專利名稱：馬抗血清的制備純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬抗血清(抗毒素)的制備、純化工藝。
背景技術(shù)：
馬抗血清(抗毒素)是由相應(yīng)毒素或類毒素(包括細(xì)菌、病毒)免疫動物所得的免疫血清(血漿)，經(jīng)胃蛋白酶消化硫酸銨鹽析制得的免疫球蛋白制劑。目前，馬抗血清(抗毒素)的制備方法包括下述步驟1、用蒸餾水將各種抗血清的免疫血漿稀釋，并用胃酶進(jìn)行消化處理得消化液；2、將消化液進(jìn)行第一次沉淀及加溫處理，在消化液中加入硫酸銨，并調(diào)節(jié)pH值，然后將消化液加溫并保持，再降溫，過濾收集上清夜，廢棄沉淀；3、將上述清液進(jìn)行第二次沉淀過濾，即在上述上清液中加入硫酸銨，靜置后過濾取沉淀物，棄上清液；4、明礬沉淀；即將上述沉淀物稀釋，再在稀釋液中加明礬，靜置后過濾取上清液，沉淀物廢棄；5、將上述上清液濃縮即可制得抗血清原液。但該工藝的不足之處是制備的抗血清純度[F(ab)2含量、比活性(IU/gp)]較低，馬血清過敏反應(yīng)率和血清病的發(fā)生率較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，提供一種提高馬抗血清(抗毒素)制劑純度[F(ab)2含量、比活性(IU/gp)]的制備工藝。
本發(fā)明提供了一種馬抗血清(抗毒素)的制備純化工藝，該工藝包括下述步驟(1)消化步驟用免疫血漿消化工藝將免疫血漿消化；(2)第一次沉淀過濾處理步驟將上述處理的消化液中加入硫酸銨形成混懸液，并調(diào)節(jié)pH值為4.8-5.2，然后將混懸液加溫并保持，再降溫，過濾收集上清液，廢棄沉淀；(3)第二次沉淀過濾處理步驟，將上述(2)步的上述清液調(diào)整pH值為7.0-7.4，加入硫酸銨進(jìn)行第二次沉淀，靜置后過濾取沉淀物，棄上清液；(4)明礬沉淀；即將上述(3)步的沉淀物稀釋至蛋白含量不超過2g/L，再調(diào)整稀釋液pH值為7.7-7.9，加明礬進(jìn)行沉淀，靜置后過濾取上清液，沉淀物廢棄；(5)將上述上清液用硫酸銨沉淀法或超濾法濃縮制得抗血清原液；(6)離子交換劑吸附純化
1)用陰離子交換劑裝柱，用pH值為7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；2)將用0.45μm的膜進(jìn)行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用pH值為7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液(酸性雜質(zhì)被吸附在層析介質(zhì)上，F(xiàn)(ab)2流穿)；3)用2M NaCl清洗柱體后，用20％乙醇洗柱，使介質(zhì)浸泡其中保存；4)將穿透液超濾濃縮調(diào)整抗血清濃度，調(diào)整蛋白含量不超過170g/L，按調(diào)整后制品總量，加氯化鈉使最終含量為750-950g/L，加三氯甲烷使最終含量不超過5g/L或硫柳汞0.1g/L或間甲酚2.5g/L為防腐劑，調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0，用0.22um濾膜除菌過濾。
所述的馬抗血清(抗毒素)包括破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素、氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗狂犬病血清、抗蛇毒血清等。
所述的離子交換劑為SP、Q、CM、DEAE、ANX Sepharose Fast Flow中的一種。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1、有效提高馬抗血清(抗毒素)制劑的純度，主要體現(xiàn)在F(ab)2含量和比活性(IU/gp)，如下表(一)，表(二)所示表一

表二


2、有效降低馬抗血清(抗毒素)制劑由于異種蛋白引起的過敏反應(yīng)和血清病的發(fā)生率。
具體的實(shí)施方式實(shí)例1馬抗血清(抗毒素)的制備純化工藝1、消化將免疫血漿用蒸餾水稀釋2-4倍，用1-2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0-3.6，加入適量胃酶及甲苯0.2％(ml/ml)，于29-31℃消化1-1.5小時(shí)。
2、第一次沉淀及加溫處理將上述處理的每100ml消化液中加入硫酸銨15g，白喉及破傷風(fēng)抗毒素用1-2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.0-5.4；抗蛇毒血清、氣性壞疽及肉毒抗毒素調(diào)節(jié)pH至4.8-5.2，抗蛇毒血清、白喉、破傷風(fēng)、氣性壞疽抗毒素加溫至57±1℃；肉毒抗毒素加溫至51±1℃，均保持30分鐘。加溫完畢，盡快降溫至45℃以下，過濾，取清液。
3、第二次沉淀上述清液用1-2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0-7.4，每100ml加硫酸銨20g；攪拌均勻后靜止30分鐘，過濾，取沉淀。
4、明礬沉淀上述沉淀用水稀釋至蛋白含量不超過2g/L，每100ml加入10％明礬液6-10ml，用1-2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.7-7.9，過濾，取清液。
5、濃縮將上述清液混合，通過超濾裝置進(jìn)行超濾，濃縮至硫酸銨含量為0.1％(g/ml)以下，即為抗血清原液。
離子交換劑吸附純化(1)用DEAE Sepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；(2)將用0.45μm的膜進(jìn)行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用pH值為7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液(酸性雜質(zhì)被吸附在層析介質(zhì)上，F(xiàn)(ab)2流穿)；(3)用2M NaCl清洗柱體后，用20％乙醇洗柱，使介質(zhì)浸泡其中保存。
(4)將穿透液超濾濃縮調(diào)整抗血清濃度(抗體效價(jià))，調(diào)整蛋白含量不超過170g/L。按調(diào)整后制品總量，加氯化鈉使最終含量為750-950g/L，加三氯甲烷使最終含量不超過5g/L，硫柳汞0.1g/L或間甲酚2.5g/L為防腐劑。調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0。用0.22um濾膜除菌過濾。
7、結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種馬抗血清的制備純化工藝，該工藝包括下述步驟(1)消化步驟用免疫血漿消化工藝將免疫血漿消化；(2)第一次沉淀過濾處理步驟將上述處理的消化液中加入硫酸銨形成混懸液，并調(diào)節(jié)pH值為4.8-5.2，然后將混懸液加溫并保持，再降溫，過濾收集上清液，廢棄沉淀；(3)第二次沉淀過濾處理步驟將上述(2)步的上述清液pH值調(diào)整為7.0-7.4，加入硫酸銨進(jìn)行第二次沉淀，靜置后過濾取沉淀物，棄上清液；(4)明礬沉淀即將上述(3)步的沉淀物稀釋至蛋白含量不超過2g/L，再調(diào)整稀釋液pH值為7.7-7.9，加明礬進(jìn)行沉淀，靜置后過濾取上清液，沉淀物廢棄；(5)將上述上清液用硫酸銨沉淀法或超濾法濃縮制得抗血清原液；(6)離子交換劑吸附純化1)用陰離子交換劑裝柱，用pH值為7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；2)將用0.45μm的膜進(jìn)行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用pH值為7.0±0.2，0.15M NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質(zhì)被吸附在層析介質(zhì)上，F(xiàn)(ab)2流穿；3)用2M NaCl清洗柱體后，用20％乙醇洗柱，使介質(zhì)浸泡其中保存；4)將穿透液超濾濃縮調(diào)整抗血清濃度，調(diào)整蛋白含量不超過170g/L，按調(diào)整后制品總量，加氯化鈉使最終含量為750-950g/L，加三氯甲烷使最終含量不超過5g/L或硫柳汞0.1g/L或間甲酚2.5g/L為防腐劑，調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0，用0.22um濾膜除菌過濾。
2.如權(quán)利要求1所述的馬抗血清的制備純化工藝，其特征在于其中所述的馬抗血清包括破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素、氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗狂犬病血清或抗蛇毒血清。
3.如權(quán)利要求1所述的馬抗血清(抗毒素)的制備純化工藝，其特征在于所述的陰離子交換劑為SP、Q、CM、DEAE或ANX Sepharose Fast Flow。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種馬抗血清(抗毒素)的制備、純化工藝，該工藝包括免疫血漿消化處理、兩次加硫酸銨的沉淀和第三次的吸附沉淀、濃縮等步驟，本發(fā)明采用離子交換劑柱層析吸附純化；可除去F(ab)
文檔編號A61K39/295GK1709506SQ20051002631
公開日2005年12月21日 申請日期2005年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月31日
發(fā)明者李景玉, 張庶民 申請人:李景玉, 張庶民