專利名稱：一種丹酚酸b有效干預口腔癌動物模型的方法
技術領域：
本發(fā)明關于活血化淤中藥干預口腔癌動物模型的方法，特別關于丹酚酸B干預口腔癌動物模型的方法。
背景技術：
口腔癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。由于其易轉移，預后差，口腔癌的預防尤為重要。癌化學預防目前已經(jīng)成為降低口腔癌發(fā)生率最有希望的手段之一。鑒于癌化學預防藥物的長期應用性，開發(fā)以天然植物或食物為基礎的藥物是當前癌化學預防的方向所在。
活血化淤是中醫(yī)治療腫瘤的基本治則之一。臨床研究表明活血化淤藥有改善微循環(huán)、抗凝血、抑制癌細胞生長和轉移、提高機體免疫功能等多種作用。長期的臨床實踐也證實，運用活血化淤藥治療各種腫瘤可獲得較好的結果。
在眾多的活血化瘀中藥中，丹參是臨床中最為常用的一味活血化淤藥。目前對于丹參保護心臟微血管內皮細胞、抑制血管內皮生長因子的血管通透性、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用方面已有深入的研究，并認為丹參酮是丹參中主要的抗腫瘤成分。丹酚酸B是丹參水溶性成分中含量最高、活血化瘀作用最強的一種。對于丹酚酸B是否同樣具有抗腫瘤作用，目前尚無系統(tǒng)的研究報道。
血管生成對腫瘤的生長和轉移起著重要的作用。研究結果表明，腫瘤相關性血管的生成始于癌前病變階段，這些新生血管與癌前病損的惡性轉變密切相關，并認為癌前病變進展到血管期可能是細胞惡性轉變的重要步驟。周曾同等對金地鼠頰囊癌變模型的癌變全過程進行觀察發(fā)現(xiàn)白斑作為一種癌前病變，伴隨其上皮異常增生程度的加重，即有血管生成。因此，通過抗血管生成治療很有可能抑制一些癌前病變如口腔白斑的惡性轉變，從而達到預防口腔癌的目的。
反應停最初是以一種鎮(zhèn)靜止吐藥物上市的。由于其具有嚴重的致畸作用，上市不久該藥就被禁止使用了。近年來，研究顯示反應停具有明顯抑制血管生成的作用，而且目前已有大量的研究證實該藥抗血管生成的作用能抑制腫瘤中新生血管的生成，進而抑制腫瘤的生長。然而有關該藥對口腔癌的作用，尚缺乏完整的資料。
本發(fā)明使用口腔癌動物模型，初步探討丹酚酸B和反應停對口腔癌的防治功效，為活血化淤中藥和血管抑制劑在癌化學預防及腫瘤治療中的應用提供科學理論依據(jù)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種丹酚酸B有效干預口腔癌動物模型的方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方法來實現(xiàn)的(1)建立口腔癌動物模型、(2)丹酚酸B藥物干預、(3)組織學檢查、(4)病理評價。在口腔癌和癌前病變的研究中，需要提供一個重復性好、穩(wěn)定又容易建立的、具有與人類口腔癌和癌前病變相似生長特性和生物學行為的動物模型。DMBA誘導的金地鼠頰囊癌變模型是深入研究口腔癌前病變和口腔癌的理想工具，其發(fā)生發(fā)展以及組織學的變化過程與人口腔癌的發(fā)展過程極為相似，可再現(xiàn)口腔癌發(fā)生過程中的多個步驟，即正常上皮，單純性上皮增生，異常增生，原位癌，和浸潤癌。
本發(fā)明結果顯示給予金地鼠頰囊黏膜連續(xù)6周DMBA刺激后，在第18周時，金地鼠頰囊黏膜表現(xiàn)出白斑樣損害、乳頭狀瘤和癌三種病損，其上皮可表現(xiàn)出正常、單純性增生、異常增生和鱗狀細胞癌等多種組織病理學表現(xiàn)。本發(fā)明中陽性對照組鱗癌的發(fā)生率為47.1％，其中約70％的鱗癌是從乳頭狀瘤發(fā)展而來。這一結果與Ning Li等報道的結果相近。然而，本發(fā)明癌變率明顯較以往報道的癌變率低，以往報道的癌變率大多在75％以上。分析其原因可能與本發(fā)明致癌劑誘導的時間和停止誘導后觀察的時間較短有關。本發(fā)明涂DMBA的時間僅有6周，停涂致癌劑后觀察12周。而以往的研究涂致癌劑的時間為12-16周，停止DMBA刺激后繼續(xù)觀察8-14周。本發(fā)明僅給金地鼠頰囊黏膜6周的DMBA刺激的目的在于誘導形成口腔癌誘癌晚期階段模型，用該模型模擬臨床上具有口腔白斑等癌前病變以及曾經(jīng)接觸過致癌劑的口腔癌高危人群，如有吸煙史或正在吸煙的人群。
本發(fā)明結果還顯示丹酚酸B將金地鼠頰囊粘膜癌誘癌晚期模型的癌變率從47.1％降低到5.6％，可見該藥能有效防止金地鼠頰囊黏膜從癌前階段向癌演變，對金地鼠頰囊粘膜的癌變過程表示出顯著的阻斷作用。盡管從病理檢查結果來看，丹酚酸B組有相當一部分動物的頰囊粘膜上皮表現(xiàn)出不同程度的異常增生，不排除隨時間的延長這些動物中部分甚至全部有癌變的可能性(這有待于在以后的實驗中延長實驗觀察時間來證實)，但丹酚酸B防止金地鼠頰囊粘膜癌變的有效性仍然是顯而易見的，至少它在早期能顯著抑制頰囊粘膜癌變，推遲頰囊粘膜癌出現(xiàn)的時間。
活血通經(jīng)、改善微循環(huán)是丹酚酸B的主要功效之一。已知缺氧是機體內血管生成的一種啟動信號，它可以通過缺氧誘導因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)誘導一系列血管生成因子的表達，如血管內皮生長因子(VEGF)，胰島素樣生長因子(insulin-likegrowth factor)，可誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase)等。由此推測丹酚酸B通過改善全身和局部組織的血液循環(huán)，增加組織的血供和營養(yǎng)，改善局部的缺氧狀況，避免HIF-1α的激活，進而抑制血管生成因子的表達，避免血管生成開關的開啟。已有報道丹酚酸B在體外能顯著抑制血管內皮生長因子(VEGF)誘導的血管通透性增高作用。至于丹酚酸B是否還影響到與腫瘤血管生成過程中其它一些相關的生長因子，以及HIF-1α是否參與丹酚酸B預防口腔癌前病變癌變以及其具體的作用機制，我們正在進行進一步的研究。
另一方面，丹酚酸B還具有很強的抗脂質氧化和自由基清除作用。這兩種機制是否也參與了丹酚酸B防止口腔癌前病變的癌變過程，尚需要進一步的研究加以探討。
本發(fā)明顯示反應停能顯著抑制金地鼠頰囊黏膜癌的形成，將患癌率從47.1％降低到5.9％。這一結果與Hoon Myoung等的結果出入較大。Hoon等在口腔癌的移植瘤模型中沒有觀察到反應停對口腔癌生長的抑制作用。我們推測這可能與實驗所選用的動物模型和實驗設計的差異有關。移植瘤模型形成的是異位腫瘤，這種腫瘤在生物特性和血管生成等方面與發(fā)生在口腔內的腫瘤相比可能具有較大的差異。而且，目前已有學者提出抗血管生成藥物的抗血管特性也具有器官特異性，這種特性可能也是造成反應停不能抑制移植于老鼠皮膚下的口腔癌生長的原因之一。然而，本發(fā)明中值得注意的一個問題是，反應停組有3只動物在實驗中途出現(xiàn)單側眼瞼麻痹，不能睜眼，同側上肢淤血、僵硬、壞死最后感染致死的情況。我們推測這可能是單側肢體發(fā)生靜脈栓塞造成的。而其它幾組動物都未出現(xiàn)這種情況。由此可見，反應停雖然具有顯著的抗腫瘤作用，但其毒副作用較大，也是在臨床使用中不可忽視的一個問題。
至于丹酚酸B和反應停對口腔癌的抑制作用還有待于在今后的研究中進一步加以證實，其具體的抑癌機制也有待于深入的研究。
本發(fā)明所公開一種丹酚酸B有效干預口腔癌動物模型的方法其優(yōu)點表現(xiàn)在(1)合理地選用DMBA誘導金地鼠頰囊癌變模型，本發(fā)明僅給金地鼠頰囊黏膜6周的DMBA刺激的目的在于誘導形成口腔癌誘癌晚期階段模型，用該模型模擬臨床上具有口腔白斑等癌前病變以及曾經(jīng)接觸過致癌劑的口腔癌高危人群，如有吸煙史或正在吸煙的人群；(2)本發(fā)明藥物干預時間從第7周開始連續(xù)12周，實驗時間適中，便于本發(fā)明實施；(3)本發(fā)明選用藥量為10mg.kg-1.d-1，灌服途徑作用于動物，充分發(fā)揮了丹酚酸B的作用效果。


圖1顯示正常頰囊黏膜(HE染色，放大倍數(shù)400)圖2顯示單純性增生(HE染色，放大倍數(shù)400)圖3顯示異常增生(HE染色，放大倍數(shù)400)圖4顯示乳頭狀瘤(HE染色，放大倍數(shù)100)圖5顯示乳頭狀瘤癌變(HE染色，放大倍數(shù)100)圖6顯示鱗癌(HE染色，放大倍數(shù)100)具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1一.實驗動物和藥品1.實驗動物的選擇和分組6-8周齡，體重80-100克的雄性敘利亞金黃地鼠80只，清潔級，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供〔許可證號SCXK(滬)2002-2003〕。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼以金地鼠專用飼料，飲用水為蒸餾水。隨機分為A、B、C、D和E5組，A、B和C組各20只，D組和E組各10只。
2.化學致癌劑將二甲基苯丙蒽(7，12-Dimethylbenz(a)anthracene，DMBA)(sigma)與分析純丙酮溶液配制成5g/L的DMBA溶液。
3.藥物丹酚酸B原藥由第二軍醫(yī)大學藥學院天然藥化教研室提供并鑒定。反應停原藥由常州制藥廠提供。
二.實驗方法1.口腔癌動物模型的建立用大直鑷翻開金地鼠右側頰囊，用蘸有0.5％DMBA丙酮溶液的1號油畫筆在頰囊中心1cm×1cm的范圍內作10次圓周運動。涂藥后禁食禁水2小時。每周一、三、五各涂藥1次，共涂6周。
2.藥物干預(1)A組從第1周至第6周，按上述方法誘導口腔癌。從第7周開始連續(xù)12周每日灌服1ml生理鹽水，作為陽性對照組。
(2)B組前六周處理同A組。從第7周開始連續(xù)12周每日灌服丹酚酸B溶液。給藥量定為成人常規(guī)用量的10倍，即10mg.kg-1.d-1。
(3)C組前六周處理同A組。從第7周開始連續(xù)12周每日灌服反應?；鞈乙?。給藥量為100mg.kg-1.d-1。
(4)D組前六周，每周一、三、五在金地鼠右側頰囊涂布丙酮溶液。從第7周開始每日灌服生理鹽水1ml，共12周，作為溶劑對照組。
(5)E組整個實驗期間正常飼養(yǎng)，不做任何處理，作為空白對照組。
3.組織學檢查和病理評判標準(1)組織學檢查切取金地鼠右側頰囊病變組織約1.0cm×1.0cm大小，10％中性甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片并作HE染色。
組織學觀察結果6周時，部分DMBA處理過的動物頰囊表面局部可見粗糙、顆粒狀的表現(xiàn)，伴有不同程度的充血，少數(shù)有白斑樣損害，但這些動物中沒有腫瘤產(chǎn)生。
18周時，DMBA處理過的動物頰囊黏膜在組織學上表現(xiàn)為單純性增生(圖2)、異常增生(圖3)、乳頭狀瘤(圖4)和鱗癌(圖5和圖6)。在形成的鱗癌中，約70％是從乳頭狀瘤發(fā)展而來(圖5)。A組有3只動物死亡，8只動物發(fā)生腫瘤，均為鱗狀上皮細胞癌，有3只動物表現(xiàn)出上皮輕度異常增生，4只表現(xiàn)出上皮中度異常增生，1只表現(xiàn)出上皮重度異常增生。B組有2只動物死亡，1只動物發(fā)生鱗狀上皮細胞癌，有3只動物的頰囊上皮表現(xiàn)為單純性增生，11只動物表現(xiàn)出上皮輕度異常增生，2只動物表現(xiàn)出上皮中度異常增生，1只表現(xiàn)出上皮重度異常增生。C組有3只動物死亡，1只動物發(fā)生鱗狀上皮細胞癌，有4只動物的頰囊上皮表現(xiàn)為單純性增生，8只動物表現(xiàn)出上皮輕度異常增生，2只動物表現(xiàn)出上皮中度異常增生，2只表現(xiàn)出上皮重度異常增生。3只中途死亡的動物在死亡之前皆出現(xiàn)一側上肢淤血、僵硬最后壞死的情況，同時還伴有同側眼瞼麻痹，不能睜眼的情況。D組有3只動物頰囊黏膜表現(xiàn)為炎癥，其余7只為正常。E組動物的病理觀察結果均為正常上皮。與A組相比，丹酚酸B組和反應停組的癌發(fā)生率明顯降低(分別是47.1％、5.6％和5.9％)(p＜0.005)。
(2)病理評價標準根據(jù)WHO口腔癌前病變協(xié)作中心12項診斷標準及病變累及上皮的范圍進行分級診斷，雙人復核。
各組動物頰囊粘膜的病理觀察結果詳見表1。
表1.各實驗組頰囊黏膜不同病理狀態(tài)的分布情況

·代表治療組與A組中相同病理狀態(tài)發(fā)生率進行比較的統(tǒng)計學差異(·代表P＜0.05；··代表P＜0.005)4.統(tǒng)計分析各實驗組的腫瘤發(fā)生率用卡方檢驗進行比較。當P值＜0.05時記為差異有統(tǒng)計學意義。所有的統(tǒng)計分析均采用SPSS 10.0軟件進行。
權利要求
1.一種丹酚酸B有效干預口腔癌動物模型的方法，其特征在于包括以下步驟(1)建立口腔癌動物模型(2)丹酚酸B藥物干預。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于(1)步驟中使用金地鼠建立口腔癌金地鼠模型。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于(1)步驟中使用0.5％DMBA丙酮溶液建立口腔癌金地鼠模型。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于(1)步驟中0.5％DMBA丙酮溶液涂用6周。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于(2)步驟中從第7周開始連續(xù)12周每日灌服丹酚酸B溶液。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于(2)步驟中丹酚酸B溶液使用量為10mg·kg-1·d-1。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于進一步包括(3)步驟組織學檢查。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于進一步包括(4)步驟病理評價。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種丹酚酸B有效干預口腔癌動物模型的方法，包括以下步驟(1)建立口腔癌動物模型、(2)丹酚酸B藥物干預、(3)組織學檢查、(4)病理評價。本發(fā)明所公開一種丹酚酸B有效干預口腔癌動物模型的方法其優(yōu)點表現(xiàn)在(1)合理地選用DMBA誘導金地鼠頰囊癌變模型；(2)藥物干預時間從第7周開始連續(xù)12周，實驗時間適中，便于本發(fā)明實施；(3)選用藥量為10mg.kg
文檔編號A61K49/00GK1727007SQ20051002831
公開日2006年2月1日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權日2005年7月29日
發(fā)明者周曾同, 楊婭 申請人:上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院