專利名稱：用作蛋白激酶抑制劑的化合物和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請依據(jù)35U.S.C.119(e)要求以2003年7月10日提交的美國臨時專利申請60/486,134作為優(yōu)先權(quán)。這些在先申請中公開的所有內(nèi)容都引入本文供參考。本發(fā)明提供一類新的化合物、含有這些化合物的藥物組合物和使用這些化合物來治療或預(yù)防與激酶活性異?；蚴д{(diào)有關(guān)的疾病或病癥，特別是與Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和/或FLT4激酶異常激活有關(guān)的疾病或病癥的方法。
背景技術(shù)：
蛋白激酶代表一大族蛋白質(zhì)，它們在調(diào)節(jié)各種各樣的細(xì)胞過程和保持對細(xì)胞功能的控制中起重要的作用。這些激酶的部分非限定性例子包括受體酪氨酸激酶如得自血小板的生長因子受體激酶(PDGF-R)、c-erbB2激酶(HER-2)、VEGF-受體激酶(例如KDR、Flt-1和Flt-4)、TGFβ、表皮生長因子受體(EGF-R)、干細(xì)胞因子受體激酶、c-Kit；非-受體酪氨酸激酶如Abl和融合激酶BCR-Abl；以及絲氨酸/蘇氨酸激酶如p38、b-RAF和c-RAF。已經(jīng)在許多疾病中觀察到了異常的激酶活性，包括良性和惡性增殖性疾病以及由不合適的免疫和神經(jīng)系統(tǒng)激活所導(dǎo)致的疾病。
本發(fā)明的新化合物可以抑制一種或多種蛋白激酶活性，因此預(yù)期可用于治療激酶相性關(guān)疾病。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供式I化合物及其N-氧化物衍生物、前藥衍生物、保護(hù)的衍生物、單一的異構(gòu)體及異構(gòu)體混合物和這些化合物的可藥用鹽和溶劑化物(例如水合物) 其中n為0、1、2或3；Z選自＝N-和＝CH-；R1選自氫和-NR4R5；其中R4選自氫和C1-6烷基；并且R5選自C6-10芳基、C5-10雜芳基、C3-12環(huán)烷基和C3-8雜環(huán)烷基，其中R5中的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基均可以是未取代的或被1-3個彼此獨(dú)立地選自下列的基團(tuán)所取代氰基、硝基、鹵素、C1-6烷基、鹵素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷氧基和-NR6R7；其中R6和R7獨(dú)立地選自氫和C1-6烷基；R2選自氫和C1-6烷基；R3選自鹵素、氰基、硝基、C1-6烷基、鹵素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷氧基、-XNR8R8、-XNR8R9、-XC(O)R8、-XNR8C(O)R9和-XC(O)NR8R9；其中X為鍵或C1-4亞烷基，R8選自氫和C1-6烷基，并且R9選自C6-10芳基、C5-10雜芳基、C3-12環(huán)烷基和C3-8雜環(huán)烷基；其中R9中的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基均是未取代的或被選自下列的基團(tuán)所取代鹵素取代的C1-6烷基、-XOR8、-XR10、-XS(O)2N(OR8)2、-XS(O)N(XOR8)2、-XSN(OR8)2、-XSR10、-XS(O)R10和-XS(O)2R10；其中X為鍵或C1-6亞烷基，R8為氫或C1-6烷基并且R10為選自C3-8雜環(huán)烷基和C5-10雜芳基的基團(tuán)；其中R10中的任何雜環(huán)烷基或雜芳基均是未取代的或被1-3個彼此獨(dú)立地選自下列的基團(tuán)所取代鹵素、氰基、硝基、C1-6烷基、鹵素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷氧基；R10中的任何一個環(huán)碳原子均可以任選地被-C(O)-替代；并且其中苯基環(huán)A和B可以具有至多4個由-N＝替代的-C＝基。
第二方面，本發(fā)明提供包含式I化合物或其N-氧化物衍生物、單一的異構(gòu)體及異構(gòu)體混合物；或其可藥用鹽，和一種或多種合適的賦形劑的藥物組合物。
第三方面，本發(fā)明提供治療動物疾病的方法，其中抑制激酶活性，特別是抑制Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和/或FLT4活性可預(yù)防、抑制或改善疾病的病理和/或癥狀，該方法包括給予動物治療有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、單一的異構(gòu)體及異構(gòu)體混合物或其可藥用鹽。
第四方面，本發(fā)明提供式I化合物在制備用于治療動物疾病的藥物中的用途，其中在所述疾病中，激酶活性，特別是Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和/或FLT4活性對該疾病的病理和/或癥狀起作用。
第五方面，本發(fā)明提供制備式I化合物及其N-氧化物衍生物、前藥衍生物、保護(hù)的衍生物、單一的異構(gòu)體及異構(gòu)體混合物和可藥用鹽的方法。
發(fā)明詳述定義作為基團(tuán)或其它基團(tuán)，例如鹵素取代的烷基和烷氧基的結(jié)構(gòu)元素的“烷基”可以是直鏈或支鏈的。C1-4-烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。鹵素取代的烷基包括三氟甲基、五氟乙基等。
“芳基”是指含有6-10個環(huán)碳原子的單環(huán)或稠合雙環(huán)芳香環(huán)。例如，芳基可以是苯基或萘基，優(yōu)選苯基。“亞芳基”是指由芳基衍生的二價基團(tuán)?！半s芳基”如芳基所定義，并且其中有一個或多個環(huán)原子為雜原子。例如雜芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、呋喃基、_唑基、異_唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“環(huán)烷基”是指含有指定環(huán)原子數(shù)的飽和或部分飽和的單環(huán)、稠合的雙環(huán)或橋接的多環(huán)。例如，C3-10環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。“雜環(huán)烷基”是指本申請中所定義的環(huán)烷基，條件是所述的一個或多個環(huán)碳由選自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的部分所代替，其中R為氫、C1-4烷基或氮保護(hù)基。例如，本申請中用于描述本發(fā)明化合物的C3-8雜環(huán)烷基包括嗎啉基、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮、1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5]癸-8-基等。
“鹵素”優(yōu)選表示氯或氟，但也可以是溴或碘。
“治療”是指減輕或緩和疾病和/或其并發(fā)癥的方法。
優(yōu)選的優(yōu)選實(shí)施方式的說明本發(fā)明提供治療與激酶有關(guān)的疾病，特別是與Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和/或FLT4激酶有關(guān)的疾病的化合物、組合物和方法。例如，與BCR-Abl有關(guān)的白血病和其它增殖性疾病可通過抑制野生型和突變型BCR-Abl進(jìn)行治療。
在一個
具體實(shí)施例方式
中，涉及如下式I化合物，其中R1選自氫和-NR4R5；其中R4選自氫和C1-6烷基；并且R5是未取代的或被1-3個基團(tuán)取代的C6-10芳基，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自鹵素取代的C1-6烷基和-NR6R7；其中R6和R7獨(dú)立地選自氫和C1-6烷基；并且R2選自氫和C1-6烷基；R3選自鹵素、C1-6烷基、-XC(O)R8、-XNR8R8、-XNR8C(O)R9和-XC(O)NR8R9；其中X為鍵或C1-4亞烷基，R8選自氫和C1-6烷基，并且R9選自C6-10芳基和C3-12環(huán)烷基；其中R9中的任何芳基或環(huán)烷基均是未取代的或被選自下列的基團(tuán)所取代-XOR8、-XR10、-XS(O)2N(XOR8)2和-XS(O)2R10；其中X為鍵或C1-6亞烷基，R8為氫或C1-6烷基并且R10為選自C3-8雜環(huán)烷基和C5-10雜芳基的基團(tuán)；其中R10中的任何雜環(huán)烷基或雜芳基均是未取代的或被1-3個C1-6烷基取代的；并且R10中的任何一個環(huán)碳原子均可以任選地被-C(O)-替代。
在另一
具體實(shí)施例方式
中，R1選自氫和-NHR5；其中R5是未取代的或被1-3個獨(dú)立地選自三氟甲基和二甲基氨基的基團(tuán)取代的苯基；并且R2為氫。
在另一
具體實(shí)施例方式
中，R3選自鹵素、甲基、甲酰基、二甲基氨基、-NHC(O)R9和-C(O)NHR9；其中R9選自苯基和環(huán)丙基；其中R9中的任何芳基或環(huán)烷基均是未取代的或被選自下列的基團(tuán)所取代-CH2OH、-XR10、-S(O)2N(C2H4OH)2和-S(O)2R10；其中X為鍵或亞甲基并且R10為選自哌嗪基、嗎啉-4-基和5-氧代-4，5-二氫-吡唑-1-基的基團(tuán)；其中R10中的任何雜環(huán)烷基或雜芳基均是未取代的或被1-3個甲基取代的。
在另一
具體實(shí)施例方式
中，R4選自鹵素、三氟甲基和-XR10；其中X為鍵或亞甲基；R10選自咪唑基、哌嗪基和嗎啉-4-基；其中任何雜芳基或雜環(huán)烷基均是未取代的或被甲基取代的。
優(yōu)選的式I化合物選自N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-苯甲酰胺；
4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-(3-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-羥基甲基-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-3-(嗎啉-4-磺?；?-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-(3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-吡唑-1-基)-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-3-(4-甲基-哌嗪-1-磺?；?-苯甲酰胺；4-[二-(2-羥基-乙基)-氨磺酰基]-N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-苯甲酰胺；4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-[3-(2-嘧啶-4-基-苯基氨基)-苯基]-苯甲酰胺；N-環(huán)丙基-3-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯甲酰胺；{6-[2-(3-氟-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(2-氟-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(4-氟-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(2-氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(3-氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(4-氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；[6-(2-鄰-甲苯基氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-(4-三氟甲基-苯基)-胺；[6-(2-間-甲苯基氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-(4-三氟甲基-苯基)-胺；[6-(2-對-甲苯基氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-(4-三氟甲基-苯基)-胺；3-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯甲醛；4-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯甲醛；(4-三氟甲基-苯基)-{6-[2-(2-三氟甲基-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-胺；(4-三氟甲基-苯基)-{6-[2-(4-三氟甲基-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-胺；
N，N-二甲基-N＇-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基}-苯-1，4-二胺；苯基-[6-(2-苯基氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-胺；{6-[2-(2，6-二氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺；和{6-[2-(2，6-二氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-胺。
其他優(yōu)選的式I化合物描述于下文實(shí)施例和表I中。
藥理學(xué)和實(shí)用性本發(fā)明化合物調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性并因此可用于治療蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，特別是Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和/或FLT4激酶對疾病的病理和/或癥狀起作用的疾病或病癥。
Abelson酪氨酸激酶(即Abl、c-Abl)參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對基因毒應(yīng)激的應(yīng)答和在細(xì)胞環(huán)境中通過整聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞信息?？偟膩碚f，Abl蛋白質(zhì)似乎是作為細(xì)胞組件起復(fù)合的作用，其整合來自各種胞外和胞內(nèi)的信號并影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的結(jié)果。Abelson酪氨酸激酶包括亞型衍生物如嵌合融合(癌基因蛋白)BCR-Abl(具有失調(diào)的酪氨酸激酶活性)或v-Abl。BCR-Abl是95％慢性骨髓性白血病(CML)和10％急性淋巴細(xì)胞白血病的致病關(guān)鍵。STI-571(Gleevec)是致癌性BCR-Abl酪氨酸激酶的抑制劑并用于治療慢性骨髓性白血病(CML)。然而，CML發(fā)病危險(xiǎn)期的一些患者由于BCR-Abl激酶的突變而對STI-571耐受。目前已報(bào)道了超過22種突變，最常見的是G250E、E255V、T315I、F317L和M351T。
本發(fā)明化合物抑制abl激酶，特別是v-abl激酶。本發(fā)明化合物也抑制野生型BCR-Abl激酶和突變的BCR-Abl激酶并因此適于治療Bcr-abl-陽性癌癥和腫瘤疾病，如白血病(特別是慢性骨髓性白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病，尤其是發(fā)現(xiàn)它們是以細(xì)胞凋亡為作用機(jī)制的)，并且還顯示出對白血病干細(xì)胞亞組的影響，而且也可能用于取出所述細(xì)胞(例如，骨髓取出)后體外純化這些細(xì)胞并在清除癌細(xì)胞后再將細(xì)胞植入(例如，再植入純化的骨髓細(xì)胞)。
PDGF(得自血小板的生長因子)是非常常見的生長因子，它在正常生長和病理性細(xì)胞增殖中都起到重要作用，如在癌癥和血管平滑肌細(xì)胞疾病，例如，在動脈粥樣硬化和血栓癥中所見到的那樣。本發(fā)明化合物可抑制PDGF受體(PDGFR)活性并因此適用于治療腫瘤性疾病，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、前列腺腫瘤和結(jié)腸、乳腺和卵巢腫瘤。
本發(fā)明化合物不僅可用作腫瘤抑制劑(例如在小細(xì)胞肺癌中)，而且可用作治療非惡性增殖性疾病，如動脈粥樣硬化、血栓癥、牛皮癬、硬皮病和纖維化，以及保護(hù)干細(xì)胞(例如對抗化療藥如5-氟尿嘧啶的血液毒性作用)和治療哮喘的藥物。本發(fā)明化合物尤其可用于治療對抑制PDGF受體激酶有反應(yīng)的疾病。
本發(fā)明化合物顯示可有效地用于治療因移植，例如同種移植導(dǎo)致的疾病，特別是組織排斥反應(yīng)，例如閉塞性細(xì)支氣管炎(OB)，即同種肺移植物的慢性排斥反應(yīng)。與沒有患OB的病人相比，那些患有OB的病人經(jīng)常顯示支氣管肺泡灌洗液中PDGF濃度升高。
本發(fā)明化合物對與血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖有關(guān)的疾病(其中PDGF和PDGF-R也經(jīng)常起作用)如再狹窄和動脈粥樣硬化也有效。這些作用及其對體內(nèi)和體外血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用的結(jié)果可通過給予本發(fā)明化合物來證明，并且也可以通過研究其對體內(nèi)機(jī)械性損傷后血管內(nèi)膜增厚的作用來證明。
本發(fā)明化合物還可抑制涉及干細(xì)胞因子(SCF，也稱作c-kit配體或青灰因子)的細(xì)胞過程，如抑制SCF受體(kit)自磷酸化和SCF-刺激的MAPK激酶(促細(xì)胞分裂劑-激活的蛋白激酶)活化。MO7e細(xì)胞是人幼巨核細(xì)胞性白血病細(xì)胞系，它依賴SCF來增殖。本發(fā)明化合物可抑制SCF受體的自磷酸化。
Ras-Raf-MEK-ERK信號途徑調(diào)整細(xì)胞對生長信號的反應(yīng)。在15％的人類癌癥中，Ras突變?yōu)橹掳┬问?。Raf族屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶并且包括三個成員，A-Raf、B-Raf和c-Raf(或Raf-1)。關(guān)于Raf作為藥物靶點(diǎn)的研究主要集中在Raf是Ras的下游效應(yīng)器的關(guān)系上。然而，近來的數(shù)據(jù)提示B-Raf可能在某些腫瘤的形成中起到非常突出的作用，并且不需要激活的Ras等位基因(Nature 417，949-954(2002年7月1日)。具體地講，已在高百分比的惡性黑色素瘤中檢測到了B-Raf突變。
黑色素瘤、特別是晚期黑色素瘤的現(xiàn)有醫(yī)學(xué)治療受到其有效性的限制。本發(fā)明化合物可抑制涉及B-Raf激酶的細(xì)胞過程，從而為人類癌癥，特別是黑色素瘤的治療提供新的治療機(jī)會。
本發(fā)明化合物也可抑制涉及c-Raf激酶的細(xì)胞過程。c-Raf由在大量人類癌癥中突變的ras癌基因激活。因此，抑制c-Raf激酶的活性可以提供一條預(yù)防ras介導(dǎo)的腫瘤生長的途徑[Campbell，S.L.，癌基因，17，1395(1998)]。
本發(fā)明化合物也可抑制涉及KDR、Flt-1和Flt-4的細(xì)胞過程。已知許多疾病與血管發(fā)生失調(diào)有關(guān)，例如由眼新血管生成引起的疾病，特別是視網(wǎng)膜病變(糖尿病性視網(wǎng)膜病變，與年齡有關(guān)的黃斑變性)；牛皮癬；成血管細(xì)胞瘤，如“草莓痣”(＝血管瘤)；各種炎性疾病，如關(guān)節(jié)炎，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，動脈粥樣硬化和移植后的動脈粥樣硬化，子宮內(nèi)膜異位或慢性哮喘；特別是腫瘤性疾病(實(shí)體瘤，但也可以是白血病和其它液體腫瘤，因?yàn)楹芏嘣佳?xì)胞和白血病細(xì)胞表達(dá)c-kit、KDR、Flt-1和Flt-4)。Flt-4在發(fā)育中的淋巴管中表達(dá)。在成人組織中，只有淋巴內(nèi)皮和某些毛細(xì)血管后小靜脈表達(dá)Flt4 mRNA并且在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)和淋巴管瘤的淋巴竇中表達(dá)增加。通過抑制KDR的催化活性來抑制KDR-介導(dǎo)的功能性作用被認(rèn)為是治療血管生成性疾病、包括癌癥的重要治療策略。
通過不同的基因編碼的多種形式的p38MAPK(α、β、γ、δ)形成了部分在細(xì)胞對各種刺激(包括滲透性應(yīng)激、紫外線和細(xì)胞因子介導(dǎo)的事件)的反應(yīng)中所涉及的激酶鏈。這四種異構(gòu)形式的p38被認(rèn)為調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)信號過程的不同方面。它的激活是導(dǎo)致合成和產(chǎn)生前炎性細(xì)胞因子如TNFα的信號事件級聯(lián)反應(yīng)的一部分。P38通過將包括其他激酶和轉(zhuǎn)錄因子的下游底物磷酸化發(fā)揮作用。已證實(shí)，抑制p38激酶的物質(zhì)可以阻斷包括但不限于TNFα、IL-6、IL-8和IL-1β的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。已證實(shí)當(dāng)在體外用脂多糖(LPS)刺激時，外周血單核細(xì)胞(PBMC)會表達(dá)和分泌前炎性細(xì)胞因子。在用LPS刺激前用P38抑制劑預(yù)處理PBMC可以有效地阻斷該作用。P38抑制劑在炎性疾病動物模型中是有效的。很多疾病的破壞作用是由過度產(chǎn)生前炎性細(xì)胞因子引起的。p38抑制劑調(diào)節(jié)這種過度產(chǎn)生的能力使得它們可用作減輕疾病的藥物。
已證實(shí)，阻斷p38功能的分子可有效地抑制骨再吸收、炎癥和其它基于免疫和炎癥的病理改變。因此，安全有效的p38抑制劑將提供一種治療可以通過調(diào)節(jié)p38信號傳遞如RA來進(jìn)行調(diào)節(jié)的衰弱退化性疾病的方法。因此，可以抑制p38活性的本發(fā)明化合物可用于治療炎癥、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、自身免疫性疾病，并且可用于治療其他細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病。
轉(zhuǎn)化的生長因子-β(TGFβ)表示一大族蛋白質(zhì)，例如包括TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，它們是細(xì)胞生長和分化、胚胎和骨發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)形成、造血、免疫和炎性反應(yīng)的多向調(diào)節(jié)劑。TGFβ族的成員啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑，最終導(dǎo)致調(diào)節(jié)細(xì)胞循環(huán)、控制增殖反應(yīng)或與介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞、細(xì)胞粘附、遷移和細(xì)胞間信息傳遞的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相關(guān)的基因表達(dá)。因此，作為TGFβ細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑抑制劑的本發(fā)明化合物可用于治療成纖維細(xì)胞增殖性疾病，包括與TGFβ活性失調(diào)相關(guān)的腎臟疾病和過度纖維化，包括腎小球腎炎(GN)，如腎小球膜增殖性GN、免疫性GN和新月形GN。其它腎臟疾病包括糖尿病性腎病、腎間質(zhì)纖維化、移植病人接受環(huán)孢菌素引起的腎纖維化和HIV相關(guān)性腎病。膠原血管疾病包括進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病、多肌炎、硬皮病、皮肌炎、嗜酸性細(xì)胞增多性肌膜炎、硬斑病或那些與Raynaud綜合癥發(fā)病相關(guān)的疾病。由TGFβ活性過強(qiáng)導(dǎo)致的肺纖維化包括成人呼吸窘迫綜合征、COPD、先天性肺纖維化和常與自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和硬皮病、化學(xué)品接觸或過敏相關(guān)的間質(zhì)肺纖維化。另一種與纖維增殖特性相關(guān)的自身免疫疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。纖維增殖性疾病可能與眼外科手術(shù)過程有關(guān)。這些過程包括伴有增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、伴有眼內(nèi)晶狀體植入的白內(nèi)障摘除術(shù)和青光眼引流術(shù)后。
成纖維細(xì)胞生長因子受體3顯示對骨生長的下調(diào)作用并且抑制軟骨細(xì)胞增殖。致死性發(fā)育不良是由成纖維細(xì)胞生長因子受體3的不同突變引起的，其中一種突變，TDII FGFR3，具有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)活性，它激活轉(zhuǎn)錄因子Stat1，導(dǎo)致細(xì)胞周期抑制劑的表達(dá)、生長抑制和異常骨發(fā)育(Su等人，Nature，1997，386，288-292)。FGFR3也常常在多發(fā)性骨髓瘤類型的癌癥中表達(dá)。
激酶c-Src傳遞許多受體的致癌信號。例如，腫瘤中EGFR或HER2/neu的過度表達(dá)導(dǎo)致c-src的結(jié)構(gòu)活化，這是惡性細(xì)胞的特點(diǎn)，在正常細(xì)胞中沒有。另一方面，c-src表達(dá)有缺陷的小鼠顯示骨硬化病表型，表明了c-src在破骨細(xì)胞功能方面的關(guān)鍵作用和與相關(guān)疾病有關(guān)的可能性。
DNA損傷可以激活細(xì)胞周期關(guān)卡激酶Chk2，激活的Chk2磷酸化Cdc25C并因此使其失活。不含活性Chk2的細(xì)胞在其對DNA損傷的關(guān)卡反應(yīng)中存在缺陷。Chk2的失活消除了對G2/M的限制，這種限制是由損傷的DNA誘導(dǎo)的并且使所導(dǎo)致的關(guān)卡缺陷型細(xì)胞對由DNA損傷所產(chǎn)生的殺傷力敏感。與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞對G2/M關(guān)卡的解除更為敏感，因此對抑制Chk2并提高由DNA損傷對癌細(xì)胞所產(chǎn)生的殺傷力的化合物存在濃厚的興趣。
人核糖體S6蛋白激酶族由至少8個成員組成(RSK1、RSK2、RSK3、RSK4、MSK1、MSK2、p70S6K和p70S6Kb)。核糖體蛋白質(zhì)S6蛋白激酶起重要的多向功能，尤其是在蛋白質(zhì)生物合成過程中對mRNA翻譯的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用(Eur.J.Biochem 2000，11；267(21)6321-30，Exp Cell Res.Nov.25，1999；253(1)100-9，Mol Cell Endocrinol.May 25，1999；151(1-2)65-77)。p70S6對S6核糖體蛋白質(zhì)的磷酸化作用還參與細(xì)胞活動(Immunol.Cell Biol.2000，8；78(4)447-51)和細(xì)胞生長(Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.，2000；65101-27)的調(diào)節(jié)，因此，可能在腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫反應(yīng)和組織修復(fù)以及其他疾病中是重要的。
如上文所述，本發(fā)明還提供一種在需要進(jìn)行治療的個體中預(yù)防或治療上文所述的任何疾病或病癥方法，該方法包括給予所述個體治療有效量的(參見“給藥和藥物組合物”，下文)式I化合物或其可藥用鹽。對于任何上述用途，所需劑量會根據(jù)給藥方式、被治療的特定疾病和所需的效果來進(jìn)行調(diào)整。
給藥和藥物組合物通常，可通過本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)和適宜的方式、單獨(dú)或與一種或多種治療劑一起給予治療有效量的本發(fā)明化合物。治療有效量可隨著疾病的嚴(yán)重性、患者的年齡和相對健康狀況、所用化合物的潛能和其它因素而改變。通常，以每日每公斤體重大約0.03-2.5mg的劑量系統(tǒng)給藥可獲得滿意的結(jié)果。大的哺乳動物，例如人的每日推薦劑量在大約0.5mg-100mg的范圍內(nèi)，通常以例如每日最多4次的分劑量給藥或以緩釋劑型給藥。適宜的口服給藥單位劑型包含大約1-50mg活性組分。
本發(fā)明化合物可以通過任何常規(guī)給藥途徑以藥物組合物的形式給藥，特別是腸道給藥，例如，以片劑或膠囊劑的形式口服給藥，或非腸道給藥，例如，以注射溶液或懸浮液的形式給藥，局部給藥，例如，以洗劑、凝膠劑、軟膏劑或霜劑的形式給藥，或以鼻腔給藥制劑或栓劑的形式給藥。含有游離形式或可藥用鹽形式的本發(fā)明化合物和至少一種可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物可按照常規(guī)方法，通過混合、制?；虬路椒ㄖ苽?。例如，口服組合物可以是片劑或明膠膠囊劑，它含有活性組分和a)稀釋劑，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纖維素和/或甘氨酸；b)潤滑劑，例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其鎂鹽或鈣鹽和/或聚乙二醇；對于片劑來說還可以含有c)粘合劑，例如，硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要還可以含有d)崩解劑，例如，淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽，或泡騰劑混合物；和/或e)吸收劑、著色劑、矯味劑和甜味劑。注射組合物可以是等滲水溶液或懸浮液，并且栓劑可以由脂肪乳劑或懸浮液制備。組合物可以被滅菌和/或含有輔助劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑或乳化劑、溶解促進(jìn)劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑。另外，它們還可以含有其它有治療價值的物質(zhì)。適宜的透皮用制劑包含有效量的本發(fā)明化合物和載體。載體包括有助于通過宿主皮膚吸收的藥理學(xué)上可接受的溶劑。例如，透皮吸收制劑是一種含有背襯膜、含有所述化合物并任選地含有載體和使所述化合物在較長的一段時間內(nèi)以受控和預(yù)定速度釋放到宿主皮膚的控速屏障的貯藥庫、以及確保所述透皮吸收制劑牢固地與皮膚接觸的部件的繃帶形式。也可以使用基質(zhì)透皮制劑。合適的局部用，例如皮膚和眼睛用制劑優(yōu)選為本領(lǐng)域公知的水溶液、軟膏劑、霜劑或凝膠劑。所述制劑可包含增溶劑、穩(wěn)定劑、張力增強(qiáng)劑、緩沖劑和防腐劑。
本發(fā)明化合物可以與一種或多種治療劑一起以治療有效量進(jìn)行給藥(聯(lián)用藥物產(chǎn)品)。例如，可以與預(yù)防或治療任何上述疾病的其它藥物產(chǎn)生協(xié)同作用。這些藥物包括免疫調(diào)節(jié)劑或抗炎物質(zhì)，例如環(huán)孢菌素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制劑類似物，例如環(huán)孢菌素A(CsA)、環(huán)孢菌素G、FK-506、雷帕霉素或類似化合物、皮質(zhì)類固醇、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、布喹那、來氟米特、咪唑立賓、麥考酚酸、嗎替麥考酚酯、15-脫氧精胍菌素、免疫抑制劑抗體，特別是白細(xì)胞受體的單克隆抗體例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或其配體，或其它免疫調(diào)節(jié)化合物，如CTLA41g。當(dāng)本發(fā)明化合物與其它治療劑一同給藥時，共同給藥的化合物的劑量當(dāng)然將根據(jù)一起使用的藥物類型、所使用的特定藥物、被治療的疾病等情況來進(jìn)行調(diào)整。
本發(fā)明還提供了一種聯(lián)用藥物產(chǎn)品，例如藥盒，其包含a)游離形式或可藥用鹽形式的第一種活性劑，它是本文公開的本發(fā)明化合物，和b)至少一種聯(lián)用的活性劑。該藥盒可包含用于給藥的使用說明。
本文使用的術(shù)語“聯(lián)合用藥”或“合并給藥”等意指包括將所選擇的治療劑給予同一病人，并且旨在包括治療劑不以相同途徑或相同時間給藥的治療方案。
本文所使用的術(shù)語“聯(lián)用藥物產(chǎn)品”是指由一種以上活性組分混合或組合所形成的產(chǎn)品并且包括活性成分的固定組合和不固定組合。術(shù)語“固定組合”是指活性組分例如式I化合物和聯(lián)用治療劑以單一實(shí)體或劑型同時給予患者。術(shù)語“不固定組合”是指活性組分例如式I化合物和聯(lián)用治療劑各自作為實(shí)體同時、一起或沒有具體時間限制地依次給予患者，其中所述給藥可在患者身體中提供治療有效水平的兩種化合物。后者也用于雞尾酒療法，例如給予三種或三種以上的活性組分。
制備本發(fā)明化合物的方法本發(fā)明還包括制備本發(fā)明化合物的方法。在所描述的反應(yīng)中，可能有必要保護(hù)在終產(chǎn)物中需要的反應(yīng)性官能團(tuán)，例如羥基、氨基、亞氨基、巰基或羧基，以避免它們不必要地參與反應(yīng)?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)實(shí)踐使用常規(guī)的保護(hù)基，例如，參見T.W.Greene和P.G.M.Wuts“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基”，John Wiley和Sons，1999，第3版。
其中R5為氫的式I化合物可按照下列反應(yīng)方案I的描述進(jìn)行制備
反應(yīng)方案I 其中R1、R2和R3如發(fā)明概述中的式I所定義。
本發(fā)明化合物(式I)可通過將式2化合物與式3化合物在適宜的溶劑(例如，二氯甲烷等)、適宜的胺(例如二異丙基乙胺等)和適宜的催化劑(醋酸銅(II)等)存在下反應(yīng)來制備。該反應(yīng)在10-50℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行并且可繼續(xù)24小時至反應(yīng)結(jié)束。合成式I化合物的詳細(xì)說明闡述于下文的實(shí)施例中。
制備本發(fā)明化合物的其它方法本發(fā)明化合物的可藥用酸加成鹽可通過將游離堿形式的化合物與可藥用無機(jī)或有機(jī)酸反應(yīng)來制備?；蛘?，本發(fā)明化合物的可藥用堿加成鹽可通過將游離酸形式的化合物與可藥用無機(jī)或有機(jī)堿反應(yīng)制備?；蛘撸}形式的本發(fā)明化合物可利用起始材料或中間體的鹽制備。
游離酸或游離堿形式的本發(fā)明化合物可分別由相應(yīng)的堿加成鹽或酸加成鹽制備，例如酸加成鹽形式的本發(fā)明化合物可通過用適宜的堿(例如，氫氧化銨溶液、氫氧化鈉等)處理轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的游離堿。堿加成鹽形式的本發(fā)明化合物可通過用適宜的酸(例如，鹽酸等)處理轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的游離酸。
非氧化形式的本發(fā)明化合物可通過在適宜的惰性有機(jī)溶劑(例如乙腈、乙醇、二_烷水溶液等)中，在0-80℃下，用還原劑(例如，硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氫化鋰、硼氫化鈉、三氯化磷、三溴化磷等)處理由本發(fā)明化合物的N-氧化物制備。
本發(fā)明化合物的前藥衍生物可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法(例如，詳情見Saulnier等人(1994)，Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters，第4卷，第1985頁)制備。例如，適宜的前藥可通過將非衍生化的本發(fā)明化合物與適宜的氨基甲?；噭?例如，1，1-酰氧基烷基羰基氯(carbanochloridate)、對硝基苯基碳酸酯等)反應(yīng)來制備。
本發(fā)明化合物的被保護(hù)衍生物可通過本領(lǐng)與普通技術(shù)人員已知的方法制備。用于產(chǎn)生保護(hù)基及其脫除的技術(shù)的詳細(xì)描述可見于T.W.Greene，“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基”，第3版，John Wiley和Sons，Inc.，1999。
在本發(fā)明化合物的制備過程中，可方便地制備或形成本發(fā)明化合物的溶劑化物(例如水合物)。本發(fā)明化合物的水合物可通過在水/有機(jī)溶劑混合物中重結(jié)晶，利用有機(jī)溶劑如二惡英、四氫呋喃或甲醇方便地制備。
本發(fā)明化合物單獨(dú)的立體異構(gòu)體可通過將化合物的外消旋混合物與旋光拆分劑反應(yīng)形成一對非對映異構(gòu)體化合物、分離非對映異構(gòu)體并重新獲得光學(xué)純對映異構(gòu)體來制備。盡管對映異構(gòu)體的拆分可利用本發(fā)明化合物的共價非對映異構(gòu)體衍生物來進(jìn)行，但可解離的復(fù)合物(例如，非對映異構(gòu)體鹽晶體)是優(yōu)選的。非對映異構(gòu)體具有不同的物理性質(zhì)(例如，熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、溶解度、反應(yīng)性等)并且可以很容易地利用這些差異進(jìn)行分離。非對映異構(gòu)體可以通過色譜法分離，或者優(yōu)選通過建立在溶解度不同基礎(chǔ)上的分離/拆分技術(shù)進(jìn)行分離。然后通過任何不會導(dǎo)致消旋化的實(shí)用方法重新獲得光學(xué)純的對映異構(gòu)體和拆分劑。用于通過外消旋混合物拆分化合物的立體異構(gòu)體的技術(shù)的更詳細(xì)描述可見于Jean Jacques，Andre Collet，SamuelH.Wilen，“對映異構(gòu)體、外消旋體和拆分”，John Wiley和Sons，Inc.，1981。
總之，式I化合物可通過下述方法制備，該方法包括(a)反應(yīng)方案I中的那些方法；和
(b)任選地將本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為可藥用鹽；(c)任選地將鹽形式的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為非鹽形式；(d)任選地將非氧化形式的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為可藥用N-氧化物；(e)任選地將N-氧化物形式的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為其非氧化物形式；(f)任選地將異構(gòu)體混合物拆分為本發(fā)明化合物的獨(dú)立的異構(gòu)體；(g)任選地將非衍化的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為可藥用前藥衍生物；和(h)任選地將本發(fā)明化合物的前藥衍生物轉(zhuǎn)化為其非衍化形式。
當(dāng)本文中未對起始材料的制備進(jìn)行具體描述時，則所述化合物是已知的或者可通過本領(lǐng)域已知的類似方法或如下文實(shí)施例所述進(jìn)行制備。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解上述轉(zhuǎn)化僅僅是制備本發(fā)明化合物方法的代表，并可類似地使用其他公知的方法。
實(shí)施例通過說明本發(fā)明式I化合物制備的下列實(shí)施例來進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺
實(shí)施例1將3-(N，N-二甲氨基)苯胺(10.0g，0.040mol)和二異丙基乙胺(15.7g，0.121mol)在丁醇(400mL)中的混合物加熱至100℃。在20分鐘內(nèi)緩慢地加入4，6-二氯嘧啶(7.81g，0.0524mol)。在加入過程中觀察到白色氣體和溶劑沸騰。將所得到的溶液攪拌24小時并且pH測量顯示為酸性條件。補(bǔ)加二異丙基乙胺(7.81g，0.0524mol)，將反應(yīng)混合物再攪拌24小時。pH測量再次顯示為酸性混合物，再次加入二異丙基乙胺(7.81g，0.0524mol)，將反應(yīng)混合物再攪拌24小時。迅速冷卻反應(yīng)混合物并真空除去溶劑。將所得到的黃色殘余物溶解在乙酸乙酯(100mL)中并用水(3x)洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾并濃縮直至出現(xiàn)大量沉淀物。通過過濾分離固體，用己烷洗滌并高真空干燥24小時，得到化合物2(7.02g，70％)；MS m/z(M+H+)249.10。
向化合物2(100mg，0.4mmol)、2-(硼酸)苯胺(110mg，0.8mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中的混合物中加入四-(三苯基膦)-鈀(0)(93mg，0.08mmol)和4M碳酸鈉(1.6mL，1.6mmol)。密封試管并在微波爐中于140℃下放置1200秒。然后將混合物傾入鹽水(10mL)中并用乙酸乙酯(3x)萃取。合并有機(jī)層，用鹽水洗滌并用硫酸鎂干燥。過濾后，除去有機(jī)溶劑，粗產(chǎn)物通過硅膠色譜純化得到化合物3(100mg，81％)；MS m/z(M+H+)306.1。
將化合物3(150mg，0.5mmol)、3-硝基苯硼酸(250mg，1.5mmol)、醋酸銅(II)(45mg，0.25mmol)和二異丙基乙胺(250mg，2.0mmol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物在室溫下攪拌過夜?；旌衔镉枚燃淄橄♂尣⒂蔑柡吞妓釟溻c洗滌。有機(jī)部分用硫酸鎂干燥，過濾并濃縮。粗產(chǎn)物然后通過硅膠色譜純化(純二氯甲烷)得到化合物4(150mg，71％收率)；MS m/z(M+H+)427.10。
將化合物4(150mg，0.35mmol)和10％Pd-C(15mg)在甲醇(10mL)中的混合物在氫環(huán)境(1大氣壓)和室溫下攪拌30分鐘。通過過濾除去鈀催化劑并將甲醇溶液濃縮至干，得到化合物5(100mg，77％收率)，為黃色糖漿；MS m/z(M+H+)397.30。
將化合物5(20mg，0.05mmol)、4-(N-甲基-哌嗪基)-甲基-苯甲酸(14mg，0.06mmol)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N＇，N＇-四甲基脲六氟磷酸鹽(23mg，0.06mmol)和二異丙基乙胺(8mg，0.06mmol)在二氯甲烷(2mL)中的混合物在室溫下攪拌過夜。LCMS純化得到N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺(9.2mg，30％收率)1H NMR 400Hz(CDCl3)δ2.51(s，3H)，2.61(br，4H)，2.78(br，4H)，2.97(s，6H)，3.58(s，2H)，6.57(m，1H)，6.68(m，2H)，6.84(m，1H)，6.97(m，1H)，7.10(m，2H)，7.18(m，1H)，7.26(m，2H)，7.40(d，J＝8.12Hz，2H)，7.46(d，J＝8.12Hz，2H)，7.54(s，br，1H)，7.79(d，J＝8.14Hz，2H)，7.86(s，1H)，8.69(s，1H)；MS m/z(M+H+)613.30。
通過重復(fù)上述實(shí)施例的方法，利用適宜的起始材料，得到下表1中所示的式I化合物。
表1





活性測定測定了與母本32D細(xì)胞相比本發(fā)明化合物選擇性抑制表達(dá)BCR-Abl的32D細(xì)胞(32D-p210)的細(xì)胞增殖的能力。測試選擇性抑制這些BCR-Abl轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖的化合物對于表達(dá)野生型或突變型BCR-Abl的Ba/F3細(xì)胞的抗增殖活性。另外還測定了化合物抑制B-RAF的能力。
抑制細(xì)胞BCR-Abl依賴性增殖(高通量方法)所使用的鼠科細(xì)胞系是用BCR-Abl cDNA轉(zhuǎn)化的32D造血祖細(xì)胞系(32D-p210)。這些細(xì)胞保持在補(bǔ)充有青霉素50μg/mL、鏈霉素50μg/mL和L-谷氨酸200mM的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。未轉(zhuǎn)化的32D細(xì)胞保持在類似條件下并加有15％WEHI條件培養(yǎng)基作為IL3源。
將50μl 32D或32D-p210細(xì)胞懸浮液以每孔5000個細(xì)胞的密度涂覆到Greiner 384孔微孔板(黑色)中。在每個孔中加入50nL的試驗(yàn)化合物(1mM，在DMSO儲備溶液中)(STI571作為陽性對照)。在37℃、5％CO2下將細(xì)胞培養(yǎng)72小時。在各孔中加入10μL 60％的Alamar Blue溶液(Tek診斷劑)并將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時。使用AcquestTM系統(tǒng)(Molecular Devices)測定熒光密度(530nm處激發(fā)，580nm處發(fā)射)。
抑制細(xì)胞BCR-Abl依賴性增殖將32D-p210細(xì)胞以每孔15000個細(xì)胞的密度涂覆到96孔TC板中。向各孔中加入50μL試驗(yàn)化合物的兩倍系列稀釋液(Cmax為40μM)(STI571作為陽性對照)。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)48小時后，向各孔中加入15μL的MTT(Promega)并將細(xì)胞再培養(yǎng)5小時。通過分光光度法測定570nm處的光密度并通過量效曲線確定50％抑制作用所需的化合物的濃度，即IC50值。
對細(xì)胞周期分布的影響將32D和32D-p210細(xì)胞以每孔2.5×106個細(xì)胞并存在于5mL培養(yǎng)基中的形式加入6孔TC板中并以1或10μM的濃度加入試驗(yàn)化合物(STI571作為對照)。然后，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)細(xì)胞24或48小時。用PBS洗滌2ml細(xì)胞懸浮液，在70％EtOH中固定1小時并用PBS/EDTA/RNase A處理30分鐘。加入碘化丙錠(Propidium iodide Cf＝10μg/ml)并在FACScaliburTM系統(tǒng)(BD Biosciences)上通過流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度。本發(fā)明試驗(yàn)化合物顯示對32D-p210細(xì)胞具有細(xì)胞凋亡作用但不誘導(dǎo)32D母本細(xì)胞凋亡。
對細(xì)胞BCR-Abl自磷酸化的作用使用c-abl特異性捕獲抗體和抗磷酸酪氨酸抗體用捕獲Elisa測定BCR-Abl的自磷酸化作用。將32D-p210細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞并存在于50μL培養(yǎng)基中的形式加入96孔TC板中。每孔加入50μL試驗(yàn)化合物的兩倍系列稀釋液(Cmax為10μM，STI571作為陽性對照)。在37℃、5％CO2下培養(yǎng)細(xì)胞90分鐘。然后，細(xì)胞在冰上用150μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的溶胞緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，5mM EDTA，1mM EGTA和1％NP-40)處理1小時。將50μL細(xì)胞溶解產(chǎn)物加到96孔光學(xué)板中，該板事先用抗-abl特異性抗體涂覆并封閉。在4℃下培養(yǎng)該板4小時。用TBS-吐溫20緩沖液洗滌后，加入50μL堿性磷酸酶結(jié)合的抗-磷酸酪氨酸抗體并將該板在4℃下培養(yǎng)過夜。用TBS-吐溫20緩沖液洗滌后，加入90μL發(fā)光底物并用AcquestTM系統(tǒng)(Molecular Devices)定量測定發(fā)光情況。所測試的本發(fā)明化合物以劑量依賴性方式抑制表達(dá)BCR-Abl的細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞BCR-Abl的自磷酸化。
對表達(dá)突變型BCR-Abl的細(xì)胞增殖的影響測試本發(fā)明化合物對表達(dá)野生型或突變型BCR-Abl的Ba/F3細(xì)胞(G250E、E255V、T315I、F317L、M351T)的抗增殖作用，這些細(xì)胞對STI571耐受或?qū)ζ涿舾行越档?。?0、3.3、1.1和0.37μM的濃度如上所述(培養(yǎng)基中不含IL3)測試這些化合物對表達(dá)突變型-BCR-Abl的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗增殖作用。由如上所述獲得的量效曲線確定對未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞沒有毒性的化合物的IC50值。
B-RAF測試本發(fā)明化合物抑制B-RAF活性的能力。在黑色壁和透明底的384孔MaxiSorp板(NUNC)中進(jìn)行測定。在DPBS中稀釋底物IκBα(1∶750)并在各孔中加入15μL。在4℃下將板培養(yǎng)過夜并在EMBLA板洗滌器上用TBST(25mM Tris，pH8.0，150mM NaCl和0.05％吐溫-20)洗滌3次。在室溫下，將板用Superblock(15μL/孔)封閉3小時，用TBST洗滌3次并蘸干(pat-dried)。將含有20μM ATP(10μL)的測定緩沖液加到各孔中，然后加入100nL或500nL化合物。將B-RAF在測定緩沖液中稀釋(1μL稀釋至25μl)中并將10μl稀釋的B-RAF加到各孔中(0.4μg/孔)。在室溫下將該板培養(yǎng)2.5小時。通過用TBST洗滌該板6次來終止激酶反應(yīng)。在Superblock中稀釋Phosph-IκBα(Ser32/36)抗體(1∶10,000)并將15μL加到各孔中。將板在4℃下培養(yǎng)過夜并用TBST洗滌6次。在Superblock中稀釋AP-結(jié)合的山羊-抗-小鼠IgG(1∶1,500)并將15μL加到各孔中。在室溫下培養(yǎng)該板1小時并用TBST洗滌6次。在各孔中加入15μL Attophos AP底物并在室溫下培養(yǎng)15分鐘。使用熒光強(qiáng)度Nanxin BBT陰離子(505二色性鏡)在Acquest或Analyst GT上讀板。
Upstate Kinase ProfilerTM-放射-酶學(xué)過濾器結(jié)合測定法評價本發(fā)明化合物抑制各種激酶(激酶的部分非限定性例子包括Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4)的能力。按照該通用方法以10μM的最終濃度一式兩份地測試化合物。需要注意的是激酶緩沖液組合物和底物隨“Upstate Kinase ProfilerTM”中激酶的不同而進(jìn)行變化。在置于冰上的eppendorf中混合激酶緩沖液(2.5μL，10倍濃度，需要時含有MnCl2)、活性激酶(0.001-0.01單位；2.5μL)、存在于激酶緩沖液中的特異性或多聚(Glu4-Tyr)肽(5-500μM或0.01mg/ml)以及激酶緩沖液(50μM；5μl)。加入Mg/ATP混合物(10μL；67.5(或33.75)mM MgCl2、450(或225)μM ATP和1μCi/μl[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol))并在約30℃下將反應(yīng)產(chǎn)物保溫約10分鐘。將反應(yīng)混合物(20μl)點(diǎn)在2cm×2cm P81(磷酸纖維素，用于帶正電的肽底物)或Whatman No.1(用于多聚(Glu4-Tyr)肽底物)方形紙上。用0.75％磷酸洗滌該方形紙4次，每次5分鐘，然后用丙酮洗滌一次，洗滌5分鐘。將該方形紙轉(zhuǎn)移到閃爍管中，加入5ml閃爍混合液并用Beckman閃爍計(jì)數(shù)器測定摻入肽底物中的32P(cpm)。計(jì)算每個反應(yīng)的抑制百分?jǐn)?shù)。
游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物顯示出有價值的藥理特性，例如，如本申請?bào)w外試驗(yàn)所示。例如，式I化合物對野生型BCR-Abl和b-Raf的IC50優(yōu)選在1×10-10到1×10-5M的范圍內(nèi)，優(yōu)選小于1μM。例如，N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺(實(shí)施例1)對b-Raf的IC50為0.667μM。
在10μM濃度下，式I化合物對Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和/或FLT4激酶的抑制百分?jǐn)?shù)大于50％，優(yōu)選大于約70％。例如，在10μM濃度下，N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺(實(shí)施例1)以括弧內(nèi)顯示的百分?jǐn)?shù)抑制下列激酶(例如，100％意指完全抑制，0％意指不抑制)Abl(90％)、c-RAF(96％)、CHK2(59％)、FGFR3(56％)、p70S6K(79％)、PDGFRα(71％)和PKCα(64％)。
可以理解的是，本文所述的實(shí)施例和具體實(shí)施方式
僅僅是出于舉例說明的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以據(jù)此進(jìn)行各種修飾或改變，并且這些修飾和改變均包括在本申請的精神和范圍內(nèi)以及所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。本文中引證的所有公開出版物、專利和專利申請的全部內(nèi)容均引入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.式I化合物及其可藥用鹽、水合物、溶劑化物和異構(gòu)體 其中n為0、1、2或3；Z選自＝N-和＝CH-；R1選自氫和-NR4R5；其中R4選自氫和C1-6烷基；并且R5選自C6-10芳基、C5-10雜芳基、C3-12環(huán)烷基和C3-8雜環(huán)烷基，其中R5中的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基均可以是未取代的或被1-3個彼此獨(dú)立地選自下列的基團(tuán)所取代氰基、硝基、鹵素、C1-6烷基、鹵素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷氧基和-NR6R7；其中R6和R7獨(dú)立地選自氫和C1-6烷基；R2選自氫和C1-6烷基；R3選自鹵素、氰基、硝基、C1-6烷基、鹵素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷氧基、-XNR8R8、-XNR8R9、-XC(O)R8、-XNR8C(O)R9和-XC(O)NR8R9；其中X為鍵或C1-4亞烷基，R8選自氫和C1-6烷基，并且R9選自C6-10芳基、C5-10雜芳基、C3-12環(huán)烷基和C3-8雜環(huán)烷基；其中R9中的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基均是未取代的或被選自下列的基團(tuán)所取代鹵素取代的C1-6烷基、-XOR8、-XR10、-XS(O)2N(OR8)2、-XS(O)N(XOR8)2、-XSN(OR8)2、-XSR10、-XS(O)R10和-XS(O)2R10；其中X為鍵或C1-6亞烷基，R8為氫或C1-6烷基并且R10為選自C3-8雜環(huán)烷基和C5-10雜芳基的基團(tuán)；其中R10中的任何雜環(huán)烷基或雜芳基均是未取代的或被1-3個彼此獨(dú)立地選自下列的基團(tuán)所取代鹵素、氰基、硝基、C1-6烷基、鹵素取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷氧基；R10中的任何一個環(huán)碳原子均可以任選地被-C(O)-替代；并且其中苯基環(huán)A和B可以具有至多4個由-N＝替代的-C＝基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1選自氫和-NR4R5；其中R4選自氫和C1-6烷基；并且R5是未取代的或被1-3個基團(tuán)取代的C6-10芳基，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自鹵素取代的C1-6烷基和-NR6R7；其中R6和R7獨(dú)立地選自氫和C1-6烷基；并且R2選自氫和C1-6烷基；R3選自鹵素、C1-6烷基、-XC(O)R8、-XNR8R8、-XNR8C(O)R9和-XC(O)NR8R9；其中X為鍵或C1-4亞烷基，R8選自氫和C1-6烷基，并且R9選自C6-10芳基和C3-12環(huán)烷基；其中R9中的任何芳基或環(huán)烷基均是未取代的或被選自下列的基團(tuán)所取代-XOR8、-XR10、-XS(O)2N(XOR8)2和-XS(O)2R10；其中X為鍵或C1-6亞烷基，R8為氫或C1-6烷基并且R10為選自C3-8雜環(huán)烷基和C5-10雜芳基的基團(tuán)；其中R10中的任何雜環(huán)烷基或雜芳基均是未取代的或被1-3個C1-6烷基取代的；并且R10中的任何一個環(huán)碳原子均可以任選地被-C(O)-替代。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中R1選自氫和-NHR5；其中R5是未取代的或被1-3個獨(dú)立地選自三氟甲基和二甲基氨基的基團(tuán)取代的苯基；并且R2為氫。
4.權(quán)利要求2的化合物，其中R3選自鹵素、甲基、甲酰基、二甲基氨基、-NHC(O)R9和-C(O)NHR9；其中R9選自苯基和環(huán)丙基；其中R9中的任何芳基或環(huán)烷基均是未取代的或被選自下列的基團(tuán)所取代-CH2OH、-XR10、-S(O)2N(C2H4OH)2和-S(O)2R10；其中X為鍵或亞甲基并且R10為選自哌嗪基、嗎啉基和5-氧代-4，5-二氫-吡唑-1-基的基團(tuán)；其中R10中的任何雜環(huán)烷基或雜芳基均是未取代的或被1-3個甲基取代的。
5.權(quán)利要求2的化合物，其中R4選自鹵素、三氟甲基和-XR10；其中X為鍵或亞甲基；R10選自咪唑基、哌嗪基和嗎啉基；其中任何雜芳基或雜環(huán)烷基均是未取代的或被甲基取代的。
6.權(quán)利要求1的化合物，選自N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-苯甲酰胺；4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-(3-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-羥基甲基-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-3-(嗎啉-4-磺?；?-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-4-(3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-吡唑-1-基)-苯甲酰胺；N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-3-(4-甲基-哌嗪-1-磺?；?-苯甲酰胺；4-[二-(2-羥基-乙基)-氨磺?；鵠-N-(3-{2-[6-(3-二甲基氨基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯基)-苯甲酰胺；4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-[3-(2-嘧啶-4-基-苯基氨基)-苯基]-苯甲酰胺；N-環(huán)丙基-3-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯甲酰胺；{6-[2-(3-氟-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(2-氟-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(4-氟-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(2-氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(3-氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；{6-[2-(4-氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(4-三氟甲基-苯基)-胺；[6-(2-鄰-甲苯基氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-(4-三氟甲基-苯基)-胺；[6-(2-間-甲苯基氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-(4-三氟甲基-苯基)-胺；[6-(2-對-甲苯基氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-(4-三氟甲基-苯基)-胺；3-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯甲醛；4-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基氨基}-苯甲醛；(4-三氟甲基-苯基)-{6-[2-(2-三氟甲基-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-胺；(4-三氟甲基-苯基)-{6-[2-(4-三氟甲基-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-胺；N，N-二甲基-N′-{2-[6-(4-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-苯基}-苯-1，4-二胺；苯基-[6-(2-苯基氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-胺；{6-[2-(2，6-二氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺；和{6-[2-(2，6-二氯-苯基氨基)-苯基]-嘧啶-4-基}-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-胺。
7.一種藥物組合物，其含有治療有效量的權(quán)利要求1的化合物和可藥用賦形劑。
8.一種治療動物疾病的方法，其中抑制激酶和/或細(xì)胞因子活性可預(yù)防、抑制或改善疾病的病理和/或癥狀，該方法包括給予動物治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述激酶選自Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4。
10.權(quán)利要求1的化合物在制備用于治療動物疾病的藥物中應(yīng)用，其中所述疾病的病理和/或癥狀與激酶Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和/或FLT4的活性有關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類新的化合物、含有這些化合物的藥物組合物和使用這些化合物來治療或預(yù)防與激酶活性異?；蚴д{(diào)有關(guān)的疾病或病癥，特別是與Abl、BCR－Abl、EGF－R、c－erbB2激酶(HER－2)、CHK2、FGFR3、p70S6K、PKC、PDGF－R、p38、TGFβ、KDR、c－Kit、b－RAF、c－RAF、FLT1和/或FLT4激酶異常激活有關(guān)的疾病或病癥的方法。
文檔編號A61P35/00GK1860106SQ200480028450
公開日2006年11月8日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者G·肖浦克, P·菲雷, N·S·格雷, P·因巴赫, 劉異, J·舍普費(fèi)爾, R·斯廷斯瑪 申請人:Irm責(zé)任有限公司, 諾瓦提斯公司