專利名稱：生產(chǎn)單克隆抗體的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及免疫學(xué)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)單克隆抗體的方法和組合物，和體外生產(chǎn)這種抗體的方法。
背景技術(shù)：
將所需試劑導(dǎo)入特異性靶細(xì)胞長時間以來對科學(xué)家來說已是一種挑戰(zhàn)。試劑特異性靶向的挑戰(zhàn)是使生物靶細(xì)胞得到足夠量的試劑或正確試劑，而不使生物其余部分過多暴露于所述試劑。遞送特異性試劑的非常希望的靶是免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)是包括很多具有不同活性的不同類型細(xì)胞的復(fù)雜的身體反應(yīng)系統(tǒng)。一部分免疫系統(tǒng)的活化通常由于系統(tǒng)的其他相關(guān)部分不需要的活化而引起各種反應(yīng)。目前，沒有通過靶向免疫系統(tǒng)特異性成分產(chǎn)生特別希望的反應(yīng)的令人滿意的方法或組合物。
免疫系統(tǒng)是包括各式各樣成分的復(fù)雜的身體相互作用系統(tǒng)，所述成分包括細(xì)胞和細(xì)胞因子，它們與來自身體內(nèi)部和身體外部的刺激相互作用。除直接作用以外，免疫系統(tǒng)的反應(yīng)也受到身體其他系統(tǒng)的影響，包括神經(jīng)、呼吸、循環(huán)和消化系統(tǒng)。
免疫系統(tǒng)的一個眾所周知方面是它對侵入生物、體內(nèi)細(xì)胞改變或由接種疫苗呈遞的外來抗原產(chǎn)生反應(yīng)的能力。對免疫系統(tǒng)的這種活化產(chǎn)生反應(yīng)的一些第一類型細(xì)胞是吞噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。吞噬細(xì)胞除其他細(xì)胞外包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和多形核嗜中性白細(xì)胞。這些細(xì)胞通常與外來抗原結(jié)合，內(nèi)在化它并常常破壞它。它們也產(chǎn)生介導(dǎo)其他免疫反應(yīng)的可溶分子，所述免疫反應(yīng)如炎癥反應(yīng)。天然殺傷細(xì)胞可以識別并破壞某些病毒感染的胚胎和腫瘤細(xì)胞。免疫反應(yīng)的其他因子包括補(bǔ)體途徑，它能夠獨(dú)立應(yīng)答外來抗原或與細(xì)胞或抗體一起作用。
對于接種很重要的免疫系統(tǒng)的一個方面是免疫系統(tǒng)對特定病原體或外來抗原的特異性反應(yīng)。反應(yīng)的一部分包括對于所述外來抗原的“記憶”的確立。第二次接觸后，記憶功能允許對外來抗原產(chǎn)生更快和通常更大的反應(yīng)。淋巴細(xì)胞與其他細(xì)胞和因子一起在記憶功能和反應(yīng)中起著重要作用。
通常，人們認(rèn)為對抗原的反應(yīng)包括體液反應(yīng)和細(xì)胞反應(yīng)。體液免疫反應(yīng)是由非細(xì)胞因子介導(dǎo)的，該因子是由細(xì)胞釋放的且發(fā)現(xiàn)在血漿或細(xì)胞內(nèi)流體中可能游離或可能不游離。免疫系統(tǒng)體液反應(yīng)的主要成分是由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體介導(dǎo)的。由細(xì)胞相互作用產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，所述細(xì)胞包括抗原呈遞細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)和T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)。
免疫反應(yīng)能力的最廣泛利用的一個方面是單克隆抗體的生產(chǎn)。20世紀(jì)70年代中期單克隆抗體(Mab)技術(shù)的來臨提供了有價值的新治療和診斷工具。研究人員和臨床醫(yī)師首次可以使用能夠與預(yù)定抗原部位結(jié)合和具有各種免疫效應(yīng)功能的無限量均一抗體。目前，生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
這些單克隆抗體被認(rèn)為在醫(yī)學(xué)和診斷學(xué)中擁有巨大前景。不幸的是，由于單克隆抗體治療中所固有的問題，基于這些蛋白的治療產(chǎn)品的開發(fā)受到了限制。例如，大多數(shù)單克隆抗體是從小鼠得到的，且因此，不能很好固定人補(bǔ)體。當(dāng)用于人時，它們也缺乏其他重要的免疫球蛋白功能特征。
使用單克隆抗體最大的缺點(diǎn)是非人單克隆抗體當(dāng)注射給人患者時具有免疫原性的事實。注射外來抗體后，患者增加的免疫反應(yīng)可能相當(dāng)強(qiáng)烈。免疫反應(yīng)導(dǎo)致外來抗體的迅速消除，從而在初步治療后，基本上消除抗體的治療效用。不幸的是，一旦免疫系統(tǒng)對外來抗體起反應(yīng)而致敏，用相同或不同非人抗體的隨后治療可能無效或甚至危險。
小鼠可以容易地用外來抗原免疫以產(chǎn)生許多高親和力抗體。然而，由于小鼠抗體在人體中的呈遞，鼠抗體導(dǎo)入人將引起人抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)的產(chǎn)生。在患者中使用鼠抗體通常限于數(shù)天或數(shù)周的期限。更長的治療時間段可能引起過敏反應(yīng)。此外，一旦患者中發(fā)展了HAMA，它就常常阻止用于診斷或治療目的的鼠抗體的未來的使用。
為克服HAMA反應(yīng)的問題，研究人員已嘗試了修飾非人抗體的幾個方法，以使得它們像人的。這些方法包括小鼠/人嵌合、人源化和靈長類動物源化(primatization)。制備更像人抗體的早期工作使用組合兔和人抗體。抗體的蛋白亞單位，兔Fab片段和人Fc片段通過蛋白二硫鍵相連形成新人工蛋白分子或嵌合抗體。
已經(jīng)使用重組分子生物技術(shù)來產(chǎn)生嵌合抗體。使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建編碼小鼠抗體可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域和人抗體輕鏈(LC)和重鏈(HC)恒定結(jié)構(gòu)域的DNA序列之間的基因融合，以允許嵌合抗體表達(dá)。這些嵌合抗體含有很多非人氨基酸序列并且對人具有免疫原性。暴露于這些嵌合抗體的患者產(chǎn)生人-抗嵌合體抗體(HACA)。HACA針對鼠V區(qū)，且還可以針對重組嵌合抗體中存在的新V區(qū)/C區(qū)(恒定區(qū))接頭。
為了克服嵌合抗體的免疫原性呈現(xiàn)的一些限制，使用分子生物學(xué)技術(shù)來產(chǎn)生人源化或重構(gòu)抗體。編碼鼠單克隆抗體的抗原結(jié)合部分或互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的DNA序列通過分子學(xué)方式嫁接到編碼人抗體重鏈和輕鏈構(gòu)架的DNA序列上。人源化Mabs比嵌合Mabs含有更大百分比的人抗體序列。包含大約90％人抗體和10％小鼠抗體的最終產(chǎn)物在人抗體上含有小鼠結(jié)合部位。為了保留正確的形狀和由此保留對靶抗原的結(jié)合親和力，它還含有來自小鼠Mab向人源化Mab構(gòu)架的某些氨基酸置換。
在實踐中，用鼠CDRs簡單置換人CDRs不足以產(chǎn)生保留原始鼠抗體特異性的有效人源化抗體。有在人可變區(qū)中包含少量決定性鼠抗體殘基的另外需求。這些殘基的特性取決于原始鼠抗體和受體人抗體兩者的結(jié)構(gòu)。正是這些鼠抗體殘基的存在有助于在患者中產(chǎn)生HACA反應(yīng)，從而引起單克隆抗體的迅速清除和過敏反應(yīng)的擔(dān)憂。
將另一個技術(shù)，稱作重修表面(resurfacing)技術(shù)，用于人源化小鼠抗體。重修表面包括在一種方法中用人抗體表面替換小鼠抗體表面，所述方法比其他人源化技術(shù)更快和更有效。這個技術(shù)提供了通過僅僅人源化重組體Fv V區(qū)表面上可接近的那些氨基酸，使鼠單克隆抗體重設(shè)計以類似人抗體的方法。鼠單克隆抗體的重修表面可以維持重構(gòu)形式的原始小鼠單克隆抗體的抗體親抗原性，因為保留了天然的構(gòu)架-CDR相互作用。這些抗體也有由于它們的小鼠來源而具有抗原性的問題。
其他技術(shù)使用靈長類動物，而不是小鼠的序列來人源化Mabs。這個方法的基本原理稱作靈長類動物源化，是靈長類動物抗體可變區(qū)中的大部分序列與人的序列無法區(qū)分。治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和嚴(yán)重哮喘的靈長類動物源化抗CD4 Mabs正在開發(fā)。然而，這些Mabs對于患者的免疫系統(tǒng)仍然是外來蛋白并引起免疫反應(yīng)。
在避免對外來蛋白的免疫反應(yīng)的努力中，各種制備僅含有人抗體成分的人Mabs的方法正在開發(fā)。一個方法是分離天然產(chǎn)生抗所需抗原的抗體的人B細(xì)胞克隆并使其在三體瘤(trioma)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長。因為人抗體僅僅抗對宿主是外來的抗原，所以人B細(xì)胞無一產(chǎn)生抗人抗原的抗體。因此，這個方法對產(chǎn)生抗人蛋白抗原的Mabs無用。
產(chǎn)生人Mabs的兩個其他方法是噬菌體展示和轉(zhuǎn)基因小鼠的使用。噬菌體展示技術(shù)利用人制備抗任何可能結(jié)構(gòu)的抗體的能力。這個技術(shù)使用來自很多個體的抗體基因來產(chǎn)生大的噬菌體抗體文庫，每個噬菌體都在其表面展示功能性抗體可變結(jié)構(gòu)域。從這個文庫，根據(jù)它們結(jié)合所需抗原的能力選擇單個可變結(jié)構(gòu)域。通過分子生物學(xué)技術(shù)，將具有所需結(jié)合特征的抗體可變結(jié)構(gòu)域和能最好地滿足潛在人治療產(chǎn)物的恒定結(jié)構(gòu)域組合產(chǎn)生Mab。這個技術(shù)仍缺乏抗原特異性。噬菌體文庫無法含有針對任何和所有所需抗原的每個結(jié)合區(qū)。它還可能含有缺乏特異性的結(jié)合區(qū)。因此，這個技術(shù)可能需要相當(dāng)大的工程以使抗體親和力增加至有效水平。
轉(zhuǎn)基因小鼠也用于產(chǎn)生“人”抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠是通過用人免疫球蛋白基因座取代小鼠免疫球蛋白基因座而產(chǎn)生的。這個方法可能提供優(yōu)于噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，因為它利用小鼠體內(nèi)親和力成熟機(jī)構(gòu)。
產(chǎn)生人或人樣Mabs的所有當(dāng)前技術(shù)都不足以提供對所述抗原是抗原特異性的物種特異性抗體。嵌合抗體具有保留鼠抗體特異性和刺激人Fc依賴性補(bǔ)體固定和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的優(yōu)點(diǎn)。然而，這些嵌合抗體的鼠可變區(qū)仍可以引起HAMA反應(yīng)，因此限制了嵌合抗體作為診斷和治療劑的價值。
疫苗可能針對任何外來抗原，無論其來自另一種生物、改變的細(xì)胞，還是正?！白陨怼奔?xì)胞中誘導(dǎo)的外來屬性。外來抗原的施用途徑可以幫助確定產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類型。例如，將抗原遞送至粘膜表面，如經(jīng)口接種活脊髓灰質(zhì)炎病毒，刺激免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生粘膜表面的免疫反應(yīng)。注射抗原到肌肉組織常常促進(jìn)長效IgG反應(yīng)的產(chǎn)生。
疫苗通?？梢苑譃閮蓚€類型，全疫苗和亞單位疫苗。全疫苗可以由已被滅活或減毒或殺死的病毒或微生物產(chǎn)生?；顪p毒疫苗具有模擬足以觸發(fā)類似于對野生型生物的反應(yīng)的免疫反應(yīng)的自然感染的優(yōu)點(diǎn)。這種疫苗通常提供高水平的保護(hù)，尤其是如果通過自然途徑施用，且一些疫苗可能僅需要一劑即可給予免疫性。一些減毒疫苗的另一個優(yōu)點(diǎn)是它們提供群體成員間人到人的傳遞。然而，這些優(yōu)點(diǎn)與幾個缺點(diǎn)相抵。一些減毒疫苗具有有限的保存期限和在熱帶環(huán)境中不易貯藏。還有一種可能性，即苗將回復(fù)到毒性野生型生物，從而引起有害甚至危及生命的疾病。減毒疫苗的使用在免疫缺陷狀態(tài)，如AIDS和妊娠中禁忌。
殺死的疫苗是更安全的，因為它們無法回復(fù)毒力。它們在運(yùn)輸和貯藏過程中通常更穩(wěn)定并適于在無免疫應(yīng)答的患者中使用。然而，它們比活減毒疫苗低效，從而通常需要一劑以上。另外，它們不提供群體成員間人到人的傳遞。
亞單位疫苗的生產(chǎn)需要關(guān)于疫苗應(yīng)針對的微生物或細(xì)胞的表位的知識。設(shè)計亞單位疫苗中的其他考慮是亞單位的大小和亞單位多好地代表了全部微生物菌株或細(xì)胞。由于在生產(chǎn)全細(xì)菌疫苗中遭遇的問題和與使用它們相關(guān)的副作用，開發(fā)細(xì)菌疫苗的當(dāng)前焦點(diǎn)已轉(zhuǎn)變?yōu)閬唵挝灰呙绲纳a(chǎn)。這種疫苗包括基于Vi莢膜多糖的傷寒疫苗和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的Hib疫苗。
因為與減毒疫苗的使用相關(guān)的安全考慮和殺死的疫苗的低功效，本領(lǐng)域需要增強(qiáng)疫苗功效的組合物和方法。本領(lǐng)域還需要增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的組合物和方法，它們刺激體液和細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。本領(lǐng)域進(jìn)一步需要免疫反應(yīng)的選擇性調(diào)節(jié)和操縱免疫系統(tǒng)的各種成分以產(chǎn)生所需的反應(yīng)。另外，對于更迅速的活化反應(yīng)，需要可以促進(jìn)和擴(kuò)大免疫反應(yīng)的方法和組合物。對用僅一劑就能提供保護(hù)的疫苗接種人和動物群體的能力的需要增加。
需要的是將特異性試劑的遞送僅靶向至靶細(xì)胞的組合物和方法。這種組合物和方法應(yīng)該能把治療劑有效遞送至靶細(xì)胞。還需要的是在體外和體內(nèi)系統(tǒng)兩者中都可以使用的組合物和方法。
還有對單克隆抗體的組合物和生產(chǎn)它們的改進(jìn)方法的普遍需要。有對生產(chǎn)對預(yù)定抗原具有親和力的人抗體的方法的具體需要。這些人免疫球蛋白應(yīng)該以適于治療和診斷制劑的方式容易地和經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明包括制備物種特異性抗原特異性單克隆抗體的組合物和方法，所述單克隆抗體優(yōu)選IgG單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步包括復(fù)制免疫系統(tǒng)元件的載體，所述免疫系統(tǒng)元件特別是免疫突觸的抗原呈遞細(xì)胞(APC)元件。優(yōu)選的載體任選包含將負(fù)載抗原的II類主要組織相容性(MHC)蛋白、共刺激蛋白B7和結(jié)構(gòu)蛋白胞內(nèi)粘著蛋白(I-CAM)結(jié)合在膠態(tài)金屬載體表面上。這種載體復(fù)制三維方向(3-Dorientation)的APC(圖3)，從而產(chǎn)生能夠活化CD4+T細(xì)胞以使免疫的B細(xì)胞抗體反應(yīng)成熟的合成抗原呈遞細(xì)胞(sAPC)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括載體，其包括合成的CD4+T細(xì)胞(sTc)和合成的生發(fā)中心(sGC)。在一個實施方案中，合成的CD4+T細(xì)胞包含與CD40配體和細(xì)胞因子結(jié)合的膠態(tài)金屬載體。在另一個實施方案中，合成的生發(fā)中心包含與B淋巴細(xì)胞刺激物結(jié)合的膠態(tài)金屬載體；增加B細(xì)胞抗體對體外免疫的反應(yīng)效率和特異性的BlyS和CD30L/受體系統(tǒng)。雖然不希望受任何具體理論的限制，在一個實施方案中，抗原與B細(xì)胞生長因子的物理并列通過表面IgM抗原受體提高了人TNF抗原的攝取和誘導(dǎo)更強(qiáng)的B細(xì)胞反應(yīng)。在相同B細(xì)胞上并列這些信號進(jìn)一步提高了體外引起抗原特異性B細(xì)胞反應(yīng)的能力。
本發(fā)明包括制備合成的免疫成分元件的方法。在此教導(dǎo)了制備模擬免疫系統(tǒng)成分功能的載體組合物的方法。本發(fā)明還包括治療免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病和病理的方法。接種方法也包括在本發(fā)明中。
附圖簡述

圖1提供了免疫突觸的示意圖。
圖2提供了活化的CD4+T細(xì)胞引起的初次抗體應(yīng)答分化的示意圖。
圖3A提供了膠態(tài)金合成抗原呈遞細(xì)胞的示意圖。圖3B提供了膠態(tài)金合成T細(xì)胞的示意圖。圖3C提供了膠態(tài)金合成生發(fā)中心的示意圖。
圖4提供了單一顆粒sAPC不能形成功能性免疫突觸的示意圖。
圖5提供了產(chǎn)生多個顆粒膠態(tài)金sAPC的示意圖。
圖6提供了描繪多個細(xì)胞因子與相同膠態(tài)金顆粒結(jié)合的圖。
圖7是靶向巨噬細(xì)胞(圖7A)、樹突細(xì)胞(圖7B)和B細(xì)胞(圖7C)的EGF鏈霉抗生物素蛋白金的一系列照片。
圖8提供了對各種體外刺激起反應(yīng)的細(xì)胞的免疫反應(yīng)性的圖。
圖9A提供了膠態(tài)金顆粒自動裝配到EIA板的固體支持體上的示意圖。1＝EIA板；2＝抗人TNF的鼠Mab；3＝人TNF(藍(lán)方框)；4＝與鏈霉抗生物素蛋白TNF結(jié)合的32nm膠態(tài)金；5＝生物素化的BSA；6＝17nm鏈霉抗生物素蛋白膠態(tài)金；7＝生物素化的人IL-6；8＝綴合堿性磷酸酶的兔抗人IL-6。
圖9B提供了與IL-1或TNF結(jié)合的膠態(tài)金顆粒自動裝配到四臂PEG-硫醇主鏈的示意圖(Sun Bio，Inc.)。
圖10A提供了圖9A中顆粒產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性信號的圖。
圖10B提供了圖9B中顆粒產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性信號的圖。
圖11提供了膠態(tài)金/TNF結(jié)合裝置的示意圖。
圖12提供了離子強(qiáng)度對凍干后的膠態(tài)金TNF載體穩(wěn)定性的作用的圖。
圖13提供了在低離子強(qiáng)度溶液中TNF結(jié)合膠態(tài)金的模型的示意圖。
圖14提供了在高離子強(qiáng)度溶液中TNF結(jié)合膠態(tài)金的模型的示意圖。
發(fā)明詳述參考在此包括的下列具體實施方案的詳細(xì)說明可以更容易理解本發(fā)明。盡管已經(jīng)參考其某些實施方案的詳情描述了本發(fā)明，但并不意味應(yīng)認(rèn)為這種詳情作為本發(fā)明范圍的限制。在此提及的參考文獻(xiàn)全文以其全部內(nèi)容并入此處作為參考，包括美國臨時申請序號60/526,360。
本發(fā)明包括產(chǎn)生抗原特異性、物種特異性IgG單克隆抗體的方法和組合物。本發(fā)明包括包含復(fù)制抗原呈遞細(xì)胞(APC)、T細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)生發(fā)中心元件的天然存在和/或合成載體的方法和組合物。
本發(fā)明包括模擬免疫反應(yīng)任何元件或階段的載體。免疫反應(yīng)是由各種類型細(xì)胞識別外來抗原發(fā)起的，主要是巨噬細(xì)胞或其他抗原呈遞細(xì)胞。這引起淋巴細(xì)胞活化，尤其是特異性識別特定外來抗原的淋巴細(xì)胞，并導(dǎo)致免疫反應(yīng)發(fā)展和可能的外來抗原消除。覆蓋針對外來抗原消除的免疫反應(yīng)的是引起輔助功能、刺激物功能、抑制因子功能和其他反應(yīng)的復(fù)雜相互作用。免疫系統(tǒng)的反應(yīng)能力必須在刺激和抑制的多個部位小心地控制，否則反應(yīng)將不發(fā)生、過度反應(yīng)或在消除后不停止。
對外來抗原起反應(yīng)的識別期由外來抗原與免疫細(xì)胞上特異性受體的結(jié)合組成。這些受體通常在接觸抗原前就存在。識別還可以包括通過巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞或通過血清或體液內(nèi)因子識別進(jìn)行的與抗原的相互作用。
在活化期，淋巴細(xì)胞經(jīng)歷至少兩次重大改變。它們增殖，從而引起抗原特異性淋巴細(xì)胞克隆的擴(kuò)展和反應(yīng)的擴(kuò)大，且抗原刺激的淋巴細(xì)胞子代分化為效應(yīng)細(xì)胞或存活的、易于對再次暴露于抗原起反應(yīng)的記憶細(xì)胞。有提高這個反應(yīng)的許多擴(kuò)大機(jī)制。
在效應(yīng)期，活化的淋巴細(xì)胞執(zhí)行可以引起抗原消除或建立疫苗反應(yīng)的功能。這種功能包括細(xì)胞反應(yīng)，如調(diào)節(jié)、輔助、刺激物、抑制因子或記憶功能。許多效應(yīng)功能需要細(xì)胞和細(xì)胞因子的聯(lián)合參與。例如，抗體與外來抗原結(jié)合并通過血液嗜中性白細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞提高它們的吞噬作用。補(bǔ)體途徑被活化，并可能參與除觸發(fā)其他身體反應(yīng)如發(fā)熱之外的微生物的裂解和吞噬作用。
在對抗原的免疫反應(yīng)中，免疫細(xì)胞通過直接的細(xì)胞與細(xì)胞的接觸或間接的細(xì)胞與細(xì)胞(因子介導(dǎo)的)通訊而彼此相互作用。例如，T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和B細(xì)胞之間的相互作用是有效免疫反應(yīng)必需的?？乖蔬f細(xì)胞(APC)通過將加工的抗原和其他活化信號呈遞給B和T細(xì)胞而活化它們。活化的T細(xì)胞輔助控制免疫反應(yīng)并參與外來生物的除去。輔助T細(xì)胞引起細(xì)胞變成更好的效應(yīng)細(xì)胞，如輔助細(xì)胞毒性T細(xì)胞前體發(fā)育為殺傷細(xì)胞，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，和輔助增加其他細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞的功能?；罨腂細(xì)胞分裂并產(chǎn)生抗原特異性抗體和記憶B細(xì)胞。包含在免疫反應(yīng)中的細(xì)胞還分泌細(xì)胞的因子或細(xì)胞因子，它們提高吞噬細(xì)胞的功能、刺激炎性反應(yīng)和影響各種細(xì)胞。
這些細(xì)胞的反應(yīng)還包括反饋環(huán)。巨噬細(xì)胞和其他單核吞噬細(xì)胞，或APCs活躍吞噬抗原以呈遞給B和T細(xì)胞并且淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子可以提高這種活性。巨噬細(xì)胞還產(chǎn)生細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子除別的活性外可刺激T細(xì)胞增殖和分化，征募其他炎性細(xì)胞，特別是嗜中性白細(xì)胞，和負(fù)責(zé)很多炎癥的全身效應(yīng)，如發(fā)熱。一個這種細(xì)胞因子，稱為白細(xì)胞介素-12，對細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的發(fā)展特別重要。
樹突細(xì)胞也是APCs，其啟動免疫反應(yīng)。有許多不同類型的樹突細(xì)胞，包括皮膚的淋巴樣樹突細(xì)胞和郎格漢斯細(xì)胞。它們遍及身體，且尤其是在脾、淋巴結(jié)、扁桃體、淋巴集結(jié)和胸腺中可以發(fā)現(xiàn)它們。它們是不規(guī)則形狀的細(xì)胞，其不斷伸展和收縮樹狀(樹狀的)突起。它們在免疫系統(tǒng)中的作用之一是誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)B和T細(xì)胞活化和分化。它們是細(xì)胞毒性T細(xì)胞發(fā)育、B細(xì)胞引起的抗體形成和一些多克隆反應(yīng)如氧化性有絲分裂發(fā)生的有力輔助細(xì)胞。它們還刺激T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2。
接種疫苗的重要武器是B淋巴細(xì)胞或B細(xì)胞提供的對抗原的反應(yīng)。B細(xì)胞代表約5至15％的循環(huán)淋巴細(xì)胞。B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其可以釋放到體液、隨附著的蛋白分泌或插入B細(xì)胞的表面膜中。這種固定的免疫球蛋白充當(dāng)特異性抗原受體。在對抗原的反應(yīng)中，這些免疫球蛋白受體在B細(xì)胞上特異性部位交聯(lián)。這個過程被稱為加帽，隨后是免疫球蛋白的內(nèi)在化和降解。在APCs中，所述APCs可能包括B細(xì)胞，抗原片段與MHC結(jié)合并最終在APC表面上表達(dá)。
B漿細(xì)胞產(chǎn)生并分泌可以結(jié)合外來蛋白、多糖、脂質(zhì)或胞外或細(xì)胞結(jié)合形式的其他化學(xué)物質(zhì)的抗體分子。單個漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體對于一個抗原是特異性的。分泌的抗體結(jié)合抗原并觸發(fā)促進(jìn)它們破壞的機(jī)制。
1975年，Kohler和Milstein(Kohler，G.，和Milstein，C.，Nature(London).1975.volume 256pp-495)描述了從免疫的小鼠脾臟分離的產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與攻擊性增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合的方法。此生成的雜交細(xì)胞即雜交瘤具有兩個親本細(xì)胞的特征。在它繼續(xù)生長和增殖過程中，它產(chǎn)生并分泌大量抗體。通過一系列系統(tǒng)的細(xì)胞稀釋，可以分離產(chǎn)生單一特異性的抗體-單克隆抗體(Mab)的遺傳單一的雜交瘤細(xì)胞。
最普通程序要求單克隆抗體的產(chǎn)生從免疫動物開始。排入局部淋巴結(jié)或脾的抗原活化原初 B細(xì)胞以產(chǎn)生IgM抗體。這些活化的B細(xì)胞用抗原活化的CD4+T細(xì)胞呈遞以誘導(dǎo)類別轉(zhuǎn)換。類別轉(zhuǎn)換的特征是抗體產(chǎn)生類型由IgMs至IgGs的改變(Kuby，J.，Immunology Third Edition 1997.eds Allen D.，pp-205-213)。分泌抗體的B細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離自免疫的動物的淋巴結(jié)或脾，并與物種特異性骨髓瘤細(xì)胞融合。然后允許融合細(xì)胞生長而產(chǎn)生抗原特異性IgG抗體。在篩選過程中，根據(jù)它們的治療潛力選擇陽性融合克隆。
用外來抗原可以容易地免疫小鼠以產(chǎn)生廣譜的高親和力抗體。然而，由于外來蛋白在體內(nèi)的呈遞，將鼠抗體引入人引起人抗小鼠抗體(HAMA)的產(chǎn)生。鼠抗體在患者中的使用通常限于數(shù)天或數(shù)周。而且，一旦HAMA在患者中發(fā)展，它常常妨礙鼠抗體的其他診斷或治療目的的未來應(yīng)用。
這個技術(shù)在動物中的早期成功激勵科學(xué)家們在20世紀(jì)80年代擴(kuò)展這個觀念并試圖生產(chǎn)人單克隆抗體。然而，從動物外推到人充滿了困難。第一個障礙是抗原特異性B細(xì)胞的缺乏。標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體方法要求這些細(xì)胞從已免疫的動物收獲，這種方法通常不適用于人。由于下列事實，這個問題更加復(fù)雜，(i)沒有活化的B細(xì)胞的現(xiàn)成來源；(ii)外周血中存在的免疫活性B細(xì)胞的貧乏，和(iii)不能從人受試者獲得淋巴結(jié)或脾。這些因素激勵開發(fā)各種體外策略以產(chǎn)生人單克隆抗體。雖然最初的結(jié)果顯示了巨大的前景，但是不能完全重建體內(nèi)抗體反應(yīng)事件的順序最終引起該技術(shù)失敗，并且這個技術(shù)方法基本上已經(jīng)被棄用。
體外生產(chǎn)抗體的第一個障礙是原初人B細(xì)胞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化至活化的B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率相對低。過去，解決這項挑戰(zhàn)被證明是困難的，即使當(dāng)使用回憶抗原如破傷風(fēng)毒素(Butler等人，J.Immuol.1983.volume 130PP-165)來誘導(dǎo)人外周血B細(xì)胞淋巴細(xì)胞的初次抗體應(yīng)答時也如此。本發(fā)明包括制備活化引起抗體產(chǎn)生途徑的載體的方法。本發(fā)明還包括天然存在或合成的載體的組合物。這種載體包含結(jié)合多個B細(xì)胞配體的膠態(tài)金平臺。
已經(jīng)描述過受體/配體對交聯(lián)以加強(qiáng)生物學(xué)反應(yīng)的許多實例(Carroll，K.，Prosser，E.，和Kennedy，R.Hybridoma 1991.10229-239)。本發(fā)明包括增加對體外免疫的B細(xì)胞抗體反應(yīng)效率和特異性的膠態(tài)金屬的載體。不希望被任何特定理論限制，據(jù)信抗原與B細(xì)胞生長因子的物理并列可以提高抗原通過表面IgM抗原受體的攝取，并誘導(dǎo)更強(qiáng)的B細(xì)胞反應(yīng)。還有改善的抗原加工和呈遞。相同B細(xì)胞上并列具有這些信號提高了體外引發(fā)抗原特異性B細(xì)胞反應(yīng)的能力。
在一個實施方案中，成分特異性免疫刺激分子和/或MHC蛋白和/或抗原可以與膠態(tài)金屬平臺直接結(jié)合或可以通過結(jié)合基團(tuán)成員與膠態(tài)金屬平臺結(jié)合。這種結(jié)合基團(tuán)可以包括免疫成分上存在的或被合成地添加到其上的游離巰基或吡啶基。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括膠態(tài)金屬作為能夠與結(jié)合基團(tuán)成員結(jié)合的平臺，成分特異性免疫刺激劑或MHC蛋白或抗原與所述平臺結(jié)合以產(chǎn)生合成的APC。在可供選擇的優(yōu)選實施方案中，結(jié)合基團(tuán)是鏈霉抗生物素蛋白/生物素，且成分特異性免疫刺激劑是細(xì)胞因子。本發(fā)明的實施方案也可以包括以稍不特異的方法結(jié)合抗原、或MHC蛋白或成分特異性免疫刺激劑，其中不使用結(jié)合配偶體，如使用聚陽離子或蛋白。照此，本發(fā)明預(yù)期使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相互作用分子，如聚陽離子元件，包括但不限于聚賴氨酸、硫酸魚精蛋白、組蛋白或脫唾液酸糖蛋白。
結(jié)合對的成員包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何這種結(jié)合對，包括但不限于抗體-抗原對、酶-底物對；受體-配體對；和鏈霉抗生物素蛋白-生物素。新的結(jié)合配偶體可以是特別設(shè)計的。結(jié)合配偶體的基本要素是結(jié)合對之一與另一個結(jié)合對成員之間特異性結(jié)合，從而結(jié)合配偶體能夠特異連接。結(jié)合成員的另一個所需要素是每個成員都能夠結(jié)合或被結(jié)合到整合分子或靶向分子。
本發(fā)明的組合物包含膠態(tài)金屬、抗原和成分特異性免疫刺激劑。可選擇地，本發(fā)明的組合物包含膠態(tài)金屬、MHC蛋白、抗原和成分特異性免疫刺激劑。成分特異性免疫刺激劑可以包括可以用于治療應(yīng)用的生物活性劑，或者成分特異性免疫刺激劑可用于檢測方法。在另外的實施方案中，一個或多個成分特異性免疫刺激劑與膠態(tài)金屬混合、締合或直接或間接結(jié)合?；旌?、締合和結(jié)合包括共價和離子鍵和允許衍生的PEG或衍生的聚-1-賴氨酸、成分特異性免疫刺激劑和其他成分彼此之間和與膠態(tài)金屬顆粒之間長期或短期締合的其他更弱或更強(qiáng)締合。
在又一個實施方案中，該組合物也可以包括與膠態(tài)金屬混合、締合或結(jié)合的一個或多個靶向分子。靶向分子可以直接或間接與金屬顆粒結(jié)合。間接結(jié)合包括通過分子如聚賴氨酸或其他整合分子的結(jié)合，或與同時結(jié)合靶向分子和金屬溶膠或與金屬溶膠結(jié)合的另一個分子的分子的任何締合。
特別感興趣的是檢測劑，如可用于顯現(xiàn)或檢測螯合的膠態(tài)金屬載體的染料或放射性材料。預(yù)期熒光、化學(xué)發(fā)光、熱敏、不透明的、珠子、磁性和振動材料也可以用作與本發(fā)明組合物中膠態(tài)金屬締合或結(jié)合的可檢測劑。
體外原初人B細(xì)胞產(chǎn)生初次抗體應(yīng)答僅代表人抗體反應(yīng)體外重建的第一步。來自免疫的人B細(xì)胞的初級抗體反應(yīng)引起IgM抗體分泌。稱為抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的第二類淋巴樣細(xì)胞也使抗原內(nèi)在化。一旦被內(nèi)在化，這些細(xì)胞將蛋白抗原加工為片段，該片段然后在結(jié)合兩個主要組織相容性復(fù)合體(MHCs)之一的細(xì)胞表面上表達(dá)。這些細(xì)胞對于抗體類別轉(zhuǎn)換很重要。
在此介紹了免疫系統(tǒng)反應(yīng)的當(dāng)前學(xué)說。本發(fā)明不局限于在此描述的機(jī)制，而是可以在多個方法中起作用，不被在此描述的任何特定理論所限制。依賴于微環(huán)境，表達(dá)與II類MHC分子結(jié)合的抗原的APCs活化CD4+T細(xì)胞的兩個亞型之一。這些細(xì)胞亦稱為輔助T細(xì)胞，執(zhí)行必要的輔助功能以促進(jìn)細(xì)胞或體液(抗體)免疫反應(yīng)。TH1CD4+細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，而CD4+細(xì)胞的TH2亞型與分泌IgM的B細(xì)胞相互作用以啟動類別轉(zhuǎn)換過程。
APC活化CD4+TH2T細(xì)胞隨著被稱為免疫突觸的兩細(xì)胞半裂(bicellular cleft)形成而發(fā)生(Wulfing C，Sumen C，Sjaastad MD，Wu LC，Dustin ML，Davis MM.Nat Immunol 2002.3142-7)。免疫突觸的形成包括APC上信號傳導(dǎo)和結(jié)構(gòu)配體與T細(xì)胞上它們各自的受體的相互作用和重排以形成允許這兩個細(xì)胞之間聯(lián)系和信號傳導(dǎo)的三維(3-D)橋(圖1)。APC和T細(xì)胞之間的抗原信號傳導(dǎo)通過MHC/抗原復(fù)合體與T細(xì)胞受體復(fù)合體的結(jié)合而發(fā)生，同時免疫突觸的結(jié)構(gòu)完整性由APC上的ICAM(胞內(nèi)粘附分子)、LFA-3和CD72分別與T細(xì)胞上的LFA-1、CD2和CD5受體的相互作用來維持。免疫突觸的成功形成引起CD4+T細(xì)胞表達(dá)被稱為CD40配體的B細(xì)胞刺激分子。
免疫突觸的形成可以發(fā)信號使T細(xì)胞變成有活性或無活性的(無反應(yīng)性的)。哪個反應(yīng)被啟動取決于APC上B7分子提供給T細(xì)胞的共刺激信號強(qiáng)度。B7分子可以與T細(xì)胞上的B7受體分子CD28或CTLA4相互作用。這些B7受體在它們在T細(xì)胞表面上的密度以及它們對B7分子的親和力方面不同。CD28對B7的親和力比CTLA4更低，但是在T細(xì)胞表面上以高得多的密度存在。B7與CD28受體的結(jié)合向T細(xì)胞發(fā)送活化信號，而CTLA4結(jié)合B7誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性(Kuby，J.，Immunology Third Edition 1997.eds Allen D.，PP.213-218)。因此，免疫突觸中呈遞過多B7將確保T細(xì)胞被活化。活化的CD4+/CD40+T細(xì)胞與分泌IgM的B細(xì)胞形成突觸。T細(xì)胞上CD40配體與B細(xì)胞上CD40受體的相互作用引起分泌IgM的B細(xì)胞經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生IgGs(圖2)。
本發(fā)明包括制備能夠活化CD4+T細(xì)胞的sAPCs、以及能使免疫的B細(xì)胞或無限增殖化B細(xì)胞的抗體反應(yīng)成熟的合成CD4+T細(xì)胞(sTc)和合成生發(fā)中心(sGC)的方法。本發(fā)明的組合物包含能夠活化T細(xì)胞的膠態(tài)金屬載體和引起免疫的或無限增殖化B細(xì)胞成熟的載體。例如，載體可能具有與膠態(tài)金屬載體表面締合的負(fù)載抗原的II類主要組織相容性(MHC)蛋白、共刺激蛋白B7和結(jié)構(gòu)蛋白胞內(nèi)粘附分子(ICAM)。這個載體復(fù)制三維方向APC(圖3)并且起著能夠活化CD4+T細(xì)胞以使免疫的B細(xì)胞的抗體反應(yīng)成熟的合成抗原呈遞細(xì)胞(sAPC)的作用。sAPC的一個實施方案包括膠態(tài)金屬單個顆粒上的全部成分。sAPC的另一個實施方案包括與膠態(tài)金的單獨(dú)顆粒結(jié)合的免疫突觸的組成蛋白，其在體外自動裝配形成sAPC。
包括合成抗原呈遞細(xì)胞(sAPC)的本發(fā)明方法和組合物包含容易得到和可以“從冰箱中拉出”并用于操縱人抗體反應(yīng)的組合物。因此本發(fā)明包括疾病和免疫相關(guān)機(jī)能障礙和病理的治療方法。膠態(tài)金屬組合物對變量提供控制，該變量負(fù)責(zé)啟動、維持和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)(下調(diào)或上調(diào))，如顆粒大小、每個顆粒結(jié)合的蛋白量、蛋白在顆粒上運(yùn)動的靈活性，以及顆粒的三維裝配，確保sAPC的可重復(fù)控制。
本發(fā)明的載體組合物可用于體外生產(chǎn)單克隆抗體。這種單克隆抗體可用在多種疾病的治療方法中。本發(fā)明的載體組合物還可以用于制備改善的疫苗組合物。
在疫苗療法中，使用特別設(shè)計用來刺激人免疫系統(tǒng)細(xì)胞和體液反應(yīng)的合成免疫原的組合物。通過產(chǎn)生用于呈遞抗原和刺激特異細(xì)胞的特異性合成細(xì)胞免疫元件，能夠?qū)崿F(xiàn)更可預(yù)測和有效的疫苗反應(yīng)。
本發(fā)明包括聯(lián)合疫苗和DNA疫苗。聯(lián)合疫苗的實例是百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素及其表面的菌毛血凝素。在DNA疫苗接種中，給患者施用編碼蛋白抗原的核酸，該核酸然后被轉(zhuǎn)錄、翻譯和以一些形式表達(dá)，以產(chǎn)生對抗原的強(qiáng)烈、長期的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
通過使用佐劑可以非特異性地增強(qiáng)疫苗產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。這些是化合物或載體成分，如脂質(zhì)體、乳劑或微球體的異質(zhì)組，具有幾個不同的作用機(jī)理。本發(fā)明的方法包括使用疫苗來預(yù)防疾病和治療癌癥。
除癌癥之外，許多疾病是由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的，且本發(fā)明包括這種疾病的治療方法，其通過施用包含能夠刺激免疫系統(tǒng)及其成分的膠態(tài)金屬載體的有效量組合物來實現(xiàn)。該疾病包括克羅恩病、銀屑病、炎性腸病、成人呼吸窘迫綜合征、變態(tài)反應(yīng)、濕疹、鼻炎、蕁麻疹、過敏反應(yīng)、移植排斥(如腎臟、心臟、胰腺、肺臟、骨和肝臟移植)、風(fēng)濕性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血清陰性的脊椎關(guān)節(jié)炎疹、Sjogren氏綜合征、系統(tǒng)性硬化病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、獲得性免疫缺損綜合征、手足口病、Hashimoto氏甲狀腺炎、Graves氏病、Addison氏病、多內(nèi)分泌自身免疫病、肝炎、硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、惡性貧血、乳糜瀉、抗體介導(dǎo)的腎炎、腎小球性腎炎、Wegener氏肉芽腫病、微觀多動脈炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、天皰瘡、皰疹樣皮炎、白癜風(fēng)、多發(fā)性硬化、腦脊髓炎、Guillain-Barre綜合征、重癥肌無力、Lambert-Eaton綜合征、鞏膜、鞏膜外層、葡萄膜炎、慢性粘膜皮膚念珠菌病、Bruton氏綜合征、嬰兒期一過性低丙種球蛋白血癥、骨髓瘤、X連鎖高IgM綜合征、Wiskott-Aldrich氏綜合征、共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、自身免疫性嗜中性白細(xì)胞減少癥、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、淀粉樣變性、慢性淋巴細(xì)胞性白血病或非何杰金氏淋巴瘤。
本方法通過靶向用于活化的特殊免疫成分來增強(qiáng)疫苗有效性。使用包含與膠態(tài)金屬和抗原締合的成分特異性免疫刺激劑的組合物。疫苗當(dāng)前可得的疾病實例包括但不限于霍亂、白喉、嗜血桿菌屬、甲型肝炎、乙型肝炎、流行性感冒、麻疹、腦膜炎、流行性腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌性肺炎、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、風(fēng)疹、破傷風(fēng)、結(jié)核、傷寒、水痘-帶狀皰疹、百日咳和黃熱病。
施用途徑和用于將抗原遞送至免疫系統(tǒng)的載體組合是設(shè)計所需免疫反應(yīng)中的有效工具。本發(fā)明包括方法和組合物，其包含各種載體或與遞送試劑締合的載體，所述遞送試劑如可以提供長期釋放免疫刺激性載體組合物的脂質(zhì)體、微膠囊或微球體。這些遞送系統(tǒng)作用就象容納載體和向免疫系統(tǒng)緩慢釋放它的內(nèi)部貯庫。例如，脂質(zhì)體可以充滿包含載體的組合物，所述載體包含與膠態(tài)金屬締合的抗原和成分特異性免疫刺激劑。
抗原/成分特異性免疫刺激劑/金屬復(fù)合物緩慢從脂質(zhì)體釋放并被免疫系統(tǒng)識別為外來的，和成分特異性免疫刺激劑所針對的特殊成分活化免疫系統(tǒng)。成分特異性免疫刺激劑的存在更迅速活化免疫反應(yīng)級聯(lián)，且免疫反應(yīng)更迅速和更特異地產(chǎn)生。
本發(fā)明中預(yù)期的其他方法和組合物包括使用抗原/成分特異性免疫刺激劑/膠態(tài)金屬復(fù)合物，其中膠態(tài)金屬顆粒具有不同的大小。成分特異性免疫刺激劑的順序施用可以通過使用這些不同大小的膠態(tài)金屬顆粒以一劑施用來完成。一劑將包括與抗原復(fù)合的四個獨(dú)立的成分特異性免疫刺激劑，且每個都具有不同大小的膠態(tài)金屬顆粒。因此，同時施用將提供免疫成分的順序活化以產(chǎn)生更有效疫苗和對群體的更大保護(hù)。順序活化的這種單劑施用的其他類型可以通過不同大小膠態(tài)金屬顆粒和脂質(zhì)體組合或充滿不同大小膠態(tài)金屬顆粒的脂質(zhì)體來提供。
如上所述的這種疫苗接種系統(tǒng)的使用在提供可以以一劑施用的疫苗中很重要。一劑施用在治療動物群體如家畜或野生動物群體中很重要。一劑施用在治療保健不力的群體如窮人、無家可歸的、鄉(xiāng)村居民或沒有充分保健的發(fā)展中國家的人中很重要。在所有國家中，很多人無法使用預(yù)防型保健，如接種疫苗。傳染病，如結(jié)核的重現(xiàn)增加了對可以一次給予并仍提供持久有效保護(hù)的疫苗的需要。本發(fā)明的組合物和方法提供了這種有效保護(hù)。
在此使用的術(shù)語“膠態(tài)金屬”包括任何不溶于水的金屬顆?；蚪饘倩衔镆约胺墙饘賮碓吹哪z體，如分散在液體或水中的膠態(tài)炭(水溶膠)?？捎糜诒景l(fā)明的膠態(tài)金屬實例包括但不限于周期表IIA、IB、IIB和IIIB族的金屬，以及過渡金屬，特別是VIII族金屬。優(yōu)選金屬包括金、銀、鋁、釕、鋅、鐵、鎳和鈣。其他合適的金屬還可以包括下列所有它們的各種氧化態(tài)鋰、鈉、鎂、鉀、鈧、鈦、釩、鉻、錳、鈷、銅、鎵、鍶、鈮、鉬、鈀、銦、錫、鎢、錸、鉑和釓。優(yōu)選金屬以離子形成(優(yōu)選來源于合適的金屬化合物)提供，例如Al3+、Ru3+、Zn2+、Fe3+、Ni2+和Ca2+離子。優(yōu)選的金屬是銀，特別是在硼酸鈉緩沖液中，其具有大約0.1％至0.001％的濃度，和最優(yōu)選大約0.01％溶液。另一個優(yōu)選金屬是金，特別是Au3+形式。特別優(yōu)選形式的膠態(tài)金是HAuCl4(OmniCorp，South Plainfield，NJ)。這種膠態(tài)銀溶液的顏色是黃色的，且膠體顆粒可以是1至100納米。這種金屬離子可以單獨(dú)或以與其他無機(jī)離子的復(fù)合體存在。
本發(fā)明中可以使用任何抗原。本發(fā)明中有用的抗原實例包括但不限于白細(xì)胞介素-1(“IL-1”)、白細(xì)胞介素-2(“IL-2”)、白細(xì)胞介素-3(“IL-3”)、白細(xì)胞介素-4(“IL-4”)、白細(xì)胞介素-5(“IL-5”)、白細(xì)胞介素-6(“IL-6”)、白細(xì)胞介素-7(“IL-7”)、白細(xì)胞介素-8(“IL-8”)、白細(xì)胞介素-10(“IL-10”)、白細(xì)胞介素-11(“IL-11”)、白細(xì)胞介素-12(“IL-12”)、白細(xì)胞介素-13(“IL-13”)、脂質(zhì)A、磷脂酶A2、內(nèi)毒素、葡萄球菌腸毒素B、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素和其他毒素、I型干擾素、II型干擾素、腫瘤壞死因子(TNF-α或b)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(“TGF-β”)、淋巴毒素、移動抑制因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“CSF”)單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF、粒細(xì)胞CSF、血管上皮生長因子(“VEGF”)、血管生成素、轉(zhuǎn)化生長因子(“TGF-α”)、熱激蛋白、表皮生長因子(“EGF”)、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纖維細(xì)胞生長因子和其他炎性和免疫調(diào)節(jié)蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有義、反義、癌細(xì)胞特異性抗原；如MART、MAGE、BAGE、和熱激蛋白(HSPs)；突變體p53；酪氨酸酶；粘蛋白，如Muc-1、PSA、TSH、自身免疫抗原；免疫治療藥如AZT；和血管生成和抗血管生成藥如血管抑素(angiostatin)、內(nèi)皮抑素(endostatin)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和前列腺特異性抗原和促甲狀腺素。
成分特異性免疫刺激劑可以是作用于免疫系統(tǒng)任何分子或化合物，例如增加APC刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力的任何分子。成分特異性免疫刺激劑的實例包括但不限于抗原、膠態(tài)金屬、佐劑、受體分子、核酸、免疫原性蛋白和輔助細(xì)胞因子/免疫刺激劑、藥物、化療劑和載體。
本發(fā)明中可以使用任何類型的藥劑。例如，抗炎藥如類固醇和非類固醇抗炎藥、可溶受體、抗生素、止痛劑、COX-2抑制劑。特別感興趣的化療劑包括下列非限制性實例，紫杉醇、紫杉醇、紫杉烷(taxanes)、長春滅瘟堿、長春新堿、阿霉素、無環(huán)鳥苷、順鉑、氨甲蝶呤、光輝霉素和他克林。
這些成分特異性免疫刺激劑可以單獨(dú)或聯(lián)合使用。它們可以以游離狀態(tài)或以復(fù)合物使用，如與膠態(tài)金屬組合。
本發(fā)明中有用的成分特異性免疫刺激劑實例包括但不限于白細(xì)胞介素-1(“IL-1”)、白細(xì)胞介素-2(“IL-2”)、白細(xì)胞介素-3(“IL-3”)、白細(xì)胞介素-4(“IL-4”)、白細(xì)胞介素-5(“IL-5”)、白細(xì)胞介素-6(“IL-6”)、白細(xì)胞介素-7(“IL-7”)、白細(xì)胞介素-8(“IL-8”)、白細(xì)胞介素-10(“IL-10”)、白細(xì)胞介素-11(“IL-11”)、白細(xì)胞介素-12(“IL-12”)、白細(xì)胞介素-13(“IL-13”)、脂質(zhì)A、磷脂酶A2、內(nèi)毒素、葡萄球菌腸毒素B和其他毒素、I型干擾素、II型干擾素、腫瘤壞死因子(“TNF-α”)、Flt-3配體、轉(zhuǎn)化生長因子-β(“TGF-β”)淋巴毒素、移動抑制因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“CSF”)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF、粒細(xì)胞CSF、血管上皮生長因子(“VEGF”)、血管生成素、轉(zhuǎn)化生長因子(“TGF-α”)、熱激蛋白、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纖維細(xì)胞生長因子和其他炎性和免疫調(diào)節(jié)蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有義、反義、癌細(xì)胞特異性抗原；如MART、MAGE、BAGE、和熱激蛋白(HSPs)；突變體p53；酪氨酸酶；自身免疫抗原；免疫治療藥，如AZT；和血管生成和抗血管生成藥，如血管抑素、內(nèi)皮抑素、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和前列腺特異性抗原和促甲狀腺激素。
對本發(fā)明有用的佐劑包括但不限于熱殺死的丁酸分枝桿菌(M.Butyricum)和結(jié)核分枝桿菌(M.Tuberculosis)。核苷酸的非限制性實例是DNA、RNA、mRNA、有義和反義。免疫原性蛋白的實例包括但不限于KLH(Keyhole Limpet Cyanin)、甲狀腺球蛋白和含有佐劑和在基因中編碼的抗原部分的融合蛋白。
成分特異性免疫刺激劑可以使用已知的基因療法以它們的核酸形式遞送，且在翻譯后產(chǎn)生它們的作用?；罨庖叱煞秩缈乖牧硗庠梢酝瑫r或順序遞送，從而使得細(xì)胞翻譯的成分特異性免疫刺激劑和外部添加的元件協(xié)同工作以特異性靶向免疫反應(yīng)。
特別優(yōu)選的實施方案提供了使用包含試劑的載體組合物活化免疫反應(yīng)的方法，該試劑包含與成分特異性免疫刺激劑結(jié)合的特異性抗原。這種方法有效并可以在體外或體內(nèi)使用。在此使用的成分特異性免疫刺激劑意思指對于免疫系統(tǒng)的成分如B或T細(xì)胞是特異性的，而且能夠影響所述成分，從而使得該成分在免疫反應(yīng)中具有活性的試劑。成分特異性免疫刺激劑可能能夠影響免疫系統(tǒng)的幾個不同成分，且這種能力可以用于本發(fā)明的方法和組合物中。該試劑可以是天然存在的或可以通過分子生物學(xué)技術(shù)或蛋白受體操作來產(chǎn)生或修飾。
免疫反應(yīng)中成分的活化可以引起免疫反應(yīng)其他成分的刺激或抑制，從而導(dǎo)致免疫反應(yīng)的全面刺激或抑制。為便于表達(dá)，在此描述了免疫成分的刺激，但是應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語刺激預(yù)期了所有免疫成分的反應(yīng)，包括但不限于刺激、抑制、排斥和反饋活性。
受影響的免疫成分可以具有多種活性，從而引起抑制和刺激或反饋機(jī)制的啟動或抑制。本發(fā)明不限于在此詳述的免疫反應(yīng)實例，而是預(yù)期免疫系統(tǒng)所有方面的成分特異性作用。
免疫系統(tǒng)每個成分的活化可以是同時的、順序的或其任何組合。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，多個成分特異性免疫刺激劑同時施用。在這個方法中，用多個分開的制劑同時刺激免疫系統(tǒng)，每個制劑包含含有成分特異性免疫刺激劑的載體組合物。優(yōu)選，該載體組合物包含與膠態(tài)金屬締合的成分特異性免疫刺激劑。更優(yōu)選，該組合物包含與同一大小顆?；虿煌笮☆w粒的膠態(tài)金屬和抗原締合的成分特異性免疫刺激劑。最優(yōu)選，該組合物包含與同一大小顆粒或不同大小顆粒的膠態(tài)金屬、抗原和PEG或PEG衍生物(優(yōu)選硫醇-PEG(PEG(SH)n))或衍生聚-1-賴氨酸(優(yōu)選聚-1-賴氨酸硫醇(PLL(SH)n)))締合的成分特異性免疫刺激劑。
成分特異性免疫刺激劑為單個免疫成分提供特異性刺激的上調(diào)的影響。例如，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)特異性刺激巨噬細(xì)胞，而TNF-α(腫瘤壞死因子α)和Flt-3配體特異性刺激樹突細(xì)胞。熱殺死的丁酸分枝桿菌和白細(xì)胞介素-6(IL-6)是B細(xì)胞的特異性刺激物，且白細(xì)胞介素-2(IL-2)是T細(xì)胞的特異性刺激物。包含這種成分特異性免疫刺激劑的載體組合物分別提供巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞的特異性活化。例如，當(dāng)施用包含成分特異性免疫刺激劑IL-1β的載體組合物時，巨噬細(xì)胞被活化。優(yōu)選組合物是與膠態(tài)金屬締合的IL-1β，且最優(yōu)選組合物是與膠態(tài)金屬和抗原締合的IL-1β，以為所述抗原提供特異性巨噬細(xì)胞反應(yīng)。載體組合物可以進(jìn)一步包含靶向分子、整合分子、PEGs或衍生的PEGs。
免疫反應(yīng)的許多元件可能是對抗原的有效免疫反應(yīng)必需的。同時刺激的方法的實施方案是施用四個分開的成分特異性免疫刺激劑的組合物制劑，所述成分特異性免疫刺激劑包含1)用于巨噬細(xì)胞的IL-1β，2)用于樹突細(xì)胞的TNF-α和Flt-3配體，3)用于B細(xì)胞的IL-6和4)用于T細(xì)胞的IL-2。每個成分特異性免疫刺激劑載體組合物可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何途徑施用，并且可以使用相同途徑或不同途徑，這取決于期望的免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明方法和組合物的另一個實施方案中，單個免疫成分順序活化。例如，這個順序活化被分為兩個階段，致敏階段(primer phase)和免疫階段。該致敏階段包括刺激APCs，優(yōu)選巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，而免疫階段包括刺激淋巴細(xì)胞，優(yōu)選B細(xì)胞和T細(xì)胞。在兩個階段的每一個內(nèi)，單個免疫成分的活化可以是同時的或順序的。對于順序活化，優(yōu)選活化方法是施用引起巨噬細(xì)胞，隨后是樹突細(xì)胞，繼之以B細(xì)胞，之后是T細(xì)胞活化的載體組合物。最優(yōu)選方法是聯(lián)合順序活化，包括施用引起巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞同時活化，隨后是B細(xì)胞和T細(xì)胞同時活化的載體組合物。這是啟動免疫系統(tǒng)幾個途徑的多個成分特異性免疫刺激劑的方法和組合物的實例。
試劑與金屬溶膠結(jié)合的一個方法包括下列步驟，盡管僅僅為了清楚目的，公開的方法提及單一試劑TNF與金屬溶膠膠態(tài)金的結(jié)合。使用允許膠態(tài)金溶膠中的顆粒和蛋白溶液中TNF之間相互作用的裝置。該裝置的示意圖在圖11顯示。這個裝置通過將混合室減至小體積，使未結(jié)合的膠態(tài)金顆粒與待結(jié)合的蛋白TNF的相互作用最大化。這個裝置使大體積金溶膠與大體積TNF的相互作用能夠在小體積T形連接器中發(fā)生。相反，向大體積膠態(tài)金顆粒添加小體積蛋白不是確保蛋白與金顆粒均一結(jié)合的優(yōu)選方法。向大體積蛋白添加小體積膠態(tài)金的相反方法也不是。實際上，膠態(tài)金顆粒和蛋白TNF通過從兩個大儲庫抽出膠態(tài)金顆粒和TNF蛋白的單個蠕動泵被施加到T形連接器中。為進(jìn)一步確保適當(dāng)?shù)幕旌?，一字排列式混合器就位于T形連接器的下游?；旌掀饔辛Φ鼗旌夏z態(tài)金顆粒和TNF，兩者都以大約1L/分鐘的優(yōu)選流速通過連接器流動。
在與試劑混合前，使用1N NaOH將金溶膠的pH調(diào)至pH 8-9。調(diào)節(jié)金溶膠pH的優(yōu)選方法使用100mM TRIS，以調(diào)節(jié)膠態(tài)金溶膠pH至pH 6。重構(gòu)高度純化凍干的重組人TNF。稀釋TNF的優(yōu)選方法是在用100mM TRIS調(diào)至pH 6的水中。在將溶膠或TNF添加至它們各自的儲庫之前，用夾關(guān)閉連接容器和T形連接器的管。將等體積膠態(tài)金溶膠和TNF溶液添加到合適儲庫中。溶液中活化劑的優(yōu)選濃度為約0.01至15μg/ml，并可以根據(jù)試劑與金屬溶膠顆粒的期望比率而改變。溶液中TNF的優(yōu)選濃度為0.5至4μg/ml，且對于TNF-膠態(tài)金組合物的最優(yōu)選TNF濃度是0.5μg/ml。
一旦將溶液適當(dāng)加載到它們各自的儲庫，則打開蠕動泵，將試劑溶液和膠態(tài)金溶液抽取到T形連接器中，通過一字排列式混合器，通過蠕動泵和進(jìn)入收集瓶。在收集瓶中攪拌混合溶液以溫育另外一小時。
在包含PEG(無論衍生與否)的組合物中，制備這種組合物的方法包括下列步驟，盡管僅僅為了清楚目的，公開的方法提及將PEG硫醇添加至金屬溶膠組合物中。可以使用下列步驟制備任何PEG、衍生的PEG組合物或任何大小的PEG組合物或包含幾個不同PEGs的組合物。15分鐘溫育后，將硫醇衍生的聚乙二醇(PEG)溶液添加至膠態(tài)金/TNF溶膠。本發(fā)明預(yù)期使用具有任何衍生基團(tuán)的任何大小的PEG，盡管優(yōu)選的衍生的PEGs包括mPEG-OPSS/2,000、mPEG-OPSS/5,000、mPEG-OPSS/10,000、mPEG-OPSS/12,000、mPEG-OPSS/20,000、mPEG-OP(SS)2/2,000、mPEG-OP(SS)2/3,400；mPEG-OP(SS)2/8,000、mPEG-OP(SS)2/10,000、硫醇-PEG-硫醇/2,000、mPEG-硫醇5,000和mPEG-硫醇10,000、mPEG-硫醇12,000、mPEG-硫醇20,000(Sun-BIO Inc.)。優(yōu)選的PEG是mPEG-硫醇5000，其在水中濃度為150μg/ml，pH 5-8。因此，將10％v/v的PEG溶液添至膠態(tài)金-TNF溶液中。將金/TNF/PEG溶液溫育另外15分鐘。
在優(yōu)選方法中，TNF和PEG-硫醇部分同時與膠態(tài)金納米顆粒(nanoparticle)結(jié)合。在這個方法中，使用100mM TRIS堿將膠態(tài)金納米顆粒pH調(diào)至6.0。類似地，使用100mM TRIS溶液將水的pH調(diào)至6.0。TNF和PEG-硫醇(20,000)分別在后一溶液中稀釋至5和15μg/ml的終濃度。膠態(tài)金納米顆粒和TNF/PEG-硫醇溶液都加載到它們各自的儲庫并通過T形連接器和一字排列式混合器結(jié)合，其中使用蠕動泵通過T形連接器抽取每種溶液。結(jié)合15分鐘后，將人血清清蛋白(在水中為200μg/ml)添加至膠態(tài)金/TNF/PEG-硫醇溶液并溫育另外15分鐘。
使膠態(tài)金/TNF/PEG溶液順序超濾通過50-100K MWCO滲濾柱體。用ELISA測量50-100K保留物和滲透物的TNF濃度，以確定與金顆粒結(jié)合的TNF量。
滲濾后，添加冷凍保護(hù)劑如甘露糖醇20mg/ml；和/或人血清清蛋白5mg/ml的組合物并將樣品在-80℃冷凍。將樣品凍干至干燥并在真空下密封，隨后重構(gòu)和分析重構(gòu)的樣品中存在的游離和與膠態(tài)金結(jié)合的TNF的量。
本發(fā)明的組合物可施用于體外和體內(nèi)系統(tǒng)。體內(nèi)施用可以包括直接應(yīng)用于靶細(xì)胞或這種施用途徑，包括但不限于適于經(jīng)口、直腸、經(jīng)皮、眼(包括玻璃體內(nèi)或intracameral)、鼻、局部(包括口腔和舌下)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、氣管內(nèi)和硬膜外)施用的制劑。優(yōu)選方法包括經(jīng)口或注射途徑施用本發(fā)明有效量的包含載體的組合物。
該制劑可以方便地存在于單位劑型中并可以用傳統(tǒng)制藥技術(shù)制備。通過使金屬溶膠載體和藥物載體或賦形劑締合而制備藥物制劑組合物。通常，制劑的制備方法是組合物與液體載體或細(xì)碎的固體載體或兩者均勻和密切締合，然后，如果需要，使產(chǎn)品成形。
通過下列實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，不應(yīng)將實施例解釋為以任何方式強(qiáng)加于其范圍的限制。相反，應(yīng)明確地認(rèn)識到，可以求助于各種其他實施方案、改動和其等同方案，在閱讀這里的說明書之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到這些實施方案、改動和其等同方案的提示，但不背離本發(fā)明精神和/或所附權(quán)利要求的范圍。
實施例實施例1膠態(tài)金的制備使用Frens和Horisberger描述的反應(yīng)制備膠態(tài)金溶膠(Frens，G.Nature Phys.Sci.1972，241，20-22，和Horsiberger，M.Biol.Cellulaire.1979.36253-258)。在這個反應(yīng)中，通過添加檸檬酸鈉使HAuCl4形式的離子金還原成Au0納米顆粒。一般，將2.5ml 4％氯金酸(水中)溶液添至1L去離子水中。有力攪拌溶液并加熱至滾沸。通過添加1％檸檬酸鈉溶液啟動還原反應(yīng)。顆粒大小受添加至反應(yīng)的檸檬酸鹽量的控制。例如通過分別添加40、15和7.5ml檸檬酸鹽溶液形成17、32和64nm顆粒。添加檸檬酸鹽后，允許溶液沸騰和混合另外45分鐘。冷卻后，使溶膠通過0.22μm滅菌過濾器過濾并在室溫下貯藏直到使用。
膠態(tài)金溶膠的生產(chǎn)已從1.0L按比例增大到10L。使用UV-VIS波長掃描、動態(tài)光散射和差速離心技術(shù)檢查這些顆粒的平均粒度和均一性。制備的顆粒具有在它們預(yù)測大小10％以內(nèi)常規(guī)測量的平均粒度并顯示出1.03-1.12或更低的多分散性測量值。
實施例2增加免疫活性B細(xì)胞的數(shù)目為了增加用于免疫的免疫活性B細(xì)胞的數(shù)目，從全血或棕黃層單元分離II類MHC限制的表面IgM+/sIgD+人B細(xì)胞。包被了抗IgM、抗IgD和抗CD19抗體的磁珠分離B細(xì)胞群。用細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-7處理sIgM+/sIgD-不成熟B細(xì)胞，以募集另外的B細(xì)胞(Sudo，T.，Ito，M.，Ogawa，Y.，Iizuka，M.，Kodoma，H.，Kunisasa，T.，Hayashi，S.C.，Ogawa，M.，Sakai，K.，Nishikawa，S.，Nishkawa，S.C.J.Exp.Med.1989.170333-338)。已表明這種處理使這些B細(xì)胞成熟，如通過sIgM+/sIgD-B細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換為sIgM+/sIgD+B細(xì)胞顯示的。使用FACS分離法純化這些分離的細(xì)胞至接近均一性。
TNF與載體如KLH或甲狀腺球蛋白(參見下面的討論)綴合提高人TNF的抗原性。TNF:KLH抗原與含有B細(xì)胞靶向/活化劑如白細(xì)胞介素-6(IL-6)的膠態(tài)金顆粒表面結(jié)合。IL-6是已知刺激抗體從免疫的B細(xì)胞合成的細(xì)胞因子。在相同金顆粒上具有兩個部分確保了B細(xì)胞接受KLH:TNF抗原信號以及IL-6信號以活化抗體反應(yīng)。
實施例3初次抗體應(yīng)答的鑒別對治療抗體的生產(chǎn)關(guān)鍵的是類別轉(zhuǎn)換過程。來自免疫的人B細(xì)胞的初次抗體應(yīng)答引起IgM抗體分泌。稱為抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的第二類淋巴樣細(xì)胞也使抗原內(nèi)在化。一旦被內(nèi)在化，這些細(xì)胞就將蛋白抗原加工為片段，該片段在結(jié)合兩個主要組織相容性復(fù)合體(MHCs)之一的細(xì)胞表面上表達(dá)。
依賴于微環(huán)境，表達(dá)與II類MHC分子結(jié)合的抗原的APCs活化CD4+T細(xì)胞的兩個亞型之一。這些細(xì)胞亦稱輔助T細(xì)胞，執(zhí)行必要的輔助功能以促進(jìn)細(xì)胞或體液(抗體)免疫反應(yīng)。TH1CD4+細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，而CD4+細(xì)胞的TH2亞型與分泌IgM的B細(xì)胞相互作用以啟動類別轉(zhuǎn)換過程。
APC活化CD4+TH2T細(xì)胞隨著被稱為免疫突觸的兩細(xì)胞半裂形成而發(fā)生。免疫突觸的形成包括APC上信號傳導(dǎo)和結(jié)構(gòu)配體與T細(xì)胞上它們各自受體的相互作用和重排以形成允許這兩個細(xì)胞之間聯(lián)系和信號傳導(dǎo)的三維(3-D)橋(圖1)。APC和T細(xì)胞之間的抗原信號傳導(dǎo)通過MHC/抗原復(fù)合體與T細(xì)胞受體復(fù)合體的結(jié)合而發(fā)生，同時免疫突觸的結(jié)構(gòu)完整性由APC上的ICAM、LFA-3和CD72分別與T細(xì)胞上的LFA-1、CD2和CD5受體的相互作用來維持。免疫突觸的成功形成引起CD4+T細(xì)胞表達(dá)被稱為CD40配體的B細(xì)胞刺激分子。
免疫突觸的形成可以發(fā)信號使T細(xì)胞變成有活性或無活性的(無反應(yīng)性的)。哪個反應(yīng)被啟動取決于APC上B7分子提供給T細(xì)胞的共刺激信號強(qiáng)度。B7分子可以與T細(xì)胞上的B7受體分子CD28或CTLA4相互作用。這些B7受體在它們在T細(xì)胞表面上的密度以及它們對B7分子的親和力方面不同。CD28對B7的親和力比CTLA4更低，但是在T細(xì)胞表面上以高得多的密度存在。B7與CD28受體的結(jié)合向T細(xì)胞發(fā)送活化信號，而CTLA4結(jié)合B7誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性(Kuby，J.，Immunology Third Edition 1997.eds Allen D.，pp-213-218)。因此，免疫突觸中呈遞過多B7將確保T細(xì)胞被活化。
在這個過程中，免疫的人B細(xì)胞經(jīng)歷免疫球蛋白基因重排，以產(chǎn)生高度特異性的高親和力IgG抗體。
這個載體最初從MHC、B7和ICAM蛋白在膠體金顆粒表面上裝配。免疫突觸的呈遞是三維方向的，以允許這個載體成功觸發(fā)CD4+T-細(xì)胞以以MHC限制性方式表達(dá)CD40配體。
還任選使用表達(dá)CD40配體的sTc，聯(lián)合各種細(xì)胞因子和其多個分子對治療性mAb發(fā)出關(guān)鍵親和力成熟信號的合成生發(fā)中心來啟動這個過程。
實施例4具有間隔臂的sAPC/sTc/sGC的產(chǎn)生這個sAPC建立在用于結(jié)合生物素化形式的MHC、B7和ICAM蛋白的鏈霉抗生物素蛋白膠態(tài)金顆粒上。這個單個顆粒sAPC具有更大的柔性，因為組成蛋白通過形成生物素-抗生物素蛋白橋的生物素化間隔臂與膠態(tài)金顆粒間接結(jié)合。類似地，可以使用與它們各個成分與膠態(tài)金屬系鏈的類似策略產(chǎn)生sTc和sGCs。
實施例5自動裝配的APCs/sTcs/sGCs開發(fā)了自動裝配的合成APCs。每個APC蛋白與不同膠態(tài)金顆粒結(jié)合產(chǎn)生免疫突觸蛋白的復(fù)雜基質(zhì)。為指導(dǎo)這個sAPC裝配，制備定點(diǎn)分子支架以更好三維定向各種顆粒。圖5所示的是這個自動裝配的sAPC的表示。每個顆粒亞單位制劑允許單個顆粒結(jié)合多個試劑。為了闡明的目的，II類MHC分子與還結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白的32nm膠態(tài)金顆粒結(jié)合。sAPC剩余的兩個亞單位B7和ICAM與17nm顆粒結(jié)合。如同MHC顆粒，ICAM亞單位含有鏈霉抗生物素蛋白-?？课稽c(diǎn)。為了裝配這個顆粒，使用生物素化人血清清蛋白將ICAM和MHC顆粒連接在一起。為完成載體的裝配，使用二硫醇化的聚乙二醇將MHC和B7顆粒連接在一起。
在這個模型中，免疫突觸的形成通過T細(xì)胞受體/膜重排而發(fā)生。這個載體也可以與固體支持體臺如EIA板結(jié)合。這個支架允許兩個膠態(tài)金靶向的抗原和sAPCs存在于相同基質(zhì)中。結(jié)果，原初B細(xì)胞免疫后，sAPC可以活化CD4細(xì)胞以表達(dá)CD40配體并因而誘導(dǎo)類別轉(zhuǎn)換。
通過改變與CD40L/細(xì)胞因子或BLYS/CD30L的結(jié)合配偶體，產(chǎn)生了自動裝配的合成T細(xì)胞或合成生發(fā)中心。
實施例6蛋白與膠態(tài)金顆粒的結(jié)合蛋白與膠態(tài)金顆粒的結(jié)合受到膠態(tài)金溶膠和蛋白溶液pH的影響。在最適pH下，蛋白與膠態(tài)金顆粒表面結(jié)合并防止它們被鹽沉淀。通過溶膠顏色從紅色變?yōu)楹谏菀椎刈C明了膠態(tài)金的鹽誘導(dǎo)沉淀作用。測定描述的每個蛋白的pH結(jié)合最適值，所述蛋白包括MHC、B7、ICAM、IL-6和KLH:TNF抗原。例如，如下所述步驟概述了MHC分子與膠態(tài)金顆粒結(jié)合的方法。類似步驟將用于確定每個其他蛋白的結(jié)合條件。
通過用1N NaOH將1ml等分試樣的膠態(tài)金的pH從4調(diào)至11測定MHC與膠態(tài)金結(jié)合的pH結(jié)合最適值。將100μl等分試樣的每種金溶液置于微量離心管并與1ng MHC蛋白溫育30分鐘。然后向每管添加100μl 10％NaCl溶液。pH結(jié)合最適值定義為允許MHC蛋白與膠態(tài)金顆粒結(jié)合，同時防止鹽誘導(dǎo)的沉淀作用的pH。
除確定pH結(jié)合最適值之外，對每個蛋白進(jìn)行飽和結(jié)合分析。對于這個試驗，膠態(tài)金顆粒pH將被如上所述調(diào)至pH結(jié)合最適值。隨后向100μl等分試樣的膠態(tài)金中添加遞增量的(0.025-5ng蛋白)MHC蛋白。結(jié)合30分鐘后，將各個等分試樣以10,000rpms離心以與結(jié)合膠態(tài)金的蛋白分開。分析上清液和膠態(tài)金沉淀中每個級分中存在的MHC蛋白相對量。
實施例7
結(jié)合的MHC蛋白的質(zhì)量的定量為了定量與每個金顆粒結(jié)合的MHC蛋白的質(zhì)量，開發(fā)定量EIAs進(jìn)行MHC和B7蛋白的測量。ICAM的EIAs已經(jīng)可從市場上買到。通過開發(fā)每個蛋白的競爭性結(jié)合的EIA來定量測量MHC和B7蛋白。使用pH 9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將市場上可買到的B7和MHC蛋白的抗體(兩個抗體都可從Research Diagnostics，Inc.得到)包被在EIA板上。產(chǎn)生MHC和B7參考標(biāo)準(zhǔn)物，以提供1.56ng/ml至500ng/ml的劑量范圍。將這些標(biāo)準(zhǔn)物添加至含有MHC或B7蛋白的特異性抗體的EIA板。將結(jié)合膠態(tài)金的樣品添加至EIA板中的其他指定孔中。
各種蛋白的濃度通過建立樣品中存在的蛋白或標(biāo)準(zhǔn)物和生物素化形式分子對抗體位點(diǎn)的競爭性結(jié)合反應(yīng)來測定。用鏈霉抗生物素蛋白堿性磷酸酶檢測生物素化配體。添加底物后，樣品中存在的分析物的質(zhì)量和顯色的顏色量之間產(chǎn)生相反的關(guān)系。
實施例8多個蛋白與相同顆粒的結(jié)合為了增加體外免疫的效率和特異性，需要多個化學(xué)性質(zhì)不同的蛋白結(jié)合到單個膠態(tài)金顆粒表面上。證明了三個不同蛋白細(xì)胞因子(IL-1、IL-6和TNF)與相同膠態(tài)金顆粒的結(jié)合。每個細(xì)胞因子在特殊的pH下與膠態(tài)金結(jié)合。
如上面所證明的，分別確定了IL-1在6至8的pH下結(jié)合膠態(tài)金，而IL-6在8至11的pH下結(jié)合。將在水中含0.25ng/ml三種細(xì)胞因子的溶液與膠態(tài)金溶膠在pH 8下混合。取出樣品并將剩余溶液pH調(diào)至11。每個pH改變前，收集另外的樣品。將兩個樣品離心，且將生成的膠態(tài)金沉淀重懸于PBS中。
為證明相同金顆粒上存在全部三種細(xì)胞因子，向包被了TNF的單克隆抗體的EIA板添加各種沉淀。結(jié)合后，洗滌板，并使指定孔與綴合堿性磷酸酶的兔抗IL-1、IL-6或TNF溫育。洗滌后，向每孔添加底物以啟動顯色。圖6中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明由于pH結(jié)合最適值重疊，pH 8時，IL-1和TNF都存在于顆粒上。然而，極少的IL-6信號可以被檢測到。增加pH到11允許IL-6結(jié)合這些顆粒。
實施例9嵌合載體靶向特異細(xì)胞使EGF和鏈霉抗生物素蛋白與相同32nm膠態(tài)金顆粒結(jié)合。樣品被分成三個等分試樣以進(jìn)行第二/靶向分子的結(jié)合。一個樣品與生物素化IL-1結(jié)合，另一個與生物素化GM-CSF結(jié)合，且第三個與生物素化IL-6結(jié)合。結(jié)合生物素化配體后，將樣品離心以除去任何游離試劑，并將膠態(tài)金沉淀添加至Ficoll分離的人白細(xì)胞。培養(yǎng)8天后，用數(shù)字?jǐn)z影術(shù)證明各種膠態(tài)金載體的攝取。
通過使用生物素化IL-1、生物素化GM-CSF或生物素化IL-6進(jìn)行靶向，使EGF鏈霉抗生物素蛋白金靶向巨噬細(xì)胞(圖7A)、樹突細(xì)胞(圖7B)和B細(xì)胞(圖7C)。每個圖中的黑色染色(用紅色箭標(biāo)突出顯示)代表各種膠態(tài)金載體的攝取。
如在圖7中可以看到的，各種膠態(tài)金/細(xì)胞因子嵌合體不同地靶向免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞元件。黑色染色(用箭標(biāo)突出顯示)代表膠態(tài)金顆粒，其已被各種免疫細(xì)胞內(nèi)在化和聚集。這些數(shù)據(jù)表明IL-1將膠態(tài)金EGF靶向巨噬細(xì)胞，而GM-CSF將嵌合體靶向樹突細(xì)胞，且IL-6將載體靶向B細(xì)胞。
實施例10人淋巴細(xì)胞的免疫這些載體可用于從分離的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生初次免疫反應(yīng)。通過密度離心從全血收集白細(xì)胞。用甲狀腺球蛋白綴合的TNF/IL-6膠態(tài)金載體處理這些細(xì)胞。細(xì)胞每2天接受膠態(tài)金載體脈沖，共八天。最后脈沖后，將細(xì)胞培養(yǎng)另外5天。收集上清液并用直接EIA檢測人抗人TNF(IgM/IgD和IgG聯(lián)合)抗體的存在。如圖8中可以看到的，嵌合cAU甲狀腺球蛋白TNF具有最高的免疫密度。
實施例11免疫人B細(xì)胞和樹突細(xì)胞以表達(dá)II類MHC使用增加體外人淋巴細(xì)胞免疫效率的兩個不同方法。首先，TNF與免疫原性載體，如甲狀腺球蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白或鼠血清清蛋白偶聯(lián)提高TNF的免疫原性。使用標(biāo)準(zhǔn)EDC/NHS和戊二醛(gluteraldehyde)方法進(jìn)行載體TNF綴合。其次，它們與含有細(xì)胞特異性靶向試劑的膠態(tài)金顆粒偶聯(lián)增加這些抗原的特異性。為將抗原遞送靶向于B細(xì)胞，使載體抗原復(fù)合體與包含IL-6的膠態(tài)金顆粒結(jié)合。為將載體抗原遞送靶向于樹突細(xì)胞，使載體抗原復(fù)合體與包含GM-CSF的膠態(tài)金顆粒結(jié)合。
這些載體最初用于免疫原初MHC限制的人B細(xì)胞和樹突細(xì)胞，以產(chǎn)生II類MHC抗原。這些相同的載體后來用于從新的或復(fù)制組的原初B細(xì)胞誘導(dǎo)初次抗體應(yīng)答。免疫方案包括用各種載體順序免疫B細(xì)胞和樹突細(xì)胞。結(jié)果，B細(xì)胞和樹突細(xì)胞遇到載體一次，而TNF抗原遇到三次。
實施例12B細(xì)胞產(chǎn)生II類MHC蛋白為引起人B細(xì)胞產(chǎn)生II類MHC蛋白，將106個表面IgM+/IgD+人B細(xì)胞鋪在24孔板上并在1.5ml AIM V培養(yǎng)基中培養(yǎng)。鋪平板后二十四小時，用與IL-6靶向的膠態(tài)金載體結(jié)合的THYRO:TNF抗原脈沖細(xì)胞。兩天后，用IL-6載體靶向的KLH:TNF載體脈沖細(xì)胞。培養(yǎng)另外兩天后，用第三個載體TNF抗原MSA:TNF免疫細(xì)胞。將細(xì)胞溫育另外三至七天并通過FACS分析檢測II類MHC表達(dá)的存在。可供選擇地，可以用膠態(tài)金抗原同時脈沖細(xì)胞。
類似的步驟用于脈沖樹突細(xì)胞以表達(dá)II類MHC蛋白。用與GM-CSF靶向的膠態(tài)金載體結(jié)合的TNF載體抗原免疫這些細(xì)胞。使用包被了抗CD34的磁珠從外周血分離樹突細(xì)胞前體。體外擴(kuò)展這些細(xì)胞，這通過在補(bǔ)充了1000ng/ml GM-CSF和100ng/ml IL-4的AIMV無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們來實現(xiàn)。通過用于探測CD1a和空II類MHC分子的FACS分析證實它們成熟后，用10ng/ml TNF脈沖使細(xì)胞分化為成熟樹突細(xì)胞。用GM-CSF靶向的膠態(tài)金TNF抗原免疫這些成熟的樹突細(xì)胞。檢測負(fù)載抗原的II類MHC蛋白復(fù)合物，這通過FACS或用鏈霉抗生物素蛋白綴合的藻紅蛋白(Research DiagnosticInc.)檢測系統(tǒng)檢測的生物素化抗原肽的原位分析來實現(xiàn)。
實施例13用于II類MHC抗原分離方法的發(fā)展分離MHC的方法使用“一般的”非MHC相容性血液樣品。這些MHC分子用于限定膠態(tài)金顆粒上蛋白的pH和飽和最適值。一旦限定了，這些方法就適于從免疫的MHC限制的血液庫中純化負(fù)載抗原的MHC。
使用Sette描述的方法進(jìn)行一般的和負(fù)載抗原的人II類MHC的分離(Sette等人，J.Immunol.1992.148844)。簡言之，將來自非HLA匹配的人全血的棕黃層以108個細(xì)胞/ml的最小密度冷凍，并進(jìn)行超聲處理以破裂細(xì)胞。使這些細(xì)胞懸浮于含2％Renex、150mM NaCl、5mM EDTA和2mM PMSF的50mM TRIS-HCl、pH 8.5的緩沖液中。通過離心除去大的微粒，包括核(10000×g 20分鐘)。然后將細(xì)胞溶解產(chǎn)物在通過使抗人II類MHC分子的鼠抗體(ResearchDiagnostics Inc.)與蛋白A/G瓊脂糖珠結(jié)合制備的親和柱上分級分離。使溶解產(chǎn)物通過該柱至少5次，以使MHC蛋白與固定的抗體的結(jié)合最大化。用含10mM TRIS-HCl pH 8.0/0.1％Renex的10柱體積緩沖液洗滌該柱，隨后用含1％正辛基葡糖苷(n-ocytlglucoside)的5柱體積PBS另外洗滌。使用具有1％正辛基葡糖苷，pH 11.5的50mM二乙胺鹽水緩沖液從柱洗脫II類MHC蛋白。洗脫后，立即通過添加2M甘氨酸、pH 2.0中和每個級分。使含II類MHC分子的級分等分試樣并以25μg等分試樣凍干。
實施例14人B7.1分子的產(chǎn)生用重組DNA技術(shù)制備人共刺激分子B7.1?；蜃鳛槭袌錾峡少I到的瞬時表達(dá)載體系統(tǒng)(InVivogen Inc.)的一部分來提供。為構(gòu)建體提供允許從質(zhì)粒構(gòu)建體分離活性基因的合適限制位點(diǎn)。使用限制性內(nèi)切酶NcoI和NheI從pORF宿主質(zhì)粒分離人B-7.1基因。這個雙酶切消化導(dǎo)致兩個線性化DNA片的形成。一個基因片段由B-7.1基因(893bp)組成，而另一個片段(3210bp)組成p-ORF質(zhì)粒的輔助基因。在1％瓊脂糖凝膠上分級分離基因片段并用溴化乙錠染色顯色。從凝膠切下條帶并使用QuiaQuick凝膠提取樹脂純化。將純化的線性化基因插入桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(CloneTech Inc.)，所述表達(dá)系統(tǒng)在強(qiáng)CMV啟動子的控制下。根據(jù)廠家說明書和條件，將桿狀病毒整合的基因轉(zhuǎn)染入SF9昆蟲細(xì)胞系。106個B7轉(zhuǎn)染的NOS細(xì)胞將在生物反應(yīng)器中擴(kuò)展。用親和層析處理培養(yǎng)基和細(xì)胞溶解產(chǎn)物，其中使用預(yù)先固定在A蛋白/G瓊脂糖凝膠柱的抗人B7.1蛋白的鼠單克隆抗體(Research DiagnosticsInc)。
實施例15合成的抗原呈遞細(xì)胞的產(chǎn)生單個顆粒sAPC為使初次抗體應(yīng)答成熟，有能力的sAPC必須誘導(dǎo)引起抗體類別轉(zhuǎn)換的CD4T細(xì)胞/B細(xì)胞相互作用。通過結(jié)合膠態(tài)金單個顆粒上免疫突觸蛋白開發(fā)第一個sAPC。檢測這個載體以及鏈霉抗生物素蛋白膠態(tài)金核心上建立的一個載體活化CD4+T細(xì)胞的能力。
一旦分離了免疫突觸的成分并將其純化至均一，它們就與膠態(tài)金顆粒結(jié)合以開發(fā)單個顆粒sAPC。使用兩個策略開發(fā)這些APCs。第一個策略包括免疫突觸成分(即負(fù)載肽的MHC、B7和ICAM分子)與膠態(tài)金顆粒的直接結(jié)合。盡管不希望受限制，但人們相信每毫升金將結(jié)合250ng每種蛋白/毫升膠態(tài)金溶膠。
第一個支架裝配在EIA板表面上。該材料包括包被了人TNF的單克隆抗體的EIA板；32nm TNF/鏈霉抗生物素蛋白膠態(tài)金嵌合體；生物素化BSA17nm鏈霉抗生物素蛋白膠態(tài)金載體；生物素化人IL-6、綴合堿性磷酸酶的兔抗人IL-6。將各種成分裝配入支架，如圖9A描繪的。這個研究的對照簡單地為32nm顆粒，無支架構(gòu)建于其上的TNF?？课稽c(diǎn)。如圖10A表示，當(dāng)全部支架分子塊料存在時，產(chǎn)生強(qiáng)信號。僅通過省去TNF?？课稽c(diǎn)，不形成支架，且結(jié)果無信號產(chǎn)生。
免疫突觸蛋白與膠態(tài)金單個顆粒的直接結(jié)合導(dǎo)致顆粒表面上蛋白的嚴(yán)格定向。為了增加sAPC上這些蛋白運(yùn)動的靈活性，開發(fā)可替換的單個顆粒sAPC。這種單個顆粒sAPC是在結(jié)合生物素化形式的MHC、B7和ICAM蛋白的鏈霉抗生物素蛋白膠態(tài)金平臺上開發(fā)的。該蛋白通過經(jīng)由間隔臂連接蛋白的生物素殘基與鏈霉抗生物素蛋白金顆粒結(jié)合。
使用幾個生物素化試劑如NHS-生物素(Pierce Chemical Co.)使蛋白生物素化。這個試劑在蛋白和生物素部分之間放置1.35nm的間隔臂?？晒┻x擇地，使用NHS-LC-LC-生物素使蛋白生物素化。這個試劑在蛋白和生物素殘基之間放置3.05nm的間隔壁。這種間隔臂促進(jìn)蛋白運(yùn)動以促進(jìn)配體結(jié)合。這個增添的靈活性提高了蛋白完成適當(dāng)?shù)娜S定向和與CD4+T細(xì)胞形成有功能的免疫突觸的能力。
實施例16自動裝配的sAPC的產(chǎn)生多顆粒sAPC在免疫突觸形成過程中將具有自動定向的靈活性。靈活性是裝配用于將顆粒連接在一起的部分的直接結(jié)果。接頭可以是烷、蛋白和聚乙二醇(PEG)，以允許最大的載體功能性。
使用包含四個末端游離硫醇的四臂聚乙二醇(10,000MW)主鏈裝配第二個支架(圖9B中所示)。這個接頭用于連接與IL-1或TNF結(jié)合的膠態(tài)金單個顆粒。連接后，將制劑離心并使用僅用IL-1單克隆抗體包被的EIA板測定兩種蛋白。結(jié)合后，洗滌板并使用連接IL-1或TNF多克隆抗體的酶進(jìn)行檢測。類似地，圖9B中描述的載體只有在在接頭存在下才對兩種蛋白產(chǎn)生信號(圖10B)。沒有接頭時，僅觀察到背景色。
為進(jìn)一步增加sAPC的靈活性，將成分蛋白裝配在不同膠態(tài)金顆粒上。將這些顆粒裝配入支架系統(tǒng)，以產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化的sAPC。溶液中可以使用多顆粒sAPC，或如圖9A和9B所示提供EIA板上固體支持體。
MHC、B7和ICAM蛋白與如前所述的不同膠態(tài)金顆粒結(jié)合。通過各種支架分子物理地連接顆粒?！斑B接”分子的功能是提供免疫突觸形成中膠態(tài)金單個顆粒的更大靈活性。無論sAPC作為獨(dú)立顆粒還是作為與固體表面結(jié)合的部分基質(zhì)提供，都發(fā)生這個靈活性。
第一個添加物由修飾的二硫醇烷部分組成。烷二硫醇的功能是通過形成硫醇-金鍵使膠態(tài)金單個顆粒結(jié)合在一起。在生物傳感器開發(fā)中，已使用這些部分在玻璃載玻片表面上建立自動裝配的金結(jié)構(gòu)(Mirkin，C.A，Letsinger，R.，Mucic，R.C.，和Storhoff，J.J.Nature.1996.382 607-609)。硫醇基允許烷部分直接與膠態(tài)金顆粒表面結(jié)合。市場上可買到的烷硫醇試劑的實例包括1，5戊烷二硫醇、1，6己烷二硫醇和癸烷二硫醇(Sigma Chemical Company)。
作為烷二硫醇的替換物，也使用各種大小的2、3和4臂聚乙二醇(SunBio，Walnut Creek，CA)。這些聚合物的每個臂都具有游離硫醇基，其用于通過形成金-硫醇結(jié)合而結(jié)合膠態(tài)金單個顆粒。這些試劑提供在水中完全溶解度的另外優(yōu)點(diǎn)。
免疫突觸的多個蛋白部分與膠態(tài)金單個顆?；蚨鄠€顆粒結(jié)合使得能夠產(chǎn)生合成的抗原呈遞細(xì)胞(sAPC)，所述抗原呈遞細(xì)胞能夠驅(qū)動引起免疫人B細(xì)胞中類別轉(zhuǎn)換的細(xì)胞事件。
實施例17sAPC刺激CD4+T細(xì)胞以表達(dá)CD40配體測試單個顆粒和自動裝配的sAPCs誘導(dǎo)MHC限制的CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD40配體的能力。隨后，將0.1至10μg負(fù)載抗原的MHC(在sAPC上呈遞)添加至在AIM V培養(yǎng)基中生長的106個II類限制的CD4+T細(xì)胞中。該刺激發(fā)生在IL-4和IL-10存在下，其驅(qū)動CD4+T細(xì)胞的TH2亞型產(chǎn)生。sAPC刺激4、12和24小時后，收集CD4細(xì)胞并用FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD40配體抗體染色并用FACS進(jìn)行分析。
在CD4+T細(xì)胞活化過程中，如前文所述免疫新的一組MHC限制的B淋巴細(xì)胞(即未用于分離MHC的細(xì)胞)，以產(chǎn)生抗原特異性IgM抗體。使用以前描述的靶向的TNF抗原免疫M(jìn)HC限制的B細(xì)胞。檢測抗原特異性IgMs和從它們各自的細(xì)胞產(chǎn)生CD40配體后，將活化的CD4+T細(xì)胞添加到分泌IgM的B細(xì)胞。通過檢測人抗人TNFIgGs來監(jiān)控類別轉(zhuǎn)換。使IgG陽性克隆與如下所述的K6H6/B5小鼠人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細(xì)胞系融合。
實施例18抗體檢測和B細(xì)胞的無限增殖化組合來自陽性孔的所有細(xì)胞，離心一次，用PBS洗滌，并與2×106個小鼠/人異源骨髓瘤K6H6/B5細(xì)胞組合。異源骨髓瘤細(xì)胞系K6H6/B5(可通過ATCC得到)是這些人淋巴細(xì)胞的理想融合配偶體，因為這些癌細(xì)胞是抗體的非分泌者且可以獲得，沒有專利限制。使用用PEG的標(biāo)準(zhǔn)融合方案融合人和骨髓瘤細(xì)胞。使用傳統(tǒng)的HAT/HT選擇方案選擇成功融合的細(xì)胞。使用直接ELISA檢測生長的克隆的TNF特異性人IgG抗體的產(chǎn)生。將顯示抗原識別的那些克隆按比例增加至T-75瓶中，在這點(diǎn)冷藏所有克隆并如下所述檢測它們的上清液中的中和抗體的活性。
實施例19TNF生物活性的中和使用充分表征的WEHI 164生物測定法檢測TNF抗體中和TNF生物活性的能力。簡言之，TNF劑量依賴性抑制這些細(xì)胞的體外增殖。為了這個生物測定，將5000個WEHI細(xì)胞鋪平板在24孔組織培養(yǎng)簇中。向板中指定孔添加TNF(15.6pg/ml至500pg/ml)。為了測定人單克隆抗體中和TNF作用的能力，在1μg每種TNF單克隆抗體存在下，制備相同標(biāo)準(zhǔn)劑量范圍的TNF標(biāo)準(zhǔn)物。將各種處理的細(xì)胞培養(yǎng)5天，并使用Coulter計數(shù)器確定細(xì)胞數(shù)目。
實施例20離子強(qiáng)度對結(jié)合膠態(tài)金的TNF的凍干穩(wěn)定性的影響將如圖11所示的膠態(tài)金結(jié)合裝置用于將TNF與如前所述的膠態(tài)金納米顆粒結(jié)合。結(jié)合后，將30K PEG-硫醇以50μg/ml添加至pH 9的去離子水溶液中。
為了檢測離子強(qiáng)度對TNF-膠態(tài)金鍵穩(wěn)定性的影響，向容納TNF溶液的容器中添加各種量的鹽(1×標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖鹽水形式；PBS)。PBS終濃度從0至0.325％的標(biāo)準(zhǔn)PBS變化。結(jié)合和滲濾后，向樣品中添加冷凍保護(hù)劑(甘露糖醇20mg/ml；人血清清蛋白5mg/ml)。隨后將樣品等分試樣為1ml樣品并在-80℃冷凍。冷凍后，將樣品凍干至干燥并在真空下密封。
隨后，用1ml去離子水重構(gòu)樣品，并用1％PEG-1450/水溶液稀釋十倍。將樣品離心，以使結(jié)合膠態(tài)金的TNF與游離TNF分離。用EIA分析膠態(tài)金沉淀和上清液兩者的TNF濃度。這些研究的數(shù)據(jù)在表I中示出。
表1.在不存在鹽的情況下制備的凍干膠態(tài)金TNF的釋放特征總TNF百分比膠態(tài)金沉淀 68上清液 32表I表明32％的TNF是從凍干后載體中釋放的。在重復(fù)研究中，我們觀察到多達(dá)50％的蛋白是凍干后釋放的。
實施例21增加離子強(qiáng)度對凍干的膠態(tài)金-TNF藥物穩(wěn)定性的影響通過添加0.25×溶液(77.25毫滲透壓摩爾/kg)來修飾在3mMTRIS溶液中預(yù)先稀釋至0.5μg/ml TNF終濃度的TNF溶液。溶液如上文所述結(jié)合。結(jié)合后，添加如上文所述的30K PEG-硫醇和冷凍保護(hù)劑并在-80℃冷凍樣品。如上文所述凍干樣品，隨后重構(gòu)和分析重構(gòu)的樣品中存在的游離和與膠態(tài)金結(jié)合的TNF的量。這些研究的數(shù)據(jù)在圖12中示出。
如在圖2可以看出的，增加離子強(qiáng)度顯著提高凍干過程中載體的穩(wěn)定性。鹽效應(yīng)是劑量依賴性的。如表II所示，在添加到TNF的鹽量降低時，凍干后更多蛋白被釋放。
表II.鹽濃度對載體凍干后TNF釋放的影響鹽濃度 0 4.519.346.577.25(毫滲透壓摩爾/kg)釋放百分比 40 30 10 6 6在不存在鹽的情況下結(jié)合TNF導(dǎo)致一部分TNF結(jié)合在離子雙層中，而不是直接結(jié)合在金顆粒上(圖13)。凍干過程中，溶劑化離子層的水喪失，且因此重構(gòu)后，這些載體釋放與離子云結(jié)合的一部分TNF。通過添加鹽來增加離子強(qiáng)度，離子層收縮/破壞(圖14)并允許全部TNF直接與顆粒表面結(jié)合。凍干后，這個制劑的全部TNF與顆粒表面結(jié)合。
上面引用的全部專利、出版物和摘要的全部內(nèi)容都在此并入作為參考。應(yīng)該理解前文僅僅涉及本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而且其中可以進(jìn)行許多改動或變更，而不背離下列權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種載體組合物，其包含合成的APC，其中合成的APC包含膠態(tài)金屬、抗原和成分特異性免疫刺激劑。
2.權(quán)利要求1的載體組合物，其中所述成分特異性免疫刺激劑包括抗原、膠態(tài)金屬、佐劑、受體分子、核酸、免疫原性蛋白、輔助細(xì)胞因子/免疫刺激劑、藥物、化療劑或載體。
3.權(quán)利要求1的載體組合物，其中所述成分特異性免疫刺激劑包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、脂質(zhì)A、磷脂酶A2、內(nèi)毒素、葡萄球菌腸毒素B、I型干擾素、II型干擾素、腫瘤壞死因子(TNF-α)、Flt-3配體、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、淋巴毒素、移動抑制因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(CSF)、單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF、粒細(xì)胞CSF、血管上皮生長因子(VEGF)、血管生成素、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α)、熱激蛋白、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纖維細(xì)胞生長因子、炎性和免疫調(diào)節(jié)蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有義、反義、多核苷酸、癌細(xì)胞特異性抗原、突變體p53、酪氨酸酶、粘蛋白、自身免疫抗原、免疫治療藥、血管生成或抗血管生成藥。
4.權(quán)利要求3的成分特異性免疫刺激劑，其中所述癌細(xì)胞特異性抗原是MAGE、BAGE或MART。
5.權(quán)利要求3的成分特異性免疫刺激劑，其中所述粘蛋白是MUC-1、PSA或TSH。
6.權(quán)利要求1的載體組合物，其中所述膠態(tài)金屬包括膠態(tài)金、膠態(tài)銀、膠態(tài)鐵、膠態(tài)鋁或膠態(tài)鉑。
7.權(quán)利要求1的載體組合物，進(jìn)一步包含藥物可接受成分，所述成分包括賦形劑、緩沖液或載體。
8.權(quán)利要求1的載體組合物，進(jìn)一步包含佐劑，其中所述佐劑包括脂質(zhì)體、乳劑、微球體、可生物降解的聚合物和聚苯乙烯、明礬、熱殺死的丁酸分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌、百日咳毒素和破傷風(fēng)毒素、或LPS和葡萄球菌腸毒素B。
9.權(quán)利要求1的載體組合物，其中所述載體進(jìn)一步包含共刺激蛋白。
10.權(quán)利要求1的載體組合物，其中所述載體進(jìn)一步包含主要組織相容性復(fù)合體。
11.權(quán)利要求1的載體組合物，其中所述載體進(jìn)一步包含生發(fā)中心。
12.權(quán)利要求1的載體組合物，其中所述載體進(jìn)一步包含結(jié)構(gòu)蛋白。
13.權(quán)利要求1的載體組合物，進(jìn)一步包含靶向分子、整合分子、PEG、衍生的PEG、聚-L-賴氨酸或衍生的聚-L-賴氨酸、生物素-抗生物素蛋白、雙功能PEG或雙功能聚合物。
14.權(quán)利要求13的載體組合物，其中所述雙功能PEG包含硫醇和生物素。
15.權(quán)利要求13的載體組合物，其中所述聚-L-賴氨酸包含硫醇和生物素。
16.權(quán)利要求1的載體組合物，其中合成的APC是凍干的并且在施用前被貯藏一段時間。
17.一種體外生產(chǎn)單克隆抗體的方法，其包括a)將抗原、成分特異性免疫刺激劑與膠態(tài)金屬混合或結(jié)合以形成合成的APC；和b)體外刺激來自人的免疫細(xì)胞以活化免疫細(xì)胞，以產(chǎn)生對合成的APC的初次反應(yīng)；其中合成的APC包含抗原、成分特異性免疫刺激劑和膠態(tài)金屬；和c)使活化的免疫細(xì)胞無限增殖化；和d)選擇產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包含主要組織相容性復(fù)合體。
19.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包含生發(fā)中心。
20.一種包含完全人蛋白的抗原特異性、人特異性單克隆抗體，其由下述方法制備a)體外刺激來自人的免疫細(xì)胞以活化免疫細(xì)胞，以產(chǎn)生對合成的APC的初次反應(yīng)；其中合成的APC包含抗原、成分特異性免疫刺激劑和膠態(tài)金屬；和b)使活化的免疫細(xì)胞無限增殖化；和c)選擇產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
21.一種影響免疫反應(yīng)的方法，其包括施用包含至少一種膠態(tài)金屬顆粒、抗原和至少一種成分特異性免疫刺激劑的組合物。
22.一種增強(qiáng)疫苗功效的方法，其包括施用包含至少一種膠態(tài)金屬顆粒、抗原和至少一種成分特異性免疫刺激劑的組合物。
23.一種治療疾病和免疫相關(guān)機(jī)能障礙和病理的方法，其包括給人或動物施用治療有效量的包含合成的APC的載體組合物，其中所述合成的APC包含至少一種膠態(tài)金屬、抗原和成分特異性免疫刺激劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述膠態(tài)金屬顆粒具有不同的大小。
25.權(quán)利要求24的方法，其中施用成分特異性免疫刺激劑、抗原和不同大小的膠態(tài)金屬顆粒包括將成分特異性免疫刺激劑、抗原和不同大小的膠態(tài)金屬顆粒作為一劑同時施用。
26.權(quán)利要求23的方法，其中該方法在治療疾病中用于刺激或抑制免疫成分，其中所述疾病是癌癥、實體腫瘤癌、克羅恩病、乳腺癌、銀屑病、炎性腸病、成人呼吸窘迫綜合征、變態(tài)反應(yīng)、鼻炎、濕疹、蕁麻疹、過敏反應(yīng)、移植排斥、風(fēng)濕性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血清陰性的脊椎關(guān)節(jié)炎疹、Sjogren氏綜合征、系統(tǒng)性硬化病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、I型糖尿病、獲得性免疫缺損綜合征、Hashimoto氏甲狀腺炎、Graves氏病、Addison氏病、多內(nèi)分泌自身免疫病、肝炎、硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、惡性貧血、乳糜瀉、抗體介導(dǎo)的腎炎、腎小球性腎炎、Wegener氏肉芽腫病、微觀多動脈炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、天皰瘡、皰疹樣皮炎、銀屑病、白癜風(fēng)、多發(fā)性硬化、腦脊髓炎、Guillain-Barre綜合征、重癥肌無力、Lambert-Eaton綜合征、鞏膜、鞏膜外層、葡萄膜炎、慢性粘膜皮膚念珠菌病、Bruton氏綜合征、嬰兒期一過性低丙種球蛋白血癥、骨髓瘤、X連鎖高IgM綜合征、Wiskott-Aldrich氏綜合征、共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、自身免疫性嗜中性白細(xì)胞減少癥、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、淀粉樣變性、慢性淋巴細(xì)胞性白血病或非何杰金氏淋巴瘤。
27.權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包含主要組織相容性復(fù)合體。
28.一種多顆粒自動裝配的合成的APC，其包含至少兩個膠態(tài)金屬、抗原和至少一個成分特異性免疫刺激劑，其中所述多顆粒合成的APC是使用支架分子裝配的，且其中所述支架分子包括生物素化的間隔臂、烷接頭、蛋白、聚乙二醇、衍生的PEG、多臂PEG或硫醇化聚-L-賴氨酸。
29.權(quán)利要求28的多顆粒自動裝配的合成的APC，其中所述膠態(tài)金屬顆粒具有不同的大小。
30.權(quán)利要求28的多顆粒自動裝配的合成的APC，進(jìn)一步包含靶向分子和整合分子。
31.權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包含主要組織相容性復(fù)合體。
全文摘要
本發(fā)明包括制備單克隆抗體的組合物和方法。本發(fā)明進(jìn)一步包括復(fù)制免疫系統(tǒng)成分的載體，所述免疫系統(tǒng)成分特別是免疫突觸的抗原呈遞細(xì)胞(APC)元件。另外，本發(fā)明可以進(jìn)一步包括合成的T細(xì)胞。
文檔編號A61K48/00GK1925843SQ200480041234
公開日2007年3月7日 申請日期2004年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月2日
發(fā)明者L·塔馬金, G·F·帕茨奧蒂 申請人:細(xì)胞免疫科學(xué)公司