專利名稱：多價(jià)腦膜炎球菌類別1外膜蛋白疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到基于腦膜炎球菌外膜蛋白的疫苗。
腦膜炎球菌病幾乎完全是由血清組分A、B、C、W和Y腦膜炎雙球菌引起。一種4價(jià)A，C，W，Y多糖疫苗可用來(lái)對(duì)抗這種疾病。該疫苗具有多糖固有的免疫學(xué)特性，例如在幼兒體內(nèi)低的免疫原性，以及在以前從未與有關(guān)細(xì)菌接觸過(guò)的個(gè)體中不誘發(fā)免疫記憶。結(jié)果是，該多糖疫苗僅用于到腦膜炎球菌病發(fā)病率高的地區(qū)去的風(fēng)險(xiǎn)群體(如士兵和旅游者)，也用于該病爆發(fā)時(shí)期。
在研制對(duì)抗腦膜炎球菌病的適當(dāng)?shù)亩嗵且呙鐣r(shí)，一個(gè)很大的問(wèn)題是所謂B多糖的非常低的免疫原性，對(duì)此，一種可能的解釋是B多糖與人類糖脂的結(jié)構(gòu)上的大量對(duì)應(yīng)。由于在很多國(guó)家中高于50%的腦膜炎球菌病是由組分B腦膜炎雙球菌引起的(Poolman，J.T.etal，MeningoeoeealSerotypesandSerogroupBDiseaseinNorth-westEurope，TheLancet，September1986，P.P.555-558)，使用上述4價(jià)A，C，W，Y-多糖疫苗并未使病情減輕，雖然化學(xué)修飾方法的確可大大提高B-多糖的免疫原性，但這樣做引起的問(wèn)題會(huì)達(dá)到如此程度;即作為一種自動(dòng)免疫應(yīng)答的結(jié)果，接種以后這種修飾的B多糖會(huì)引起不需要的副反應(yīng)。
因此曾采用另一種嘗試，使用腦膜炎雙球菌的外膜蛋白作為疫苗代替膠囊多糖，因?yàn)樵摰鞍椎目贵w具有殺細(xì)菌活性。然而，腦膜炎雙球菌具有多種外膜蛋白，本申請(qǐng)人已篩選了其中的兩種用于疫苗研制，類別1和類別2/3外膜蛋白(Frasch，C.E.et，al，SerotypeAntigensofNeisseriaMenin-gitidisandaProposedSchemeforDesignationofSerotypes，ReviewsofInfectionsDiseases，Volume7，number4，JulyAugust1985，Pages504-510〕，這樣得到的對(duì)抗腦膜炎球菌病的外膜蛋白疫苗含有純化的同一品系的類別1和2/3外膜蛋白，內(nèi)毒素含量已盡可能地降低。此類第一代外膜蛋白疫苗和確實(shí)的亞基疫苗已由不少研究人員做出，并見于許多專利出版物(EP-A-O，145，359;EP-A-O，109，668;EP-A-O，088，303〕，但此類疫苗缺點(diǎn)在于它所誘發(fā)的免疫性依賴于品系特征。原因是幾種類別1和2/3外膜蛋白發(fā)生于腦膜炎奈瑟氏球菌(腦膜炎雙球菌)內(nèi)。因此嘗試用來(lái)自幾個(gè)品系的外膜蛋白制備多價(jià)疫苗，以得到刺激一種廣泛保護(hù)作用的可能性。在與抗體殺菌作用(尤其是單克隆)及動(dòng)物體內(nèi)的保護(hù)作用相關(guān)的研究中，發(fā)現(xiàn)抗體主要對(duì)類別1外膜蛋白有效(PoolmanJ.T.etal，Comparisonpfmeningococcalouter-membraneproteinvaccinessolublizeodwithdetergentorcpolysaccharide，AntonievanLeeuwenhoek，1987年12月，53，413-419〕。然而，流行病學(xué)研究表明在腦膜炎雙球菌中有近10種不同的類別1外膜蛋白(Abdillahi，H.andpool-manJ.T.1988，SerosubtypinggroupBmeningococciusingmonoclonalantibodiesinawhole-cell-ELISA，MicrobialPatho-genesis，Vol.4，Pages27-32〕?，F(xiàn)在已知的用純化方法得到的5種或更多的類別1外膜蛋白的組合物是不可能的，原因是伴隨內(nèi)毒素純化，會(huì)出現(xiàn)一種毒性的脂多糖。
已發(fā)現(xiàn)上述缺點(diǎn)可借助于一種疫苗來(lái)去除，該疫苗特征為一種或多種腦膜炎球菌類別1外膜蛋白片段，所述片段已據(jù)與殺菌抗體反應(yīng)性而做了選擇，其含有一低到可接受的含量的內(nèi)毒素，更特別地，本發(fā)明之疫苗含有類別1蛋白質(zhì)的表面定位片段，其衍生于類別1和2/3外膜蛋白結(jié)合制劑。這些片段可通過(guò)蛋白質(zhì)切割方法得到，也可通過(guò)肽合成得到。
除了上述提到的低含量?jī)?nèi)毒素這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是可得到能大量溶解于水介質(zhì)中的產(chǎn)品，這與未切為片斷的疏水的外膜蛋白相反，后者只能借助于相當(dāng)可觀量的去污劑及其類似物而保存于溶液中。
更特殊地，本發(fā)明涉及到這樣一些疫苗，其特征為，存在一種或多種A，B，C，W和/或Y組分腦膜炎球菌類別1外膜蛋白的片段。
因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)上述類別1外膜蛋白發(fā)生于A，B，C，W和Y腦膜炎雙球菌，據(jù)本發(fā)明得到的多價(jià)類別1外膜蛋白片段疫苗能激發(fā)起對(duì)于所有這些血清組分的一種殺菌免疫應(yīng)答。這意味著A，C，W，Y多糖疫苗可由據(jù)本發(fā)明的一種疫苗取代，這種疫苗對(duì)于腦膜炎球菌病具有強(qiáng)反應(yīng)性。
考慮到腦膜炎球菌病主要由組分B腦膜炎雙球菌引起及發(fā)生于組分B腦膜炎雙球菌的類別1外膜蛋白也發(fā)生于組分A，C，W和Y腦膜炎雙球菌這一事實(shí)，本發(fā)明有利地涉及到一種疫苗，其特征為組分B腦膜炎雙球菌類別1外膜蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段。優(yōu)選為，此疫苗制劑始于至少10個(gè)品系組分B腦膜炎雙球菌，這些品系被選作為10種不同的類別1外膜蛋白。
本發(fā)明疫苗含有，例如，5-10種外膜蛋白片段，用溴化氰處理類別1外膜蛋白得到。這些片段也可通過(guò)肽合成或重組DNA技術(shù)得到。
此外，本發(fā)明疫苗可有利地含有腦膜炎球菌A，C，Y和W多糖和/或去污劑。對(duì)此須注意這樣一個(gè)事實(shí)，即可采用產(chǎn)生兩性離子，陽(yáng)離子、陰離子及不產(chǎn)生離子的去污劑，例如Zwittergent3-10，Zwittergent3-14(即N-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸鹽)，吐溫-20和脫氧膽酸鈉。
據(jù)本發(fā)明的疫苗還可含一種吸收劑如氫氧化鋁，磷酸鈣，或更有利地，磷酸鋁。該片段還可在免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)中加工或與其它佐劑結(jié)合。以便獲得較高的免疫原性。
多價(jià)腦膜炎球菌蛋白片段疫苗制劑在下文中將詳細(xì)討論;但這些解釋不應(yīng)認(rèn)為是限制性的。
A)品系/培養(yǎng)程序尤其是，品系H44/76(B∶15∶P1∶16)(HoltenE.，Norway)，187(B∶4∶P1.1)(EtienneJ，F(xiàn)rance)，Swiss4(B∶4∶P1.15)(HirschelB，Switserland)，B2106(B∶4∶P1.2)(Berger U，West Germany)，395(B∶NT∶P1.9)(Jonsdottir K.，Iceland)，M990(B∶6∶P1∶6)(Frasch c，U.S.A.)，M1080(B∶1∶P1.1)(Frasch C.U.S.A.)，2996(B∶2b∶P1.2)(本申請(qǐng)人制備)，M982(B∶9∶P1.9)(Frasch C.U.S.A.)S3446(B∶14∶P1.6)(Frasch C.U.S.A.)，H355(B∶15∶P1.15)(Holten E，Norway)，6557(B∶17∶P1∶17)(Zollinger W，U.S.A)及B40(A∶4∶P1.NT)(A chtman M，West Germany)，從-70℃預(yù)培養(yǎng)物接種于搖動(dòng)燒瓶中，再轉(zhuǎn)移至40，140或350升發(fā)酵培養(yǎng)基中，該半合成培養(yǎng)基具有下列成分L-谷氨酸1.3克/升，L-半胱氨酸鹽酸0.02克/升，亞磷酸氫二鈉Na2-HPO2·2H2O)10克/升，氯化鉀(Kcl)0.09克/升，氯化鈉(NaCl)6克/升，氯化銨(NH4Cl)1.25克/升，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.6克/升，葡萄糖5克/升，硝酸鐵(Fe(NO3)3)100微克/升，酵母透析液。
在發(fā)酵器中培養(yǎng)時(shí)，PH和CO2被監(jiān)測(cè)并自動(dòng)調(diào)節(jié)到PH7.0-7.2，空氣飽和度為10%，用離心方法收集細(xì)胞，用無(wú)菌0.14MNaCl洗滌，-20℃貯存或凍干。
B).用溴化氰處理得到的類別1外膜蛋白片段的純化。
步驟(A)所得細(xì)菌團(tuán)塊用0.5MCaCl2，1%(W/V)Zwittergent 3-14(Zw 3-14)和0.14M NaCl(PH4.0)萃取，每克干重用100毫升。重懸浮后，PH調(diào)至6.0，該懸浮液于室溫下攪拌1小時(shí)，離心(1小時(shí)，3000×g)，然后用無(wú)菌方法收集上清液，將20%乙醇(V/V)加到此上清液中，攪拌30分鐘后將產(chǎn)物離心，(30分鐘，10，000×g)，之后，在無(wú)菌條件下收集上清。上清液再通過(guò)Amicon Hollow Fiber System(H1D×50，斷流50000)進(jìn)行分離過(guò)濾達(dá)到濃縮，將CaCl2和乙醇去除，濃縮物用0.1M醋酸鈉，25mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.05%Zw3-14，PH6.0稀釋至原始體積，然后用分離過(guò)濾方法再次濃縮。此過(guò)程重復(fù)5次，最后濃縮物的PH值調(diào)至4.0，將20%(V/V)乙醇加入到濃縮物中，攪拌30分鐘，將產(chǎn)物離心(30分鐘，10000×g)，得到的沉淀物置于70%(V/V)甲酸中，再用10倍過(guò)量的溴化氰(CNBr)在室溫下處理16小時(shí)。用蒸發(fā)方法去除CNBr和甲酸，換以0.2M Tris(三羥甲基氨基甲烷)，6M尿素溶液，PH為7.2。上清液含有類別1外膜蛋白(分子量約20，000至25，000道爾頓)及未受影響的類別3外膜蛋白的片段，最后采用凝膠過(guò)濾進(jìn)行純化，Sephacryl S-200或TSK-2000和0.2M Tris，6M尿素溶液作為洗脫劑，將類別1外膜蛋白和類別3外膜蛋白片段分離。收集所需級(jí)分，并濃縮，此過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)是類別1外膜蛋白片段的純度及低的內(nèi)毒素含量。
為制備疫苗，將大量類別1外膜蛋白的這些不同片段(5至10種)混合使蛋白質(zhì)終濃度為1毫克/毫升，與腦膜炎球菌C多糖(W/W＝1∶1)混合并透析。
據(jù)本發(fā)明，另一種制備疫苗的可能方法包括用吐溫-20%和脫氧膽酸鈉作為去污劑，在這個(gè)方法中，腦膜炎球菌C多糖的使用成為多余的了。
以此方式得到的多價(jià)類別1外膜蛋白疫苗與磷酸鋁混合得到終濃度為20-50微克/毫升類別1外膜蛋白及2毫克/毫升磷酸鋁，此疫苗人類劑量為0.5毫升，所以在10價(jià)疫苗的情形中每次接種最多注射100-200微克蛋白。
該疫苗制劑的組成是借助于單克隆抗體，用一種定量的抗原決定試驗(yàn)監(jiān)測(cè)的，分子量由HPLC(高壓液相層析)測(cè)定，所有類別1蛋白片段的免疫原性借助于常用良性試驗(yàn)測(cè)定。
C)用蛋白水解和肽合成方法制備肽疫苗。
從C-末端溴化氰片段(與殺菌單克隆抗體結(jié)合的抗原表面決定基位于這些片段上)開始，借助于內(nèi)溶素C和蛋白水解酶endoAr-C制備較小的片段。這些片段用高壓液相層析方法純化，用氨基酸順序儀，采用Edman降解的方法測(cè)定其氨基酸順序。具有分子量約4000道爾頓(約33個(gè)氨基酸)的一條肽與殺菌單克隆抗體反應(yīng)，其具有下列順序PVSVRYDSEFSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAY。借助于蛋白水解酶endoGlu-C進(jìn)行水解，得到一條6000道爾頓的肽，其與殺菌單克隆抗體結(jié)合，N-末端順序?yàn)镕SGFSGSVQFVPI。用蛋白水解酶endoArg-C和endoGlu-C得到的肽FSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAY為結(jié)合殺菌單克隆抗體的抗原表面決定基，借助于肽合成，并采用有機(jī)化學(xué)方法制備了一系列的肽以便更深入表征此抗原表面決定基。具有順序FSGFSGSVQFV和PIQNSKSAYTP的肽呈陽(yáng)性反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了用蛋白質(zhì)水解方法所得到的結(jié)果。此方法將確定腦膜炎球菌類別1外膜蛋白的結(jié)合殺菌抗體的抗原表面決定基，借助于蛋白質(zhì)水解技術(shù)，肽合成或重組技術(shù)，可以只對(duì)感興趣的抗原表面決定基進(jìn)行加工而產(chǎn)生一種疫苗其中相應(yīng)的抗原表面決定基是B和Th。
權(quán)利要求
1.疫苗，特征為腦膜炎球菌類別1外膜蛋白的一種或多種片段。
2.權(quán)利要求1所述疫苗，特征為腦膜炎球菌類別1外膜蛋白的A，B，C，W和/或Y組分的一種或多種片段。
3.權(quán)利要求1或2所述疫苗，特征為B組分腦膜炎球菌類別1外膜蛋白的一種或多種片段。
4.權(quán)利要求3所述疫苗，特征為5-10種不同的B組分腦膜炎球菌類別1外膜蛋白的一種或多種片段。
5.權(quán)利要求1-4中之一或更多項(xiàng)所述疫苗，特征為，用溴化氰處理類別1外膜蛋白后得到的蛋白片段。
6.權(quán)利要求5所述疫苗，特征為5-10種類別1外膜蛋白片段，其分子量為20，000-25，000道爾頓。
7.權(quán)利要求1-4中之一或更多項(xiàng)所述疫苗，特征為用蛋白水解方法(例如用endoArg-C，endoGlu-C)得到的類別1外膜蛋白片段。
8.權(quán)利要求1-4中之一或更多項(xiàng)所述疫苗，特征為合成肽，至少對(duì)應(yīng)于腦膜炎球細(xì)類別1外膜蛋白的一種或多種能結(jié)合殺菌抗體的抗原表面決定基。
9.權(quán)利要求8所述疫苗，特征為含有至少一種或多種肽FSGFSGSVQFV和PIQNSKSAYTP。
10.權(quán)利要求1-4中之一或更多項(xiàng)所述疫苗，特征為，是rDNA產(chǎn)物，至少對(duì)應(yīng)于腦膜炎球菌類別1外膜蛋白的一種或多種能與殺菌抗體結(jié)合的抗原表面決定基。
11.權(quán)利要求1-10中之一或更多項(xiàng)所述疫苗，特征在于，該疫苗也含有腦膜炎球菌A，C，Y和W多糖，可能與蛋白質(zhì)產(chǎn)物相結(jié)合。
12.權(quán)利要求1-11中之一或更多項(xiàng)所述疫苗，特征為該疫苗還含有兩性離子，陽(yáng)離子，陰離子和/或非離子的去污劑。
13.權(quán)利要求12所述疫苗，特征在于該去污劑選自兩性離子去污劑Zw3-10，Zw3-14，吐溫-20和脫氧膽酸鈉。
14.權(quán)利要求1-13中之一或更多項(xiàng)所述疫苗，特征為該疫苗還含有吸收劑，選自磷酸鋁，氫氨化鋁和磷酸鈣。
15.權(quán)利要求14所述疫苗，特征為吸收劑是磷酸鋁。
16.權(quán)利要求1-10所述疫苗，特征在于采用了佐劑，例如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一類多價(jià)疫苗，其對(duì)于腦膜炎球菌疾病具有強(qiáng)烈作用，該疫苗特征為血清組分A，B，C，W和/或Y的一個(gè)或多個(gè)片段，優(yōu)選為血清組B腦膜炎球菌類別1外膜蛋白。上述片段可用本發(fā)明中的切割類別1外膜蛋白的方法得到，也可用肽合成方法得到。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1030443SQ8810421
公開日1989年1月18日 申請(qǐng)日期1988年7月7日 優(yōu)先權(quán)日1987年7月7日
發(fā)明者簡(jiǎn)·西奧尼斯·波爾曼, 羅伯特·強(qiáng)西·賽德 申請(qǐng)人:荷蘭王國(guó)福利、公共健康與文化部