J.Neurosci.1998；183803-3815；and Ramon-Cueto A，Cordero MI，Santos-Benito FF，Avila J.“Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in theirspinal cords by olfactory ensheathing glia”.Neuron 2000；25425-435)，即使在完全橫切脊髓之后仍具有給人深刻印象的運(yùn)動(dòng)和感覺功能恢復(fù)[Ramon-Cueto等，2000，在前引用的]，并且我們最近的初步實(shí)驗(yàn)顯示大鼠來源的建立的細(xì)胞系在培養(yǎng)物和體內(nèi)保持這種神經(jīng)元再生性能力，我們推斷人OEG細(xì)胞的可逆永生化作用并不產(chǎn)生再生能力的顯著減弱，即使到目前為止并不知道潛在的分子機(jī)制。
據(jù)我們所知，這是第一次證明可逆性永生化的人OEG細(xì)胞能夠促進(jìn)培養(yǎng)的來自的成熟哺乳動(dòng)物CNS的神經(jīng)元的軸突再生。我們的人OEG細(xì)胞系代表有用的工具，來促進(jìn)OEG細(xì)胞在研究和應(yīng)用中的用途。這些細(xì)胞系和類似物單獨(dú)或在包含其的藥物組合物中，可以用來治療CNS病損。
權(quán)利要求
1.一種可逆性-或逆轉(zhuǎn)-永生化的嗅鞘神經(jīng)膠質(zhì)(OEG)細(xì)胞系。
2.一種按照權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其用于治療方法中。
3.一種按照權(quán)利要求2的細(xì)胞系，其用于促進(jìn)神經(jīng)元再生。
4.一種按照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的細(xì)胞系，其是人細(xì)胞系。
5.一種包含前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的細(xì)胞系和藥用載體的藥物組合物。
6.一種制備用于移植入患者體內(nèi)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群的方法，其包括a)提供初級(jí)OEG細(xì)胞的樣品；b)通過用一種DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化OEG細(xì)胞而使所述OEG細(xì)胞永生化，由此產(chǎn)生永生化的OEG細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建體包含含有癌基因或癌基因組合的可去除DNA片段；c)培養(yǎng)所述永生化的OEG細(xì)胞；d)選擇保持它們的功能特性的那些永生化的OEG克隆細(xì)胞系；和e)從所述永生化的OEG細(xì)胞中去除癌基因或癌基因的組合，所述去除導(dǎo)致產(chǎn)生用于移植入患者體內(nèi)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群。
7.權(quán)利要求6的方法，其中OEG細(xì)胞獲自人供體。
8.權(quán)利要求6的方法，其中通過將所述癌基因或癌基因的組合置于重組酶靶位點(diǎn)的側(cè)翼而將它制成可去除的，并且通過將一種基因?qū)胗郎募?xì)胞中而完成去除，所述基因被表達(dá)來產(chǎn)生一種特異性識(shí)別重組酶靶位點(diǎn)的重組酶。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述重組酶是Cre重組酶并且所述重組酶靶位點(diǎn)是loxP位點(diǎn)。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述癌基因是編碼SV40大T抗原的基因，編碼端粒末端轉(zhuǎn)移酶催化亞基的基因、編碼Bmi-1蛋白的基因或所述癌基因的任何組合。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述可去除的DNA片段還包含自殺基因，其編碼能夠通過一種外源試劑破壞所述永生化細(xì)胞的基因產(chǎn)物，如果所述可去除的DNA片段未從所述細(xì)胞中去除的話。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述自殺基因是編碼單純皰疹病毒胸苷激酶的基因，并且通過暴露于9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤而破壞所述細(xì)胞，如果所述可去除的DNA片段未從所述細(xì)胞中去除的話。
13.由權(quán)利要求6的方法生產(chǎn)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群。
14.一種對(duì)患者治療神經(jīng)損害的方法，所述方法包括將足量的權(quán)利要求13的OEG細(xì)胞移植入患者體內(nèi)以促進(jìn)患者神經(jīng)元損傷區(qū)域的神經(jīng)元再生。
15.一種制備用于移植入患者體內(nèi)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群的方法，其包括a)提供初級(jí)OEG細(xì)胞的樣品；b)通過用一種DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化OEG細(xì)胞而使所述OEG細(xì)胞永生化，所述DNA構(gòu)建體包含含有癌基因或癌基因組合、可選擇的標(biāo)記基因以及編碼單純皰疹病毒胸苷激酶的基因的可去除DNA片段，這些基因一起排列于loxP位點(diǎn)的任一側(cè)側(cè)翼上；c)培養(yǎng)所述永生化的OEG細(xì)胞；d)選擇保持其功能特性的那些永生化的OEG克隆細(xì)胞系；和e)通過從永生化的OEG細(xì)胞中去除所述DNA片段來逆轉(zhuǎn)OEG細(xì)胞的永生化作用，所述去除是通過將編碼Cre重組酶的基因?qū)胨鲇郎腛EG細(xì)胞，以進(jìn)行DNA片段在loxP位點(diǎn)上的切除而實(shí)現(xiàn)的，所述切除導(dǎo)致產(chǎn)生用于移植入患者體內(nèi)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述OEG細(xì)胞獲得自人供體。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述癌基因是編碼SV40大T抗原的基因，編碼端粒末端轉(zhuǎn)移酶催化亞基的基因、編碼Bmi-1蛋白的基因或所述癌基因的任何組合。
18.一種由權(quán)利要求10的方法生產(chǎn)的功能性O(shè)EG細(xì)胞集群。
19.一種對(duì)患者治療神經(jīng)損害的方法，包括將足量的權(quán)利要求18的OEG細(xì)胞移植入患者體內(nèi)以促進(jìn)患者神經(jīng)元損傷區(qū)域的神經(jīng)元再生。
20.一種永生化的OEG細(xì)胞，其包含用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的初級(jí)OEG細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建體包含在癌基因或癌基因的組合側(cè)翼的兩個(gè)重組酶靶位點(diǎn)，所述癌基因或癌基因的組合賦予OEG細(xì)胞永生化作用，其中當(dāng)靶位點(diǎn)暴露于特異性識(shí)別所述靶位點(diǎn)的重組酶時(shí)，所述永生化作用可以由通過在重組酶靶位點(diǎn)上的剪切來切除癌基因而成為可逆的。
21.權(quán)利要求20的永生化OEG細(xì)胞，其中所述重組酶靶位點(diǎn)是loxP位點(diǎn)并且所述永生化作用可以通過在loxP位點(diǎn)上的Cre重組酶剪切而成為可逆的。
22.權(quán)利要求20的永生化OEG細(xì)胞，其中所述DNA構(gòu)建體還包含可選擇的標(biāo)記基因。
23.權(quán)利要求20的永生化OEG細(xì)胞，其中所述DNA構(gòu)建體還包含自殺基因，其編碼能夠通過一種外源試劑破壞所述永生化細(xì)胞的基因產(chǎn)物，如果所述癌基因未從細(xì)胞中去除的話。
24.權(quán)利要求23的永生化OEG細(xì)胞，其中所述自殺基因是編碼單純皰疹病毒胸苷激酶的基因，并且所述外源試劑是9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤。
25.權(quán)利要求20的永生化OEG細(xì)胞，其中所述OEG細(xì)胞獲自人供體。
26.一種包含權(quán)利要求25的永生化OEG細(xì)胞集群的細(xì)胞系。
27.一種在移植到患者中后有功能的逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞，其是通過將權(quán)利要求20的永生化OEG細(xì)胞中的DNA構(gòu)建體暴露于重組酶而產(chǎn)生的，所述重組酶在重組酶靶位點(diǎn)通過剪切而切除所述癌基因或癌基因的組合。
28.一種對(duì)患者治療神經(jīng)損害的方法，包括將足量的權(quán)利要求27的逆轉(zhuǎn)-永生化OEG細(xì)胞移植入患者體內(nèi)以促進(jìn)患者神經(jīng)元損傷區(qū)域的神經(jīng)元再生。
29.一種細(xì)胞文庫，其包含按照權(quán)利要求6-12或15-17任一項(xiàng)的方法制備的可逆性永生化或逆轉(zhuǎn)-永生化的OEG細(xì)胞的集合。
30.可逆性永生化或逆轉(zhuǎn)-永生化的嗅鞘神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在制備治療神經(jīng)元損害的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明是基于嗅鞘神經(jīng)膠質(zhì)(OEG)細(xì)胞促進(jìn)成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中軸突再生的能力。這種特定的能力可以歸因于幾種因素的組合，諸如細(xì)胞膜的分子組成和/或分泌某些分子的能力；以及減小神經(jīng)膠質(zhì)創(chuàng)傷和在受損的CNS中伴隨著新生長軸突的能力。我們從初級(jí)的人OEGs發(fā)展出永生化的細(xì)胞系。由來自供體的死后人組織培養(yǎng)所述細(xì)胞并利用可逆的系統(tǒng)進(jìn)行永生化。通過其以與初級(jí)OEGs相似的方式促進(jìn)由成年大鼠視網(wǎng)膜節(jié)神經(jīng)元的軸突再生能力而選擇這些OEG人克隆細(xì)胞系中的一些。這些細(xì)胞系，單獨(dú)或在包含這些細(xì)胞的藥物組合物中，可以用來修復(fù)CNS中的神經(jīng)元損害。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1823161SQ200480020663
公開日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2004年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月18日
發(fā)明者M·T·莫雷諾·弗洛雷斯, M·T·馬丁·貝爾梅霍, J·阿維拉·德·格拉多, F·萬多謝爾·胡拉多, J·迪亞斯·尼多, F·利姆, E·帕斯特拉納·伊斯基耶多 申請(qǐng)人:科學(xué)研究高等機(jī)關(guān)