專利名稱：骨生成促進劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨生成促進劑，它包含乳過氧化物酶(lactoperoxidase)和/或其消化產(chǎn)物作為有效成分。而且，本發(fā)明涉及包含乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物的食品、飲料、藥物或飼料，其用于促進骨生成。
背景技術(shù)：
近年來，各種骨疾病如骨質(zhì)疏松、骨折、腰痛隨著老齡人口的增長而顯著增加。在骨組織中，骨生成和骨吸收保持恒定。年輕人中，骨生成和骨吸收維持平衡，但隨著年齡的增長，由于各種原因這種平衡被打破，向骨吸收轉(zhuǎn)移(疏松)。長時間持續(xù)這種狀態(tài)使得骨組織變脆，導(dǎo)致發(fā)生各種骨疾病如骨質(zhì)疏松、骨折和腰痛。認為防止疏松可預(yù)防各種骨疾病如骨質(zhì)疏松、骨折和腰痛。
通常，為防止疏松和預(yù)防或治療各種骨疾病如骨質(zhì)疏松、骨折和腰痛，曾實施以下方法(1)食物補鈣，(2)輕微運動，(3)隔離，(4)藥物等。對于食物補鈣，使用鈣鹽如碳酸鈣和磷酸鈣以及天然鈣制劑如蛋殼粉和魚骨粉。然而，它們不是完全合適的口服消化物質(zhì)。對于輕微運動，據(jù)說最好是慢跑或走路。然而，體弱的人甚至進行輕微的運動也認為非常麻煩，臥床老人則幾乎不能進行運動。對于補充活化維生素D3，據(jù)說隔離是有用的。但是，即使進行了隔離，也只得到不充分的作用。如果給予藥物，采用已知可有效治療骨質(zhì)疏松癥的1-α-羥基維生素D3、降鈣素制劑等。但是，這些物質(zhì)本身是藥物而不能用作食品。
另一方面，本發(fā)明人通過研究奶中的骨生成促進因子和骨吸收抑制因子，獲得了具有骨生成促進作用和骨吸收抑制作用并可用作食物的物質(zhì)。在研究過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，乳過氧化物酶可促進成骨細胞分化而具有骨生成促進作用。成骨細胞是在骨生成中起主要作用的細胞，存在于骨組織的表面并分泌骨基質(zhì)蛋白。磷酸鈣晶體沉積在骨基質(zhì)蛋白上形成硬骨組織。
另一方面，破骨細胞產(chǎn)生自造血干細胞，存在于松質(zhì)骨表面并溶解骨。認為破骨細胞能溶解骨基質(zhì)(骨吸收)，接著成骨細胞合成骨基質(zhì)，導(dǎo)致骨生成、生長(成型)或代謝(重塑)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，乳過氧化物酶可促進在骨代謝中起著骨生成主要作用的成骨細胞的分化，而具有骨生成促進作用和骨增強作用。
乳過氧化物酶大量存在于奶中，是一種含有血紅素鐵的糖蛋白，分子量約為80000。牛奶中乳過氧化物酶的含量比人奶中高。人奶中的含量為0.01mg/100mL或更少，而牛奶中的含量約為3mg/100mL。乳過氧化物酶的功能包括在過氧化氫的存在下氧化各種物質(zhì)。也就是說，乳過氧化物酶氧化硫氰根離子(SCN-)產(chǎn)生的氧硫氰根離子(OSCN-)可抑制某些種類微生物的增殖。SCN-是活的機體中一種代謝物，一般存在于奶中，因而奶中的乳過氧化物酶可抑制產(chǎn)生過氧化氫的微生物的增殖。如上所述，認為乳過氧化物酶作為一種牛奶抗菌劑起作用，也稱為乳過氧化物酶系統(tǒng)。關(guān)于乳過氧化物酶的用途，已知技術(shù)有，在發(fā)酵的奶中加入乳過氧化物酶，以在產(chǎn)品的周轉(zhuǎn)和防腐過程中抑制酸度的過度增加(例如，參見專利文獻1)；加入抗衰老劑(例如，參見專利文獻2)；加入低卡路里營養(yǎng)劑(例如，參見專利文獻3)；加入治療動物皮膚病的制劑(例如，參見治療文獻4)等，以維持產(chǎn)品在使用前合適的酸度。但是，乳過氧化物酶對成骨細胞分化的促進作用尚未闡明，因而乳過氧化物酶還沒有用于骨增強。
為了闡明牛奶的骨增強作用，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，存在于牛奶中的微量堿性蛋白具有成骨細胞增殖促進作用，骨增強作用和骨吸收抑制作用，它們在專利中已公開(例如，參見專利文獻5)。但是，尚不知道該堿性蛋白中所含的乳過氧化物酶具有骨生成促進作用。
專利文獻1WO 92/13064專利文獻2JP 05-124980A專利文獻3JP 09-107917A專利文獻4JP 07-233086A專利文獻5JP 08-151331A

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題在研究具有成骨細胞增殖促進作用、骨增強作用和骨吸收抑制作用的物質(zhì)過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，乳過氧化物酶可促進成骨細胞的分化而具有骨生成促進作用和骨增強作用。并且發(fā)現(xiàn)，乳過氧化物酶的消化產(chǎn)物也可促進成骨細胞的分化而具有相同的作用，因而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種含有乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物作為有效成分的新型骨生成促進劑。并且，本發(fā)明的目的是通過加入乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物，提供具有骨生成促進作用的食品、飲料、藥物或飼料。
考慮到骨質(zhì)疏松疾病的性質(zhì)，本發(fā)明的目的是提供骨生成促進劑和食品、飲料、藥物或飼料來促進骨生成，這些物質(zhì)可在每天的食物中長時間給予直接消化或口服消化，對骨直接發(fā)揮骨生成促進作用，因而預(yù)計可有效預(yù)防或緩解/治療骨質(zhì)疏松癥。
解決問題的方法從哺乳動物的奶中制備乳過氧化物酶。奶來源的例子包括牛、水牛、人、豬、綿羊、山羊、馬等的奶。已知乳過氧化物酶并可由以下方法制備例如，使奶材料如脫脂奶和乳清蛋白與陽離子交換樹脂中接觸，該樹脂吸附堿性蛋白，再以0.1-1.0M濃度的鹽洗脫該蛋白，然后通過反滲透(RO)膜脫鹽并濃縮，電滲析(ED)等，需要時可干燥。并且，用磺化載體(JP 03-109400A)純化乳過氧化物酶的方法可用于工業(yè)生產(chǎn)。并且，在本發(fā)明中，也可使用基因工程技術(shù)制備乳過氧化物酶，例如，WO 91-06639中描述的重組LPO等。注意到乳過氧化物酶是市售產(chǎn)品，由Sigma，Sederma等銷售。
通過用蛋白酶如胰蛋白酶、胰酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、激肽釋放酶、組織蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶或V8蛋白酶消化上述乳過氧化物酶，得到的乳過氧化物酶消化產(chǎn)物是一種肽混合物。優(yōu)選將乳過氧化物酶消化至分子量10000或更低。
本發(fā)明的作用一種包含乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物作為有效成分的骨生成促進劑，以及可促進骨生成的含有本發(fā)明乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物的食品、飲料、藥物、飼料，這些物質(zhì)可促進成骨細胞分化而提高骨生成效果，因而具有骨增強作用可用于預(yù)防或緩解各種骨疾病如骨質(zhì)疏松癥等。此外，本發(fā)明骨生成促進劑和促進骨生成的食品或飲料的優(yōu)點在于，它們從容易獲得的物質(zhì)制備，質(zhì)量保持一致，不需要復(fù)雜的加工可便宜地生產(chǎn)，并可大量生產(chǎn)。
附圖簡要說明

圖1顯示對給予本發(fā)明實施例1的乳過氧化物酶的骨質(zhì)疏松大鼠與對照大鼠(不給予乳過氧化物酶)作了股骨斷裂應(yīng)力的比較。
優(yōu)選實施方式如果給予本發(fā)明骨生成促進劑，可采用未經(jīng)修飾的乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物。然而，需要時，也可用乳糖、淀粉等稀釋后制成粉末、顆粒、片劑或膠囊使用，或根據(jù)常規(guī)方法配制到飲料等中。而且，可將乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物加入到食品或飲料如奶、乳品飲料、咖啡飲料、果汁、果凍、餅干、面包、面條和香腸中，以促進成骨細胞的分化來促進骨生成。而且，同時采用含有氯化鈣、碳酸鈣、乳酸鈣、蛋殼、乳源性鈣等可吸收性鈣制劑可進一步提高骨生成促進作用。并且，通過在飼料中加入上述有效成分可促進家畜、家禽等的骨生成。
成人需每天口服10mg或更多(以固體質(zhì)量計)的乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物，作為本發(fā)明有效量的骨生成促進劑及可促進骨生成的食品或飲料，以獲得骨生成促進作用。而且，在骨生成促進劑中，需加入5mg-100g/100g(以固體質(zhì)量計)乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物，而在促進骨生成的食品或飲料中，需加入5mg-100g/10g(以固體質(zhì)量計)乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物。
如上所述，通過服食本發(fā)明骨生成促進劑以促進成骨細胞的分化，可促進骨生成，而預(yù)防或緩解各種骨疾病如骨質(zhì)疏松癥。此外，還可獲得骨增強作用。應(yīng)注意乳過氧化物酶是一種天然乳產(chǎn)生的成分，并證實其對大鼠沒有急性毒性。
下面，結(jié)合實施例和試驗實施例將更詳細地描述本發(fā)明。這些實施例和試驗實施例僅是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1用去離子水充分洗滌填充有400克陽離子交換樹脂、磺化Chitopearl(FujiboHoldings，Inc.制造)的色譜柱(直徑5cm×高30cm)，然后，以流速25mL/min使40L未滅菌的脫脂奶通過該柱。然后，用去離子水充分洗滌該柱，用含有1.5M氯化鈉的0.02M碳酸鹽緩沖液(pH7.0)進行洗脫。接著，用S-Sepharose FF柱(Amersham Biosciences制造)吸附含有乳過氧化物酶的洗脫組份，用去離子水充分洗滌該柱。用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡柱子，再用0-1M線性梯度的NaCl洗脫所吸附的組份，收集含有乳過氧化物酶的組份。然后，用HiLoad 16/60Superdex 75pg(Amersham Biosciences)，通過凝膠過濾色譜處理該組份，得到11g乳過氧化物酶。注意這樣得到的乳過氧化物酶純度為91％，無需進一步修飾可用作骨生成促進劑。
實施例2將5mg實施例1所得乳過氧化物酶懸浮在10mL水中，加入蛋白酶胰蛋白酶(Sigma制造)，使最終濃度為0.01重量％，然后在37℃下酶處理1小時。接著，90℃熱處理5分鐘使酶失活，再凍干，得到4.1mg乳過氧化物酶消化產(chǎn)物。用凝膠過濾技術(shù)分析這樣得到的乳過氧化物酶消化產(chǎn)物，顯示該產(chǎn)物的分子量為10000或更低。
試驗實施例1研究實施例1得到的乳過氧化物酶和實施例2得到的乳過氧化物酶消化產(chǎn)物對成骨細胞分化的促進作用。具體地說，用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(FlowLaboratories制造)將人源性前成骨細胞MG63細胞配成密度2×104細胞/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，在5％CO2、37℃下培養(yǎng)4天，以該細胞作為試驗培養(yǎng)細胞。然后，將培養(yǎng)液換為含有1％胎牛血清的培養(yǎng)液。將實施例1得到的乳過氧化物酶加入到培養(yǎng)液中，使最終濃度為10和100μg/mL，同時將實施例2得到的乳過氧化物酶消化產(chǎn)物溶液(90℃熱處理5分鐘后的溶液和未經(jīng)熱處理的溶液)加入到此培養(yǎng)液中，使最終濃度各自為100μg/mL，37℃培養(yǎng)5天。收集培養(yǎng)上清液，用前膠原I型C-肽EIA試劑盒(Takara MK101)測定培養(yǎng)上清液中的I型膠原水平，研究成骨細胞分化促進活性。用無乳過氧化物酶溶液作為對照。膠原水平以各樣品的I型膠原測定水平與對照的I型膠原測定水平的百分比(％)表示。結(jié)果如表1所示。
表1

在加入實施例所得乳過氧化物酶或?qū)嵤├?所得乳過氧化物酶消化產(chǎn)物的各組中，發(fā)現(xiàn)與對照組(無乳過氧化物酶)相比，I型膠原水平增加，因此它們具有成骨細胞分化促進作用。
同時發(fā)現(xiàn)，乳過氧化物酶消化產(chǎn)物傾向于產(chǎn)生更多I型膠原，比乳過氧化物酶具有更強的成骨細胞增殖活性。
試驗實施例2通過動物實驗，研究實施例1所得乳過氧化物酶的骨增強作用。動物實驗采用4周齡SD雌性大鼠。預(yù)先喂養(yǎng)1周后，對大鼠進行外科手術(shù)，切除卵巢，然后用缺鈣飼料喂養(yǎng)5周，用該大鼠進行動物實驗。發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過外科手術(shù)切除卵巢并用缺鈣飼料喂養(yǎng)5周的大鼠明顯處于骨質(zhì)疏松狀態(tài)。
將處于骨質(zhì)疏松狀態(tài)的大鼠分為2組，每組6只對照組(組A)，不加入乳過氧化物酶；試驗組B(組B)加入1.0重量％乳過氧化物酶。用試驗飼料喂養(yǎng)這些大鼠4個月又1周，如表2所示。注意加入酪蛋白調(diào)節(jié)各試驗飼料，使具有相同的氮含量(17.06％)。并且，在各試驗飼料中，每100g混合有300mg鈣、230mg磷和50mg鎂。
表2

4個月又1周后，取出每組大鼠的股骨和脛骨，通過骨折性質(zhì)測定裝置(Rheometer Max，型號RX-1600，Aitecno Inc.制造)測定股骨的骨強度。結(jié)果如圖1所示。參考圖1，發(fā)現(xiàn)給予乳過氧化物酶組(組BLPO)的股骨斷裂應(yīng)力比對照組(組A無LPO)高。
實施例3(制備骨生成促進劑)將93.4g水合晶體葡萄糖、5g碳酸鈣、1g糖酯、0.5g矯味劑加入到100mg實施例1得到的乳過氧化物酶中，混合，將混合物制成片劑，得到本發(fā)明骨生成促進劑。
實施例4(制備可促進骨生成的乳品飲料)將實施例1得到的乳過氧化物酶加入到原料奶中，使?jié)舛葹?g/L，在勻漿壓力120kg/cm2下勻漿化該混合物，然后75℃加熱15秒滅菌，得到本發(fā)明可促進骨生成的乳品飲料。
實施例5(制備可促進骨生成的乳品飲料)將實施例2得到的乳過氧化物酶消化產(chǎn)物加入到原料奶中，使?jié)舛葹?g/L，在勻漿壓力120kg/cm2下勻漿化該混合物，然后75℃加熱15秒滅菌，得到本發(fā)明可促進骨生成的乳品飲料。
實施例6(制備可促進骨生成的飲料)將40g實施例1得到的乳過氧化物酶溶于50L去離子水中，用乳酸將pH調(diào)節(jié)至3.2，然后加入1kg蔗糖和10g矯味劑溶解，再90℃加熱15秒滅菌，將50mL該溶液裝入到各個有蓋玻璃瓶中，密封玻璃瓶，得到本發(fā)明可促進骨生成的飲料。
實施例7(制備可促進骨生成的餅干)混合以下重量比例的粗品原料實施例1得到的乳過氧化物酶0.005％，面粉50.0％，糖20.0％，鹽0.5％，人造黃油12.5％，蛋12.1％，水4.1％，碳酸氫鈉0.1％，碳酸氫銨0.2％和碳酸鈣0.5％，得到生面團。使生面團成形并烘焙，得到本發(fā)明可促進骨生成的餅干。
實施例8(制備可促進骨生成的果凍)混合以下重量比例的粗品原料實施例1得到的乳過氧化物酶0.0005％，果糖20.0％，砂糖15.0％，淀粉糖漿5.0％，瓊脂1.0％，矯味劑0.11％，鈣0.1％和水58.79％。然后將該混合物裝入到容器中，加熱滅菌，得到本發(fā)明可促進骨生成的果凍。
實施例9(制備可促進骨生成的精制干酪)混合以下重量比例的粗品原料實施例1得到的乳過氧化物酶0.005％，高達干酪43.0％，切達干酪43.5％，檸檬酸鈉2.0％，乳源性鈣1.0％和水10.5％。85℃下乳化該混合物，得到本發(fā)明可促進骨生成的精制干酪。
實施例10(制備可促進骨生成的嬰幼兒制品)混合以下重量比例的粗品原料實施例1得到的乳過氧化物酶0.001％，脫脂奶75.61％，乳清蛋白濃縮物2.36％，乳糖13.86％，礦物混合物0.32％，水溶性維生素混合物0.32％和含脂溶性維生素的脂肪7.53％，得到本發(fā)明可促進骨生成的嬰幼兒制品。
實施例11(制備狗糧)混合以下重量比例的粗品原料實施例1得到的乳過氧化物酶0.001％，大豆糕12.0％，脫脂奶粉14.0％，大豆油4.0％，玉米油2.0％，棕櫚油28.0％，玉米淀粉15.0％，面粉9.0％，麩皮2.0％，維生素混合物9.0％，礦物質(zhì)混合物2.0％和纖維素3.0％，得到本發(fā)明可促進骨生成的狗喂養(yǎng)飼料(狗糧)。
工業(yè)可應(yīng)用性一種包含乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物作為有效成分的骨生成促進劑，以及可促進骨生成的含有本發(fā)明乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物的食品、飲料、藥物、飼料等，這些物質(zhì)可促進成骨細胞分化以促進骨生成作用，所以它們可用于人或家畜的骨增強并可用于預(yù)防或緩解各種骨疾病如骨質(zhì)疏松癥。
權(quán)利要求
1.一種骨生成促進劑，其包含作為有效成分的乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物。
2.一種促進骨生成的食品、飲料、藥物或飼料，其含有乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供通過促進成骨細胞分化而能促進骨生成的骨生成促進劑，以及可促進骨生成的食品、飲料、藥物或飼料。即一種通過促進成骨細胞分化而促進骨生成的骨生成促進劑，其包含活性成分乳過氧化物酶和/或其經(jīng)蛋白酶如胰蛋白酶消化所獲得的消化產(chǎn)物；以及可促進骨生成的含有乳過氧化物酶和/或其消化產(chǎn)物的食品、飲料、藥物或飼料。
文檔編號A61P19/08GK1835766SQ200480023179
公開日2006年9月20日 申請日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月15日
發(fā)明者元賣睦美, 松山博昭, 森田如一, 芹澤篤, 川上浩 申請人:雪印乳業(yè)株式會社