專(zhuān)利名稱(chēng)：雷公藤甲素在制備抗卵巢癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雷公藤甲素在制備抗卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率占女性生殖器官惡性腫瘤的第三位，僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，而且有逐年增多的趨勢(shì)。近10年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率一直處于持續(xù)和明顯上升的狀態(tài)，目前已躍居我國(guó)女性惡性腫瘤之首或第二位。由于受卵巢解剖部位置的影響，卵巢癌早期診斷困難，晚期治療效果差。卵巢癌的治療從以外科解剖學(xué)為主導(dǎo)的階段發(fā)展到了現(xiàn)代的以生物學(xué)概念為主導(dǎo)的階段，包括外科手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療及生物治療等綜合措施，化療在卵巢癌的綜合治療中占有極其重要的地位。盡管卵巢癌細(xì)胞減滅術(shù)的水平不斷提高，新的化療藥物不斷被開(kāi)發(fā)利用，卵巢癌總的5年生存率仍然很低，徘徊在25％～30％。目前的腫瘤化療藥物盡管其抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞的作用肯定，但對(duì)人體的毒副作用較大，易產(chǎn)生耐受，因而限制了在腫瘤臨床方面的應(yīng)用。因此，尋找新型的化療藥物對(duì)卵巢癌的綜合治療就顯得很重要。
雷公藤甲素是是衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物雷公藤的主要活性成分，已有多家文獻(xiàn)報(bào)道雷公藤甲素在體內(nèi)外對(duì)腫瘤的化學(xué)預(yù)防和治療作用，但雷公藤甲素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用卻未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題提供雷公藤甲素在制備抗卵巢癌藥物中的應(yīng)用，用雷公藤甲素制備的抗卵巢癌藥物對(duì)卵巢癌具有較好的療效，且副作用少。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是雷公藤甲素在制備抗卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明經(jīng)口給予雷公藤甲素2μg/kg或40μg/kg，一天兩次，20天后，抑瘤率為43.29％，23.99％。


圖1為本發(fā)明IC30，IC60，IC90雷公藤甲素處理48小時(shí)對(duì)A2780卵巢癌細(xì)胞凋亡及死亡的影響圖；圖2為本發(fā)明IC30，IC60，IC90雷公藤甲素處理48小時(shí)對(duì)OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞凋亡及死亡的影響圖；圖3為本發(fā)明IC60雷公藤甲素處理24，48，72小時(shí)對(duì)A2780卵巢癌細(xì)胞周期的影響圖；圖4為本發(fā)明IC60雷公藤甲素處理24，48，72小時(shí)對(duì)OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞周期的影響圖；
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明中醫(yī)學(xué)在抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用，具有減毒、增效等特點(diǎn)。本發(fā)明選擇雷公藤甲素作為抗癌藥物，用MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)，探討雷公藤甲素對(duì)卵巢癌細(xì)胞活性的影響及藥物作用機(jī)制。旨在選擇一種抗腫瘤作用強(qiáng)、毒性小的藥物。
本發(fā)明通過(guò)MTT法、流式細(xì)胞儀等技術(shù)揭示雷公藤甲素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖的影響及其在細(xì)胞周期調(diào)控方面的機(jī)制。
材料與方法1實(shí)驗(yàn)材料1.1細(xì)胞株(1)人卵巢癌細(xì)胞株A2780(p53基因野生型)由同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科腫瘤研究室提供；(2)人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3(p53基因突變型)，HIO-180，CCD-19Lu，J774A.1由美國(guó)Virginia Commonwealth University免疫學(xué)教研室提供；1.2藥物雷公藤甲素，由福建福州凱華藥業(yè)有限公司提供，純度99.7％，用DMSO配成儲(chǔ)備液置于-20℃保存，使用時(shí)用PBS液稀釋?zhuān)笵MSO終濃度為0.4％。
2實(shí)驗(yàn)方法2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力及藥物敏感性取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.25％胰酶消化后，加入培養(yǎng)液吹打混勻，以5.0×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。雷公藤甲素配成0.5ng/mL、1.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL 10種終濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(不含細(xì)胞)、細(xì)胞對(duì)照組(含0.4％的DMSO的PBS溶液，不含藥物)和藥物實(shí)驗(yàn)組(0.5ng/mL、1.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL組)，每種濃度的藥物分別加入培養(yǎng)后的96孔板內(nèi)，20μL/孔，每個(gè)劑量3個(gè)平行孔。在CO2箱內(nèi)分別培養(yǎng)24，48，72h，1000r·min-1離心10min，棄上清每孔加入5mg/mL MTT 20μL，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。培養(yǎng)后，再離心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入200μL/孔DMSO振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570mm波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光度A值，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式細(xì)胞存活率＝OD(藥物組)/OD(對(duì)照組)×100％，抑制率＝1-存活率，來(lái)計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。
以藥物濃度為因變量，細(xì)胞抑制率為應(yīng)變量，即X＝藥物濃度，Y＝抑制率，建立回歸方程。利用該回歸方程求出雷公藤甲素分別作用A2780和OVCAR-3細(xì)胞24、48、72h時(shí)的IC30、IC50、IC60、IC90濃度。
2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)雷公藤甲素作用A2780和OVCAR-3細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(含0.4％的DMSO PBS溶液，不含藥物)，藥物實(shí)驗(yàn)組(A2780細(xì)胞IC30-0.59ng/mL、IC60-1.67ng/mL、IC90-2.74ng/mL三組；OVCAR-3細(xì)胞IC30-3.26ng/mL、IC60-13.6ng/mL、IC90-24.2ng/mL三組)。細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25％胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按濃度2×106/mL接種6孔板中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，分別加入IC30、IC60、IC90濃度的雷公藤甲素培養(yǎng)48h，用0.25％胰酶消化成單細(xì)胞懸液，離心1000rpm，5min，吸去上清液，PBS液洗2次，用1×Binding Buffer將細(xì)胞調(diào)整至1×106/mL濃度，取100μL轉(zhuǎn)至5mL流式專(zhuān)用試管，加入5μL FITC-Annexin V(濃度1mg/mL，1×Binding Buffer稀釋)，混勻細(xì)胞，避光孵育15min，加入10μL PI(濃度250μg/mL)溶液，再加入400μL 1×Binding Buffer，1小時(shí)之內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。
2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)雷公藤甲素對(duì)各細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響分別取雷公藤甲素作用24，48，72h的IC60濃度作為以下實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞對(duì)照組(含0.4％的DMSO PBS溶液，不含藥物)，藥物實(shí)驗(yàn)組(A2780細(xì)胞24h-2.6ng/mL、48h-1.8ng/mL、72h-1.5ng/mL三組；OVCAR-3細(xì)胞24h-123ng/mL、48h-13.6ng/mL、72h-8.3ng/mL三組)。細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25％胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按濃度2×106/mL接種6孔板中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。加入對(duì)照溶液和IC60濃度的雷公藤甲素分別培養(yǎng)24，48，72h。用0.25％胰酶消化成單細(xì)胞懸液，4℃離心1000rpm，5min，吸去上清液，PBS液洗2次，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入EP管中，離心1000rpm，5min，去上清，一滴一滴加入冷(-20℃)乙醇(終濃度70％)固定細(xì)胞，并且一邊加入固定劑一邊振蕩，防止形成細(xì)胞團(tuán)，4℃固定過(guò)夜(固定的細(xì)胞可以保存一段時(shí)間)，離心除去乙醇，PBS洗1次，去上清。將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到1×106/mL，加入250μg/mL的RNA酶(含0.1％TritonX-100)，50μg/mL碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，4℃暗處放置30min。將樣品放入FCM的樣品室，用激發(fā)波長(zhǎng)488nm測(cè)定。
2.4雷公藤甲素對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制作用的影響純系Balb/c小鼠8周齡，體重20±2g，雌性。右側(cè)腋窩皮下接種A2780和OVCAR-3細(xì)胞(5×106個(gè))后，分為A2780對(duì)照組，A2780給藥組(ig雷公藤甲2μg/kg，Bid)；OVCAR-3對(duì)照組，OVCAR-3給藥組(ig雷公藤甲素20μg/kg，Bid)，20天后，斷頸處死小鼠，取腋窩瘤組織稱(chēng)重。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1雷公藤甲素對(duì)各細(xì)胞的敏感性本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)不同濃度的雷公藤甲素分別作用24，48，72h后對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株及正常細(xì)胞株的抑制作用，結(jié)果如下表。由表(1-4)可見(jiàn)，人卵巢癌細(xì)胞株A2780比人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3對(duì)雷公藤甲素更為敏感，不同濃度雷公藤甲素均可抑制A2780和OVCAR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且呈濃度依賴(lài)性。雷公藤甲素對(duì)正常細(xì)胞如HIO-180，CCD-19Lu，J774A.1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用也表現(xiàn)呈劑量依賴(lài)性，雷公藤甲素作用人卵巢癌細(xì)胞A2780的IC50值比作用于正常細(xì)胞的IC50值低得多，雷公藤甲素分別作用于A(yíng)2780細(xì)胞后24，48，72h的IC50值比HIO-180低47，65，65倍；比CCD-19Lu細(xì)胞低65，84，85倍；比J774A.1細(xì)胞低269，165，168倍。人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞對(duì)雷公藤甲素的敏感性不及A2780細(xì)胞株，雷公藤甲素分別作用于OVCAR-3細(xì)胞后24，48，72h的IC50值比HIO-180低1.1，8.3，11倍；比CCD-19Lu細(xì)胞低1.5，8.3，14倍；比J774A.1細(xì)胞低6.3，21，28倍(見(jiàn)表2)。
表1.雷公藤甲素對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780，OVCAR-3 30％抑制率的時(shí)間濃度關(guān)系 表2.雷公藤甲素對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780，OVCAR-3及正常細(xì)胞株HIO-180，CCD-19Lu，J774A.1 50％抑制率的時(shí)間濃度關(guān)系 表3.雷公藤甲素對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780，OVCAR-3 60％抑制率的時(shí)間濃度關(guān)系 表4.雷公藤甲素對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780，OVCAR-3 90％抑制率的時(shí)間濃度關(guān)系
3.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)雷公藤甲素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響應(yīng)用流式細(xì)胞儀采用Annexin V-PI雙染法對(duì)不同濃度的雷公藤甲素誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞A2780和OVCAR-3產(chǎn)生早期細(xì)胞凋亡進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示(參見(jiàn)圖1、圖2)，IC30濃度雷公藤甲素對(duì)A2780和OVCAR-3細(xì)胞都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，凋亡率在6～15％，并且大多數(shù)細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài)；IC60濃度雷公藤甲素對(duì)A2780細(xì)胞作用48h后，只有5％的細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài)，65％的細(xì)胞處于晚期凋亡狀態(tài)，10％的細(xì)胞壞死；而IC60濃度雷公藤甲素對(duì)OVCAR-3細(xì)胞作用48h后，50％的細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài)，65％的細(xì)胞處于晚期凋亡狀態(tài)，10％的細(xì)胞壞死；隨著雷公藤甲素濃度的增高，A2780細(xì)胞對(duì)雷公藤甲素越敏感，IC90濃度雷公藤甲素對(duì)A2780細(xì)胞作用48h后，細(xì)胞凋亡率反而降低，但是對(duì)于OVCAR-3細(xì)胞而言，它對(duì)雷公藤甲素的敏感度不及A2780細(xì)胞，IC90濃度雷公藤甲素對(duì)OVCAR-3細(xì)胞作用48h后，細(xì)胞凋亡率比同濃度的雷公藤甲素對(duì)A2780細(xì)胞的凋亡率高。
3.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)雷公藤甲素對(duì)各細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響IC60濃度的雷公藤甲素對(duì)A2780細(xì)胞分別作用24h(2.6ng/ml)，48h(1.8ng/ml)，72h(1.5ng/ml)以及對(duì)OVCAR-3細(xì)胞分別作用24h(123ng/ml)，48h(13.6ng/ml)，72h(8.3ng/ml)后細(xì)胞周期和DNA含量變化如下圖3，圖4。由圖可見(jiàn)，雷公藤甲素作用24h后，處于S期的細(xì)胞比例增加，這種情況一直持續(xù)到48h，從24h到72h A2780細(xì)胞sub-G1期的細(xì)胞比例逐漸增加；與此同時(shí)，雷公藤甲素作用48h后，OVCAR-3細(xì)胞在G2/M期阻滯，一直到作用后72h，并且與A2780細(xì)胞相同的是，也有sub-G1期的細(xì)胞比例逐漸增加的趨勢(shì)。
3.4雷公藤甲素對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制作用的影響由表5可見(jiàn)，雷公藤甲素對(duì)A2780荷瘤小鼠的抑瘤率為43.29％，對(duì)OVCAR-3荷瘤小鼠的抑瘤率為23.99％，均有顯著性差異。
表5.雷公藤甲素對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制作用的影響

與對(duì)照組相比**p＜0.014討論本研究探討了雷公藤甲素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用及其作用機(jī)理。當(dāng)雷公藤甲素的濃度超過(guò)IC60時(shí)，卵巢癌細(xì)胞A2780和OVCAR-3的細(xì)胞凋亡率不隨濃度的升高而增大，而隨時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)，說(shuō)明雷公藤甲素超過(guò)IC60濃度誘導(dǎo)該卵巢癌細(xì)胞凋亡不呈劑量依賴(lài)性，而呈時(shí)間依賴(lài)性。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素對(duì)人卵巢癌A2780細(xì)胞的細(xì)胞毒作用在0.5 to 5.0ng/mL濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量和時(shí)間依賴(lài)性，一旦濃度超過(guò)這個(gè)范圍繼續(xù)增加，其細(xì)胞毒作用沒(méi)有明顯增強(qiáng)；對(duì)于人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞，當(dāng)雷公藤甲素濃度在2.5 to 10ng/mL范圍內(nèi)時(shí)，其細(xì)胞毒作用表現(xiàn)為呈劑量依賴(lài)性，超過(guò)這個(gè)濃度范圍則呈時(shí)間依賴(lài)性。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素對(duì)正常細(xì)胞如HIO-180，CCD-19Lu，J774A.1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用也表現(xiàn)呈劑量依賴(lài)性，雷公藤甲素作用人卵巢癌細(xì)胞A2780的IC50值比作用于正常細(xì)胞的IC50值低得多，雷公藤甲素分別作用于A(yíng)2780細(xì)胞后24，48，72h的IC50值比HIO-180低47，65，65倍；比CCD-19Lu細(xì)胞低65，84，85倍；比J774A.1細(xì)胞低269，165，168倍。人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞對(duì)雷公藤甲素的敏感性不及A2780細(xì)胞株，雷公藤甲素分別作用于OVCAR-3細(xì)胞后24，48，72h的IC50值比HIO-180低1.1，8.3，11倍；比CCD-19Lu細(xì)胞低1.5，8.3，14倍；比J774A.1細(xì)胞低6.3，21，28倍。提示雷公藤甲素對(duì)卵巢癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的毒性作用具有高度的選擇性，可以作為抗人卵巢癌的化療藥物。
權(quán)利要求
1.雷公藤甲素在制備抗卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及雷公藤甲素在制備抗卵巢癌藥物中的應(yīng)用。雷公藤甲素對(duì)卵巢癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的毒性作用具有高度的選擇性，用雷公藤甲素制備的抗卵巢癌藥物對(duì)卵巢癌具有較好的療效，且副作用少?？梢宰鳛榭谷寺殉舶┑幕熕幬铩?br> 文檔編號(hào)A61P35/00GK1762346SQ20051001950
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者丁虹, 李清敵, 吳建元, 馬瑤, 王黎, 付婷婷, 周惠萍 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)