專利名稱：大黃蒽醌類化合物在防治呼吸道合胞病毒感染性疾病的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大黃蒽醌類化合物的應(yīng)用，具體地說(shuō)是大黃蒽醌類化合物在防治呼吸道合胞病毒感染性疾病上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(RSV)屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，與副流感病素等同為一屬，均為單負(fù)股RNA病毒，能引起上下呼吸道疾病，是嬰幼兒和小年齡兒童急性下呼吸道感染常見(jiàn)的病原，幾乎所有2歲以下的兒童都有過(guò)RSV感染[8]。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)RSV感染是老年人和免疫抑制成人的重要病毒[9]。目前對(duì)RSV感染仍缺乏特異有效的治療方法?？共《舅幬锊《具?又名利巴韋林，Ribavirin)被證明可以用于治療RSV感染，但由于其毒性較大，只能霧化吸入，并且近年來(lái)隨著對(duì)其療效的爭(zhēng)議，使其臨床應(yīng)用受限[10]。目前尚無(wú)安全有效的抗RSV感染的疫苗，因此抗RSV藥物的研究成為近年來(lái)國(guó)際醫(yī)藥學(xué)界矚目的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要公開(kāi)毒副作用低的中藥大黃提取物——大黃蒽醌類化合物在防治呼吸道合胞病毒感性疾病的應(yīng)用。
本發(fā)明是將大黃蒽醌類化合物應(yīng)用于防治呼吸道合胞病毒感染性疾病。
所述的大黃蒽醌類化合物在防治呼吸道合胞病毒感染性疾病上的應(yīng)用，是將大黃蒽醌類化合物制成藥劑學(xué)上的任何劑型。
將大黃蒽醌類化合物制成大黃注射液，大黃總蒽醌含量為100mg/ml，每支2.0ml，臨床用于防治由呼吸道合胞病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天2次，5天一個(gè)療程。
也可將大黃蒽醌類化合物制成大黃片片劑，大黃總蒽醌含量為200mg/0.5g/片，臨床用于防治由呼吸道合胞病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
本發(fā)明用大黃蒽醌類化合物抗呼吸道合胞病毒是用不同濃度的大黃蒽醌類化合物分別體外作用于Hep-2細(xì)胞和接種在Hep-2細(xì)胞上的呼吸道合胞病毒，以病毒唑?yàn)閷?duì)照藥，觀察大黃蒽醌類化合物對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性作用和對(duì)呼吸道合胞病毒抑制作用的情況，其對(duì)Hep-2細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50為209.7μg/ml，對(duì)照為364.7μg/ml，對(duì)呼吸道合胞病毒的半數(shù)有效濃度IC50為96.7μg/ml，對(duì)照為66μg/ml。
應(yīng)用結(jié)果證實(shí)大黃蒽醌類化合物體外對(duì)接種在Hep-2細(xì)胞上的呼吸道合胞病毒有明顯的抑制作用，且存在明顯的量效關(guān)系，隨藥物濃度的增加，其抗病毒的活性增強(qiáng)，抑制率升高，經(jīng)直線回歸分析，P＜0.05，大黃蒽醌類化合物濃度在128μg/ml以上時(shí)，對(duì)呼吸道合胞病毒引起的RSV細(xì)胞病變的抑制率可達(dá)50％以上。
應(yīng)用的具體步驟是1、所用的藥物為大黃蒽醌類化合物(RAA)，細(xì)胞為Hep-2細(xì)胞，病毒為呼吸道合胞病毒RSV-long株；2、用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，用胰酶將生長(zhǎng)良好的Hep-2細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，按1×105/ml濃度分種于40孔板，每孔0.1ml。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后備用；3、觀察藥物對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性作用根據(jù)Mosmnna建立的四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)藥物對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性作用。
在培養(yǎng)長(zhǎng)成單層的細(xì)胞孔板，棄培養(yǎng)液上清，換含不同濃度的含藥維持液，每種濃度重復(fù)4孔，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5mg/ml MTT的不含血清的MEM培養(yǎng)基50μl，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO乙醇體積比為1∶1)100μl，振蕩5～10分鐘，待結(jié)晶完全溶解，置96孔酶標(biāo)測(cè)定儀上，測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的光密度OD值，并根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率，找出藥物對(duì)細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度范圍。
細(xì)胞存活率(％)＝(實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100％。
藥物對(duì)Hep-2細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，壁厚，胞漿內(nèi)顆粒增加，折光性增強(qiáng)。將不同濃度的藥物作用于細(xì)胞后的結(jié)果見(jiàn)表1表1大黃蒽醌類化合物(RAA)對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性作用Table 1 The Cytotoxity of the RAA to Hep-2 cell
4、觀察藥物對(duì)呼吸道合胞病毒增殖的抑制作用于已長(zhǎng)成單層Hep-2細(xì)胞的40孔板上，每孔接種50ul 100TCID50的RSV液，分別于33℃吸附90min，棄病毒上清。根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在藥物無(wú)毒濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的含藥維持液每孔0.2ml，然后將RSV培養(yǎng)板置33℃，5％CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE。隔天換新鮮含藥維持液。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、陽(yáng)性藥物病毒唑組和藥品組。
CPE記錄方法為-為無(wú)CPE，+為25％細(xì)胞出現(xiàn)CPE；++為50％細(xì)胞出現(xiàn)CPE；+++為75％細(xì)胞出現(xiàn)CPE；++++為100％細(xì)胞出現(xiàn)CPE。約在病毒對(duì)照+++～++++時(shí)棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5mg/ml MTT的培養(yǎng)液50μl，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后洗去MTT上清，加DMSO溶解液每孔100μl，混勻，5～10分鐘后，用酶標(biāo)儀測(cè)570nm波長(zhǎng)處的光密度OD值。并按下述公式計(jì)算藥物對(duì)RSV抑制率。
RSV對(duì)Hep-2細(xì)胞CPE表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓，折光性減弱，有合胞體形成。根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇在無(wú)毒濃度范圍內(nèi)，將藥物分別以不同的濃度進(jìn)行抑制RSV病毒實(shí)驗(yàn)，其病毒抑制率見(jiàn)表2。
表2大黃蒽醌類化合物(RAA)的抗RSV作用Table 2 The antiviral activity of Rhubarb Anthraquinone analogues to RSV
5、結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0的probit回歸法計(jì)算藥物對(duì)Hep-2細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50為209.7μg/ml，抗呼吸道合胞病毒的半數(shù)有效濃度IC50為96.7μg/ml，藥物的治療指數(shù)Tl為2.3，說(shuō)明大黃蒽醌類化合物在Hep-2細(xì)胞中對(duì)呼吸道合胞病毒有較強(qiáng)的抑制作用。
大黃蒽醌類化合物是從我國(guó)的中藥大黃提取分離得到的，大黃在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，自然資源豐富，原料大黃易得，大黃蒽醌類化合物抗呼吸道合胞病毒的作用強(qiáng)，對(duì)人體的毒副作用小，加工提取工藝成熟，可以制成針劑、片劑等劑型，應(yīng)用到呼吸道合胞病毒感染性疾病的防治上。
(四)具體實(shí)施例實(shí)施例1將大黃蒽醌類化合物制成針劑大黃注射液，大黃總蒽醌含量100mg/ml，每支2.0ml，臨床用于防治由呼吸道合胞病毒引起的疾病，用法每次2.0ml，肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天2次，5天一個(gè)療程。
實(shí)施例2將大黃蒽醌類化合物制成大黃片片劑，大黃總蒽醌含量200mg/0.5g/片，臨床用于防治由呼吸道合胞病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
權(quán)利要求
1.大黃蒽醌類化合物在防治呼吸道合胞病毒感染性疾病的應(yīng)用，其特征是將大黃蒽醌類化合物應(yīng)用于防治呼吸道合胞病毒感染性疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大黃蒽醌類化合物在防治呼吸道合胞病毒感染性疾病的應(yīng)用，其特征是將大黃蒽醌類化合物制成藥劑學(xué)上的任何劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大黃蒽醌類化合物在防治呼吸道合胞病毒感染性疾病的應(yīng)用，其特征是將大黃蒽醌類化合物制成大黃注射液，大黃總蒽醌含量100mg/ml，每支2.0ml，臨床用于治療由呼吸道合胞病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天2次，5天一個(gè)療程。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大黃蒽醌類化合物在防治吸道合胞病毒感染性疾病的應(yīng)用，其特征是將大黃蒽醌類化合物制成大黃片劑，大黃總蒽醌含量200mg/0.5g/片，臨床用于防治由呼吸道合胞病毒引起的疾病，用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
全文摘要
大黃蒽醌類化合物在防治呼吸道合胞病毒感染性疾病上的應(yīng)用，是將大黃蒽醌類化合物制成藥劑學(xué)上的任何劑型應(yīng)用于防治呼吸道合胞病毒引起的疾病。大黃蒽醌類化合物對(duì)Hep－2細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC
文檔編號(hào)A61K9/20GK1843340SQ20051002068
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月6日
發(fā)明者羅偉生, 徐慶, 張奉學(xué), 蘇小建, 劉衛(wèi)兵, 唐祖年, 梁榮感, 李麗亞, 韋京辰 申請(qǐng)人:桂林醫(yī)學(xué)院