一種蛋白a免疫親和柱的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分離材料技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種蛋白A免疫親和柱的制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的中流砥柱。1986年，美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市 了第一個(gè)抗體藥Orthoclone 0KT3用于治療移植物抗宿主病(GVHD)，翻開了生物醫(yī)藥歷史 嶄新的一頁(yè)。2003年，市場(chǎng)對(duì)單克隆抗體的需求量為幾克到幾千克不等，約占生物藥品的 20%(Journal of Chromatography B，2007,848(l) :97_107)。2015年，超過(guò)25種抗體藥物被 FDA批準(zhǔn)用于治療人類的疾病，臨床試驗(yàn)近千例（Journal of Chromatography B，2015， 983-984:26-31)。開發(fā)工藝簡(jiǎn)便、適于大規(guī)模生產(chǎn)的抗體純化材料成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研 究熱點(diǎn)之一。
[0003] 由于硅膠具有耐高壓、耐高流速和性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，二十世紀(jì)七八十年代，研究者 采用無(wú)定型硅膠或無(wú)孔硅膠開發(fā)鍵合蛋白A材料（美國(guó)發(fā)明專利4681870 ; Journal of Immunological Methods，1987,101(2):209-217;Artificial Organs，1989,13(1):71-77; Journal of Chromatography A，1989，476: 195-203)，IMRE Corporation開發(fā)的商品柱 PR0S0RBA? columns (Seattle，WA)在臨床得到應(yīng)用，但普遍存在蛋白A偶聯(lián)量低、抗體結(jié)合 能力差(0.1~5 mg)和效率低等不足。1990年，Kuroda等首次報(bào)道孔徑為2~50 nm的介孔硅膠 (Bull Chem,1990, 63：988-992；Journal of the Chemical Society, Chemical Communications，1993，8:680-682)。介孔硅膠具有很高的比表面積和大的孔體積，傳質(zhì)擴(kuò) 散性能優(yōu)良，在蛋白A復(fù)合材料制備及純化生物大分子和抗體中得到良好的應(yīng)用(Journal of Chromatography A,2007,1161(1-2)：36~40；Journal of Materials Chemistry,2009, 19(14):2013;Analytical Biochemistry，2011，409(l):123-129)〇
[0004] 將蛋白A偶聯(lián)到硅膠基質(zhì)的文獻(xiàn)方法主要有：鹵代烷烴偶聯(lián)法（Journal of Chromatography A，2007，11 6 1 ( 1 _2 ) : 36-40 )、戊二酉簽偶耳關(guān)法（Journa 1 of Chromatographic Science，2011，49(2):148-153)、席夫喊偶聯(lián)法（Analytical Biochemistry，2010，406(2) : 235-237)和琥泊酰亞胺偶聯(lián)法(Analytical Biochemistry， 2011,409(1):123-129)等。它們各具特色，又有不足，如反應(yīng)步驟復(fù)雜、條件苛刻、或反應(yīng)時(shí) 間長(zhǎng)，以及在柱外進(jìn)行蛋白A偶聯(lián)再轉(zhuǎn)移裝柱，不利于規(guī)模化生產(chǎn)，更為重要的是，復(fù)雜的反 應(yīng)步驟和繁瑣的操作可能導(dǎo)致蛋白A變性失活，降低經(jīng)濟(jì)效益。
[0005] 1，1' -羰基二咪唑較多應(yīng)用在蛋白質(zhì)的固定中，偶聯(lián)反應(yīng)的效率高，反應(yīng)時(shí)間短 (Journal of Biological Chemistry, 1979，254(8):2572;Journal of Separation Science,2013,36(8)： 1343-1348；Chinese Journal of Analytical Chemistry,2012,40 (1) : 89-94;)。中國(guó)發(fā)明專利200610123710.9公開了一種為羰基二咪唑偶聯(lián)法合成瓊脂糖 基的蛋白A親合柱;Bencina等用羰基二咪唑偶聯(lián)法將蛋白A結(jié)合到甲基丙稀酸酯整體柱上， 蛋白A的偶聯(lián)量遠(yuǎn)高于其它方法（Journal of Separation Science，2004,27(10_ll) :811- 818)。然而，尚未見(jiàn)以1，Γ -羰基二咪唑?yàn)榕悸?lián)劑，柱上衍生法將蛋白Α固定到多孔硅膠的 報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明根據(jù)目前蛋白A免疫親和柱生產(chǎn)周期長(zhǎng)、反應(yīng)條件苛刻、轉(zhuǎn)移操作繁瑣、難 以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、以及單位蛋白A純化抗體量低等不足，提供了一種蛋白A免疫親和柱的制備 方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明提供了一種蛋白A免疫親和柱的制備方法，包括如下步驟： 51. 將多孔硅膠與3-三氨丙基三乙氧基硅烷得到改性硅膠； 52. 將S1中所得改性硅膠裝柱，利用1，1'_羰基二咪唑(CDI)作為偶聯(lián)劑，在柱內(nèi)與蛋 白Α發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，即得所述蛋白Α免疫親和柱； 所述S1中硅膠的粒徑為40 μL?，孔徑為100 nm; 所述S2中蛋白A的偶聯(lián)濃度按改性硅膠質(zhì)量計(jì)為10.0~75.0 mg/g。
[0008] 本發(fā)明所述路線如下所示：
載體的孔隙是配體向待分離大分子接近的運(yùn)動(dòng)通道，對(duì)吸附材料的親和能力有很大影 響，并且這一影響與配體分子及待分離大分子的大小有關(guān)，因而親和吸附材料基質(zhì)的孔徑 選擇極為重要。其適中的比表面積和較大的孔徑尺寸的有利于蛋白A結(jié)構(gòu)的舒展和抗體分 子自由進(jìn)出孔道內(nèi)，大大降低傳質(zhì)阻礙，達(dá)到較高的吸附能力。
[0009] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硅膠孔徑為40 μπι，粒徑為100nm時(shí)，較其它孔粒徑的硅膠能獲得 更好的效果。
[0010] 另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)蛋白A的偶聯(lián)濃度會(huì)影響蛋白A的偶聯(lián)量和免疫親和柱純化抗 體的能力。
[0011]因此，只有在載體孔徑和粒徑合適的前提下，采用適當(dāng)濃度的蛋白A與改性硅膠發(fā) 生偶聯(lián)，才能獲得抗體純化的最佳效果。
[0012]所述S2中蛋白A的加入量在20.0~50.0 mg/g范圍（按改性硅膠質(zhì)量計(jì)）。本申請(qǐng) 人發(fā)現(xiàn)在上述蛋白A的量在20.0~50.0 mg/g(按改性硅膠質(zhì)量計(jì))范圍內(nèi)，其偶聯(lián)量較10~75 mg/g(按改性硅膠質(zhì)量計(jì))范圍內(nèi)蛋白A的偶聯(lián)量、覆蓋率和結(jié)合兔IgG量均有提升。
[0013]更優(yōu)選地，所述S2中蛋白A的量在30.0~50.0 mg/g的范圍（按改性硅膠質(zhì)量計(jì)）。即 在該條件下，蛋白A在改性硅膠上的偶聯(lián)量、覆蓋率和結(jié)合兔IgG量進(jìn)一步提升。
[0014]更優(yōu)選地，所述S2中蛋白A的量為40.0 mg/g (按改性硅膠質(zhì)量計(jì)）。
[0015] 本發(fā)明以1，Γ -羰基二咪唑?yàn)榕悸?lián)劑，柱上衍生法將蛋白A偶聯(lián)到多孔硅膠基質(zhì)； 在優(yōu)化的蛋白A初始條件下進(jìn)行生產(chǎn)，蛋白A免疫親和柱能在較高的流速下純化抗體，效率 顯者提尚。
[0016] 通過(guò)本發(fā)明提供的蛋白A免疫親和柱，在硅膠粒徑為40 μπι，孔徑為100 nm，蛋白A 的加入量為40 mg/g(按改性硅膠質(zhì)量計(jì)），所述親和柱表面覆蓋率30.1 nmol/m2,兔IgG的 結(jié)合量達(dá)到27.4 mg/g(按改性硅膠質(zhì)量計(jì)），洗脫液中兔IgG純度為92%~95%，說(shuō)明本發(fā)明制 備的蛋白A免疫親和柱具有優(yōu)異的偶聯(lián)和純化抗體效果，應(yīng)用前景良好。
[0017] 優(yōu)選地，所述S1中硅膠與3-氨丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)的質(zhì)量體積比為1: 1.5;所 述s 1中溶劑為甲苯，所述反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)，所述反應(yīng)時(shí)間為4 h。
[0018] 優(yōu)選地，所述S2中改性硅膠以乙腈-異丙醇的混合液為勻漿液、甲醇為頂替液進(jìn)行 裝柱，所述乙腈與異丙醇的體積比為1: 1。
[0019]優(yōu)選地，所述S2中以乙腈沖改性硅膠柱5~15 min，然后以1，Γ -羰基二咪唑的乙腈 溶液循環(huán)沖柱5~30 min，再以溶有蛋白A的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)循環(huán)沖柱20~40 min，最后 使用pH 7.0、50 mM的PBS溶液循環(huán)沖柱5~15 min;所述溶解蛋白A的PBS溶液的pH為7.0,摩 爾濃度為10 mM; 所述S2中所述1，Γ-羰基二咪唑的質(zhì)量與乙腈的體積比為1:30。
[0020] 同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明通過(guò)選用粒徑與孔徑合適的多孔硅膠基質(zhì)填柱，有利于蛋白A與抗體分子的結(jié) 合作用，降低了傳質(zhì)阻礙，提高了蛋白A免疫親和柱耐受高壓和高流速的性能，有利于實(shí)現(xiàn) 大規(guī)模的抗體純化。采用羰基咪唑偶聯(lián)法柱上鍵合蛋白A，制備工藝簡(jiǎn)便、連續(xù)，條件溫和， 減少了合成過(guò)程中的轉(zhuǎn)移操作，有利于保持配體活性和實(shí)現(xiàn)蛋白A免疫親和材料的連續(xù)化 生產(chǎn)。對(duì)蛋白A的偶聯(lián)濃度進(jìn)行了優(yōu)化，有利于提高昂貴的蛋白A的利用率，節(jié)約成本。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為實(shí)施例8中蛋白A的HPLC譜圖； 圖2為實(shí)施例8中蛋白A的濃度與HPLC色譜峰間的關(guān)系圖； 圖3為實(shí)施例8中IgG的濃度與其在280 nm處的吸光度值間的關(guān)系圖； 圖4為用施例5中的蛋白A親和柱提純的IgG電泳圖； 圖5為用實(shí)施例1和實(shí)施例7中的蛋白A親和柱提純的IgG電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員 可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
[0023] 除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè) 備。
[0024] 實(shí)施例1在含有40.0 g多孔硅膠(粒徑40 μL?，孔徑10 nm)的無(wú)水甲苯溶液中加入 60.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)加熱反應(yīng)4h，索式洗滌后真空干燥得到氨基改 性的硅膠（即改性硅膠）。以體積比1:1的乙腈-異丙醇混合液為勻漿液、甲醇為頂替液，在14 MPa壓力下將2.0 g改性硅膠裝填入不銹鋼柱管內(nèi)。然后，將裝填硅膠的不銹鋼柱連接到液 相栗上，先以乙腈沖柱10 min，接著以2.0 g 1，Γ-羰基二咪唑的60 mL乙腈溶液循環(huán)沖柱 15 min，再以溶有40.0 mg蛋白A的10 mL PBS溶液(pH 7.0,10 mM)循環(huán)沖柱30 min，繼續(xù) 以10 mL PBS溶液(pH 7.0,50 mM)循環(huán)沖柱lOmin洗除未鍵合的蛋白A，4°C保存。
[0025] 實(shí)施例2在含有40.0 g多孔硅膠(粒徑40 μπι，孔徑100 nm)的無(wú)水甲苯溶液中加 入60.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)加熱反應(yīng)4h，索式洗滌后真空干燥得到氨基 改性的硅膠（即改性硅膠）。以體積比1:1的乙腈-異丙醇混合液為勻漿液、甲醇為頂替液，在 14 MPa壓力下將2.0 g改性硅膠裝填入不銹鋼柱管內(nèi)。然后，將裝填硅膠的不銹鋼柱連接到 液相栗上，先以乙腈沖柱10 min，接著以2.0 g 1，1'_羰基二咪唑的60 mL乙腈溶液循環(huán)沖 柱15 min，再以溶有40.0 mg蛋白A的10 mL PBS溶液(pH 7.0，10 mM)循環(huán)沖柱30 min，繼 續(xù)以10 mL PBS溶液(pH 7.0,50 mM)循環(huán)沖柱lOmin洗除未鍵合的蛋