骨修復(fù)促進(jìn)劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供包含至少一種B-型利尿鈉肽受體激動劑作為活性成分的骨修復(fù)促進(jìn)劑。
【專利說明】骨修復(fù)促進(jìn)劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及含有利尿鈉肽受體NPR-B激動劑作為活性成分的骨修復(fù)促進(jìn)劑，所述 激動劑用C-型利尿鈉肽（CNP)或CNP衍生物表示。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨骼系統(tǒng)由骨組織和軟骨以及肌肉組成，在身體各部分的運(yùn)動中發(fā)揮作用。而且， 部分中樞神經(jīng)組織和內(nèi)臟位于顱骨和脊柱內(nèi)，骨骼系統(tǒng)在保護(hù)中樞神經(jīng)組織和內(nèi)臟免受因 外界所致物理性應(yīng)力中發(fā)揮作用。此外，骨骼系統(tǒng)是鈣和磷的重要貯庫，骨的內(nèi)部起血細(xì)胞 的制備場所的作用。人的骨骼系統(tǒng)由大約200塊骨形成，根據(jù)其形狀和性質(zhì)分類為若干種。 稱為長骨或管狀骨的骨包括肱骨和股骨，特征為在長管狀骨干的兩端都有鼓起的骨骺。當(dāng) 從表面上看時，長骨似乎由密質(zhì)骨（骨密質(zhì)）構(gòu)成，但內(nèi)部是稀疏結(jié)構(gòu)（松質(zhì)骨），并且骨髓 位于其中。骨骺的表面是與密質(zhì)骨相連的薄皮質(zhì)，內(nèi)部由十字交叉的薄骨膠原的松質(zhì)骨構(gòu) 成。
[0003] 通常，認(rèn)為在長骨中，當(dāng)骨組織經(jīng)強(qiáng)大外力等而受損，以及為了便于治療而進(jìn)行切 骨程序等時，響應(yīng)于這種狀態(tài)，生理功能嘗試修復(fù)骨以使骨具備其原形狀和強(qiáng)度。此時，認(rèn) 為牽涉到由許多不同類型的細(xì)胞和體液因子高度控制的復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)。
[0004] 目前，骨折的治療經(jīng)手術(shù)實施。在治療期間，受累部分必須長時間固定等，因此，患 者的負(fù)擔(dān)大。還有因不充分的修復(fù)、異常骨形成等所致而再骨折的風(fēng)險。在嚴(yán)重?fù)p傷、骨質(zhì) 疏松癥/衰老伴發(fā)的骨脆等背景的情況下，存在進(jìn)一步延長治療的高可能性。因此，要求骨 修復(fù)促進(jìn)劑促進(jìn)骨修復(fù)和縮短修復(fù)期或者在恢復(fù)后恢復(fù)骨的正常形狀和強(qiáng)度。但是，至今 可以滿足上述要求的作用劑尚未投入實際應(yīng)用。骨折的愈合過程分三個階段進(jìn)行：炎癥期、 修復(fù)期和重塑期，然而相互有一定程度重疊（非專利文獻(xiàn)1)。首先，緊接著骨折之后（炎癥 期），免疫細(xì)胞清除損傷的軟組織、骨碎片、內(nèi)出血的血液等。由于免疫細(xì)胞的活性和血流的 增加，骨折部位周圍變膨脹和疼痛。因在受累部分與血腫形成伴發(fā)的炎癥反應(yīng)所致，未分化 的間充質(zhì)細(xì)胞被局部誘導(dǎo)，這些細(xì)胞分化成骨原細(xì)胞比如成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞或者軟骨細(xì) 胞，這幾種細(xì)胞在后續(xù)修復(fù)期發(fā)揮重要作用。
[0005] 修復(fù)期始于骨折幾天內(nèi)，需要幾周至幾個月，在此期間，形成修復(fù)的新骨（外骨 痂）。清除骨折裂縫的血腫，產(chǎn)生肉芽組織，形成軟骨痂。軟骨痂被硬骨痂逐漸代替的過程 (軟骨內(nèi)骨化）和由存在于骨膜中的骨原細(xì)胞形成新骨的過程（膜內(nèi)骨化）同時進(jìn)行。已 知在形成骨痂然后骨痂被更硬的結(jié)構(gòu)代替的過程中，各種類型的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨 細(xì)胞等控制彼此的活性。認(rèn)為這些細(xì)胞由在炎癥期期間誘導(dǎo)至損傷部位的具有多能性的未 分化間充質(zhì)細(xì)胞分化而來。認(rèn)為這些未分化的間充質(zhì)細(xì)胞是骨和軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉 細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的共同前體細(xì)胞，這些細(xì)胞各自受組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件控制（非 專利文獻(xiàn)2)。在骨折部位，還預(yù)期牽涉多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
[0006] 在重塑期中，將骨修復(fù)至其正常狀態(tài)的原有條件，但是，為此需要長時間比如幾個 月。在此過程中，具有低密度的外骨痂被逐漸再吸收，被正常骨代替，從而最終恢復(fù)正常形 狀和強(qiáng)度。因此，骨修復(fù)不是由骨性聯(lián)接而是由在骨性聯(lián)接后骨折部位的形狀來完成，骨膠 原回收，即骨痂重塑的進(jìn)程，對于骨折部位機(jī)械性恢復(fù)是重要的。
[0007] 另一方面，雖然在活體生長的骨生長過程中也形成骨，但這是不同于骨修復(fù)過程 的生理學(xué)現(xiàn)象。在長骨的生長中，在骨骺部分重復(fù)軟骨形成并及其被骨的代替，骨生長。在 骨干與骨骺之間有生長板軟骨（骨骺軟骨），根據(jù)軟骨細(xì)胞的分化階段，可將生長板軟骨自 關(guān)節(jié)軟骨表面向骨干分類為休眠軟骨細(xì)胞、增殖軟骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞三層。長骨以兩 種方式生長，即其中存在于關(guān)節(jié)側(cè)的前體細(xì)胞分化為休眠軟骨細(xì)胞的外加生長，和其中增 殖軟骨細(xì)胞在增殖同時生長的內(nèi)加生長。增殖軟骨細(xì)胞在某個部位一起增大，變成肥大軟 骨細(xì)胞。在肥大軟骨細(xì)胞周圍的軟骨基質(zhì)中，出現(xiàn)基質(zhì)小泡，小泡充當(dāng)軟骨鈣化的起始點(diǎn)。 鈣化的軟骨基質(zhì)被消化和吸收。此時，在軟骨與骨之間的邊界部分，血管侵入其中已C存肥 大軟骨細(xì)胞的軟骨腔隙，而且破壞和吸收軟骨的破軟骨細(xì)胞出現(xiàn)在邊界部分，鈣化的軟骨 基質(zhì)被吸收，肥大軟骨細(xì)胞本身也分泌基質(zhì)金屬蛋白酶比如MMP-3和MMP-13,作為其結(jié)果， 軟骨基質(zhì)降解。破軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，稍后成骨細(xì)胞侵入軟骨基質(zhì)以形成初級小梁。如上文描 述，血管和破軟骨細(xì)胞侵入軟骨腔隙內(nèi)、鈣化的軟骨基質(zhì)降解以及骨基質(zhì)通過成骨細(xì)胞加 入消失的軟骨基質(zhì)中的縫隙內(nèi)，連續(xù)進(jìn)行，骨骺中軟骨增加，然后軟骨被骨代替，從而長骨 生長。當(dāng)成熟時，骨生長需要的生長板骨化并消失（非專利文獻(xiàn)3)。
[0008] C-型利尿鈉肽（CNP)是作用于軟骨細(xì)胞的肽激素，在骨生長中發(fā)揮重要作用（非 專利文獻(xiàn)4、非專利文獻(xiàn)5等）。利尿鈉肽是一系列肽激素的通稱，所述肽激素與包括鳥苷 酸環(huán)化酶的利尿鈉肽受體特異性結(jié)合，激活鳥苷酸環(huán)化酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cGMP水平，從而表 達(dá)各種生物活性。
[0009] 在哺乳動物中，主要已知三種利尿鈉肽：心房利尿鈉肽（ANP)、腦利尿鈉肽（BNP) 和CNP 15ANP和BNP是NPR-A (利尿鈉肽受體-A，也稱為：GC-A)的激動劑，主要在調(diào)節(jié)體 液容積中發(fā)揮作用，在臨床上已被用作心力衰竭的治療藥物。
[0010] CNP在1990年首次在大腦中發(fā)現(xiàn)，起初認(rèn)為CNP發(fā)揮顱神經(jīng)肽的功能，然而后來， 變得顯然的是CNP也存在于末梢（periphery)。在早期的基礎(chǔ)研究中，報道了其在軟骨以外 的成骨細(xì)胞中表達(dá)及其對骨再吸收的作用（非專利文獻(xiàn)6和非專利文獻(xiàn)7)。至于CNP的體 內(nèi)生理學(xué)作用，根據(jù)先前的研究，已報道：CNP敲除小鼠主要因骨骼異常所致而表現(xiàn)出明顯 的生長停滯，通過與軟骨特異性CNP轉(zhuǎn)基因小鼠雜交挽救該表型（非專利文獻(xiàn)4);在連續(xù) 靜脈內(nèi)給予CNP-22的正常小鼠以及全身性和軟骨特異性CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中促進(jìn)生長板軟 骨的增殖和促進(jìn)骨生長（非專利文獻(xiàn)5和非專利文獻(xiàn)8)等。已證實CNP在骨生長期間的 軟骨形成中，特別是在生長板軟骨中發(fā)揮非常重要的作用。
[0011] 在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中，體長隨著長骨在主要軸向方向的過度生長而變長。在此類 小鼠中，根據(jù)對生長板的組織化學(xué)分析，已證實：1)生長板因增殖軟骨細(xì)胞層和肥大軟骨 細(xì)胞層的生長所致而變厚；2)增殖軟骨細(xì)胞層的細(xì)胞外基質(zhì)增加；和3)成熟肥大軟骨細(xì)胞 的大小增加。除了這些事實以外，因為在所述小鼠生長板中通過肥大軟骨細(xì)胞層中的BrdU 染色所顯示的軟骨細(xì)胞的增殖方面尚未觀察到明顯改變，所以認(rèn)為CNP并非在生長板中促 成軟骨細(xì)胞的分化或增殖，而是在生長板各個分化階段中促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化表型的表達(dá) (非專利文獻(xiàn)8)。
[0012] 根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，CNP預(yù)期在發(fā)育或生長過程中發(fā)揮改善軟骨發(fā)育不良的作用，還預(yù) 期有可能臨床用作針對包括軟骨發(fā)育不全在內(nèi)的矮小癥的治療藥物（非專利文獻(xiàn)9)。此 夕卜，在非專利文獻(xiàn)10中，已報道包含于關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨細(xì)胞由CNP控制分化。
[0013] 如上文描述，公認(rèn)為CNP對骨/軟骨的作用是控制涉及骨生長中的生長板或關(guān)節(jié) 軟骨的軟骨形成，尚無關(guān)于在經(jīng)歷不同于骨生長的過程的骨折或骨切斷的愈合中對骨修復(fù) 過程的作用的報道。
[0014] 至今已進(jìn)行多種關(guān)于將某些體液因子應(yīng)用于骨修復(fù)的研究。例如，已經(jīng)有力地進(jìn) 行旨在通過局部給予細(xì)胞生長因子比如骨形態(tài)發(fā)生因子（BMP)或堿性成纖維細(xì)胞生長因 子（bFGF)促進(jìn)骨修復(fù)的研究。已報道bFGF具有增加骨痂的作用，在臨床試驗中通過直接給 予至骨折位點(diǎn)，縮短治療期（非專利文獻(xiàn)11)。但是，在動物實驗中，證實對骨密度和機(jī)械性 強(qiáng)度無影響，視為不直接促進(jìn)骨性聯(lián)接。另外，已報道將低劑量的已知具有激活成骨細(xì)胞作 用的甲狀腺激素（PTH)間歇式地給予全身，可明顯增加骨痂的骨密度和機(jī)械性強(qiáng)度，但是， 已知PTH激活破骨細(xì)胞的作用，進(jìn)一步指出了加重癥狀的可能性（非專利文獻(xiàn)12)。此外， 還要注意產(chǎn)生諸如骨肉瘤等副作用的可能性（非專利文獻(xiàn)13)。如上文描述，在骨修復(fù)中表 現(xiàn)出充分作用和效應(yīng)的骨修復(fù)促進(jìn)藥物尚未投入實際使用，期望發(fā)現(xiàn)或研發(fā)一種新藥。
[0015] 引用目錄 非專利文獻(xiàn) 非專利文獻(xiàn) I: Schindeler A等，Semin Cell Dev Biol, (2008)，19卷，5 期， 459-466 頁 非專利文獻(xiàn)2: Ohishi M等，J Cell Biochem.，（2010)，109卷，2期，277-282 頁 非專利文獻(xiàn) 3: Emons J 等，Horm Res Paediatr.，（2011)，75 卷，6 期，383-91 頁 非專利文獻(xiàn)4: Chusho H等，Proc Nat Acad Sci.，（2001)，98卷，7期，4016-4021 頁 非專利文獻(xiàn) 5: Yasoda A 等，Nat Med.，（2004)，10 卷，1 期，80-86 頁 非專利文獻(xiàn)6: Suda M等，Biochem Biophys Res Commun.，（1996)，223卷，1 期， 1-6頁 非專利文獻(xiàn) 7: Holiday LS 等，J Biol Chem.，（1995)，270 卷，32 期， 18983-18989 頁 非專利文獻(xiàn) 8: Kake T等，Am J Physiol Endocrinol Metab.，（2009)，297 卷，6 期，E1339-E1348 頁 非專利文獻(xiàn) 9: Yasoda A 等，Endocrinology, (2009)，150 卷，7 期，3138-3144 頁 非專利文獻(xiàn) 10: STEPHEN DW 等，Tissue Engineering: Part A, (2008)，14 卷，3 期，441-448 頁 非專利文獻(xiàn) 11: Kawaguchi H 等，J Bone Miner Res.，（2010)，25 卷，12 期， 2735-2743 頁 非專利文獻(xiàn) 12: Horwitz MJ等，J Bone Miner Res., (2011)，26 卷，9 期， 2287-2297 頁 非專利文獻(xiàn) 13: Vahle JL 等，Toxicol Pathol·, (2002)，30 卷，12 期，312-321 頁 發(fā)明概述 技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于提供用于促進(jìn)由骨折愈合代表的骨修復(fù)機(jī)制的藥劑。
[0016] 問題的解決方案 作為對促進(jìn)骨折愈合過程中的骨修復(fù)的藥物的深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過反 復(fù)皮下給予CNP衍生物至骨折模型大鼠，骨折部位的機(jī)械性強(qiáng)度與未給予藥物組相比在更 早的時間點(diǎn)恢復(fù)至骨折之前的狀態(tài)等。本發(fā)明人基于這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步研究，從而完成本發(fā) 明。
[0017] 本發(fā)明提供下列發(fā)明。
[0018] (1)提供骨修復(fù)促進(jìn)劑，其含有至少一種利尿鈉肽受體NPR-B激動劑作為活性成 分。
[0019] (2) (1)的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中NPR-B激動劑是C-型利尿鈉肽（CNP)或其活性片 段；或其突變體、其衍生物或其修飾體；或者抗利尿鈉肽受體NPR-B抗體。
[0020] (3) (1)的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中NPR-B激動劑是hCNP-22 (SEQ ID NO: 1)、 hCNP6-22 (SEQ ID NO: 1 的氨基酸號 6 至 22)或 hCNP-53 (SEQ ID NO: 2);或其突變體、 其衍生物或其修飾體。
[0021] (4) (1)的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中NPR-B激動劑是hCNP-22或hCNP6-22的衍生物或 修飾體。
[0022] (5) (2)至⑷中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中衍生物是這樣的衍生物，其中選自 由免疫球蛋白Fc區(qū)衍生的肽、血清白蛋白和在生長素釋放肽C-端側(cè)的部分肽的至少一種 附加肽結(jié)合至hCNP-22或hCNP6-22的N-端、C端或者其兩端。
[0023] (6) (5)的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中衍生物由其中自SEQ ID NO: 2的N端缺失1個以 上至30個以下的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列或者選自SEQ ID NO: 6至15的氨基酸序列組 成。
[0024] (7) (2)至⑷中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中修飾體是這樣的修飾體，其中PEG 或其類似親水聚合物結(jié)合至hCNP-22、hCNP6-22或hCNP-53的N端、C端或其兩端。
[0025] (8) (1)的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中NPR-B激動劑是SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 2的 氨基酸號18至53、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 15中的任一個氨基酸序列組成的肽。
[0026] (9) (1)至（8)中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中骨損傷部位中直至骨修復(fù)的時間 段縮短。
[0027] (10) (1)至（8)中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中在骨修復(fù)后骨組織的骨強(qiáng)度和/ 或連續(xù)性恢復(fù)至等同于未骨折的骨中相應(yīng)部位的水平。
[0028] (11) (1)至（8)中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中通過在骨修復(fù)的骨痂形成階段給 予骨修復(fù)促進(jìn)劑和在骨痂形成的后期或者形成完成之后停止給予而實現(xiàn)促進(jìn)骨修復(fù)。
[0029] (12) (1)至（11)中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其用于治療骨折。
[0030] 此外，本發(fā)明將提供促進(jìn)骨修復(fù)的方法(其中使用上述（1)至（12)中任一項的骨 修復(fù)促進(jìn)劑)、用作骨修復(fù)促進(jìn)劑的活性成分的NPR-B激動劑或其用途，即以下發(fā)明。
[0031] (13) -種促進(jìn)骨修復(fù)的方法，其包括將有效量的NPR-B激動劑給予需要骨修復(fù) 的受試者。
[0032] (14) -種治療骨折的方法，其包含將有效量的NPR-B激動劑給予骨折患者。
[0033] (15) -種NPR-B激動劑，其用于在需要骨修復(fù)的受試者中促進(jìn)骨修復(fù)。
[0034] (16) (15)的NPR-B激動劑，其用于治療骨折患者的骨折。
[0035] 發(fā)明的有益效果 本發(fā)明的NPR-B激動劑具有通過促進(jìn)骨折愈合過程的骨修復(fù)縮短骨折治療期的作用。 此外，通過使修復(fù)后的骨強(qiáng)度恢復(fù)至等同于骨折之前的水平，改善治療的預(yù)后，此外，再骨 折的風(fēng)險小。
[0036] 附圖簡述 圖1顯示給予藥物后8周大鼠骨折模型的股骨軟X射線圖像。上部分（第1組）是對 照組，中間部分（第2組）是其中以10 nmol/kg給予CNP衍生物A的組，下部分（第3組） 是其中以100 nmol/kg給予CNP衍生物A的組。通過從左邊開始以RL的順序排列來顯示 每組10個模型中各個體的左和右股骨。R是未處理的右股骨，L是已向其實施了骨折手術(shù) 的左股骨。
[0037] 圖2是顯示在大鼠閉合式股骨骨折模型中骨折治療后4周的股骨強(qiáng)度的圖。陰影 線條圖代表媒介物給予組，黑線條圖代表CNP衍生物A給予組，R是未處理的右股骨，L是已 實施骨折治療的左股骨。此外，垂直軸顯示骨的硬度（N X mm/deg)。
[0038] 圖3顯示這樣的直方圖，其顯示在圖2所顯示的骨強(qiáng)度測量值的分布。3A顯示未 處理的右股骨的結(jié)果，3B顯示已實施骨折治療的左股骨的結(jié)果。陰影線條圖代表媒介物給 予組，黑線條圖代表向其給予CNP衍生物的組。水平軸顯示硬度的水平（N X _/deg)，垂 直軸顯示屬于各種硬度水平的例數(shù)。
[0039] 圖4顯示這樣的圖，其顯示在大鼠閉合式股骨骨折模型中骨折治療后1周在股骨 中各基因（4A: sox9基因，4B: II型膠原基因，4C: X型膠原基因）的表達(dá)水平。陰影 線條圖代表媒介物給予組，黑線條圖代表CNP衍生物A給予組。"假手術(shù)"顯示已實施假手 術(shù)治療的大鼠左股骨的結(jié)果，"骨折"顯示已實施骨折治療的大鼠左股骨的結(jié)果。垂直軸顯 示通過泛素 C的mRNA表達(dá)水平標(biāo)化的各基因 mRNA表達(dá)水平。
[0040] 圖5顯示各種NPR-B激動劑在大鼠閉合式股骨骨折模型中的作用（5A:血液CGMP 水平，5B:已對其實施了骨折治療的左股骨的骨折部位的骨痂直徑，5C:已對其實施了 骨折治療的股骨中X型膠原基因表達(dá)水平）。在所有圖中，陰影線條圖代表媒介物給予組， 黑線條圖代表給予NPR-B激動劑的組（從左邊起：CNP衍生物A、hCNP-53、CNP衍生物C和 CNP衍生物D)。
[0041] 在圖5A中，垂直軸顯示血液中cGMP水平。在圖5B中，垂直軸顯示骨痂的直徑 (mm)。在圖5C中，垂直軸顯示通過泛素 C mRNA表達(dá)水平標(biāo)化的X型膠原基因 mRNA的表達(dá) 水平。
[0042] 實施方案的說明 在本發(fā)明中，"利尿鈉肽受體NPR-B激動劑"意指與B-型利尿鈉肽受體（利尿鈉肽受 體-B，也稱為：鳥苷酸環(huán)化酶B (GC-B)，有時稱為"NPR-B"）結(jié)合并具有激活其鳥苷酸環(huán)化 酶的作用（下文，"NPR-B激動劑活性"）的物質(zhì)，有時簡稱為"NPR-B激動劑"。代表性NPR-B 激動劑的實例包括例如C-型利尿鈉肽（CNP)。本發(fā)明的NPR-B激動劑無特殊限定，只要 NPR-B激動劑是具有NPR-B激動劑活性的物質(zhì)，可使用CNP和其活性片段、其突變體、其衍 生物、其修飾體等。此外，本發(fā)明的激動劑包括與CNP不具有結(jié)構(gòu)相似性的肽或小分子化合 物，只要此類物質(zhì)具有NPR-B激動劑活性。
[0043] 本發(fā)明CNP的實例包括由22個氨基酸組成的人衍生的CNP-22 (hCNP-22: GLSKGCFGLK LDRIGSMSGL GC: SEQ ID NO: 1，其具有哺乳動物比如豬和大鼠的共同氨基酸 序列）、人衍生的 CNP-53 (hCNP-53,氨基酸序列：DLRVDTKSRA AWARLLQEHP NARKYKGANK KGLSKGCFGL KLDRIGSMSG LGC: SEQ ID NO: 2)、雞衍生的CNP-22 (GLSRSCFGVK LDRIGSMSGL GC: SEQ ID NO: 3)和蛙衍生的 CNP-22 (GYSRGCFGVK LDRIGAFSGL GC: SEQ ID NO: 4)。
[0044] 認(rèn)為在各種類型的CNP中，由包含于序列中的2個C殘基之間的二硫鍵所形成 的環(huán)結(jié)構(gòu)（例如，在hCNP-22中，在SEQ ID NO: 1的6位C與22位C之間形成二硫鍵， 形成環(huán)結(jié)構(gòu)）對于與NPR-B受體結(jié)合和活性重要（Furuya, M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，（1992)，183，3 期，964-969 頁；Silver, MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. , (2006), 15, 14-21 頁; 和 Calderone, A. , Minerva Endocrinol., (2004)，29，113-127頁）。根據(jù)Furuya等的報道，已報道CNP6-22 (其為僅由環(huán)結(jié)構(gòu)組 成的肽（由SEQ ID NO: 1的氨基酸號6至22組成的肽）），或者甚至是其中將ANP環(huán)結(jié)構(gòu) N-端側(cè)序列和C-端側(cè)序列分別添加至環(huán)結(jié)構(gòu)的N端和C端的肽，顯示與hCNP-22幾乎相同 的NPR-B激動劑活性。該報道還顯示在hCNP-22的9位L和10位K具有突變的肽減弱活 性，但在除以上2處以外的位置（例如16位S和17位M)具有突變的肽，和其中ANP的10 至12位的氨基酸序列取代為L-K-L (其為hCNP-22的相應(yīng)序列（SEQ ID NO: 1的9至11 位））的肽，顯示與hCNP-22幾乎相同的NPR-B激動劑活性等。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，對于NPR-B 激動劑活性而言重要的環(huán)結(jié)構(gòu)氨基酸序列是CFGLKLDRIG-Xaal-Xaa2-SGLGC (這里，Xaal 代表S或A, Xaa2代表M、F或E; SEQ ID NO: 5)，該序列稱為"環(huán)結(jié)構(gòu)序列"。
[0045] 在本發(fā)明中，具有生物學(xué)活性的肽或蛋白的"活性片段"意指由與肽或蛋白的生物 學(xué)活性相關(guān)的區(qū)域組成并保留至少部分的肽或蛋白所具備的生物學(xué)活性的活性片段。由 SEQ ID NO: 1至4中任一個的氨基酸序列的至少部分氨基酸序列組成并具有NPR-B激動劑 活性的肽可用作本發(fā)明CNP的活性片段?；钚云蔚膶嵗ㄓ缮鲜霏h(huán)結(jié)構(gòu)序列（SEQ ID NO: 5的氨基酸序列）組成的肽，具體實例包括hCNP6-22; SEQIDN0: 1、3或4的肽，其中 氨基酸序列1至5位的一些或全部氨基酸缺失，其中所述缺失包括含有1位的連續(xù)氨基酸； 和SEQ ID NO: 2的肽，其中氨基酸序列1至31位的一些或全部氨基酸缺失，其中所述缺失 包括含有1位的連續(xù)氨基酸，然而，活性片段不限于此，任何具有環(huán)結(jié)構(gòu)序列和NPR-B激動 劑活性的活性片段都可用作本發(fā)明的CNP活性片段。
[0046] 作為本發(fā)明的NPR-B激動劑，可使用上述活性片段本身，此外，也可使用肽例如活 性片段的衍生物，只要它保留預(yù)期的激動劑活性，其中將一個或更多個氨基酸添加至活性 片段的N端、C端或其兩端。此類肽的實例可包括其中將從ANP的C端和N端衍生的序列 添加至 hCNP6_22 的 N 端、C 端或其兩端的肽（Furuya, M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，（1992)，183，3 期，964-969 頁）。
[0047] 在本發(fā)明中，具有生物學(xué)活性的肽或蛋白的"突變體"意指其中在肽或蛋白的氨基 酸序列中一個至幾個區(qū)域中的一個至幾個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加（在下文稱 為"取代等"）并且保留至少部分的肽或蛋白所具備的生物學(xué)活性的突變體。"幾個區(qū)域"通 常意指3個區(qū)域，優(yōu)選2個區(qū)域。"幾個氨基酸"通常意指10個氨基酸，優(yōu)選5個氨基酸， 更優(yōu)選3個氨基酸，甚至更優(yōu)選2個氨基酸。在多個區(qū)域進(jìn)行取代等的情況下，可以進(jìn)行取 代、缺失、插入和添加中僅任一種，或者可進(jìn)行取代、缺失、插入和添加中的兩種或更多種的 組合。此外，用于取代等的氨基酸可以是天然存在的氨基酸，可以是修飾體比如?；问降?天然存在的氨基酸，或者可以是人工合成的氨基酸類似物。另外，只要保留原肽或蛋白的部 分活性，可以選擇其中進(jìn)行了取代等的任何區(qū)域，但優(yōu)選對其進(jìn)行取代等的區(qū)域是原肽或 蛋白的活性區(qū)域或受體結(jié)合區(qū)域以外的區(qū)域。
[0048] 例如，作為CNP突變體，可采用其中在任何區(qū)域已進(jìn)行取代等的突變體，只要保留 NPR-B激動劑活性，但CNP突變體優(yōu)選包括其中保留上述環(huán)結(jié)構(gòu)序列并且在環(huán)結(jié)構(gòu)序列區(qū) 域以外的區(qū)域已進(jìn)行取代等的肽。具體的CNP突變體可以是其中在描述于SEQ ID NO: 1 至4的氨基酸序列中預(yù)期的一個或更多個區(qū)域內(nèi)可進(jìn)行一個至幾個氨基酸的取代等的突 變體，只要具備NPR-B激動劑活性，但是其可優(yōu)選為其中在描述于SEQ ID NO : 1至4的任一 個的氨基酸序列中除了 SEQ ID NO :5中所顯示的氨基酸以外的氨基酸處的一個至幾個區(qū) 域內(nèi)進(jìn)行一個至幾個氨基酸的取代等的突變體，可更優(yōu)選其中在描述于SEQ ID NO :1、3或 4的氨基酸序列的1至5位處的一個至幾個區(qū)域內(nèi)進(jìn)行一個至幾個氨基酸的取代等的突變 體，或者其中在描述于SEQ ID NO :2的氨基酸序列的1至31位處的一個至幾個區(qū)域內(nèi)進(jìn)行 一個至幾個氨基酸的取代等的突變體。
[0049] 作為本發(fā)明的NPR-B激動劑，可采用上述突變體本身，此外，還可以采用肽比如突 變體的衍生物，其中將一個或更多個氨基酸加至突變體的N端、C端或其兩端，只要保留預(yù) 期的激動劑活性。
[0050] 作為CNP突變體的具體實例，有報道：在hCNP-22的17位和18位帶有突變的肽 具有與hCNP-22相同的NPR-B激動劑活性；甚至在其中這類突變體的環(huán)結(jié)構(gòu)元件的N端和 C端被由ANP衍生的序列置換的突變體的衍生物中，已顯示NPR-B激動劑活性為hCNP-22 活性的約90% ;在9至11位任一位帶有突變的肽顯示hCNP-22的50%以上的NPR-B激動劑 活性；在10和11位都帶有突變的肽具有hCNP-22的40%以上的NPR-B激動劑活性；等等 (Furuya, M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，（1992)，183，3期，964-969頁）。 此外，在另一份參考文獻(xiàn)中，已描述各種hCNP-22突變體保留NPR-B激動劑活性；并進(jìn)一步 具有對由中性內(nèi)肽酶（NEP)產(chǎn)生的裂解的耐受性，所述中性內(nèi)肽酶是CNP分解代謝酶；等等 (W0 2009/067639 小冊子）。
[0051] 在本發(fā)明中，具有生物學(xué)活性的肽或蛋白的"衍生物"意指這樣的融合肽，其包含 肽或蛋白的氨基酸序列，所述肽或蛋白上另外添加了另一種肽或蛋白，并且保留了至少部 分的該生物活性肽或蛋白所具備的生物學(xué)活性。具有至少部分此類生物學(xué)活性（在本發(fā)明 中，結(jié)合NPR-B并激活鳥苷酸環(huán)化酶的作用）的融合肽也稱為生物活性肽的衍生物。在本 發(fā)明的衍生物中，附加肽可融合于原生物活性肽或蛋白的C端或N端之一，或者附加肽可融 合于原生物活性肽或蛋白的C端和N端兩端。作為待添加的肽，肽無特殊限定，但是優(yōu)選不 具有自身生物活性的肽。此外，附加肽可以直接鍵合，或者可以通過由一個至幾個氨基酸組 成的連接序列鍵合。作為連接序列，已知各種連接系列，但是經(jīng)常使用含有許多G、S等的連 接序列。此類附加肽的實例包括免疫球蛋白（優(yōu)選IgG)的Fc區(qū)、血清白蛋白和來自生長 素釋放肽C-端側(cè)的部分序列。用作本發(fā)明NPR-B激動劑的衍生物的實例可包括CNP (優(yōu)選 hCNP-22或hCNP-53)的衍生物和CNP活性片段（優(yōu)選hCNP6-22)的衍生物，優(yōu)選hCNP-22 的衍生物或者h(yuǎn)CNP6-22的衍生物。
[0052] CNP衍生物的具體實例可包括例如公開于美國專利申請US 2010-305031公布內(nèi) 容中的各種CNP衍生物（美國專利申請公布內(nèi)容中的SEQ ID NO: 109、110、124至130、157 和158)。在該文中，已報道在其中將從生長素釋放肽C-端側(cè)衍生的部分序列添加至生物 活性肽比如ANP、CNP和促胃動素的衍生物中，在保留原肽的生物活性的同時改善了血液半 衰期。在該報道中，在任何其中將含有從生長素釋放肽C端衍生的W k-X1-Y-Zm-Wn (這里，W 代表堿性氨基酸比如Lys和Arg ;Y代表酸性氨基酸比如Asp和Glu ;X和Z相同或相互不 同，可以是除了酸性氨基酸和堿性氨基酸以外的任何氨基酸；k和η相互獨(dú)立，是整數(shù)1或 2 ;1和m相互獨(dú)立，是自然數(shù)0、1或2 ;此類序列的實例優(yōu)選包括RKESKK、RKDSKK、RKSEKK 和RKSDKK)的肽添加至CNP的N端或C端或者其兩端的各種衍生物中，也保留NPR-B激動 劑活性，并且延長血液半衰期。該公布內(nèi)容的描述結(jié)合到本說明書的描述中。
[0053] 此外，作為CNP或CNP活性片段的衍生物，甚至在其中將ANP的C-端部分添加至 hCNP-22 C-端的肽，或者其中將ANP的N-端部分和C-端部分加至hCNP6-22 (CNP活性片 段的衍生物）的N端和C端的肽中，保留具有與hCNP-22大致相同的程度的NPR-B激動劑 活性（Furuya, M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，（1992)，183，3 期，964-969 頁）。此外，在另一份參考文獻(xiàn)中，已描述hCNP-22和hCNP-53的各種衍生物保留NPR-B激動 劑活性；此外在各種衍生物中多種衍生物具有NEP降解耐受性；等等（W0 2009/067639小 冊子）。而且，在描述于該WO 2009/067639小冊子的衍生物中，已報道定義為本說明書中的 CNP衍生物D、由SEQ ID NO :15的氨基酸序列組成的衍生物對小鼠軟骨發(fā)育不全模型的藥 理學(xué)作用（Florence L.等·，Am. J. Hum. Genet.，（2012)，91 (6)，1108-1114 頁：正 文：http://www. sciencedirect. com/science/article/pii/S000292971200537X:補(bǔ)充： http://download, cell. com/AJHG/mmcs/journals/0002-9297/PIIS000292971200537X. mmcl. pdf) 〇
[0054] 本發(fā)明的CNP-22衍生物的實例包括由其中自N端連續(xù)的I個以上至30個以下氨 基酸從CNP-53氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)中缺失的氨基酸序列組成的肽。此類衍生物優(yōu) 選由自 hCNP-53 (SEQIDN0: 2) N 端連續(xù)的 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24或25個氨基酸缺失的氨基酸序列組成的肽，更優(yōu)選hCNP-36,其中來自hCNP-53 N端 的17個連續(xù)氨基酸缺失（由SEQ ID NO: 2的氨基酸號18至53的氨基酸序列組成的肽， CNP衍生物C)。
[0055] 這些各種CNP衍生物和CNP活性片段的衍生物可優(yōu)選用作本發(fā)明的NPR-B激動 齊U。本發(fā)明的NPR-B激動劑更優(yōu)選為由其中來自N端的1個以上至30個以下（優(yōu)選25個 以下，更優(yōu)選20個以下）連續(xù)氨基酸從SEQ ID N0:2中缺失的氨基酸序列組成的衍生物，或 者任何選自SEQ ID NO: 6至15的衍生物；而且優(yōu)選CNP衍生物A (SEQ ID NO: 13)、CNP 衍生物C (SEQ ID NO: 2的氨基酸號18至53)，或者CNP衍生物D (SEQ ID NO: 15)。
[0056] 在本發(fā)明中，具有生物學(xué)活性的肽或蛋白的"修飾體"意指這樣的修飾體，其中通 過與另一種化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)修飾包含于肽或蛋白中的氨基酸的一個至幾個區(qū)域，此外 在此類修飾體中保留至少部分的肽或蛋白所具備的生物學(xué)活性。只要在此類修飾體中保留 原肽或蛋白的活性，任何區(qū)域可選作為進(jìn)行修飾的區(qū)域。例如，在其中化學(xué)物質(zhì)大至某種程 度比如聚合物的修飾體中，優(yōu)選在肽或蛋白的除開活性區(qū)域或受體結(jié)合部位以外的區(qū)域進(jìn) 行修飾。另外，在用于防止被分解代謝酶裂解的修飾的情況下，優(yōu)選在裂解位點(diǎn)進(jìn)行修飾。
[0057] 例如，只要具備NPR-B激動劑活性，CNP的修飾體可以是其中在SEQ ID NO: 1至 4中任一個的氨基酸序列中預(yù)期的一個或更多個區(qū)域被修飾的修飾體，但是優(yōu)選其中在SEQ ID N0:1至4中任一個的氨基酸序列中，在除了 SEQ ID N0:5顯示的氨基酸以外的氨基酸中 的一個至幾個區(qū)域被修飾的修飾體，更優(yōu)選其中在SEQ ID NO :1、3或4的氨基酸序列的1 至5位處的一個至幾個區(qū)域被修飾的修飾體。此外，在賦予抗NEP裂解的耐受性的修飾的 情況下，已知NEP在環(huán)結(jié)構(gòu)中SEQ ID NO :5的1位C與2位F之間的位點(diǎn)裂解CNP，該位點(diǎn) 包含于各種CNP肽內(nèi)，因此，可修飾該區(qū)域。
[0058] 此外，上述CNP活性片段、CNP突變體及其衍生物的修飾體也包括于本發(fā)明中。只 要此類各種修飾體保留NPR-B激動劑活性，它們也可用于本發(fā)明。
[0059] 作為化學(xué)修飾的方法，已知多種方法，例如已知添加用于制藥技術(shù)（藥理學(xué)上使 用）的高分子量聚合物比如聚乙二醇（PEG)和聚乙烯醇（PVA)的方法；其中將作為連接體 的化合物添加至側(cè)鏈中的氨基比如K殘基，經(jīng)由該連接體鍵合另一種蛋白等（例如血清白 蛋白）的方法；等等。但是，方法不限于此，可采用多種方法。
[0060] 作為CNP、其活性片段、其突變體及其衍生物的這類修飾體的具體實例，例如 在TO 2009/067639小冊子中公開其中將各種類型的水性聚合物比如PEG與hCNP-22 和hCNP-53鍵合的修飾體，和其中Cys6-Phe7的肽鍵（hCNP-22中的NEP裂解位點(diǎn)） 被-CH 2-NH-、-C(=0)-N(R)-(其中R代表低級烷基比如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、 異丁基、仲丁基或叔丁基）的假肽鍵取代的多重修飾體，等等保留NPR-B激動劑活性，其中 許多具有比hCNP-22更改善的血液半衰期。此外，至于各種生物活性肽的修飾體的制備方 法，例如可以參考美國專利申請US 2009-0175821等的公開內(nèi)容適當(dāng)制備修飾體。
[0061] 環(huán)結(jié)構(gòu)對于CNP和NPR-B受體的結(jié)合是重要的。因此，特別是在其中附加肽或部 分鍵合至其末端部分的衍生物或修飾體中，此類附加肽或部分影響環(huán)結(jié)構(gòu)較少，可在充足 程度上預(yù)期衍生物或修飾體保留NPR-B激動劑活性，而不抑制與NPR-B受體結(jié)合。這得到 上述許多參考文獻(xiàn)的支持。
[0062] 上述CNP或其活性片段；或其突變體、其衍生物及其修飾體可以是從天然細(xì)胞或 組織收集的那些，可以是通過使用遺傳工程或細(xì)胞工程技術(shù)制備的那些，可以是化學(xué)合成 的那些，或者可以是其中將如上獲得的那些經(jīng)酶處理或者化學(xué)處理以修飾氨基酸殘基或者 除去部分氨基酸序列的那些。這些物質(zhì)可以根據(jù)常規(guī)方法參考本說明書及引用文獻(xiàn)的描述 而適當(dāng)?shù)刂苽洹?br> [0063] 可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法容易地測量某種物質(zhì)是否具有NPR-B 激動劑活性。具體來講，所述方法是將物質(zhì)加至其中強(qiáng)制表達(dá)NPR-B(Suga S.等， Endocrinology，（1992)，130 (1)，229-239頁）的培養(yǎng)細(xì)胞中，測量培養(yǎng)細(xì)胞的胞內(nèi) cGMP水平。描述"保留部分NPR-B激動劑活性"意指當(dāng)在同一試驗中測量NPR-B激動劑物 質(zhì)和CNP的NPR-B激動劑活性時，NPR-B激動劑物質(zhì)增加 cGMP活性的峰值保留CNP的峰值 的至少10%以上，優(yōu)選保留30%以上，更優(yōu)選50%以上，甚至更優(yōu)選70%以上。此外，即使 NPR-B激動劑物質(zhì)的活性在其峰值無明顯增加，當(dāng)給予活體時在活性持續(xù)時間和血液半衰 期方面顯示有利結(jié)果的物質(zhì)也可用于本發(fā)明。
[0064] 此外，即使不具有與利尿鈉肽共有的結(jié)構(gòu)的化合物（例如小分子化合物），只要其 為當(dāng)加入上述測試方法時，引起產(chǎn)生cGMP的能力得到改善的化合物，也可在本發(fā)明中用作 在NPR-B激動劑。
[0065] 此外，根據(jù)本領(lǐng)域的普通知識通過上述方法從由用含有NPR-B配體結(jié)合位點(diǎn)的抗 原蛋白免疫動物而制備的抗NPR-B抗體中篩選具有NPR-B激動劑活性的抗體。由此制備的 具有NPR-B激動劑活性的抗-NPR-B抗體也可用作本發(fā)明的NPR-B激動劑。另外，可將由此 使用的抗體制備成各種已知形式，即通過免疫原性動物制備的抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗 體、人源化抗體、完全全人抗體等。可使用基于上述抗體制備的抗體片段比如Fab和scFv。
[0066] 本發(fā)明的NPR-B激動劑實例優(yōu)選包括CNP、具有其環(huán)結(jié)構(gòu)序列的活性片段，或者 其中在環(huán)結(jié)構(gòu)序列以外的序列中進(jìn)行取代等的突變體，或其衍生物或修飾體；更優(yōu)選包括 hCNP-22、hCNP-53、hCNP6-22、其衍生物或其修飾體；甚至更優(yōu)選包括hCNP-53、CNP衍生物A (CNP(l-22)生長素釋放肽（12-28，E17D) :SEQIDN0:13)、CNP衍生物B(CNP(l-22)生 長素釋放肽（12-28) :SEQ ID NO: 8)、CNP衍生物C (SEQ ID NO: 2的氨基酸號18至53)、 CNP衍生物D (SEQ ID NO: 15)，及其部分肽。
[0067] 上述NPR-B激動劑用作骨修復(fù)促進(jìn)劑的活性成分。"骨修復(fù)促進(jìn)劑"意指具有加速 或促進(jìn)在骨折、截骨手術(shù)、骨延長手術(shù)、骨移植手術(shù)等中受損骨組織的修復(fù)進(jìn)程的作用的作 用劑。通過使用骨修復(fù)促進(jìn)劑的作用，縮短骨組織的修復(fù)時間，或者使修復(fù)后的骨強(qiáng)度恢復(fù) 直至骨折前的水平，可避免再骨折的風(fēng)險，可減少受試患者的負(fù)擔(dān)。
[0068] 向其施用本發(fā)明藥用組合物的受試者無特殊限制，只要其是具有在除了只通過膜 內(nèi)骨化形成的骨比如顱骨等以外的骨中受損骨組織的患者。只要其是這樣的骨，可將藥用 組合物施用于任何部位的受損骨，所述骨優(yōu)選為頭部分（眼眶骨、顴骨和下顎骨）、軀干部 分（肋骨、髖骨、頸椎骨、胸椎、腰椎、骶骨和尾骨）、上肢（肩胛骨、鎖骨、肱骨、肘部、橈骨、 尺骨、舟骨、鉤骨、掌骨和趾骨）或下肢（髖關(guān)節(jié)、股骨、脛骨、腓骨、足關(guān)節(jié)、跟骨、舟骨和跖 骨），更優(yōu)選股骨、肱骨或肋骨。此外，骨組織的損傷形式無具體限制，例如可提到在截骨術(shù) 或骨延長手術(shù)中已被切開的骨的骨性聯(lián)接、骨折（骨的斷裂、裂化、粉碎性骨折、復(fù)雜性骨 折等）的治療等。
[0069] 可用作本發(fā)明藥用組合物的活性成分的物質(zhì)可以是上述NPR-B激動劑的藥學(xué)上 可接受的鹽。也就是說，在本發(fā)明中，上述NPR-B激動劑的無機(jī)酸（例如鹽酸、硫酸或磷酸） 或有機(jī)酸（例如甲酸、乙酸、丁酸、琥珀酸、檸檬酸等）的酸加成鹽也可用作活性成分。備選 地，在本發(fā)明中，上述物質(zhì)的金屬（鈉、鉀、鋰、鈣等）鹽或者與有機(jī)堿的鹽的形式也可用作 活性成分。此外，本發(fā)明的藥用組合物可包含游離形式的根據(jù)活性成分的物質(zhì)或其藥學(xué)上 可接受的鹽。
[0070] 本發(fā)明的藥用組合物包含NPR-B激動劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分，此 外通過使用在普通配制期間所使用載體、賦形劑、其它添加劑、稀釋劑等來制備。配制的載 體或賦形劑的實例包括例如乳糖、硬脂酸鎂、淀粉、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、橄欖 油、麻油、可可脂、乙二醇及其它常用的載體或賦形劑。
[0071] 作為口服給予的固體組合物，使用片劑、丸劑、膠囊、散劑、粒劑等。在此類固體組 合物中，將至少一種活性成分與至少一種非活性稀釋劑例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羥丙基 纖維素、微晶纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、偏硅酸鋁鎂等混合。根據(jù)常規(guī)方法，組合物可 包含除非活性稀釋劑以外的添加劑，例如潤滑劑比如硬脂酸鎂、崩解劑比如乙醇酸鈣纖維 素和增溶劑比如谷氨酸或天冬氨酸。可將片劑或丸劑根據(jù)需要用糖衣比如蔗糖、明膠或羥 丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，或者胃溶或腸溶物制成的膜來包衣，或者可用兩層以上包 衣。此外，還包括用可吸收的物質(zhì)比如明膠制成的膠囊。
[0072] 口服給予的液體組合物包含藥學(xué)上可接受的乳化劑、溶液劑、助懸劑、糖漿劑、酏 劑等，可另外包含常用的非活性稀釋劑，例如純凈水、乙醇等。該組合物可包含輔劑比如濕 潤劑、除了非活性稀釋劑以外的助懸劑；甜味劑；香料；芳香劑；防腐劑等。
[0073] 作為胃腸外給予的注射劑，包括在無菌和含水形式或無水形式下的溶液劑、助 懸劑和乳化劑。作為含水溶液劑或助懸劑，包括例如注射溶劑和可注射的鹽水溶液。作 為無水溶液劑和助懸劑，包括例如丙二醇、聚乙二醇、植物油比如橄欖油、醇比如乙醇、 Polysorbate 80 (注冊商標(biāo)）等。此類組合物可另外包含輔劑比如防腐劑、濕潤劑、乳化 齊?、分散劑、穩(wěn)定劑（例如乳糖）和增溶劑（例如谷氨酸和天冬氨酸）?？蓪⑦@些例如通過 用微濾膜過濾除菌、熱滅菌比如高壓蒸汽滅菌或者混合殺菌劑的常用滅菌方法等滅菌。注 射劑可以是溶液制劑，或者可以是在使用前溶解和重構(gòu)的凍干制劑。作為凍干用的賦形劑， 可使用例如糖醇比如甘露醇或者葡萄糖或糖類。
[0074] 本發(fā)明的藥用組合物優(yōu)選通過常用于藥物的給予方法，例如口服給予法；或者跨 黏膜給予、靜脈內(nèi)給予、肌內(nèi)給予、皮下給予等的胃腸外給予方法來給予。在活性成分是 NPR-B激動劑抗體的情況下，本發(fā)明的藥用組合物通常經(jīng)由胃腸外途徑給予，例如經(jīng)注射 (皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射等）、經(jīng)皮膚、經(jīng)黏膜、經(jīng)鼻、經(jīng)肺等給予，但 是也可口服給予。
[0075] 在活性成分是肽類物質(zhì)的情況下，本發(fā)明的藥用組合物也可作為在消化道中較不 容易降解的藥用制劑口服給予，例如作為其中將作為活性成分的肽封閉在核糖體內(nèi)的微膠 囊制劑口服給予。此外，還可使用其中經(jīng)由消化道以外的直腸、鼻、舌下等黏膜吸收本發(fā)明 藥用組合物的給予方法。在這種情況下，可將本發(fā)明的藥用組合物以栓劑、噴鼻劑、吸入劑 或舌下片劑的形式給予個體。
[0076] 可用作本發(fā)明藥用組合物活性成分的物質(zhì)的劑量根據(jù)疾病類型；個體（患者）的 年齡和體重；癥狀程度；和給予途徑而變化，但是，例如約100 mg/kg以下,優(yōu)選約50 mg/kg 以下，更優(yōu)選5 mg/kg以下，通常作為每天劑量的上限。此外，作為每天劑量的下限，劑量是 例如約0. 005 yg/kg以上，優(yōu)選0. 025 yg/kg以上，更優(yōu)選0. I yg/kg以上。
[0077] 在本發(fā)明中CNP的劑量根據(jù)受試個體的體重、待治療的疾病、癥狀等而變化，但 是，在局部給予時組織水平為約KT 15 M至KT6 M水平，優(yōu)選約KT12 M至KT8 M水平。對于 全身給予，在本發(fā)明中CNP的劑量為約0.01 μ g/頭至10000 μ g/頭水平，優(yōu)選1 μ g/頭 至5000 μ g/頭水平。
[0078] 本發(fā)明的骨修復(fù)促進(jìn)劑可通過在骨的修復(fù)階段給予至少一段時間直至充分形成 骨痂，然后停止給予而達(dá)到充分促進(jìn)骨折修復(fù)或者對骨折的治療效果。本發(fā)明提供此類治 療方法、特征為在該方法給予的骨修復(fù)促進(jìn)劑等。已發(fā)現(xiàn)NPR-B激動劑至少促進(jìn)骨痂形成， 從而在骨修復(fù)過程中促進(jìn)受損骨的修復(fù)。認(rèn)為在該過程中，NPR-B激動劑抑制骨受損部位 中軟骨細(xì)胞肥大，由此維持軟骨細(xì)胞的增殖期，從而增加軟骨細(xì)胞的數(shù)量，增加軟骨細(xì)胞產(chǎn) 生的軟骨基質(zhì)的量，然后促進(jìn)骨痂形成。從這種機(jī)制的角度來看，認(rèn)為從骨損傷治療開始給 予本發(fā)明的NPR-B激動劑直至骨痂充分形成時，從而可充分實現(xiàn)骨修復(fù)促進(jìn)作用，因此認(rèn) 為在骨痂充分形成階段，可停止給予所述促進(jìn)劑。在骨受損部位形成骨痂的時間根據(jù)骨損 傷的部位、損傷的狀況、患者的愈合能力等而變化?？梢罁?jù)受傷部分的X射線圖像來確定骨 痂的形成狀態(tài)，因此，規(guī)律地觀察和監(jiān)測受傷部分的X射線圖像，然后優(yōu)選確定停止給予的 時間。
[0079] 本發(fā)明的藥用組合物可與另一種骨形成促進(jìn)劑、骨再吸收抑制劑或骨折治療劑組 合使用。待組合的作用劑的實例包括例如二膦酸鹽劑、BMP劑、PTH劑、bFGF劑和抗-RANKL 抗體劑，但不限于這些作用劑。
[0080] 此外，在本發(fā)明治療劑用于基因療法的情況下，可使用這樣的療法，其中將在宿主 細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子(例如巨細(xì)胞病毒啟動子（CMV啟動子）等)序列下游的編碼NPR-B 激動劑肽的氨基酸序列的核酸并入適合基因療法的已知載體比如病毒載體優(yōu)選慢病毒載 體、腺相關(guān)病毒載體，更優(yōu)選腺病毒載體；或者化學(xué)合成的脂質(zhì)體、病毒包膜，或者病毒包膜 和合成脂質(zhì)體的復(fù)合物內(nèi)。作為編碼CNP的基因，可使用含有編碼SEQ ID NO :1至5中任一 氨基酸序列的核苷酸序列的基因。至于具體基因療法的方法，可使用描述于Experimental Medicine (Jikken Igaku), 12卷，303頁，1994中的方法，在其中所引用文獻(xiàn)的方法等。 實施例
[0081] 下面，通過實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0082] 實施例1:大鼠股骨骨折模型測試 [方法] 在6周齡雌性SD品系（Crl:⑶）IGS大鼠的左股骨骨干經(jīng)手術(shù)制備骨折模型。將巴 比妥基麻醉劑（Somnopentyl?, Kyoritsu Seiyaku Corporation)腹膜內(nèi)給予動物以麻醉 動物。進(jìn)行異氟燒（Escain, Mylan Inc.)吸入麻醉作為對麻醉的輔助。切開膝關(guān)節(jié)上側(cè)的 皮膚，在股直肌與股外側(cè)肌之間進(jìn)行剝離以暴露股骨。在股骨骨干中心遠(yuǎn)端約〇. 5 _處，用 切骨機(jī)（Osada Equipment Co.，Ltd.)按橫斷面完全切開骨干。然后，將21G注射針插入 左股骨大轉(zhuǎn)子與股骨頸之間的骨髓，用2至3條縫線縫合肌肉和皮膚。為了防止術(shù)后化膿， 給予注射用抗生素青霉素 G鉀（Meiji Seika Kaisha, Limited),用聚維酮碘（Isodine?, Meiji Seika Kaisha，Limited)消毒皮膚的縫合部位。作為測試物，將CNP衍生物A (SEQ ID NO: 13:美國專利申請US 2010-305031公布內(nèi)容的SEQ ID NO: 157，通過描述于該 公布內(nèi)容中的方法制備）用于以10或100 nmol/kg每天1次重復(fù)皮下給予8周。將媒介 物給予對照組。在給予結(jié)束日期的第二天，切除左和右股骨和左和右脛骨。對于切除的骨， 測量骨長和骨折部位的骨痂大小，對左和右股骨進(jìn)行軟X射線攝影，然后確定骨折部位的 愈合狀態(tài)。隨后，通過使用骨強(qiáng)度測量儀MZ-500S (MARUT0 INSTRUMENT CO.，LTD.)和骨 強(qiáng)度測試系統(tǒng)CTR win Ver. 1.21 (System Supply Co.，Ltd.)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲強(qiáng)度測試。 完成測量后的骨用10%中性緩沖福爾馬林固定，制備和觀察病理樣本。對包括備用大鼠在 內(nèi)的一組14只大鼠進(jìn)行給予。在給予后2、4和6周，將每種情況中的1只大鼠制樣用于隨 訪，另外在對照組中已顯示骨不連接樣癥狀的1只大鼠從評估中排除，最終以一組10只大 鼠評估結(jié)果。
[0083] [結(jié)果] 股骨的軟X射線圖像顯示于圖1中。觀察到給予CNP衍生物A有降低保留的骨折線的 趨勢和增強(qiáng)皮質(zhì)骨連續(xù)性的趨勢。骨強(qiáng)度測試的結(jié)果顯示于表1中。左股骨骨折部位的斷 裂能以CNP衍生物A-劑量依賴性增加。在左/右股骨的比率上，與媒介物給予組的0. 45 相比，100 nmol/kg給予組恢復(fù)多至0.90。在最大負(fù)荷（左/右股骨比率）上，媒介物給予 組是0.66,這一數(shù)值意味著與正常右股骨相比骨折的左股骨的抗負(fù)荷強(qiáng)度已恢復(fù)了大約一 半，相比之下，第2組即10 nmol/kg給予組是0.86,第3組即100 nmol/kg給予組是1.03, 劑量依賴性增加。在測試物給予組中斷裂強(qiáng)度和斷裂變形也顯示高值。
[0084] 各樣本中股骨組織的結(jié)果顯示于表2中。在左股骨骨折部位的骨痂區(qū)中，100 nmol/kg給予組連續(xù)性得到改善，軟骨細(xì)胞減少。另一方面，在皮質(zhì)骨區(qū)中，10 nmol/kg給 予組連續(xù)性稍增強(qiáng)。在更高劑量組，除上述以外，觀察到軟骨減少，破骨細(xì)胞減少，結(jié)締組織 減少。在本測試中骨折后8周采集的個體組織的圖像中，骨痂形成已完成，因此，該個體被 視為處于重塑期（骨密階段）或更晚。在這種情況下，在100 nmol/kg CNP衍生物A給予 組中，觀察到與對照組相比，軟骨形成等級降低的趨勢和骨痂骨化等級升高的趨勢，提示有 可能促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化。依據(jù)這些結(jié)果，認(rèn)為通過CNP衍生物A給藥促進(jìn)骨切斷區(qū)的修復(fù)。
[0085] CNP 衍生物 A 在8周給予結(jié)束時骨強(qiáng)度測試的結(jié)果 (均值土標(biāo)準(zhǔn)差，N = 10)
[表1]

【權(quán)利要求】
1. 一種骨修復(fù)促進(jìn)劑，其包含至少一種利尿鈉肽受體NPR-B激動劑作為活性成分。
2. 權(quán)利要求1的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中NPR-B激動劑是C-型利尿鈉肽（CNP)或其活性 片段；或其突變體、其衍生物或其修飾體；或者抗利尿鈉肽受體NPR-B抗體。
3. 權(quán)利要求1的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中NPR-B激動劑是hCNP-22(SEQIDNO: 1)、 hCNP6-22(SEQIDNO: 1 的氨基酸號 6 至 22)或hCNP-53(SEQIDNO: 2);或其突變體、 其衍生物或其修飾體。
4. 權(quán)利要求1的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中NPR-B激動劑是hCNP-22或hCNP6-22的衍生物 或修飾體。
5. 權(quán)利要求2至4中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中衍生物是這樣的衍生物，其中選自 由免疫球蛋白Fc區(qū)衍生的肽、血清白蛋白和在生長素釋放肽C-端側(cè)的部分肽的至少一種 附加肽結(jié)合至hCNP-22或hCNP6-22的N端、C端或者其兩端。
6. 權(quán)利要求5的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中衍生物由其中自SEQIDNO: 2的N端缺失一個 以上至30個以下的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列或者選自SEQIDNO: 6至15的氨基酸序列 組成。
7. 權(quán)利要求2至4中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中修飾體是這樣的修飾體，其中PEG 或其類似親水聚合物結(jié)合至hCNP-22、hCNP6-22或hCNP-53的N端、C端或其兩端。
8. 權(quán)利要求1的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中NPR-B激動劑是由SEQIDNO: 2、SEQIDNO: 2 的氨基酸號18至53、SEQIDNO: 13和SEQIDNO: 15中的任一個氨基酸序列組成的肽。
9. 權(quán)利要求1至8中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中骨損傷部位中直至骨組織修復(fù)的時 間段縮短。
10. 權(quán)利要求1至8中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中在骨修復(fù)后骨組織的骨強(qiáng)度和/ 或連續(xù)性恢復(fù)至等同于未骨折的骨相應(yīng)部位的水平。
11. 權(quán)利要求1至8中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其中通過在骨修復(fù)的骨痂形成階段給 予骨修復(fù)促進(jìn)劑和在骨痂形成的后期或者形成完成之后停止給予來實現(xiàn)促進(jìn)骨修復(fù)。
12. 權(quán)利要求1至11中任一項的骨修復(fù)促進(jìn)劑，其用于治療骨折。
13. -種促進(jìn)骨修復(fù)的方法，其包含將有效量的NPR-B激動劑給予需要骨修復(fù)的受試 者。
14. 一種治療骨折的方法，其包含將有效量的NPR-B激動劑給予骨折患者。
15. -種NPR-B激動劑，其用于在需要骨修復(fù)的受試者中促進(jìn)骨修復(fù)。
16. 權(quán)利要求15的NPR-B激動劑，其用于在骨折患者中治療骨折。
【文檔編號】A61K47/34GK104379171SQ201380033624
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月25日
【發(fā)明者】若林直美, 山木明, 杉山真佐子 申請人:第一三共株式會社