專利名稱：多種腦膜炎球菌血清群的液體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗細(xì)菌性腦膜炎的免疫接種領(lǐng)域，尤其涉及針對(duì)多種病原體所引起的細(xì)菌性腦膜炎的混合免疫接種。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)是一種寄居在咽喉部可引起腦膜炎(并且，有時(shí)引起敗血病而不是腦膜炎)的不能運(yùn)動(dòng)的人病原體革蘭氏陰性菌。它可引起地方病和流行病。在引入抗b型流感嗜血桿菌(Hib)的偶聯(lián)疫苗后，腦膜炎奈瑟球菌已成為導(dǎo)致美國(guó)細(xì)菌性腦膜炎的主要原因。引起細(xì)菌性腦膜炎的第三類病原體是肺炎鏈球菌，但現(xiàn)在已可獲得有效的疫苗(PrevNarTM[1])。類似于Hib疫苗，肺炎鏈球菌疫苗依據(jù)的是偶聯(lián)的莢膜多糖抗原。
基于微生物的莢膜多糖，已經(jīng)鑒定到幾種腦膜炎奈瑟球菌的血清群，包括(A，B，C，H，I，K，L，29E，W135，X，Y和Z)。血清群A是撒哈拉沙漠以南非洲最常見(jiàn)的流行疾病原。血清群B和C與絕大部分發(fā)生在美國(guó)和大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家的病例有關(guān)。美國(guó)和發(fā)達(dá)國(guó)家中的其它一些病例是由血清群W135和Y引起的。雖然莢膜多糖是最有效的保護(hù)性免疫原，每個(gè)血清群需要不同的糖抗原，而且該方法不適于免疫抵御血清群B。因此，近年來(lái)采用血清群C的偶聯(lián)糖疫苗獲得成功(MenjugateTM[2]，MeningitecTM和NeisVac-CTM)但對(duì)血清群A、B、W135或Y所致疾病卻無(wú)作用；相反，它們選擇性地使這些血清群成為腦膜炎球菌疾病的主要原因。
一種可注射的血清群A、C、Y和W135莢膜多糖的四價(jià)疫苗已經(jīng)知道了很多年[3，4]，并批準(zhǔn)可用于人類。此疫苗中的多糖不是偶聯(lián)的，而是以1∶1∶1∶1的重量比存在[5]，各含有50μg純化多糖。雖然在青少年和成人中有效，但其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答差、保護(hù)時(shí)間短，不能用于嬰兒[例如，參考6]。而且，該疫苗的缺點(diǎn)是用時(shí)需要從凍干形式重建。
對(duì)于血清群B，所提供的一種疫苗效果捉摸不定。試驗(yàn)了其外膜囊泡疫苗[例如，參考7]，但通常保護(hù)力只限于用于制備該疫苗的菌種。
因此，仍然需要能保護(hù)兒童對(duì)腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的疫苗，還需要給藥前無(wú)需重建的疫苗。而且，仍然需要對(duì)血清群B能提供廣泛保護(hù)力的疫苗。
發(fā)明概述本發(fā)明滿足了所有這些需要，依據(jù)是八項(xiàng)獨(dú)立的發(fā)現(xiàn)。第一，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以單劑量混合時(shí)，腦膜炎球菌血清群C、W135和Y的偶聯(lián)莢膜多糖在人體中安全且具有免疫原性。第二，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入血清群A的偶聯(lián)莢膜多糖時(shí)保持了這種作用。第三，發(fā)現(xiàn)這些偶聯(lián)抗原可以單一水性劑量穩(wěn)定地混合而無(wú)需凍干。第四，發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用少量特定多肽抗原可實(shí)現(xiàn)對(duì)血清群B感染的廣泛保護(hù)力。第五，發(fā)現(xiàn)這些多肽抗原可與糖抗原聯(lián)用，而不會(huì)喪失對(duì)五種血清群任一種的保護(hù)效力。第六，發(fā)現(xiàn)即使加入Hib偶聯(lián)物，仍然保持效力。第七，發(fā)現(xiàn)加入血清群B菌株的蛋白質(zhì)抗原可提高血清群W135偶聯(lián)物的效力。最后，發(fā)現(xiàn)將Hib偶聯(lián)物加入到腦膜炎球菌偶聯(lián)物中可提高對(duì)腦膜炎球菌血清群W135的整體活性。
因此，本發(fā)明提供了一種水性免疫原性組合物，給予受試者后，該組合物能夠誘導(dǎo)對(duì)腦膜炎奈瑟球菌血清群B、C、W135和Y的殺菌性免疫應(yīng)答反應(yīng)，所述組合物包含(i)偶聯(lián)的血清群C莢膜多糖抗原；(ii)偶聯(lián)的血清群W135莢膜多糖抗原；(iii)偶聯(lián)的血清群Y莢膜多糖抗原；和(iv)一種或多種血清群B的多肽抗原。該水性組合物也可誘導(dǎo)對(duì)腦膜炎奈瑟球菌血清群A的殺菌性免疫應(yīng)答反應(yīng)，因而還包含(v)偶聯(lián)的血清群A莢膜多糖抗原。
本發(fā)明還提供一種水性免疫原性組合物，給予受試者后，該組合物可誘導(dǎo)(a)對(duì)至少腦膜炎奈瑟球菌血清群W135的殺菌性免疫應(yīng)答反應(yīng)和(b)對(duì)b型流感嗜血桿菌疾病的保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，所述組合物包含(i)偶聯(lián)的血清群W135莢膜多糖抗原；(ii)偶聯(lián)的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗原。該組合物可還包含血清群C、Y及任選A的偶聯(lián)莢膜多糖抗原。其還可包含腦膜炎奈瑟球菌血清群B的多肽抗原。
優(yōu)選的糖抗原是寡糖抗原。
血清群C、W135和Y制備腦膜炎球菌莢膜多糖的技術(shù)已經(jīng)知道了許多年，一般涉及以下步驟多糖沉淀(例如，使用陽(yáng)離子去污劑)，乙醇分餾，冷苯酚提取(以除去蛋白質(zhì))和超速離心(以除去LPS)[例如，參見(jiàn)8]。
一種更優(yōu)選的方法[9]涉及多糖沉淀后，用低級(jí)醇增溶沉淀的多糖。沉淀可采用陽(yáng)離子去污劑如四丁基銨和十六烷基三甲基銨鹽(例如，溴鹽)，或溴化己二甲銨和十四烷基三甲基銨鹽來(lái)實(shí)現(xiàn)。尤其優(yōu)選溴化十六烷基三甲基銨(“CTAB”)[10]。沉淀物質(zhì)的增溶可采用低級(jí)醇如甲醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二醇等來(lái)實(shí)現(xiàn)，但特別適合增溶CTAB-多糖復(fù)合物的是乙醇。可將乙醇加入到沉淀的多糖中，使最終的乙醇濃度(以乙醇和水的總含量計(jì))為50％-95％。
再次溶解后，可進(jìn)一步處理多糖以除去污染物。這在即使是微量污染物也不能接受的情況下尤其重要(例如，對(duì)于人疫苗生產(chǎn))。這通常將包括一次或多次過(guò)濾步驟如深度過(guò)濾，可采用活性碳過(guò)濾，分子大小過(guò)濾和/或超濾。
一旦過(guò)濾除去污染物，可沉淀多糖作進(jìn)一步處理和/或加工。這可通過(guò)陽(yáng)離子交換方便地實(shí)現(xiàn)(例如，通過(guò)加入鈣或鈉鹽)。
純化后，將莢膜多糖與載體蛋白偶聯(lián)，如下所述。
純化和偶聯(lián)腦膜炎球菌多糖的其它可選方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)11和12中所述。
另一種替代的純化方法是從頭合成或部分合成，例如參考文獻(xiàn)13所述的Hib合成和參考文獻(xiàn)14所述的MenA合成方法來(lái)獲得本發(fā)明莢膜多糖。
可對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾，例如O-乙酰化或脫-O-乙?；Ｈ魏蚊?O-乙?；虺?乙?；砂l(fā)生在多糖的特定位置上。例如，大多數(shù)血清群C菌株的O-乙?；挥谕僖核釟埢腃-7和/或C-8上，但約15％的臨床分離菌株缺乏這些O-乙?；鶊F(tuán)[15，16]。乙酰化似乎不會(huì)影響其保護(hù)效力(例如，不同于MenjugateTM產(chǎn)品，NeisVac-CTM產(chǎn)品使用了脫-O-乙?；嗵?，但這兩種疫苗都有效)。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖單元的聚合物。血清群Y糖類似于血清群W135糖，除了該二糖重復(fù)單元包含葡萄糖而不是半乳糖外。類似于血清群C糖，MenW135和MenY多糖具有不同的O-乙?；?，但位于唾液酸7和9位[上17]。優(yōu)選在偶聯(lián)前進(jìn)行這種化學(xué)修飾，但也可在偶聯(lián)期間進(jìn)行。
優(yōu)選分別純化不同血清群的糖，然后在偶聯(lián)之前或之后混合。
血清群A本發(fā)明組合物可包含偶聯(lián)的血清群A莢膜多糖抗原。可用與血清群C、W135和Y(如上所述)相同的方法純化和偶聯(lián)該糖，雖然其結(jié)構(gòu)不同血清群C、W135和Y的莢膜是圍繞的唾液酸(N-乙?；?神經(jīng)氨酸，NeuAc)，血清群A的莢膜是N-乙?；?甘露糖胺(唾液酸的天然前體)。血清群A糖特別易水解，其在水性介質(zhì)中不穩(wěn)定性意味著(a)血清群A液體疫苗的免疫原性會(huì)隨時(shí)間下降，(b)由于糖水解產(chǎn)物釋放入疫苗，其質(zhì)量控制更加困難。
天然MenA莢膜多糖是(α1→6)-連接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸鹽的均聚物，C3和C4位上有部分O-乙?；?。主要糖苷鍵是1-6磷酸二酯鍵，包括D-甘露糖胺的C1半縮醛基和C6醇基。平均鏈長(zhǎng)為93個(gè)單體。它具有以下通式 本發(fā)明者制備了修飾的糖抗原，它保留天然血清群A多糖的免疫原活性但在水中要穩(wěn)定得多。該單糖單元的C3和4碳位結(jié)合的羥基被封閉基團(tuán)取代[參考文獻(xiàn)18]。
具有封閉基團(tuán)而替代羥基的單糖單元的數(shù)目可不同。例如，所有或基本上所有的單糖單元可具有封閉基團(tuán)?；蛘?，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的單糖單元可具有封閉基團(tuán)。至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)單糖單元具有封閉基團(tuán)。
類似地，單糖單元是封閉基團(tuán)的數(shù)量可不同。例如，任何特定單糖單元上封閉基團(tuán)的數(shù)量可為1或2。
末端單糖單元可具有或不具有取代其天然羥基的封閉基團(tuán)。優(yōu)選保留末端單糖單元上的游離異頭(anomeric)羥基，以提供下一步反應(yīng)(例如，偶聯(lián))的連接手柄?？蓪⑵渌u基轉(zhuǎn)化為封閉基團(tuán)后再發(fā)生還原氨基化作用(例如，用NaBH3CN/NH4Cl)，將異頭羥基轉(zhuǎn)化為氨基(-NH2或-NH-E，其中E是氮保護(hù)基)。
通過(guò)羥基的衍生化反應(yīng)，即用另一種基團(tuán)取代羥基的氫原子，可直接實(shí)現(xiàn)封閉基團(tuán)取代羥基。用作封閉基團(tuán)的合適的羥基衍生物包括，例如，氨甲酯、磺酸酯、碳酸酯、酯、醚(例如，甲硅烷基醚或烷基醚)和縮醛。一些這種封閉基團(tuán)的具體例子包括烯丙基、Aloc、芐基、BOM、叔丁基、三苯甲基、TBS、TBDPS、TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、THP等。不能直接獲得、可完全取代羥基的其它封閉基團(tuán)包括C1-12烷基、C3-12烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基、NR1R2(R1和R2如以下段落所定義)、H、F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3、CCl3等。
優(yōu)選的封閉基團(tuán)為通式-O-X-Y或-OR3，其中，X是C(O)、S(O)或SO2；Y是C1-12烷基、C1-12烷氧基、C3-12環(huán)烷基、C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，各自任選地被1、2或3個(gè)獨(dú)立地選自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3的基團(tuán)取代；或Y是NR1R2；R1和R2獨(dú)立地選自H、C1-12烷基、C3-12環(huán)烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基；或R1和R2可偶聯(lián)形成C3-12飽和雜環(huán)基；R3是C1-12烷基或C3-12環(huán)烷基，各自可任選地被1、2或3個(gè)獨(dú)立地選自F、Cl、Br、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3的基團(tuán)取代；或R3是C5-12芳基或C5-12芳基-G1-6烷基，各自可任選地被1、2、3、4或5個(gè)選自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3的基團(tuán)取代。當(dāng)R3是C1-12烷基或C3-12環(huán)烷基時(shí)，一般被1、2或3個(gè)上述基團(tuán)取代。當(dāng)R1和R2偶聯(lián)形成C3-12飽和雜環(huán)基時(shí)，表示R1和R2與氮原子一起形成含3-12間任何數(shù)量碳原子的飽和雜環(huán)基(例如，C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。該雜環(huán)基可包含1或2個(gè)除氮原子外的雜原子(例如N、O或S)。C3-12飽和雜環(huán)基的例子是吡咯烷基、哌啶基、嗎啉基、哌嗪基、咪唑烷基、氮雜環(huán)丁基和氮丙啶基。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的衍生化過(guò)程，例如羥基與酰鹵、烷基鹵、磺酰鹵等的反應(yīng)，可從-OH制備封閉基團(tuán)-O-X-Y和-OR3。因此，-O-X-Y中的氧原子優(yōu)選為羥基氧原子，而-O-X-Y中優(yōu)選用-X-Y基團(tuán)取代羥基的氫原子。
或者，可通過(guò)取代反應(yīng)如Mitsonobu型取代反應(yīng)，獲得封閉基團(tuán)。制備羥基的封閉基團(tuán)的這些和其它方法是公知的。
更優(yōu)選地，封閉基團(tuán)是-OC(O)CF3[19]，或氨甲酯基團(tuán)-OC(O)NR1R2，其中R1和R2獨(dú)立地選自C1-6烷基。更優(yōu)選地，R1和R2都是甲基，即封閉基團(tuán)是-OC(O)NMe2。氨甲酯封閉基團(tuán)對(duì)糖苷鍵具有穩(wěn)定作用，可在溫和條件下制備。
優(yōu)選修飾的MenA多糖包含n個(gè)單糖單元，其中，至少h％的單糖單元在3和4位不具有-OH。h值為24或以上(例如，25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99或100)，優(yōu)選50或以上。缺失的羥基優(yōu)選為上述封閉基團(tuán)(取代)。
其它優(yōu)選的修飾MenA多糖包含的單糖單元中，至少s個(gè)單糖單元3位不具有-OH且4位不具有-OH。s值至少為1(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90)。缺失的-OH優(yōu)選為上述封閉基團(tuán)(取代)。
可用于本發(fā)明的合適的修飾MenA多糖具有以下通式 其中，n是1-100的整數(shù)(優(yōu)選是5-25，更優(yōu)選15-25的整數(shù))；T是通式(A)或(B)
各Z基團(tuán)獨(dú)立地選自O(shè)H或上述封閉基團(tuán)；和各Q基團(tuán)獨(dú)立地選自O(shè)H或上述封閉基團(tuán)；Y選自O(shè)H或上述封閉基團(tuán)；E是H或氮保護(hù)基；并且，約7％以上(例如，8％、9％、10％或以上)的Q基團(tuán)是封閉基團(tuán)。
各n+2 Z基團(tuán)可相同或不同。類似地，各n+2 Q基團(tuán)可相同或不同。所有Z基團(tuán)可是OH。或者，至少10％、20、30％、40％、50％或60％的Z基團(tuán)是OAc。優(yōu)選地，約70％的Z基團(tuán)是OAc，其余的Z基團(tuán)是OH或上述封閉基團(tuán)。至少約7％的Q基團(tuán)是封閉基團(tuán)。優(yōu)選地，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至是100％的Q基團(tuán)是封閉基團(tuán)。
優(yōu)選的封閉基團(tuán)是吸電子基團(tuán)。不希望被理論所限制，認(rèn)為由于糖苷鍵上的多糖羥基可發(fā)生分子內(nèi)親核攻擊(例如，通過(guò)形成環(huán)狀中間體)，因此糖苷鍵不穩(wěn)定易水解。羥基親核性越強(qiáng)，分子內(nèi)親核攻擊的趨勢(shì)越高。吸電子封閉基團(tuán)具有使氧孤電子對(duì)移位的作用，從而降低氧親核性并降低分子內(nèi)親核攻擊的趨勢(shì)。
因此，為提供對(duì)血清群A的保護(hù)力，該水性組合物可包含上述MenA修飾糖。
優(yōu)選本發(fā)明組合物可在37℃儲(chǔ)存28天，28天后，偶聯(lián)的MenA多糖只有不到f％起始總量將解離，其中，f為20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或以下。
共價(jià)結(jié)合通常在本發(fā)明組合物中莢膜多糖是與載體蛋白偶聯(lián)的。一般，偶聯(lián)可使糖從T-非依賴性抗原轉(zhuǎn)化為T-依賴性抗原，從而提高了糖的免疫原性，而能引發(fā)免疫記憶。
偶聯(lián)尤其適用于兒科疫苗，是一種公知的技術(shù)[例如，參考文獻(xiàn)20-29所述]。
優(yōu)選的載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，例如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素、或CRM197白喉毒素突變體[30-32]。其它合適的載體包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[33]；合成的肽[34，35]；熱休克蛋白[36，37]；百日咳蛋白[38，39]；細(xì)胞因子[40]；淋巴因子[40]；激素[40]；生長(zhǎng)因子[40]；人工蛋白，包括各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細(xì)胞表位[41]如N19蛋白[42]；流感嗜血桿菌的蛋白D[43，44]；肺炎鏈球菌溶血素[45]；肺炎球菌表面蛋白PspA[46]；鐵攝取蛋白[47]；艱難梭狀芽胞桿菌的毒素A或B[48]；細(xì)菌毒素突變體(例如，霍亂毒素“CT”或大腸桿菌不耐熱毒素“LT”)；如Glu-29取代的CT[49]等。優(yōu)選的載體是白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、流感嗜血桿菌蛋白D，尤其是CRM197。
在本發(fā)明組合物中，可使用一種以上載體蛋白，以降低載體抑制的風(fēng)險(xiǎn)。這種不同的載體蛋白可用于不同的血清群，例如血清群A多糖可與CRM197偶聯(lián)，而血清群C多糖可與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)。也可以對(duì)其特定多糖抗原使用一種以上的載體蛋白，例如，可將血清群A糖分為兩組，一些與CRM197偶聯(lián)，另一些與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)。然而，一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選對(duì)所有血清群使用相同的載體蛋白，優(yōu)選CRM197。
一種載體蛋白可攜帶一種以上的多糖抗原[50]。例如，一種載體蛋白可與血清群A和C的糖偶聯(lián)。為此一目的，可在偶聯(lián)反應(yīng)之前混合這些糖。然而，一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選每種血清群具有不同的偶聯(lián)物。
優(yōu)選糖(載體)蛋白的比率(w/w)為1∶5(即蛋白質(zhì)過(guò)量)-到5∶1(即多糖過(guò)量)的偶聯(lián)物。優(yōu)選比率1∶2到5∶1，更優(yōu)選1∶1.25到1∶2.5。MenA和MenC優(yōu)選過(guò)量的載體蛋白。
偶聯(lián)物可與游離載體蛋白聯(lián)用[51]。當(dāng)某給定的載體蛋白在本發(fā)明組合物中以游離和偶聯(lián)形式存在時(shí)，優(yōu)選非偶聯(lián)形式在整個(gè)組合物中的量不大于載體蛋白總量的5重量％，更優(yōu)選小于2重量％。
可采用任何合適的偶聯(lián)反應(yīng)，需要時(shí)采用合適的接頭。
通常在偶聯(lián)前活化或功能化糖?；罨砂?，例如，氰基試劑如CDAP(例如，1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽[52，53等])。其它合適的技術(shù)利用碳二亞胺、肼、活性酯、降冰片烷、p-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU；也見(jiàn)參考文獻(xiàn)27的內(nèi)容)。
可采用已知方法，例如，參考文獻(xiàn)54和55所述方法，通過(guò)接頭基團(tuán)形成連接鍵。一種類型的連接鍵包括多糖的還原氨基化，所產(chǎn)生的氨基與己二酸接頭基團(tuán)的一端連接，然后蛋白質(zhì)與己二酸接頭基團(tuán)的另一端連接[25，56，57]。其它接頭基團(tuán)包括B-丙酰氨基[58]、硝基苯基-乙胺[59]、鹵?；u化物[60]、糖苷鍵[61]、6-氨基己酸[62]、ADH[63]、C4-C12分子[64]等。作為使用接頭基團(tuán)的一種地帶方法，也可直接連接。直接連接蛋白質(zhì)包括多糖的氧化，然后與蛋白質(zhì)還原氨基化，例如參考文獻(xiàn)65和66所述。
優(yōu)選的方法包括將氨基引入糖(例如，通過(guò)用-NH2取代末端＝O)基團(tuán)，然后用己二酰二酯(例如，己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯)衍生化，并與載體蛋白反應(yīng)。另一種優(yōu)選的反應(yīng)利用CDAP與蛋白D載體的活化，例如對(duì)于MenA或MenC。
偶聯(lián)后，分離游離和偶聯(lián)的糖。有許多合適的方法，包括疏水色譜法、切線超濾法、滲濾法等[也見(jiàn)參考文獻(xiàn)67和68等]。
當(dāng)本發(fā)明組合物包含偶聯(lián)的寡糖時(shí)，優(yōu)選寡糖的制備在偶聯(lián)反應(yīng)之前。
偶聯(lián)后，本發(fā)明方法包括測(cè)定未偶聯(lián)載體蛋白水平的步驟。一種進(jìn)行此種測(cè)定的方法涉及毛細(xì)管電泳法[69](例如在游離溶液中)、或膠束電動(dòng)色譜法[70]。
偶聯(lián)后，本發(fā)明方法可包括測(cè)定未偶聯(lián)糖水平的步驟。一種進(jìn)行此種測(cè)定的方法涉及HPAEC-PAD[67]。
偶聯(lián)后，本發(fā)明方法包括將非偶聯(lián)多糖與偶聯(lián)多糖分離的步驟。一種分離這些糖的方法是利用選擇性沉淀一種組分的方法。優(yōu)選通過(guò)脫氧膽酸鹽處理選擇性沉淀偶聯(lián)糖，而使非偶聯(lián)糖留在溶液中[67]。
偶聯(lián)后，本發(fā)明方法包括測(cè)定偶聯(lián)物的分子大小和/或摩爾質(zhì)量的步驟。尤其是測(cè)定其分布。一種進(jìn)行此種測(cè)定的方法包括分子篩色譜法，通過(guò)多角度光散射光度法和差異性折射法(SEC-MALS/RI)檢測(cè)[71]。
寡糖莢膜多糖通常以寡糖形式使用。這可通過(guò)使純化的莢膜多糖斷裂成片段而方便地形成(如通過(guò)水解)，通常接著是純化獲得所需大小的片斷。
進(jìn)行多糖的片段化優(yōu)選使寡糖的最終平均聚合度(DP)低于30(例如在10和20之間，優(yōu)選血清群A約為10；血清群W135和Y在15和25之間，優(yōu)選約15至20；血清群C在12和22之間；等等)。DP可以通過(guò)離子交換色譜或比色試驗(yàn)方便地測(cè)定[72]。
進(jìn)行水解時(shí)，水解產(chǎn)物通常要進(jìn)行大小分級(jí)，以去除長(zhǎng)度短的寡糖[73]。這可通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)，如超濾后進(jìn)行離子交換色譜。聚合度低于或等于約6(個(gè)單糖)的寡糖優(yōu)選從血清群A中去除，聚合度低于4的寡糖優(yōu)選從血清群W135和Y中去除。
多糖的化學(xué)水解通常包括在該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)條件下用酸或堿處理。莢膜多糖解聚形成其組成單糖的條件是本領(lǐng)域已知的。一種解聚方法包括使用過(guò)氧化氫[11]。將過(guò)氧化氫加入到多糖中(例如，最終H2O2濃度為1％)，然后孵育(與55℃)該混合液直到實(shí)現(xiàn)所需的鏈長(zhǎng)度減少。隨時(shí)間減少鏈長(zhǎng)度后，從混合物取樣，測(cè)定樣品中糖的(平均)分子量。一旦達(dá)到所需的鏈長(zhǎng)度，即快速冷卻終止解聚反應(yīng)。
血清群B抗病原體如乙型肝炎病毒、白喉和破傷風(fēng)的疫苗通常包含一種蛋白質(zhì)抗原(例如，HBV表面抗原、或破傷風(fēng)類毒素)。相反，無(wú)細(xì)胞性百日咳疫苗通常至少含有三種百日咳桿菌蛋白，PrevNarTM肺炎球菌疫苗含有七種不同的偶聯(lián)糖抗原。其它疫苗如細(xì)胞性百日咳疫苗、麻疹疫苗、滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗(IPV)和腦膜炎球菌OMV疫苗性質(zhì)上是大量抗原的天然復(fù)雜混合物。因此單一抗原、少量已鑒定抗原或未鑒定抗原的復(fù)雜混合物是否能引發(fā)保護(hù)力，取決于所要對(duì)抗的病原體。
如上所述，發(fā)現(xiàn)血清群B腦膜炎球菌疫苗效果捉摸不定?；贠MV的疫苗顯示保護(hù)效力范圍狹窄。而且，OMV中存在大量未鑒定抗原，以及其可變性質(zhì)，意味著OMV存在各種質(zhì)量控制問(wèn)題。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)血清群B感染的廣泛保護(hù)力，這可通過(guò)使用少量已鑒定的血清群B多肽抗原來(lái)實(shí)現(xiàn)，因而本發(fā)明組合物包含一種或多種多肽抗原，使得組合物可誘導(dǎo)對(duì)兩種或多種(例如2或3種)腦膜炎奈瑟球菌血清群B的超毒性譜系A(chǔ)4、ET-5和譜系3的殺菌性免疫應(yīng)答反應(yīng)。
已報(bào)道了腦膜炎球菌血清群A[74]和B[75，76]的基因組序列，可從其編碼的多肽選擇合適的抗原[例如，參考文獻(xiàn)77-82]。操作候選抗原以改善異源性表達(dá)[參考文獻(xiàn)83-85]。
一種優(yōu)選的組合物包含Tbp蛋白和Hsf蛋白[86]。Hsf是一種自身運(yùn)載蛋白[87-89]，也稱為nhhA[89]、GNA0992[77]或NMB0992[75]。Tbp是轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)蛋白[90-93]，包括TbpA和TbpB以及TbpA和TbpB的高分子量和低分子量形式。Tbp包括各上述蛋白質(zhì)和這些蛋白質(zhì)的復(fù)合物以及能夠偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白的其它蛋白質(zhì)或復(fù)合物。雖然Tbp可指TbpA或TbpB的高或低分子形式，但優(yōu)選同時(shí)存在TbpA和/或TbpB的高分子量和低分子量形式。最優(yōu)選地，存在高分子量和低分子量的TbpA。
另一種優(yōu)選的組合物包含血清群B的低聚糖脂(LOS)[94]?？刹捎贸迦築多肽以外的LOS或用LOS代替血清群B多肽。
另一種優(yōu)選的組合物包含選自奈瑟菌具有不同功能的至少兩種不同蛋白質(zhì)類別的抗原之一。這種蛋白質(zhì)類別的例子是粘附素、自身運(yùn)載蛋白、毒素、整合性外膜蛋白和鐵攝取蛋白。采用參考文獻(xiàn)95的命名法，這些抗原選自至少一種選自FhaB、NspA PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119和NadA的奈瑟球菌粘附素；至少一種選自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的奈瑟球菌自身運(yùn)載蛋白；至少一種選自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT(NMB1343)以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3中的一種或兩種的奈瑟球菌毒素；至少一種選自TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28(GNA2132)、Sibp、NMB0964、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrB和P2086(XthA)的奈瑟球菌鐵攝取蛋白；至少一種奈瑟球菌膜偶聯(lián)蛋白，優(yōu)選外膜蛋白，尤其是選自PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MItA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA(GNA1946)、NMB1124、NMB1162、NMB1220、NMB1313、NMB1953、HtrA和PLDA(OMPLA)的整合性外膜蛋白。認(rèn)為這些奈瑟球菌抗原的組合可令人驚訝地提高疫苗抵抗奈瑟球菌感染的效力[95]。
特別優(yōu)選的組合物包含一種或多種以下抗原[96](1)“NadA”蛋白，優(yōu)選低聚物形式(例如，三聚物)；(2)“741”蛋白；(3)“936”蛋白；(4)“953”蛋白；和(5)“287”蛋白。
MenB的“NadA”(奈瑟球菌粘附素A)在參考文獻(xiàn)80中描述為蛋白“961”(SEQ ID 2943和2944)在參考文獻(xiàn)75中描述為“NMB1994”(也可參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)11352904和7227256)。該蛋白的詳細(xì)研究見(jiàn)參考文獻(xiàn)97。用于本發(fā)明時(shí)，NadA可采用多種形式。NadA的優(yōu)選形式是其平截或缺失變體，例如參考文獻(xiàn)83-85所述。具體地說(shuō)，優(yōu)選不具有C末端膜錨著區(qū)的NadA(例如，菌株2996缺失殘基351-405，得到SEQ ID NO1)，有時(shí)使用上標(biāo)“C”以示區(qū)別，例如NadA(C)。沒(méi)有大腸桿菌膜錨著區(qū)域的NadA的表達(dá)可使蛋白質(zhì)分泌進(jìn)入培養(yǎng)物上清液，同時(shí)除去其23mer前導(dǎo)肽(例如，保留菌株2996的327mer[SEQ ID NO2])。有時(shí)用上標(biāo)“NL”區(qū)別不具有前導(dǎo)肽的多肽，例如NadA(NL)或NadA(c)(NL)。優(yōu)選的NadA多肽具有(a)與SEQ ID NO2有50％或更多(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO1的至少n個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成的片段，其中，n為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。優(yōu)選的(b)片段缺乏SEQ ID NO1的C端和/或N端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個(gè)或更多)(例如，NadA(C)、NadA(NL)、NadA(C)(NL))。其它優(yōu)選的片段包含SEQ ID1的表位，尤其優(yōu)選的SEQ ID 1片段是SEQ ID 2。這些不同的序列包括NadA的變體(例如，等位基因變體、同源物、直系同源物、旁系同源物、突變體等)。各種NadA序列如參考文獻(xiàn)98的圖9所示。
MenB的“741”蛋白見(jiàn)參考文獻(xiàn)80所述(SEQ ID 2535和2536)，“NMB1870”見(jiàn)參考文獻(xiàn)75所述(也可參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)GI7227128)。血清群A中GenBank登錄號(hào)為7379322.741的相應(yīng)蛋白[74]自然是脂蛋白。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，741蛋白可采取多種形式。741的優(yōu)選形式是其平截或缺失變體，如參考文獻(xiàn)83-85中所述。具體地說(shuō)，可刪除741的N末端直到聚甘氨酸序列并包含該序列(例如，刪除菌株MC58的殘基1-72[SEQ ID NO3])，有時(shí)用前綴“ΔG”以示區(qū)別。這種缺失可促進(jìn)表達(dá)。刪除也可除去741的脂化位點(diǎn)。優(yōu)選741序列具有(a)與SEQ ID NO3有50％或更多(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)相同性氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO3的至少n個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成的片段，其中，n為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。優(yōu)選的(b)片段包含741的表位。其它優(yōu)選的片段缺乏SEQ ID NO3的C端和/或N端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個(gè)或更多)。這些序列包括741的變體(例如，等位基因變體、同源物、直系同源物、旁系同源物、突變體等)。各種741序列見(jiàn)于參考文獻(xiàn)85的SEQ ID 1-22，參考文獻(xiàn)99的SEQ ID 1-23，參考文獻(xiàn)100的SEQ ID 1-299。
血清群B的“936”蛋白見(jiàn)參考文獻(xiàn)80所述(SEQ ID 2883和2884)，在參考文獻(xiàn)75中稱為“NMB2091”(也可參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)GI7227353)。血清群A相應(yīng)基因[74]的GenBank登錄號(hào)為7379093。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，936蛋白可采取多種形式。936的優(yōu)選形式是其平截或缺失變體，如參考文獻(xiàn)83-85中所述。具體地說(shuō)，可刪除936的N端前導(dǎo)肽(例如，刪除菌株MC58的殘基1-23，得到936(NL)[SEQ ID NO4])。優(yōu)選的936序列具有(a)與SEQ ID NO4有50％或更多(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO4的至少n個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成的片段，其中，n為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。優(yōu)選的(b)片段包含936的表位。其它優(yōu)選的片段缺乏SEQID NO4的C端和/或N端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個(gè)或更多)。這些序列包括936的變體(例如，等位基因變體、同源物、直系同源物、旁系同源物、突變體等)。
血清群B的“953”蛋白見(jiàn)參考文獻(xiàn)80所述(SEQ ID 2917和2918)，在參考文獻(xiàn)75中稱為“NMB1030”(也可參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)GI7226269)。血清群A的相應(yīng)蛋白[74]的GenBank登錄號(hào)為7380108。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，953蛋白可采取多種形式。953的優(yōu)選形式是其平截或缺失變體，如參考文獻(xiàn)83-85中所述。具體地說(shuō)，可刪除953的N端前導(dǎo)肽(例如，刪除菌株MC58的殘基1-19，得到953(NL)[SEQ ID NO5])。優(yōu)選的953序列具有(a)與SEQ ID NO5有50％或更多(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO5的至少n個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成的片段，其中，n為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。優(yōu)選的(b)片段包含953的表位。其它優(yōu)選的片段缺乏SEQ ID NO5的C端和/或N端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個(gè)或更多)。這些序列包括953的變體(例如，等位基因變體、同源物、直系同源物、旁系同源物、突變體等)。953的等位基因形式可見(jiàn)參考文獻(xiàn)82的

圖19。
血清群B的“287”蛋白見(jiàn)參考文獻(xiàn)80所述(SEQ ID 3103和3104)，在參考文獻(xiàn)75中稱為“NMB2132”，在參考文獻(xiàn)77中稱為“GNA2132”(也可參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)GI7227388)。血清群A的相應(yīng)蛋白[74]的GenBank登錄號(hào)為7379057。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，287蛋白可采取多種形式。287的優(yōu)選形式是其平截或缺失變體，如參考文獻(xiàn)83-85中所述。具體地說(shuō)，可刪除287的N端直到聚甘氨酸序列并包含該序列(例如，刪除菌株MC58的殘基1-24，得到ΔG287[SEQID NO6])。這種缺失可促進(jìn)表達(dá)。優(yōu)選的287序列具有(a)與SEQ ID NO6具有50％或更多(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO6的至少n個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成的片段，其中，n為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。優(yōu)選的(b)片段包含287的表位。其它優(yōu)選的片段缺乏SEQ ID NO6的C端和/或N端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個(gè)或更多)。這些序列包括287的變體(例如，等位基因變體、同源物、直系同源物、旁系同源物、突變體等)。287的等位基因形式可見(jiàn)參考文獻(xiàn)82的圖5和15，以及參考文獻(xiàn)80的實(shí)施例13和圖21(SEQ ID 3179-3184)。
優(yōu)選的MenB抗原包含菌株2996、MC58、95N477和394/98之一中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。蛋白287優(yōu)選得自菌株2996，或更優(yōu)選得自菌株394/98。蛋白741優(yōu)選得自血清群B菌株MC58、2996、394/98或95N477，或得自血清群C菌株90/18311。更優(yōu)選菌株MC58。蛋白936，953和NadA優(yōu)選得自菌株2996。當(dāng)某組合物包含特定蛋白質(zhì)抗原(例如741或287)時(shí)，該組合物可包含一種以上變體形式的該抗原，例如蛋白質(zhì)相同、但得自不同菌株?？砂?lián)或獨(dú)立蛋白質(zhì)形式的這些蛋白質(zhì)。
然而，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物包含一種以上菌株的相同蛋白質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)741蛋白有效。該蛋白是引發(fā)抗腦膜炎球菌抗體應(yīng)答極其有效的抗原，能在所有腦膜炎球菌血清群中表達(dá)。系統(tǒng)進(jìn)化分析法顯示，該蛋白質(zhì)可分成兩組，其中一組再一分為二，共三種變體[101]，針對(duì)給定變體的血清對(duì)相同變體組中具有殺菌活性，但對(duì)能表達(dá)其它兩種變體的菌株沒(méi)有活性，即變體組內(nèi)才有交叉保護(hù)力，但變體組間無(wú)交叉保護(hù)力。因此，為了達(dá)到最大的菌株交叉保護(hù)效力，優(yōu)選組合物應(yīng)包含蛋白741一種以上的變體。每種變體的示例性序列為SEQ ID NO10，11和12，從以天然脂蛋白形式共價(jià)連接于脂質(zhì)的N端半胱氨酸殘基開(kāi)始。因此，優(yōu)選該組合物應(yīng)包含以下至少兩種(1)第一種蛋白質(zhì)，其包含與SEQ ID 10至少有a％序列相同的氨基酸序列和/或包含SEQ ID 10的至少x個(gè)連續(xù)氨基酸的片段構(gòu)成的氨基酸序列；(2)第二種蛋白質(zhì)，其包含與SEQ ID 11至少有b％序列相同的氨基酸序列和/或包含SEQ ID 11的至少y個(gè)連續(xù)氨基酸的片段構(gòu)成的氨基酸序列；以及(3)第三種蛋白質(zhì)，其包含與SEQ ID 41至少有c％序列相同的氨基酸序列和/或包含SEQ ID 41的至少z個(gè)連續(xù)氨基酸的片段構(gòu)成的氨基酸序列。a值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。b值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。c值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。a、b和c值之間沒(méi)有內(nèi)在的相互聯(lián)系。x值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z值之間沒(méi)有內(nèi)在的相互聯(lián)系。優(yōu)選地，任何特定的741氨基酸序列不屬于(1)、(2)和(3)中的一種以上類別。因此，任何特定的741序列只屬于(1)、(2)和(3)中的一種類別。因此，優(yōu)選地蛋白(1)與蛋白(2)的序列相同性小于i％；蛋白(1)與蛋白(3)的序列相同性小于j％；蛋白(2)與蛋白(3)的序列相同性小于k％。i值為60或更高(例如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等等)并且最高為a。j值為60或更高(例如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等等)并且最高為b。k值為60或更高(例如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等等)并且最高為c。i、j和k值不存在內(nèi)在的相互聯(lián)系。
本發(fā)明組合物可包含少量(例如少于t種抗原，其中t是10、9、8、7、6、5、4或3)經(jīng)純化的血清群B抗原。尤其優(yōu)選地，該組合物不應(yīng)包含這些抗原的復(fù)雜或不明確的混合物，例如，優(yōu)選地，組合物中不包含外膜囊泡。這些抗原優(yōu)選地以重組方式在異源宿主中表達(dá)并純化。對(duì)于包含t種MenB抗原的組合物，可存在t種不同的多肽，但為了進(jìn)一步降低復(fù)雜性，優(yōu)選將至少兩種抗原表達(dá)為一條多肽鏈中(“雜合”蛋白質(zhì)[參考文獻(xiàn)83-85])，即t種抗原形成不到t種多肽。雜合蛋白具有兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)第一，通過(guò)加入合適的雜合伴侶蛋白，有助于克服蛋白質(zhì)不穩(wěn)定或表達(dá)差的問(wèn)題；第二，簡(jiǎn)化了商業(yè)生產(chǎn)，只需要進(jìn)行一次表達(dá)和純化可產(chǎn)生兩種不同用途的蛋白質(zhì)。本發(fā)明組合物中包含的雜合蛋白可包含上述五種抗原中的兩種或以上(即2、3、4或5種)。雜合優(yōu)選由五種抗原中的兩種構(gòu)成。
在五種基本抗原的組合(NadA、741、953、936和287)中，抗原可以一種以上的雜合蛋白和/或非雜合蛋白形式存在。然而，優(yōu)選地，抗原以雜合或非雜合形式存在，但不是同時(shí)存在，雖然同時(shí)包含雜合和非雜合形式(優(yōu)選脂蛋白)的蛋白741抗原是有用的，尤其是當(dāng)使用一種以上741變體時(shí)。
雜合蛋白可以由公式NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH來(lái)表示，式中，X是五種基本抗原之一的氨基酸序列；L是任選的接頭氨基酸序列；A是任選的N端氨基酸序列；B是任選的C端氨基酸序列；n為2、3、4或5。
最優(yōu)選地，n是2。用于本發(fā)明的兩種抗原雜合物包括NadA和741；NadA和936；NadA和953；NadA和287；741和936；741和953；741和287；936和953；936和287；953和287。兩種優(yōu)選的蛋白質(zhì)是X1是936，X2是741；X1是287，X2是953。
當(dāng)-X-部分具有野生型前導(dǎo)肽序列時(shí)，在該雜合蛋白中可包含或刪去該部分。在一些實(shí)施方式中，除了位于雜合蛋白N端的-X-部分的前導(dǎo)肽，可刪除所述前導(dǎo)肽，也就是說(shuō)，保留X1前導(dǎo)肽，但刪除X2…Xn的前導(dǎo)肽。這等同于刪除所有前導(dǎo)肽并將X1的前導(dǎo)肽作為-A-部分使用。
對(duì)于[-X-L-]的每種n的情況，可以具有或不具有接頭氨基酸序列-L-。例如，當(dāng)n＝2時(shí)，雜合蛋白可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等等。接頭氨基酸序列-L-通常較短(例如20個(gè)或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。實(shí)例包括有利于克隆的短肽序列、聚甘氨酸接頭序列(即Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、以及組氨酸尾(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其他合適的接頭氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。一種有用的接頭是含Bam HI限制性位點(diǎn)形成的Gly-Ser二肽(這樣有助于克隆和操作)的GSGGGG(SEQ ID NO9)，(Gly)4四肽(SEQ ID NO73)是另一種典型的聚甘氨酸接頭。當(dāng)Xn+1是ΔG蛋白，Ln是甘氨酸接頭時(shí)，這等同于Xn+1不是ΔG蛋白且不存在Ln。
-A-是任選的N端氨基酸序列。該序列通常較短(例如40個(gè)或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。實(shí)例包括引導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)那皩?dǎo)肽序列，或有利于克隆或純化的短肽序列(例如，組氨酸尾，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其他適當(dāng)?shù)腘端氨基酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如果X1缺乏其自身的N端甲硫氨酸，優(yōu)選-A-是可提供N端甲硫氨酸的寡肽(例如，1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸)。
-B-是任選的C端氨基酸序列。該序列通常較短(例如40個(gè)或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。實(shí)例包括引導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)男蛄校欣诳寺』蚣兓亩屉男蛄?例如，包含組氨酸尾，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或能提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列。其他適當(dāng)?shù)腃端氨基酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
兩種特別優(yōu)選的本發(fā)明雜合蛋白如下

這兩種蛋白可與NadA(尤其是SEQ ID NO2)聯(lián)用。因此，本發(fā)明優(yōu)選的MenB抗原組合物包含含氨基酸序列SEQ ID NO2的第一多肽，含氨基酸序列SEQ ID NO7的第二多肽，和含氨基酸序列SEQ ID NO8的第三多肽。這是本發(fā)明中使用的一組優(yōu)選MenB抗原。
如上所述，本發(fā)明組合物可誘導(dǎo)血清殺菌性抗體應(yīng)答，有效抵御兩種或三種MenB超毒性譜系A(chǔ)4、ET-5和譜系3。它們還可誘導(dǎo)對(duì)一種或多種超毒性譜系亞組、亞組III、亞組IV-1或ET-37復(fù)合物，和對(duì)其它譜系如高侵襲性譜系的殺菌性抗體應(yīng)答。這些抗體應(yīng)答可在小鼠中方便地測(cè)定，是疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)[例如，見(jiàn)參考文獻(xiàn)77的腳注14]。血清殺菌活性(SBA)測(cè)定的是補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌活性，可采用人或幼兔補(bǔ)體進(jìn)行試驗(yàn)。WHO標(biāo)準(zhǔn)要求疫苗在90％以上患者中可誘導(dǎo)SBA增加至少4倍。該組合物不需要誘導(dǎo)對(duì)這些超毒性譜系的每一種和所有MenB菌株的殺菌抗體；而是對(duì)于任何給定的由特定超毒譜系中的4種或更多血清群B腦膜炎球菌菌株構(gòu)成的組而言，該組合物誘導(dǎo)的抗體具有針對(duì)該組至少50％(例如60％、70％、80％、90％或更高)成員的殺菌活性。優(yōu)選的菌株組包括從以下至少4個(gè)國(guó)家分離的菌株GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清優(yōu)選具有至少1024的殺菌滴度(例如210、211、212、213、214、215、216、217、218或更高，優(yōu)選至少214)，即所述免疫血清經(jīng)1024倍稀釋時(shí)能夠殺滅至少50％特定菌株的測(cè)試菌，見(jiàn)參考文獻(xiàn)77所述。
優(yōu)選的組合物可誘導(dǎo)對(duì)以下血清群B腦膜炎球菌菌株的殺菌應(yīng)答反應(yīng)(i)菌簇A4、菌株961-5945(B2bP1.21，16)和/或菌株G2136(B-)；(ii)ET-5復(fù)合物、菌株MC58(B15P1.7，16b)和/或菌株44/76(B15P1.7，16)；(iii)譜系3、菌株394/98(B4P1.4)和/或菌株BZ198(BNT-)的殺菌應(yīng)答反應(yīng)。更優(yōu)選組合物可誘導(dǎo)對(duì)菌株961-5945、44/76和394/98的殺菌應(yīng)答。菌株961-5945和G2136都是奈瑟菌MLST參照菌株[參考文獻(xiàn)102中是638和1002]。菌株MC58可廣泛獲得(例如，ATCC BAA-335)，在參考文獻(xiàn)75中列出了此菌株序列。菌株44/76已被廣泛應(yīng)用和鑒定(例如，參考文獻(xiàn)103)，是奈瑟菌MLST對(duì)照菌株之一[參考文獻(xiàn)102中是237；參考文獻(xiàn)104中表2第32行]。菌株394/98于1998年在新西蘭最早分離得到，采用該菌株已發(fā)表了幾篇研究(例如，參考文獻(xiàn)105和106)。菌株BZ198是另一種MLST對(duì)照菌株[參考文獻(xiàn)102中是409；參考文獻(xiàn)104中表2第41行]。該組合物還可誘導(dǎo)對(duì)ET-37復(fù)合體的血清群W135菌株LNP17592(W1352aP1.5，2)的殺菌應(yīng)答。這是2000年在法國(guó)分離得到的Haji菌株。
本發(fā)明組合物中可包含的其它MenB多肽抗原包括包含以下氨基酸序列之一的抗原參考文獻(xiàn)78的SEQ ID NO650、參考文獻(xiàn)78的SEQ ID NO878、參考文獻(xiàn)78的SEQ ID NO884、參考文獻(xiàn)79的SEQ ID NO4、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO598、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO818、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO864、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO866、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO1196、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO1272、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO1274、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO1640、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO1788、參考文獻(xiàn)80的SEQID NO2288、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2466、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2554、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2576、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2606、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2608、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO261 、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2668、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2780、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2932、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2958、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2970、參考文獻(xiàn)80的SEQ ID NO2988；或包含以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有(a)與所述序列有50％或更多(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的相同性；和/或(b)包含所述序列的至少n個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中，n為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。優(yōu)選的(b)片段包含相關(guān)序列的表位?？砂粋€(gè)以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多)的所述多肽。
其它抗原組分本發(fā)明組合物中也可包含非腦膜炎球菌抗原和非奈瑟菌抗原，優(yōu)選不降低對(duì)腦膜炎球菌組分免疫應(yīng)答反應(yīng)的抗原。例如，參考文獻(xiàn)107公開(kāi)了腦膜炎奈瑟球菌血清群B和C的寡糖與Hib多糖的混合物。尤其優(yōu)選的非腦膜炎球菌抗原包括-白喉抗原，如白喉類毒素[例如參考文獻(xiàn)108第3章]；-破傷風(fēng)抗原，例如破傷風(fēng)類毒素[例如參考文獻(xiàn)108第4章]；-百日咳桿菌(Bordetella pertussis)的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，也可任選與百日咳桿菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3組合使用[例如參考文獻(xiàn)109和110]；-細(xì)胞百日咳抗原；-甲型肝炎病毒例如滅活的病毒的抗原[例如，111，112]；-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如112，113]，表面抗原優(yōu)選吸附在磷酸鋁上[114]；-脊髓灰質(zhì)炎抗原[例如，115，116]，如IPV。
該混合物可包含這些抗原的一種或多種，需要時(shí)可使它們脫毒(如通過(guò)化學(xué)和/或遺傳學(xué)方法使百日咳毒素脫毒)。
當(dāng)該混合物中包含白喉抗原時(shí)，優(yōu)選還包含破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。類似地，當(dāng)包含破傷風(fēng)抗原時(shí)，優(yōu)選還包含白喉抗原和百日咳抗原。類似的，當(dāng)包含百日咳抗原時(shí)，優(yōu)選還包含白喉抗原和破傷風(fēng)抗原。
該混合物中的抗原一般以每種至少1μg/ml的濃度存在。通常，其給定抗原的濃度應(yīng)足以引起對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)。混合這些抗原不會(huì)消除各單一糖抗原的保護(hù)效力，雖然可能降低實(shí)際的免疫原性(例如，ELISA滴度)。
作為在該混合物中所用蛋白質(zhì)抗原的一種替代，可采用編碼該抗原的核酸。因而可用編碼該蛋白的核酸(優(yōu)選DNA，如質(zhì)粒形式)代替混合物中的蛋白組分。類似的，本發(fā)明組合物可包含能模擬多糖抗原的蛋白質(zhì)，例如模擬表位的[117]或抗獨(dú)特型抗體。它們可代替各個(gè)多糖組分，或補(bǔ)充多糖組分。例如，該疫苗可包含MenC[118]或MenA[119]莢膜多糖的肽模擬物，代替多糖本身。本發(fā)明組合物中包含的兩種優(yōu)選的非腦膜炎球菌抗原是能提供抗b型流感嗜血桿菌(Hib)和抗肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)保護(hù)力的抗原。
b型流感嗜血桿菌(Hib)當(dāng)該組合物包含b型流感嗜血桿菌(H.influenzae)抗原時(shí)，該抗原通常是Hib莢膜多糖類抗原。b型流感嗜血桿菌多糖抗原是眾所周知的。
為了增強(qiáng)其免疫原性(特別是在兒童體內(nèi))，宜將Hib糖與載體蛋白共價(jià)結(jié)合。多糖偶聯(lián)物的制備，以及Hib莢膜多糖的具體制備通常已充分公開(kāi)[例如參考文獻(xiàn)21-29等]。本發(fā)明可采用任何合適的Hib偶聯(lián)物。下面描述了合適的載體蛋白，對(duì)Hib糖優(yōu)選的載體是CRM197(“HbOC”)、破傷風(fēng)類毒素(“PRP-T”)以及腦膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)的外膜復(fù)合物(“PRP-OMP”)。
該偶聯(lián)物的糖部分可以是多糖(例如全長(zhǎng)的磷酸聚核糖基核糖醇(PRP))，但優(yōu)選水解多糖以形成寡糖(例如分子量約1-5kDa)。
一種優(yōu)選的偶聯(lián)物包括經(jīng)己二酸脂肪酸接頭與CRM197共價(jià)連接的Hib寡糖[120，121]。破傷風(fēng)類毒素也是一種優(yōu)選的載體。
給予Hib抗原優(yōu)選產(chǎn)生抗-PRP抗體，濃度≥0.15μg/ml，更優(yōu)選≥1μg/ml。
當(dāng)組合物包含Hib糖抗原時(shí)，優(yōu)選其不包含氫氧化鋁佐劑。如果該組合物包含磷酸鋁佐劑，則Hib抗原可吸附于該佐劑[122]，或可以不吸附[123]。通過(guò)在抗原/佐劑混合時(shí)選擇合適的pH，選擇具有合適等電點(diǎn)的佐劑，和選擇組合物中各種抗原合適的混合順序，可防止吸附[124]。
本發(fā)明組合物可以包含一種以上的Hib抗原。可以凍干Hib抗原，例如用于與腦膜炎球菌抗原一起重建。
肺炎鏈球菌當(dāng)所述組合物包含肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)抗原時(shí)，該抗原通常優(yōu)選與載體蛋白偶聯(lián)的莢膜多糖抗原[例如參考文獻(xiàn)125-127]。優(yōu)選包含一種以上肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型的多糖。例如，廣泛采用了23種不同血清型的多糖混合物，例如采用5到11種不同血清型多糖的偶聯(lián)疫苗[128]。例如，PrevNarTM[1]包含7種血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，每種多糖通過(guò)還原氨基化與CRM197偶聯(lián)，每0.5毫升劑量(4μg的血清型6B)含2μg每種糖類并且偶聯(lián)物吸附在磷酸鋁佐劑上。本發(fā)明的組合物優(yōu)選包括至少血清型6B、14、19F和23F。偶聯(lián)物可以吸附在磷酸鋁上。
作為使用肺炎球菌多糖抗原之外的一種替代，組合物可以包括一種或多種多肽抗原?？梢垣@得幾種肺炎球菌菌株的基因組序列[129，130]并可以進(jìn)行反向疫苗學(xué)[131-134]來(lái)鑒定適當(dāng)?shù)亩嚯目乖璠135，136]。例如，該組合物可以包括一種或多種以下參考文獻(xiàn)137中所定義的抗原PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128和Sp130。該組合物可包含一種以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14種)的這些抗原。
在一些實(shí)施方式中，該組合物可包含肺炎球菌多糖和多肽?？梢允褂闷浜?jiǎn)單的混合物，或可將肺炎球菌多糖抗原與肺炎球菌蛋白偶聯(lián)。適合于這種實(shí)施方式的載體蛋白包括前面段落中所列舉的抗原[137]。
可以凍干肺炎球菌抗原，例如與Hib抗原一起凍干。
藥物組合物本發(fā)明組合物，除上述組分外，通常還包含一種或多種“藥學(xué)上可接受的載體”，包括本身不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的代謝慢的大分子如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[138]、海藻糖[139]、乳糖和脂質(zhì)凝聚物(例如油珠或脂質(zhì)體)。這些載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。該疫苗還可包含稀釋劑，例如水、鹽水、甘油等。此外，還可存在輔助性物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。無(wú)菌無(wú)熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水是典型的運(yùn)載體。藥學(xué)上可接受的賦形劑的全面論述見(jiàn)參考文獻(xiàn)140。
本發(fā)明組合物是水性形式，即溶液或懸浮液。可以其包裝形式直接給予這種組合物的液體制劑，而不需要用水性介質(zhì)重建，因而適于注射。組合物可以裝在小瓶中，或是裝在已充滿藥物的注射器中提供。注射器有或沒(méi)有針頭。注射器可裝有單劑量的該組合物，而小瓶可裝有單劑量或多個(gè)劑量。
本發(fā)明液體組合物還適合與凍干形式的其它疫苗重建，以重建凍干的Hib或DTP抗原。當(dāng)本發(fā)明組合物用于這種臨時(shí)重建時(shí)，本發(fā)明提供一種藥盒，其裝有兩個(gè)小瓶，或可裝有一支已充滿藥物的注射器和一個(gè)小瓶，注射器的內(nèi)容物用于再活化小瓶?jī)?nèi)容物然后注射。
可以單劑量形式或多劑量形式包裝本發(fā)明組合物。對(duì)于多劑量形式，與預(yù)充滿藥物的注射器相比，優(yōu)選小瓶。可用常規(guī)方法確定有效的劑量體積，但一般注射用組合物的人用劑量體積為0.5ml。
該組合物的pH優(yōu)選為6-8，更優(yōu)選7?？衫镁彌_劑維持合適的pH。當(dāng)組合物包含氫氧化鋁時(shí)，優(yōu)選采用組氨酸緩沖劑[141]。組合物可以無(wú)菌和/或無(wú)熱原。本發(fā)明組合物可與人體等滲。
本發(fā)明組合物是免疫原性組合物，更優(yōu)選疫苗組合物。本發(fā)明疫苗可以是預(yù)防性(即防止感染)或治療性(即治療感染)疫苗，但通常是預(yù)防性疫苗。用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫學(xué)有效量的抗原，以及其它所需組分。“免疫學(xué)有效量”指以單劑量或多劑量的一部分給予個(gè)體時(shí)對(duì)治療或預(yù)防有效。所述劑量根據(jù)待治療個(gè)體的健康和生理情況、年齡、待治療個(gè)體的分類學(xué)(例如，除人以外的靈長(zhǎng)類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，所需的保護(hù)程度、疫苗的配方、對(duì)醫(yī)療情況的主治醫(yī)生評(píng)估、以及其它相關(guān)因素而不同。預(yù)期該量落在可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的較寬的范圍內(nèi)。
在每個(gè)劑量?jī)?nèi)，各多糖抗原的量通常為1-50μg(以糖質(zhì)量測(cè)定)，例如約1μg、約2.5μg、約4μg、約5μg、或約10μg。
每劑量中存在的各多糖量基本相同。然而，MenY糖∶MenW135糖的比率(w/w)可大于1(例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)和/或MenY糖∶MenC糖的比率(w/w)可小于1(例如1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。
血清群A∶C∶W135∶Y的糖類的優(yōu)選比率(w/w)是1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。血清群CW135Y的糖類的優(yōu)選比率(w/w)是1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1；以及2∶1∶1。優(yōu)選使用基本相同量的每種糖。
優(yōu)選本發(fā)明組合物包含少于50μg腦膜炎球菌多糖/每劑量。其它優(yōu)選的組合物包含≤40μg腦膜炎球菌多糖/每劑量。其它優(yōu)選的組合物包含≤30μg腦膜炎球菌多糖/每劑量。其它優(yōu)選的組合物包含≤25μg腦膜炎球菌多糖/每劑量。其它優(yōu)選的組合物包含≤20μg腦膜炎球菌多糖/每劑量。其它優(yōu)選的組合物包含≤10μg腦膜炎球菌多糖/每劑量，但優(yōu)選地，本發(fā)明組合物包含至少10μg總腦膜炎球菌多糖/每劑量。
本發(fā)明組合物可包含抗菌劑，尤其是在多劑量形式中。
本發(fā)明組合物可包含去污劑，例如吐溫(聚山梨酯)如吐溫80。通常去污劑存在的量較低，例如＜0.01％。
本發(fā)明組合物可包含鈉鹽(例如氯化鈉)，以產(chǎn)生等滲。通常NaCl濃度為10±2mg/ml。
本發(fā)明組合物通常包含緩沖劑。常用磷酸鹽緩沖劑。
通常與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合給予本發(fā)明組合物。具體地說(shuō)，該組合物通常包含一種或多種佐劑。這些佐劑包括但不限于A.含礦物質(zhì)的組分用作本發(fā)明佐劑的含礦物質(zhì)組分包括礦物鹽類，例如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括礦物質(zhì)鹽，例如氫氧化物(如羥基氧化物)、磷酸鹽(如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如見(jiàn)參考文獻(xiàn)142第8和第9章]，或不同礦物質(zhì)的混合物，這些礦物質(zhì)可采取任何合適的形式(例如，凝膠、結(jié)晶、無(wú)定形等)，優(yōu)選可吸附的。含礦物質(zhì)的組分也可配制成金屬鹽顆粒[143]。
B.油性乳劑適合用作本發(fā)明佐劑的油性乳劑成分包括角鯊烯-水乳劑，例如MF59[參考文獻(xiàn)142第10章；也見(jiàn)于參考文獻(xiàn)144](5％角鯊烯，0.5％吐溫80和0.5％司盤85，用微流體儀配制成亞微米顆粒)。也可采用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。
C.皂苷制劑[參考文獻(xiàn)142第22章]皂苷制劑也可用作本發(fā)明佐劑。皂苷是在多種植物的樹(shù)皮、樹(shù)葉、莖、根，甚至花中發(fā)現(xiàn)的甾醇糖苷和三萜苷的異源組合。得自南美皂樹(shù)(Quillaiasaponaria Molina tree)樹(shù)皮的皂苷已在廣泛的研究中用作佐劑。也可從市場(chǎng)上購(gòu)買到Smilax ornata(sarsaprilla)、錐花絲石竹(Gypsophillapaniculata)(brides veil)和肥皂根(Saponaria off cianalis)(皂根)的皂苷。皂苷佐劑制劑包含純化的制劑如QS21，和脂質(zhì)制劑如ISCOM。QS21以StimulonTM市售。
已采用HPLC和RP-HPLC來(lái)純化皂苷組分。已鑒定了這些技術(shù)純化的特定組份，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。優(yōu)選地，皂苷是QS21。一種制備QS21的方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)145所述。皂苷制劑還可包含甾醇如膽固醇[146]。
皂苷和膽固醇的組合可用于形成獨(dú)特的顆粒，稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)[參考文獻(xiàn)142第23章]。ISCOM通常還包含磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。ISCOM中可使用任何已知的皂苷。優(yōu)選地，ISCOM包含一種或多種QuilA、QHA和QHC。ISCOM還在參考文獻(xiàn)146-148中有所描述。任選地，ISCOMS不含附加的去污劑[149]。
基于皂苷的佐劑發(fā)展綜述見(jiàn)參考文獻(xiàn)150和151。
D.病毒小體和病毒樣顆粒病毒小體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常包含一種或多種任選地與磷脂偶聯(lián)或配制入磷脂中的病毒蛋白。它們通常是非病原性、非復(fù)制性的，通常不含任何天然病毒基因組?？捎弥亟M方法產(chǎn)生或從全病毒分離得到這種病毒蛋白。這些適用于病毒小體或VLP中的病毒蛋白包括來(lái)源于流感病毒(例如HA或NA)、乙型肝炎病毒(例如核蛋白或包膜蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、QB-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP在參考文獻(xiàn)152-157中有進(jìn)一步描述。病毒小體在(例如)參考文獻(xiàn)158中有進(jìn)一步描述。
E.細(xì)菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，例如腸道細(xì)菌的脂多糖(LPS)非毒性衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。
LPS的非毒性衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A(MPL)和3-O-脫酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A與4、5或6?；湹幕旌衔铩?脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A優(yōu)選的“小顆粒”形式見(jiàn)參考文獻(xiàn)159中所述。3dMPL的這種“小顆?！毙〉阶阋栽诔^(guò)濾時(shí)通過(guò)0.22μm膜[159]。其它非毒性LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物如RC-529[160，161]。
脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌(Escherichia coli)的脂質(zhì)A衍生物，例如OM-174。OM-174在(例如)參考文獻(xiàn)162和163中有描述。
適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過(guò)磷酯鍵與鳥嘌呤連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文結(jié)構(gòu)或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激作用。
CpG序列可包含核苷酸修飾/類似修飾如硫代磷酯酰修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻(xiàn)164、165和166公開(kāi)了可能的類似取代基，例如用2’-脫氧-7-脫氮鳥嘌呤代替鳥嘌呤。CpG寡核苷酸的佐劑作用在參考文獻(xiàn)167-172中也有描述。
CpG序列可介導(dǎo)TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[173]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答，例如CpG-A ODN，或它可特異性誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，例如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN在參考文獻(xiàn)174-176中有描述。優(yōu)選地，CpG是CpG-A ODN。
優(yōu)選地，構(gòu)建CpG寡核苷酸時(shí)使其5’端可為受體所識(shí)別。優(yōu)選將兩個(gè)CpG寡核苷酸序列的3’端相連接形成“免疫聚體”。例如，見(jiàn)參考文獻(xiàn)173和177-179。
細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)得自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT”)、霍亂(“CT”)或百日咳(“PT”)。使用脫毒的ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑見(jiàn)參考文獻(xiàn)180所述，作為胃腸外佐劑見(jiàn)參考文獻(xiàn)181所述。毒素和類毒素優(yōu)選全毒素形式，包括A和B亞單位。優(yōu)選地，A亞單位含有脫毒突變；優(yōu)選B亞單位不突變。優(yōu)選地，佐劑是脫毒的LT突變體如LT-K63、LT-R72和LT-G192。使用ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72作為佐劑在參考文獻(xiàn)182-189中描述。氨基酸取代基的參考編號(hào)優(yōu)選根據(jù)參考文獻(xiàn)190中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的排列對(duì)比，該參考文獻(xiàn)的內(nèi)容被納入本文作為參考。
F.人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[191]等)[192]、干擾素(例如干擾素-γ)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。
G.生物粘著劑和粘膜粘著劑生物粘著劑和粘膜粘著劑也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質(zhì)酸微球[193]或粘膜粘著劑如聚(丙烯酸)交聯(lián)衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[194]。
H.微粒微粒也可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選由可生物降解和非毒性材料(例如聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)形成的微粒(即直徑約100m-150nm的微粒，更優(yōu)選直徑約200-300nm，最優(yōu)選直徑約500nm-10μm)，優(yōu)選聚(丙交酯-共-乙交酯)，任選經(jīng)處理而具有負(fù)電荷表面(例如用SDS)或正電荷表面(例如用陽(yáng)離子去污劑如CTAB)。
I.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)142第13和14章)適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見(jiàn)參考文獻(xiàn)195-197所述。
J.聚氧乙烯酯和聚乙烯酯制劑適合用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯酯和聚乙烯酯[198]。這種制劑還包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇表面活性劑和辛苯糖醇[199]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯糖醇[200]的混合物。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂醚(聚乙二醇單十二醚9)、聚氧乙烯-9-甾醇醚(steory ether)、聚氧乙烯-8-甾醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制劑在參考文獻(xiàn)201和202中有描述。
L.胞壁酰肽適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(去甲-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二軟脂酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE).
M.咪唑喹諾酮化合物適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，″瑞喹莫德3M″)，見(jiàn)參考文獻(xiàn)203和204所述。
本發(fā)明還包含一種或多種上述佐劑的組合。例如，本發(fā)明中可使用以下佐劑組合物(1)皂苷和水包油乳劑[205]；(2)皂苷(例如QS21)+無(wú)毒性LPS衍生物(例如3dMPL)[206]；(3)皂苷(例如QS21)+無(wú)毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選地+甾醇)[207]；(5)dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑的組合[208]；(6)SAF，含10％角鯊?fù)椤?.4％吐溫80TM、5％普流羅尼嵌段聚合物L(fēng)121，及thr-MDP，經(jīng)微體化成為亞微米乳液或經(jīng)渦旋產(chǎn)生粒徑較大的乳劑；(7)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)，(Ribi Immunochem)含2％角鯊?fù)椤?.2％吐溫80及單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)；以及(8)一種或多種礦物鹽(例如鋁鹽)+LPS無(wú)毒性衍生物(例如3dMPL)。
用作免疫刺激劑的其它物質(zhì)在參考文獻(xiàn)142第7章中有描述。
尤其優(yōu)選采用鋁鹽佐劑，抗原通?？晌接谶@些鋁鹽上。MenjugateTM和NeisVacTMMenC偶聯(lián)物采用氫氧化物佐劑，而MeningitecTM可采用磷酸鹽。本發(fā)明組合物可用氫氧化鋁吸附一些抗原，而這些抗原可與磷酸鋁偶聯(lián)。然而，一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選只使用一種鹽如氫氧化物或磷酸鹽，而不是兩種。優(yōu)選避免使用氫氧化鋁作為佐劑，尤其是當(dāng)該組合物包含Hib抗原時(shí)。因而優(yōu)選不含氫氧化鋁的組合物。而可使用磷酸鋁，典型的佐劑是無(wú)定形羥基磷酸鋁，PO4/Al摩爾比0.84-0.92，含量0.6mg Al3+/ml。可采用低劑量磷酸鋁吸附，例如50-100μgAl3+/每劑量偶聯(lián)物。當(dāng)使用磷酸鋁并且不希望抗原吸附于佐劑時(shí)，宜在溶液中加入游離的磷酸根離子(例如，通過(guò)采用磷酸鹽緩沖液)。
不是所有的偶聯(lián)物都要吸附，即一些或所有偶聯(lián)物可游離在溶液中。
磷酸鈣是另一種優(yōu)選的佐劑。
處理方法本發(fā)明還提供提高哺乳動(dòng)物抗體應(yīng)答反應(yīng)的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物給予本發(fā)明藥物組合物。
本發(fā)明提供一種提高哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法，該方法包括給予有效量的本發(fā)明組合物的步驟。免疫應(yīng)答優(yōu)選是保護(hù)性的，優(yōu)選包括抗體應(yīng)答。該方法可引發(fā)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
哺乳動(dòng)物優(yōu)選是人。當(dāng)疫苗用作預(yù)防用途時(shí)，人優(yōu)選是兒童(例如剛學(xué)會(huì)走路的孩子或嬰兒)或青少年；當(dāng)疫苗用作治療用途時(shí)，人優(yōu)選是成人。用于兒童的疫苗也可給予成人，以評(píng)價(jià)安全性、劑量、免疫原性等。
本發(fā)明還提供用作藥物的本發(fā)明組合物。該藥物優(yōu)選能夠引起哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答反應(yīng)(即，它是免疫原性組合物)，更優(yōu)選疫苗。
本發(fā)明還提供(i)偶聯(lián)的血清群C莢膜多糖抗原；(ii)偶聯(lián)的血清群W135莢膜多糖抗原；(iii)偶聯(lián)的血清群Y莢膜多糖抗原；(iv)一種或多種血清群B的多肽抗原；以及，任選地，(v)偶聯(lián)的血清群A莢膜多糖抗原，在制備用于提高哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
這些應(yīng)用和方法優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療由奈瑟菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血癥、菌血癥、淋病等)。優(yōu)選預(yù)防和/或治療細(xì)菌性和/或腦膜炎球菌性腦膜炎。
一種評(píng)價(jià)治療效果的方法包括給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測(cè)奈瑟菌感染。一種評(píng)價(jià)預(yù)防效果的方法包括給予組合物后監(jiān)測(cè)針對(duì)五種基本抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)。本發(fā)明組合物的免疫原性可用以下方法測(cè)定將其給予受試者(例如12-16月大的兒童或動(dòng)物模型[209])，然后檢測(cè)包括血清殺菌抗體(SBA)以及抗莢膜IgG的總抗體和高親力抗體的ELISA滴度(GMT)。這些免疫應(yīng)答反應(yīng)通常應(yīng)在組合物給藥約4周后測(cè)定，并與該組合物給藥前測(cè)定的值進(jìn)行比較。優(yōu)選SBA提高至少4倍或8倍。在給予單一劑量組合物時(shí)，可以進(jìn)行一次以上的給藥后測(cè)定。
本發(fā)明優(yōu)選的組合物可以在患者體內(nèi)產(chǎn)生優(yōu)于每種抗原組分對(duì)受試人群可接受百分比的血清保護(hù)力標(biāo)準(zhǔn)的抗體滴度?？乖哂械南嚓P(guān)抗體滴度(認(rèn)為某宿主對(duì)該抗原是血清陽(yáng)轉(zhuǎn)的)是熟知的，并且這些滴度由例如WHO等組織公布。優(yōu)選大于80％的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的受試者樣品是血清陽(yáng)轉(zhuǎn)的，更優(yōu)選大于90％，還要優(yōu)選大于93％，最優(yōu)選96％-100％。
本發(fā)明組合物通?？芍苯咏o予患者。直接給藥可通過(guò)不經(jīng)消化道的注射實(shí)現(xiàn)(例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或組織間隙注射)，或通過(guò)直腸、口服、陰道、局部、透皮、鼻內(nèi)、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜給藥。優(yōu)選股部或上臂肌內(nèi)給藥。注射可以通過(guò)注射針(例如皮下注射用針)，但另外可以使用無(wú)針注射。典型的肌內(nèi)注射劑量是0.5ml。
本發(fā)明可以用于誘導(dǎo)全身和/或粘膜免疫。
治療劑量可以是單劑量方案或多劑量方案。多劑量可用于初次免疫方案和/或強(qiáng)化免疫方案。強(qiáng)化劑量方案可以在初次劑量方案之后?？沙Ｒ?guī)確定初次劑量之間(例如4-16周之間)以及初次和強(qiáng)化之間的適當(dāng)間隔時(shí)間。
奈瑟菌感染影響到身體各個(gè)部位，因此本發(fā)明的組合物可制備成各種形式。例如，該組合物可以制備成可以注射的液體溶液或懸浮液。該組合物可制備用于肺部給藥，例如利用細(xì)粉或噴霧的吸入器給藥。該組合物可以制備成栓劑或陰道栓劑。該組合物可以制備成用于鼻、耳或眼睛給藥，例如噴霧劑、滴劑、凝膠劑或粉末劑[例如，參考文獻(xiàn)210和211]。報(bào)道成功進(jìn)行了肺炎球菌糖[212，213]、肺炎球菌多肽[214]、Hib多糖[215]、MenC糖[216]以及Hib和MenC糖偶聯(lián)物的混合物[217]的鼻腔給藥。
儲(chǔ)存穩(wěn)定性本發(fā)明組合物具有改善的穩(wěn)定性，尤其是血清群A糖組分。本發(fā)明提供制備疫苗組合物的方法，該方法包括以下步驟(1)混合(i)偶聯(lián)的血清群C莢膜多糖抗原、(ii)偶聯(lián)的血清群W135莢膜多糖抗原、(iii)偶聯(lián)的血清群Y莢膜多糖抗原和(iv)一種或多種血清群B的多肽抗原；(2)將步驟(1)得到的組合物儲(chǔ)存至少1周；(3)準(zhǔn)備裝有步驟(2)儲(chǔ)存的組合物的注射器，用于給患者注射；和，任選地，(4)將該組合物注射給予患者。
步驟(1)也可包括混合(v)偶聯(lián)的血清群A莢膜多糖抗原。還可包括混合(vi)偶聯(lián)的Hib抗原。還可包括混合(vii)肺炎球菌抗原。步驟(2)優(yōu)選包括至少2周、4周、6周、8周、10周、12周或更長(zhǎng)的儲(chǔ)存期。儲(chǔ)存步驟(2)可在或不在室溫以下(例如10±10℃)。
本發(fā)明還提供了制備疫苗組合物的方法，該方法包括以下步驟(1)混合(i)偶聯(lián)的血清群C莢膜多糖抗原、(ii)偶聯(lián)的血清群W135莢膜多糖抗原、(iii)偶聯(lián)的血清群Y莢膜多糖抗原和(iv)一種或多種血清群B的多肽抗原；以及(2)從混合抗原提取單位劑量體積；和(c)將提取的單位劑量包裝在熱熔密封容器中。
步驟(1)也可包括混合(v)偶聯(lián)的血清群A莢膜多糖抗原。還可包括混合(vi)偶聯(lián)的Hib抗原。還可包括混合(vii)肺炎球菌抗原。熱熔密封容器可以是小瓶或注射器。
本發(fā)明提供裝有本發(fā)明組合物的熱熔密封容器。
概要術(shù)語(yǔ)“包含”指“包括”以及“由……構(gòu)成”，例如“包含”X的組合物可以僅由X構(gòu)成，或可以包括其它物質(zhì)，例如X+Y。
術(shù)語(yǔ)“約”是關(guān)于數(shù)值x的，例如x±10％。
“基本上”不排斥“完全地”，例如“基本上”沒(méi)有的組合物可以完全沒(méi)有Y。需要時(shí)，“基本上”這個(gè)詞可以從本發(fā)明的定義中省略。
兩個(gè)氨基酸序列間序列相同性百分比指，排列對(duì)比時(shí)，比較兩個(gè)序列中相同氨基酸序列的百分比。這種比對(duì)和百分同源性或序列相同性可用本領(lǐng)域已知的軟件程序測(cè)定，例如見(jiàn)參考文獻(xiàn)218部分7.7.18中的描述。優(yōu)選的比對(duì)采用Smith-Waterman同源搜索算法來(lái)測(cè)定，該算法采用參數(shù)為缺口開(kāi)放罰分(gapopen penalty)12及缺口延伸罰分(gap extension penalty)2、BLOSUM矩陣62的仿射缺口搜索。Smith-Waterman同源搜索算法見(jiàn)參考文獻(xiàn)219中的描述。
術(shù)語(yǔ)“烷基”是指直鏈和支鏈形式的烷基基團(tuán)。烷基基團(tuán)可以間插有選自-O-、-NH-或-S-的1、2或3種雜原子。烷基基團(tuán)也可以間插有1、2或3個(gè)雙鍵和/或三鍵。然而，術(shù)語(yǔ)“烷基”通常指不含有雜原子間隔或雙鍵或三鍵間隔的烷基基團(tuán)。在提及C1-12烷基的情況下，指該烷基基團(tuán)可以包含介于1到12之間任何數(shù)目的碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。類似地，當(dāng)提及C1-6烷基時(shí)，指該烷基基團(tuán)可以包括介于1和6之間任何數(shù)目的碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6)。
術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”包括環(huán)烷基、聚環(huán)烷基和環(huán)烯烴基，以及它們與烷基基團(tuán)的組合，例如環(huán)烷基烷基基團(tuán)。環(huán)烷基可以間插有選自-O-、-NH-或-S-的1、2或3種雜原子。然而，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”通常指不含有雜原子間隔的環(huán)烷基基團(tuán)。環(huán)烷基基團(tuán)的實(shí)例包括環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)己基甲基以及金剛烷基基團(tuán)。當(dāng)提及C3-12環(huán)烷基時(shí)，指該環(huán)烷基基團(tuán)可以包含介于3和12之間任何數(shù)目的碳原子(例如C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。
術(shù)語(yǔ)“芳基”指例如苯基和萘基等芳香基團(tuán)。當(dāng)提及C5-12芳基時(shí)，指該芳基可以包括介于5和12之間任何數(shù)目的碳原子(例如C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。
術(shù)語(yǔ)“C5-12芳基-C1-6烷基”指例如苯甲基、苯乙基和萘甲基等基團(tuán)。
氮保護(hù)基團(tuán)包括甲硅烷基(例如TMS、TES、TBS、TIPS)、?；苌?例如苯鄰二甲酰亞胺、三氟乙酰胺、甲氧羰基、乙氧羰基、t-丁氧羰基(Boc)、芐氧羰基(Z或Cbz)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基(Troc))、磺酰基衍生物(例如β-三甲基甲硅烷基乙基磺?；?SES))、亞磺?；苌铩1-12烷基、苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、9-苯基芴基等等。優(yōu)選的氮保護(hù)基團(tuán)是Fmoc。
能促進(jìn)克隆和純化等的序列不是本發(fā)明必需的，可省略或除去。
應(yīng)理解糖環(huán)可以開(kāi)環(huán)或閉環(huán)形式存在，閉環(huán)形式如本文結(jié)構(gòu)通式所示，開(kāi)環(huán)形式也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
可用各種方法(例如，重組表達(dá)、細(xì)胞培養(yǎng)物的純化、化學(xué)合成(至少部分合成)等)制備各種形式(例如天然、融合、非糖基化、脂化等)的本發(fā)明多肽。優(yōu)選基本純的形式(即基本上不含其它奈瑟菌腦膜炎球菌或宿主細(xì)胞蛋白)。雖然多肽的表達(dá)可發(fā)生在奈瑟菌中，但優(yōu)選在異源宿主中。異源宿主可以是原核生物(例如細(xì)菌)或真核生物。優(yōu)選大腸桿菌，但其它合適的宿主包括枯草桿菌(Bacillus subtilis)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝桿菌(Mycobacteria)(例如結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis))、酵母菌等。
可以許多方法(例如，化學(xué)合成(至少部分合成)，從基因組或cDNA庫(kù)，從生物體自身等)制備本發(fā)明核酸，并可采取多種形式(例如，單鏈、雙鏈、帶菌體、探針等)。優(yōu)選基本純的形式(即基本上不含其它腦膜炎奈瑟球菌或宿主細(xì)胞核酸)制備。術(shù)語(yǔ)“核酸”包括DNA和RNA及其類似物，例如含修飾的主鏈(例如硫代磷酯?；?的核酸，以及肽核酸(PNA)等。本發(fā)明還包括含有上述核酸的互補(bǔ)序列的核酸(例如反義或用于探針的目的)。
按血清分群后，腦膜炎球菌分類包括血清型、血清亞型，然后是免疫型，標(biāo)準(zhǔn)命名法列出了血清群、血清型、血清亞型和免疫型，每個(gè)用冒號(hào)分隔，例如B4P1.15L3，7，9。在血清群B中，有些譜系經(jīng)常引發(fā)疾病(高入侵性)，有些譜系比其他譜系引發(fā)更嚴(yán)重形式的疾病(超毒性)，其他的幾乎罕見(jiàn)引發(fā)疾病。已知有7個(gè)超毒性譜系，即亞群I、III和IV-1、ET-5復(fù)合物、ET-37復(fù)合物、A4簇落和譜系3。這些譜系已經(jīng)通過(guò)多位點(diǎn)酶電泳(MLEE)而得以確定定義，但是多位點(diǎn)序列分型(MLST)也已經(jīng)用于腦膜炎球菌的分類[參考文獻(xiàn)104]。
本發(fā)明
具體實(shí)施例方式
ΔG287-953雜合蛋白將編碼腦膜炎球菌血清群B菌株394/98蛋白287和腦膜炎球菌血清群B菌株2996蛋白953的DNA消化并與短接頭序列連接，得到編碼氨基酸序列SEQID 7的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大腸桿菌中，培養(yǎng)此菌表達(dá)此蛋白質(zhì)。充分生長(zhǎng)后，收集細(xì)菌并純化此蛋白質(zhì)。離心細(xì)菌培養(yǎng)物，以沉淀物∶緩沖液體積比為1∶8，在50mM醋酸鹽緩沖液(pH5)中勻漿化沉淀物。采用高壓勻漿器(AVESTIN，14000psi下4個(gè)循環(huán))裂解細(xì)菌。裂菌后，加入尿素使最終濃度為5M，然后室溫?cái)嚢?小時(shí)。用200mM醋酸鹽緩沖液(pH 4)+5M尿素將pH從6降低至5。2-8℃，將該混合物16800g離心60分鐘。收集上清液，用SARTOBRANP(0.45-0.22μm SARTORIUS)過(guò)濾。濾過(guò)上清液中的蛋白質(zhì)在-20℃至少能穩(wěn)定30天，2-8℃至少能穩(wěn)定15天。
在陽(yáng)離子交換柱上進(jìn)-步純化蛋白質(zhì)(SPFF，Amersham Biosciences)，用350mMNaCl+50mM醋酸鹽+5M尿素pH 5.00洗脫。大部分雜質(zhì)存在于流穿液體中。用低濃度NaCl(180mM)預(yù)洗脫有利于去除兩種污染性大腸桿菌蛋白質(zhì)。
調(diào)節(jié)洗脫物質(zhì)至pH8(用200mM TRIS/HCl+5M尿素pH 9)，在Q瓊脂糖HP柱(Amersham)上進(jìn)-步純化，用150mM NaCl+20mM TRIS/HCl pH 8.00的5M尿素溶液洗脫。同樣，低濃度鹽(90mM)預(yù)洗脫可用于去除雜質(zhì)。
用PBS pH7.00(150mMNaCl+10mM磷酸鉀，pH7.00)以1∶2稀釋從Q HP柱過(guò)濾洗脫的物質(zhì)，然后通過(guò)切線超濾用10倍體積的PBS pH7.00滲濾。滲濾結(jié)束時(shí)，物質(zhì)濃縮1.6倍，至約1.2mg/ml總蛋白質(zhì)，用30,000Da的截留膜(再生性纖維素膜50crn2，MilliporePLCTK 30)透析該物質(zhì)，產(chǎn)率約為90％。
936-ΔG741雜合蛋白將編碼腦膜炎球菌血清群B菌株2996蛋白936和腦膜炎球菌血清群B菌株MC58蛋白741的DNA消化并與短接頭序列連接，得到編碼氨基酸序列SEQ ID8的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌中，培養(yǎng)此菌表達(dá)該蛋白質(zhì)。該重組蛋白不分泌，但在細(xì)菌中仍是可溶性蛋白。
充分生長(zhǎng)后，離心細(xì)菌，得到濕菌糊，處理如下-在20mM磷酸鈉pH 7.00的存在下，用高壓系統(tǒng)勻漿化。
-通過(guò)正交過(guò)濾離心和澄清。
-陽(yáng)離子柱色譜(SP瓊脂糖快速色譜)，用150mM NaCl的20mM磷酸鈉pH7.00洗脫。
-陰離子柱色譜(Q瓊脂糖XL)，收集流穿液。
-疏水柱色譜(苯基瓊脂糖6快速高分配(High Sub)色譜)，用20mM磷酸鈉pH 7.00洗脫。
-用PBS pH 7.4滲濾，用10Kd截留。
-最后除菌過(guò)濾，儲(chǔ)存于-20℃。
最終物質(zhì)中的蛋白質(zhì)在-20℃和2-8℃都穩(wěn)定至少3個(gè)月。
NadA(NL)(C)蛋白消化編碼腦膜炎球菌血清群B菌株2996 NadA蛋白的DNA，除去編碼其C端的序列，得到編碼的氨基酸序列SEQ ID 1的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大腸桿菌中，培養(yǎng)此菌以表達(dá)該蛋白。重組蛋白可分泌入培養(yǎng)基中，分泌的蛋白(SEQID 2)中不含前導(dǎo)肽。上清液的處理如下-濃縮7倍和用緩沖液20mM TRIS/HCl pH7.6，通過(guò)錯(cuò)流UF(截留30Kd)滲濾。
-陰離子柱色譜(Q瓊脂糖XL)，用400mM NaCl的20mM TRIS/HCl pH 7.6洗脫。
-疏水柱色譜(苯基瓊脂糖6快速高分配色譜)，用50mM NaCl的TRIS/HClpH 7.6洗脫。
-羥基磷灰石陶瓷柱色譜(HA Macro.Prep)，用200mM磷酸鈉pH 7.4洗脫。
-用緩沖液PBS pH 7.4滲濾(截留30Kd)。
-最后除菌過(guò)濾，儲(chǔ)存在-20℃。
最終物質(zhì)中的蛋白質(zhì)在-20℃和2-8℃都可至少穩(wěn)定6個(gè)月。
NadA蛋白易降解，可用蛋白質(zhì)印跡或質(zhì)譜(例如MALDI-TOF)檢測(cè)NadA的截?cái)嘈问?，表明多?0kDa MW喪失。降解產(chǎn)物可通過(guò)凝膠過(guò)濾與天然NadA相分離(例如，用柱TSK300SWXL，預(yù)柱TSKSWXL，TOSOHAAS)。過(guò)濾得到三個(gè)峰(i)保留時(shí)間12.637分鐘，表觀MW 885.036Da的第一峰；(ii)保留時(shí)間13.871分鐘，表觀MW 530.388Da的第二峰；(iii)保留時(shí)間13.871分鐘，表觀MW530.388Da的第三峰。三個(gè)峰的光散射分析表明，實(shí)際MW值為(i)208500Da、(ii)98460Da、(iii)78760Da。因此，第一峰含有NadA凝聚物，第三峰含有降解產(chǎn)物。
NadA(NL)(C)的預(yù)期分子量為34.113Da，所以峰(ii)含有三聚體蛋白質(zhì)，即所需的抗原。
抗原組合物用包含三種蛋白質(zhì)的組合物免疫小鼠，為進(jìn)行比較，也分別測(cè)試了這三種蛋白質(zhì)。每組10只小鼠。該混合物能夠誘導(dǎo)對(duì)各種菌株的高殺菌滴度(抗體)

“-”表示該菌株不含NadA基因觀察每只小鼠，三重混合物誘導(dǎo)了對(duì)產(chǎn)生各個(gè)抗原的三種血清群B菌株的高效且一致的殺菌(抗體)滴度

與OMV聯(lián)用和比較在其它試驗(yàn)中，與菌株H44/76(Norway)或菌株394/98(New Zealand)制備的10μg OMV聯(lián)合給予所述抗原(每種抗原20μg/劑量)。陽(yáng)性對(duì)照是血清群B的抗莢膜SEAM-3單抗(mAb)或抗其它菌株的CRM197-偶聯(lián)莢膜多糖單抗。該混合物幾乎總是得到高于單用OMV的(抗體)滴度，將此混合物加入到OMV幾乎總能顯著提高OMV的效力。在許多情況下，可觀察到此抗原混合物誘導(dǎo)了與陽(yáng)性對(duì)照相匹配的或超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照的應(yīng)答反應(yīng)。
超毒性譜系菌檢測(cè)測(cè)試了以下抗原對(duì)多種超毒性譜系血清群B菌株的效力(a)NadA(NL)(C)(b)ΔG287-953(c)936-ΔG741
(d)(a)、(b)和(c)的混合物(e)從菌株H44/76(Norway)制備的OMV(f)從菌株394/98(New Zealand)制備的OMV(g)ΔG287和(e)的混合物(h)(d)和(e)的混合物(i)(d)和(f)的混合物SEAM-3用作陽(yáng)性對(duì)照。
結(jié)果如下，以所示超毒性譜系中血清殺菌(抗體)滴度超過(guò)1024的菌株百分比表示

針對(duì)特定的參照菌株，殺菌(抗體)滴度如下所示

因此，組合物(d)、(h)和(i)可誘導(dǎo)對(duì)多種超毒性譜系A(chǔ)4、ET-5和譜系3血清群B腦膜炎球菌菌株的殺菌性抗體應(yīng)答反應(yīng)。用組合物(h)和(i)產(chǎn)生的抗體滴度通常高于用(d)，但對(duì)超毒性譜系A(chǔ)4、ET-5和譜系3的菌株覆蓋范圍不佳。
組合物(d)、(h)和(i)對(duì)不明類型菌株的覆蓋也較高。
與腦膜炎球菌和/或Hib偶聯(lián)物聯(lián)用三重MenB組合物與血清群C、W135和Y的寡糖偶聯(lián)物混合，得到包含以下抗原的疫苗

制備類似的疫苗，其包含MenA偶聯(lián)物(10μg糖+12.5-33μCRM197)和/或HbOCHib偶聯(lián)物(10μg糖+2-5μgCRM197)。
在一系列試驗(yàn)中，混合血清群C、W135和Y的偶聯(lián)物，每種偶聯(lián)物為40μg/ml(以糖定量)。為在使用前儲(chǔ)存MenB抗原，用15mg蔗糖、10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)凍干混合的偶聯(lián)物[在50mTorr真空下，-45℃3小時(shí)，-35℃20小時(shí)，50mTorr下30℃10小時(shí)，125mTorr下30℃9小時(shí)]。凍干前最后體積為0.3ml。重新懸浮在0.6ml水溶液中后，存在的每種血清群多糖為12μg。凍干只是為了使用方便，不影響最終產(chǎn)品在正常儲(chǔ)存期間的效力和穩(wěn)定性。
以相同的方法制備第二批物質(zhì)，但還包含與血清群C、W135和Y多糖相同劑量的血清群A偶聯(lián)物。
以相同的方法制備第三批物質(zhì)(血清群A、C、W135和Y)，但還包含與腦膜炎球菌多糖相同劑量的Hib-CRM197偶聯(lián)物。
為進(jìn)行比較，制備了血清群A和C偶聯(lián)物的凍干制劑。將MenA偶聯(lián)物與15mg蔗糖一起凍干，重建后得到12μg的多糖，如上所述。將MenC偶聯(lián)物與9mg甘露醇一起凍干，重建后得到12μg的多糖。
這些物質(zhì)與600μl血清群混合物(d)組合(或，作為相同組合物中缺少抗原的對(duì)照，即組2和3)，得到8種組合物

*所示量為多糖第0、21和35天，以200μl對(duì)CD/1只小鼠(8只小鼠/組)的體積腹膜內(nèi)給予這些組合物，第49天最后取血。用SBA試驗(yàn)檢測(cè)第49天血清對(duì)多種血清群A、B、C、W135和Y的腦膜炎球菌菌株的抗體滴度。結(jié)果如下

因此，即使加入了偶聯(lián)的腦膜炎球菌和Hib多糖抗原后，腦膜炎球菌蛋白抗原仍然有效。類似地，即使加入蛋白質(zhì)抗原后，腦膜炎球菌(多糖)偶聯(lián)物仍然有效。這些數(shù)據(jù)的確提示，在偶聯(lián)物中加入蛋白抗原可提高抗MenW135的效力(對(duì)照組2和7)。而且，存在一定水平的交叉反應(yīng)性，尤其對(duì)于血清群Y，單用蛋白抗原也產(chǎn)生了良好的抗MenY(抗體)滴度[參考文獻(xiàn)220]，組4和5也是。
數(shù)據(jù)還表明，在腦膜炎球菌(多糖)偶聯(lián)物中加入Hib(多糖)偶聯(lián)物(對(duì)照組2和3)也可提高抗W135活性。
使用修飾的MenA多糖純化MenA的莢膜多糖，經(jīng)水解得到MenA寡糖。50℃，用50mM醋酸鈉緩沖液pH4.75，以多糖濃度10mg/mL，水解多糖(2g)約4小時(shí)[73]。水解后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥溶液。
用下述反應(yīng)流程活化寡糖
將寡糖溶解在DMSO中，糖濃度10mg/mL。按寡糖∶CDI的摩爾比為1∶20，加入21.262g CDI，室溫?cái)嚢柙摲磻?yīng)混合物16小時(shí)。用80∶20(v/v)丙酮DMSO混合液選擇性沉淀然后離心，純化產(chǎn)生的MenA-CDI化合物。通過(guò)測(cè)定游離咪唑與偶聯(lián)咪唑的比率，計(jì)算出該活化反應(yīng)的效率約為67.9％。
在第二反應(yīng)步驟中，將MenA-CDI寡糖溶解在DMSO中，糖濃度約為10mg/mL。按MenA-CDI單位∶DMA的摩爾比為1∶100，加入36.288g 99％的二甲胺氫氧化物(即R1和R2＝Me)，室溫?cái)嚢柙摲磻?yīng)混合液16小時(shí)。凍干反應(yīng)產(chǎn)物，再溶解在10mg/mL水溶液中。
為除去寡糖制劑中的低分子量反應(yīng)試劑(尤其是二甲胺(DMA))，用3.5kDaMWCO膜(Spectra/PorTM)進(jìn)行透析步驟。進(jìn)行了四個(gè)透析步驟(i)用2L 1M的氯化鈉透析16小時(shí)(透析因子1∶20)，(ii)用2L 0.5M的氯化鈉透析16小時(shí)(透析因子1∶20)，(iii)和(iv)各用2L WFI(透析因子1∶20)透析16小時(shí)。為改進(jìn)純度，還用1kDa MWCO膜(Centricon)進(jìn)行滲濾步驟。
將純化的MenA-CDI-DMA產(chǎn)物溶解在pH 6.5、25mM L-組氨酸(Fluka)緩沖液中。
為制備修飾的MenA糖偶聯(lián)物(MenA-CDI-DMA)，整個(gè)加工過(guò)程如下-水解多糖，得到寡糖片段-篩選寡糖片段-還原氨基化所篩選寡糖上的末端醛基-CDI反應(yīng)前用Fmoc基團(tuán)保護(hù)末端-NH2基團(tuán)-DMA反應(yīng)期間進(jìn)行-NH2的內(nèi)部脫保護(hù)-用SIDEA(N-羥基琥珀酰亞胺己二酸)活化末端-NH2基團(tuán)-共價(jià)結(jié)合CRM197蛋白升高溫度下，修飾的MenA寡糖偶聯(lián)物比其天然MenA寡糖偶聯(lián)物的抗水解能力強(qiáng)得多。例如，37℃28天后，該修飾寡糖所釋放的糖為6.4％，而天然抗原為23.5％。而且，修飾的寡糖誘導(dǎo)的(抗體)滴度不顯著低于天然糖結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)的滴度。
將修飾的MenA偶聯(lián)物與MenC、MenW135和MenY偶聯(lián)物混合，代替未修飾寡糖偶聯(lián)物。將該四價(jià)混合物與三種MenB多肽混合，得到對(duì)腦膜炎奈瑟球菌血清群A、B、C、W135和Y的單劑量有效疫苗。
肺炎球菌組合將三種組合的MenB蛋白與肺炎球菌多糖偶聯(lián)物混合，每種肺炎球菌血清型(多糖)的最終濃度為2μg/劑量(是血清型6B的兩倍)。因此，該重建疫苗包含以下抗原

應(yīng)理解，僅僅以示例性的方式描述了本發(fā)明，對(duì)此所作的各種改進(jìn)仍屬于本發(fā)明范圍和精神。
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序列表SEQ ID 1-菌株2996的NadA，C端缺失MKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGSEQ ID 2-菌株2996的NadA，C端缺失，前導(dǎo)肽已經(jīng)加工(除去)ATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGSEQ ID 3-MC58菌株的ΔG741VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAEQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQSEQ ID 4-MC58菌株的936，前導(dǎo)肽已經(jīng)加工(除去)VSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQRSEQ ID 5-MC58菌株的953，前導(dǎo)肽已經(jīng)加工(除去)ATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPIANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMEKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQSEQ ID 6-MC58菌株的ΔG287SPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTADNPKNEDEVAQNDMPQNAAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADSMQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD
SEQ ID 7-287-953雜合蛋白MASPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGGQDMAAVSEENTGNGGAAATDKPKNEDEGAQNDMPQNAADTDSLTPNHTPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGGENAGNTAAQGTNQAENNQTAGSQNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSVVIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSATGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQDGSGGGGATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ*SEQ ID 8-936-741雜合蛋白MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQRGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ*SEQ ID 9-接頭GSGGGGSEQ ID 10-741序列CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQSEQ ID 11-741序列CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQSEQ ID 12-741序列CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
權(quán)利要求
1.一種水性免疫原性組合物，給予對(duì)象后，該組合物能誘導(dǎo)對(duì)腦膜炎奈瑟球菌血清群B、C、W135和Y的殺菌性免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中，所述組合物包含(i)偶聯(lián)的血清群C莢膜多糖抗原；(ii)偶聯(lián)的血清群W135莢膜多糖抗原；(iii)偶聯(lián)的血清群Y莢膜多糖抗原；和(iv)一種或多種血清群B多肽抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，還包含(v)偶聯(lián)的血清群A莢膜多糖抗原。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，修飾所述血清群A莢膜多糖，以使至少20％的單糖單元在其3和4位的任一位都沒(méi)有-OH。
4.如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其特征在于，所述組合物可在37℃儲(chǔ)存28天，28天后，偶聯(lián)的MenA糖初始總量只有不到20％將發(fā)生解離。
5.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述偶聯(lián)的糖是寡糖。
6.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述糖與選自以下的載體蛋白偶聯(lián)白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、流感嗜血桿菌蛋白D和CRM197。
7.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含1-10種明確的血清群B多肽抗原，并且，所述組合物可誘導(dǎo)對(duì)兩種或三種腦膜炎奈瑟球菌血清群B的超毒性譜系A(chǔ)4、ET-5和譜系3的殺菌性免疫應(yīng)答反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含以下五種抗原中的一種或多種(i)寡聚體形式的“NadA”蛋白；(ii)“741”蛋白；(iii)“936”蛋白；(iv)“953”蛋白；和(v)“287”蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含含氨基酸序列SEQ ID NO2的第一多肽、含氨基酸序列SEQ ID NO7的第二多肽和含氨基酸序列SEQ ID NO8的第三多肽。
10.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含提供抗B型流感嗜血桿菌(Hib)保護(hù)力的糖抗原。
11.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含提供抗肺炎鏈球菌保護(hù)力的抗原。
12.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含磷酸鋁佐劑。
13.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，包裝在熱熔密封容器內(nèi)。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述容器是小瓶或注射器。
15.如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，用作藥物。
16.(i)偶聯(lián)的血清群C莢膜多糖抗原；(ii)偶聯(lián)的血清群W135莢膜多糖抗原；(iii)偶聯(lián)的血清群Y莢膜多糖抗原；(iv)一種或多種血清群B的多肽抗原；以及，任選地，(v)偶聯(lián)的血清群A莢膜多糖抗原在制備用于提高哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
17.一種提高哺乳動(dòng)物抗體應(yīng)答反應(yīng)的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的組合物。
18.一種水性免疫原性組合物，給予對(duì)象后，所述組合物能誘導(dǎo)(a)至少對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的血清群W135的殺菌性免疫應(yīng)答反應(yīng)(b)抗b型流感嗜血桿菌疾病的保護(hù)力，其中，所述組合物包含(i)偶聯(lián)的血清群W135莢膜多糖抗原；(ii)偶聯(lián)的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗原。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含血清群C和Y以及任選的血清群A的偶聯(lián)莢膜多糖抗原。
20.如權(quán)利要求18或19所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含腦膜炎奈瑟球菌血清群B的一種或多種多肽抗原。
全文摘要
以單劑量混合時(shí)，腦膜炎球菌血清群C、W135和Y的偶聯(lián)莢膜多糖對(duì)人體是安全和具有免疫原性。當(dāng)加入血清群A的偶聯(lián)莢膜多糖時(shí)，保持了這種作用。這些偶聯(lián)抗原無(wú)需凍干，可在單一水性劑量中穩(wěn)定地混合。通過(guò)使用少量成分明確的多肽抗原，可實(shí)現(xiàn)對(duì)血清群B感染的廣泛保護(hù)力。對(duì)五種血清型的任一種而言，這些多肽抗原可與糖抗原混合而不喪失其保護(hù)效力。即使加入Hib偶聯(lián)物，仍然有效。通過(guò)加入血清群B菌株的蛋白抗原，可提高血清群W135偶聯(lián)物的效力。將Hib偶聯(lián)物加入到腦膜炎球菌偶聯(lián)物中可提高對(duì)腦膜炎球菌血清群W135的整體活性。
文檔編號(hào)A61K39/102GK1889975SQ200480035625
公開(kāi)日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2004年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日
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