專利名稱：負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，更具體涉及到一種負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，本發(fā)明還涉及該疫苗的制備方法和在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1.樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗腫瘤是僅次于心血管疾病，嚴(yán)重威脅人類生命的第二號“殺手”?，F(xiàn)行的三大腫瘤治療方法(手術(shù)、放療與化療)雖能緩解癥狀，但多數(shù)患者在經(jīng)受手術(shù)、大劑量放、化療的痛苦之后仍難以存活，且遇晚期腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移，則效果甚微，乃至無計可施。
免疫學(xué)突破性的研究進(jìn)展為腫瘤免疫治療提供了理論基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞是一種變異的細(xì)胞，表達(dá)區(qū)別于機(jī)體正常細(xì)胞的腫瘤特異性抗原(TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，人體免疫系統(tǒng)能夠識別、區(qū)分這些異已抗原，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，不斷地清除機(jī)體內(nèi)惡變的細(xì)胞，稱之為人體的免疫監(jiān)視能力(Immune Surveillance)。其間，一類特殊免疫細(xì)胞樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells，DCs)起著舉足輕重的作用。它是至今為止發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的專職性抗原遞呈細(xì)胞，表達(dá)豐富的抗原捕獲分子(如MMR，DEC205，F(xiàn)cRs，TLRs)、抗原遞呈分子(如MHC-I，MHC-II，CD1)及免疫共刺激分子(如CD80，CD86，CD40等)。捕獲腫瘤抗原的DCs遷移至淋巴結(jié)，將加工、處理后的抗原信息遞呈給T淋巴細(xì)胞(提供激活T淋巴細(xì)胞特異性第一信號)，同時其表面的免疫共刺激分子提供激活T淋巴細(xì)胞第二信號。T細(xì)胞經(jīng)激活分化為具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞功能的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。
鑒于樹突狀細(xì)胞強(qiáng)大的攝取、加工、遞呈抗原以及激活特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能。體外用腫瘤抗原沖擊樹突狀細(xì)胞，將攜帶腫瘤抗原信號的樹突狀細(xì)胞回輸體內(nèi)，激發(fā)機(jī)體主動特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答，達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的功效，并在體內(nèi)誘異免疫記憶，防止腫瘤的復(fù)發(fā)，該免疫治療方法被認(rèn)為是當(dāng)今最先進(jìn)、最有希望的腫瘤生物治療手段。這種攜帶腫瘤抗原信號，啟動/激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的功能性樹突狀細(xì)胞統(tǒng)稱為“樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗”(DC-based tumor vaccines)。
2.現(xiàn)有樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗種類及不足用人工合成的已知腫瘤抗原肽、腫瘤抗原蛋白、編碼腫瘤抗原RNA、腫瘤細(xì)胞裂解液、腫瘤細(xì)胞提取物、凋亡腫瘤細(xì)胞等不同形式和來源的腫瘤抗原體外負(fù)載/沖擊樹突狀細(xì)胞而制備的腫瘤疫苗均有報道。然而，1)迄今為止，已知的腫瘤特異性抗原種類有限，且存在MHC(主要組織相容性復(fù)合物)限制性，使得此類樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制；2)一種類型的腫瘤存在不止一種腫瘤抗原，而是由多種腫瘤抗原構(gòu)成的獨特腫瘤抗原庫(Antigen Repertoire)，故僅負(fù)載某種腫瘤抗原肽、蛋白或RNA的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗將給予體內(nèi)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的機(jī)會；3)用腫瘤細(xì)胞裂解液、腫瘤細(xì)胞提取物、腫瘤細(xì)胞RNA作為抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的融合疫苗均可誘導(dǎo)、激活針對多種腫瘤抗原的T淋巴細(xì)胞克隆，防止因使用單個或已知幾種腫瘤抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞所造成的免疫缺失，但其繁瑣的抗原制備過程、生物/化學(xué)試劑的添加等不同程度地破壞腫瘤抗原或使腫瘤抗原丟失、RNA轉(zhuǎn)染以及細(xì)胞融合效率的難以確定等多種因素均影響著樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的功效。
3.熱休克蛋白與樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗腫瘤抗原的抗原性(Antigenicity)、免疫原性(Immunogenicity)及抗原負(fù)載體系(Antigen Delivery System)是影響樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗功效的重要參數(shù)。以編碼免疫刺激分子(GM-CSF，CD80，IL-2等)以及熱休克蛋白HSP70，gp96等基因修飾腫瘤細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞，以期提高樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗免疫反應(yīng)性的方法不斷有所報道。
熱休克蛋白(HSPs)是存在于細(xì)胞漿和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的蛋白質(zhì)家族，由多個成員組成如HSP60，HSP70，HSP90及gp96等。高溫、缺氧、輻射等應(yīng)急狀態(tài)均能不同程度地誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)。熱休克蛋白作為分子伴侶(Chaperons)在蛋白合成后的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)，變性蛋白質(zhì)的復(fù)性等過程中發(fā)揮重要作用。HSPs能結(jié)合細(xì)胞內(nèi)5-25mer的多肽(包括腫瘤或病毒特異性抗原多肽)形成HSP-多肽復(fù)合物，參與多肽在胞漿網(wǎng)膜系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
Srivastava發(fā)現(xiàn)從腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞中提取的HSP-抗原多肽復(fù)合物免疫動物后能引起針對該腫瘤或病毒的特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，而僅免疫多肽或僅免疫HSP則不能誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答[1]?；谶@一發(fā)現(xiàn)，美國Antigenics公司(www.antigenics.com)將從患者腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中提取的gp96及HSP70-多肽復(fù)合物免疫腫瘤患者，相應(yīng)產(chǎn)品(Oncophage和AG-858)已獲FDA批準(zhǔn)進(jìn)入I-II期臨床試驗。近期又發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞表面存在多種HSPs的分子受體如CD91，CD40，LOX1，TLR2/4等，并證明HSPs能夠介導(dǎo)外源性抗原多肽向HLA-I類與HLA-II類分子的遞呈[2，3]。另又發(fā)現(xiàn)HSP60，HSP70，gp96自身能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞表達(dá)免疫共刺激分子(CD83，CD80，MHC-I)和免疫活性因子(MIP，TNFa，IL-12與IP-10等)從而活化自然殺傷細(xì)胞(NK)，NKT細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等誘導(dǎo)并擴(kuò)大非特異性免疫應(yīng)答，故HSPs有“天然免疫佐劑”的作用[4]。
1.Srivastava PK.Immunotherapy for human cancer using heat shockprotein-Peptide complexes.Curr Oncol Rep.2005 Mar；7(2)104-8.
2.Binder RJ，Vatner R，Srivastava P.The heat-shock protein receptorssomeanswers and more questions.Tissue Antigens.2004 Oct；64(4)442-51.
3.SenGupta D，Norris PJ，Suscovich TJ，et al.Heat shock protein-mediatedcross-presentation of exogenous HIV antigen on HLA class I and class II.JImmunol.2004 Aug 1；173(3)1987-93.
4.Binder RJ，Srivastava PK.Essential role of CD91 in re-presentation ofgp96-chaperoned peptides.
Proc Natl Acad Sci USA.2004 Apr 20；101(16)6128-33.
我國曹雪濤教授等提取熱處理后腫瘤細(xì)胞的外排體體外沖擊樹突狀細(xì)胞(專利申請?zhí)?2145022.6，名稱一種新型高效非細(xì)胞性疫苗的制備及其用途)，實驗結(jié)果顯示能激活樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，有效誘導(dǎo)抗原特異性和非特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。但上述(包括Antigenics公司)制備HSP-抗原肽復(fù)合物過程復(fù)雜、繁瑣，不可避免造成對抗原的破壞、抗原的降解、以及抗原的丟失，從而影響腫瘤抗原譜或抗原肽庫的完整性，同時亦增加了操作過程中污染控制的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是為了克服上述樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的缺陷，提高樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的免疫反應(yīng)性和功效，提供一種制備簡捷、快速、高效的負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供上述樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案的理論基礎(chǔ)是利用熱休克法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)多種HSPs，在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(Apoptosis)，再將完整的富含熱休克蛋白的凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞制備樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗。樹突狀細(xì)胞可將負(fù)載的上述腫瘤細(xì)胞所含有的腫瘤抗原遞呈至表面，激活T淋巴細(xì)胞對該腫瘤產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的目的是通過下列措施實現(xiàn)的一種負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，它是通過下列步驟制備獲得的1).熱休克法處理腫瘤細(xì)胞；2).富含熱休克蛋白的凋亡腫瘤細(xì)胞的制備熱休克法處理后的腫瘤細(xì)胞回復(fù)至37℃培養(yǎng)適當(dāng)時間，得富含熱休克蛋白的腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，收集凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞，備用；3).體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞；4).富含熱休克蛋白的凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞將按上述方法制備的凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞混合培育，共同培育后按常規(guī)離心法收集負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞，制備成樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其中熱休克法處理腫瘤細(xì)胞是將腫瘤細(xì)胞于39℃-43℃加熱培養(yǎng)30分鐘至4小時。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方法是生物法、物理法；其中生物法采用抗腫瘤藥物處理腫瘤細(xì)胞或采用無血清培養(yǎng)法處理腫瘤細(xì)胞，物理法采用同位素射線、紫外線、缺氧或加熱方式處理腫瘤細(xì)胞。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其中體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞是通過取單個核細(xì)胞培養(yǎng)一定時間后，洗去未貼壁細(xì)胞，加入含GM-CSF和IL-4的細(xì)胞因子組合、GM-CSF和IL-15的細(xì)胞因子組合、GM-CSF和IFNα的細(xì)胞因子組合、或者GM-CSF和TNFα的細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)成單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞；或者，取CD34+前體造血細(xì)胞，加入含GM-CSF、TNFa和Flt3-L細(xì)胞因子的培養(yǎng)基誘導(dǎo)成CD34-DCs。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其中單個核細(xì)胞、CD34+前體造血細(xì)胞來源于自體外周血、或者臍帶血、或者HLA主要配型相合者的外周血。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其中凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞時所加入的凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的數(shù)量比例為1∶1-3。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，它包括下列步驟
1).熱休克法處理腫瘤細(xì)胞；2).富含熱休克蛋白的凋亡腫瘤細(xì)胞的制備熱休克法處理后的腫瘤細(xì)胞回復(fù)至37℃培養(yǎng)適當(dāng)時間，得富含熱休克蛋白的腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，收集凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞，備用；3).體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞；4).富含熱休克蛋白的凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞將按上述方法制備的凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞混合培育，共同培育后按常規(guī)離心法收集負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞，制備成樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其中熱休克法處理腫瘤細(xì)胞是將腫瘤細(xì)胞于39℃-43℃加熱培養(yǎng)30分鐘至4小時。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方法是生物法、物理法；其中生物法采用抗腫瘤藥物處理腫瘤細(xì)胞或采用無血清培養(yǎng)法處理腫瘤細(xì)胞，物理法采用同位素射線、紫外線、缺氧或加熱方式處理腫瘤細(xì)胞。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其中體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞是通過取單個核細(xì)胞一定時間后，洗去未貼壁細(xì)胞，加入含GM-CSF和IL-4的細(xì)胞因子組合、GM-CSF和IL-15的細(xì)胞因子組合、GM-CSF和IFNα的細(xì)胞因子組合、或者GM-CSF和TNFα的細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)成單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞；或者取CD34+前體造血細(xì)胞，加入含GM-CSF、TNFa和Flt3-L細(xì)胞因子的培養(yǎng)基誘導(dǎo)成CD34-DCs。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其中單個核細(xì)胞、CD34+前體造血細(xì)胞前體造血細(xì)胞來源于自體外周血、或者臍帶血、或者HLA主要配型相合者的外周血。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其中凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞時所加入的凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的數(shù)量比例為1∶1-3。
所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果1.與基因轉(zhuǎn)染法、化學(xué)法等比較，熱休克法處理腫瘤細(xì)胞具有操作簡單、無須復(fù)雜儀器設(shè)備和化學(xué)試劑、且可迅速、高效誘導(dǎo)多種熱休克蛋白表達(dá)等諸多優(yōu)點；1)采用本發(fā)明熱休克法對腫瘤細(xì)胞株SKmel28，HepG-2，Me275，Me290以及MCF7處理的效果分別將腫瘤細(xì)胞株SKmel28，HepG-2，Me275，Me290以及MCF7置于5％CO2，42℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)2小時、4小時或42℃4小時后再加入凋亡誘導(dǎo)劑BA(BetulinicAcid，BA)于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培育24小時。收集腫瘤細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑制備細(xì)胞勻漿，12000rpm，4℃離心20min，收集上清液。Micro BSATM法(Pierce，USA)及ELISA法(Stressgenes，Canada)分別檢測細(xì)胞勻漿上清液中總蛋白及HSP60與HSP70水平。HSPs含量表達(dá)為ng/mg.Pr.。熱休克前后腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP60與HSP70蛋白水平的變化結(jié)果見圖1，結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞經(jīng)過熱休克處理后HSP60與HSP70含量明顯增加，并且經(jīng)誘導(dǎo)凋亡后HSP60與HSP70含量仍然較高。
2)基因轉(zhuǎn)染法與熱休克法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)熱休克蛋白效果比較收集腫瘤細(xì)胞株SKmel28、egfp或熱休克蛋白gp96逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的SKmel28細(xì)胞株(SKmel28-egfp和SKmel28-gp96-egfp)，以及熱休克法和BA處理的SKmel28細(xì)胞，制備細(xì)胞勻漿、細(xì)胞上清液及上清液總蛋白含量檢測方法同1)。上清液進(jìn)行8％SDS-PAGE電泳(20ug總蛋白/泳道)后轉(zhuǎn)印至PDVF膜上，用鼠抗人gp96 mAb(SPA-851，Stressgenes，Canada)及羊抗鼠二抗依次與膜共育，F(xiàn)luoro BlotTMperoxidasesubstrate(Pierce)作顯色系統(tǒng)。每泳道所加樣本如下所示1.SKmel28，2.SKmel28-egfp，3.SKmel28-gp96-egfp，4.SKmel28，42℃2h，5.SKmel28，42℃4h，6.SKmel28，42℃4h+BA 24h，7.SKmel28，BA 24h，M.Protein weight marker。結(jié)果見圖2，結(jié)果表明熱休克法效果較好，誘導(dǎo)的gp96含量較高。
圖1、2表明熱休克法處理的腫瘤細(xì)胞表達(dá)HSP的種類多、含量較高。
2.熱休克法可增加腫瘤細(xì)胞的抗原性熱休克法誘導(dǎo)腫瘤基因MAGEB3，MAGEB4的表達(dá)將Me290細(xì)胞株置5％CO2，37℃(Me290un)，或42℃4h(Me290 heat)，或加入Actinomycin D，42℃4h(Me290 heat/Act D)；收集細(xì)胞，按試劑盒說明書抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實時定量PCR(RT-PCR，_TaqMan PDARs試劑盒)，GAPDH基因作為內(nèi)對照?？v軸數(shù)字表示MAGEB3，MAGEB4基因表達(dá)水平與GAPDH基因表達(dá)水平的比值，結(jié)果見圖3，結(jié)果表明熱休克法可誘導(dǎo)腫瘤基因的表達(dá)水平，從而增加腫瘤細(xì)胞的抗原性。
3.腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSPs的高表達(dá)可增加腫瘤抗原肽與HSPs形成復(fù)合物的機(jī)會，減少新生腫瘤抗原肽被降解的可能性，同時HSPs具有天然免疫佐劑的功能，將增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗原性與免疫原性。
4.由于本發(fā)明采用凋亡的腫瘤細(xì)胞作為抗原來源，凋亡腫瘤細(xì)胞漿膜是完整的，提供了保護(hù)腫瘤抗原的良好環(huán)境，不會因裂解細(xì)胞釋放的酶類、抗原提取過程中添加生化或化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致蛋白變性或降解，因而保持腫瘤細(xì)胞的抗原性與腫瘤抗原肽庫的完整性。
用整個凋亡腫瘤細(xì)胞作為抗原，由樹突狀細(xì)胞去識別、加工并遞呈相應(yīng)的多種腫瘤抗原或多個抗原位點(epitopes)，可誘導(dǎo)、激活針對腫瘤細(xì)胞表達(dá)的多種腫瘤抗原的多個T細(xì)胞克隆(CD4+T與CD8+T，疫苗的多價性)，降低因使用單個或已知幾種腫瘤抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞所造成腫瘤逃避免疫監(jiān)視的風(fēng)險。
6.樹突狀細(xì)胞表達(dá)多種HSPs(HSP60，HSP70和gp96等)受體，用高表達(dá)HSPs的凋亡腫瘤細(xì)胞作為抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞，將有利于樹突狀細(xì)胞通過HSP受體介導(dǎo)的高效抗原攝取，提高腫瘤細(xì)胞的負(fù)載效率。
1)凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞SKmel28、凋亡細(xì)胞(未熱休克)SKmel28細(xì)胞標(biāo)記7-AAD與CD11c-APC標(biāo)記的單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(MDDCs)按1∶3，1∶1，3∶1比例共同培育3h，加入0.05％胰酶/0.02％EDTA PBS緩沖液反應(yīng)5min，洗滌離心后，用PBS懸浮細(xì)胞作流式細(xì)胞分析。每個樣本至少采集50000個細(xì)胞。流式圖中數(shù)字為CD11c-APC與7-AAD雙陽性樹突狀細(xì)胞(吞噬凋亡細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞)占樹突狀細(xì)胞總數(shù)(CD11c-APC陽性)的百分比。結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞有助于樹突狀細(xì)胞的攝取。
2)共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)一步證實樹突狀細(xì)胞能吞噬凋亡腫瘤細(xì)胞MDDCs與凋亡腫瘤細(xì)胞Me275共同培育3小時。收集細(xì)胞，作常規(guī)染色，以鼠抗人CD1a-FITC標(biāo)記MDDCs，gp100-Texas-Red標(biāo)記腫瘤細(xì)胞。用Leica TCS-NT SP共聚焦顯微鏡(FITC 510-550nm，Texas-Red 580-660nm，Bars＝10um)進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖5。
7.富含HSPs的凋亡腫瘤細(xì)胞與MDDCs共同孵育，可誘導(dǎo)MDDCs的成熟MDDCs分別與凋亡的熱休克或凋亡(未經(jīng)熱休克)腫瘤細(xì)胞Me275(1∶1)共同培育24小時。收集細(xì)胞，作常規(guī)染色。以鼠抗人CD11c-APC，HLA-DR-PerCP，和CD80-PE或CCR7-PE單抗染色細(xì)胞后，作流式細(xì)胞分析。結(jié)果見圖6，結(jié)果表明凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)CD80，HLA-DR與CCR7的表達(dá)，增加樹突狀細(xì)胞的免疫激發(fā)能力及向淋巴結(jié)遷移的能力。
8.凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞負(fù)載的樹突狀細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫激發(fā)能力GM-CSF/IL-4體外誘導(dǎo)的HLA-A201+健康志愿者M(jìn)DDCs與凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞共育2小時后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選出MDDCs并加入細(xì)胞因子使之成熟。從同一份外周血單個核細(xì)胞中分離出CD45RA+CD8+CCR7+CD45RO-的處女型T(Naive CD8T)淋巴細(xì)胞；用成熟樹突狀細(xì)胞反復(fù)刺激T淋巴細(xì)胞2次，每周一次。收集刺激的T淋巴細(xì)胞(CTL)，用經(jīng)典的4小時51Cr釋放試驗檢測CTL殺傷活性。CTL1為未負(fù)載腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞刺激的CD8T淋巴細(xì)胞，CTL2為用負(fù)載凋亡腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞所刺激的CD8T淋巴細(xì)胞；CTL3為用負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞所刺激的CD8T淋巴細(xì)胞。實驗結(jié)果來自三個獨立健康志愿者，以均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞體外刺激的CD8T淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的特異性腫瘤殺傷能力(4h-51Cr-Releasing Assay)。同時，負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞體外致敏的CD8T淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞回復(fù)生長的能力(Tumor inhibitioncapacity)。
9.簡便、安全、無毒在本疫苗制備體系中，無外源質(zhì)粒、載體、化學(xué)試劑等的摻入，且操作簡便，無須預(yù)先研究、合成或分離腫瘤抗原并省略復(fù)雜的MHC分型操作。


圖1是熱休克前后腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP60與HSP70蛋白水平變化。
圖2是熱休克法與基因轉(zhuǎn)染法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞gp96表達(dá)水平的比較。
圖3是熱休克法誘導(dǎo)腫瘤基因MAGEB3，MAGEB4的表達(dá)。
圖4是凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞SKmel28、凋亡的未熱休克腫瘤細(xì)胞與MDDC細(xì)胞共育后流式細(xì)胞分析對照圖。
圖5是共聚焦顯微鏡技術(shù)證實MDDCs攝取凋亡腫瘤細(xì)胞照片。
圖6是凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)MDDCs成熟(流式細(xì)胞分析)。
圖7是負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞體外刺激的CD8T淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的特異性腫瘤殺傷能力。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
以下實施例中所用的細(xì)胞因子購于R&D公司(USA)。
混合人AB血清系由AB型血型的健康志愿者血清混合而成的市售血清制品。
實施例1負(fù)載凋亡的熱休克黑色素瘤細(xì)胞Me290的MDDC腫瘤疫苗1.熱休克法處理黑色素瘤細(xì)胞Me290
將黑色素瘤細(xì)胞Me290接種于10％FCS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，將細(xì)胞移至5％CO2，42℃細(xì)胞培養(yǎng)箱或42℃水浴，加熱培養(yǎng)2h。
2.誘導(dǎo)熱休克后的Me290細(xì)胞凋亡將上述熱休克后的Me290細(xì)胞移回至5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，同時加入BA(植物中提取的抗癌藥物，購自Sigma公司)，作用濃度為10ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，離心法收集凋亡的腫瘤細(xì)胞，用PBS洗滌3次，最后將收集的腫瘤細(xì)胞懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基中，經(jīng)100GY的γ-射線照射后使用。
3.體外誘導(dǎo)MDDCs(單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞，下同)采集新鮮肝素抗凝的黑色素瘤患者外周血，經(jīng)Ficoll梯度離心后獲得外周單個核細(xì)胞(PBMNCs)，將PBMNCs懸浮于含2％滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度為2-3×106/ml；按每孔3ml接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置1h使單核細(xì)胞貼壁，用PBS緩沖液輕輕洗滌培養(yǎng)孔以除去未貼壁細(xì)胞；于每孔加入3ml含100ng/ml重組人GM-CSF，25ng/ml IL-4和5％滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基。于誘導(dǎo)第3天，每孔輕輕吸去1ml培養(yǎng)上清，重新加入1ml新鮮配制的RPMI1640培養(yǎng)基及細(xì)胞因子繼續(xù)誘導(dǎo)。
4.凋亡的熱休克Me290細(xì)胞負(fù)載自體MDDCs收集誘導(dǎo)第5天的自體MDDCs，懸浮于5％自體滅活血清或5％滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，按1∶1細(xì)胞數(shù)量比例于MDDCs中加入上述制備的凋亡的熱休克Me290細(xì)胞，共育48小時。常規(guī)離心法洗滌、收集負(fù)載了凋亡的熱休克Me290細(xì)胞的MDDCs，按適當(dāng)濃度懸浮于生理鹽水中，即得負(fù)載凋亡的熱休克Me290細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞疫苗。
實施例2負(fù)載凋亡的熱休克肝癌細(xì)胞的MDDC腫瘤疫苗1.肝癌樣本的處理取新鮮肝癌組織(手術(shù)或穿刺)即刻放置于無菌容器中。保存液為新鮮配制的含雙抗(青/鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)基。將剪碎的肝癌組織塊置于無菌注射器內(nèi)反復(fù)研磨，最后將細(xì)胞懸浮于保存液內(nèi)，200目濾網(wǎng)過濾制備成單細(xì)胞懸液。
2、熱休克肝癌細(xì)胞將上述制備的肝癌細(xì)胞懸液接種于含有2％混合人AB血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，置5％CO2，40℃細(xì)胞培養(yǎng)箱或40℃水浴，加熱培養(yǎng)3h。
3.誘導(dǎo)熱休克后的肝癌細(xì)胞凋亡將上述熱休克后的肝癌細(xì)胞移至5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，加入5-FU(5-氟尿嘧啶)繼續(xù)培養(yǎng)36小時后，收集凋亡的肝癌細(xì)胞，以PBS洗滌3次，最后將收集的凋亡的肝癌細(xì)胞懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中，經(jīng)100GY的γ-射線照射后使用。
3.體外誘導(dǎo)MDDCs取肝素抗凝的肝癌患者自體外周血經(jīng)Ficoll分離后獲得外周單個核細(xì)胞(PBMNCs)，將PBMNCs懸浮于含2％滅活人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度為2-3×106/ml；按每孔3ml接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置1h使單核細(xì)胞貼壁，用PBS緩沖液輕輕洗滌培養(yǎng)孔以除去未貼壁細(xì)胞；于每孔加入3ml含100ng/ml重組人GM-CSF、100ng/ml IL-15(R&D，USA)和5％滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基。于誘導(dǎo)第3天，輕輕吸去1ml培養(yǎng)上清，重新加入1ml新鮮配制的培養(yǎng)基和細(xì)胞因子繼續(xù)誘導(dǎo)。
4.將凋亡的熱休克肝癌細(xì)胞負(fù)載自體MDDCs于誘導(dǎo)第5天的MDDCs中，按1∶1細(xì)胞數(shù)量比例加入上述制備的凋亡的熱休克肝癌細(xì)胞，共育48小時后，常規(guī)離心法洗滌、收集負(fù)載了凋亡的熱休克肝癌細(xì)胞的MDDCs，懸浮于生理鹽水中，即得負(fù)載凋亡的熱休克肝癌細(xì)胞的MDDC疫苗。
實施例3負(fù)載凋亡的熱休克乳腺癌細(xì)胞MCF7的CD34-DC腫瘤疫苗1.熱休克法處理乳腺癌細(xì)胞MCF7將乳腺癌細(xì)胞MCF7接種于10％FCS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培育12h后，將細(xì)胞移至5％CO2，43℃細(xì)胞培養(yǎng)箱或43℃水浴，加熱培養(yǎng)4h。
2.誘導(dǎo)熱休克后的MCF7乳腺癌細(xì)胞凋亡將上述熱休克后的MCF7腫瘤細(xì)胞回至5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集MCF7腫瘤細(xì)胞。經(jīng)150GYγ-射線照射后，于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱無血清培養(yǎng)36小時，收集凋亡的MCF7腫瘤細(xì)胞，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基中。
3.體外分離純化CD34+造血前體細(xì)胞，誘導(dǎo)CD34-DCs(CD34+造血前體細(xì)胞誘導(dǎo)成的樹突狀細(xì)胞)。
取乳腺癌患者外周血(經(jīng)G-CSF造血動員后)，F(xiàn)icoll分離獲得外周單個核細(xì)胞(PBMNCs)，加入CD34單克隆抗體包被的磁珠分離純化得到CD34+造血前體細(xì)胞(純度＞90％)，將其懸浮于含5％滅活混合人AB血清的X-VIVO培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含GM-CSF(50ng/ml)，TNFa(10ng/ml)，F(xiàn)lt3-L(100ng/ml)。培養(yǎng)第5天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基與細(xì)胞因子，觀察并及時調(diào)整細(xì)胞密度。
4.凋亡的熱休克MCF7細(xì)胞負(fù)載自體CD34-DCs收集誘導(dǎo)培養(yǎng)第9天的CD34-DCs，懸浮于含5％滅活混合人AB血清的X-VIVO培養(yǎng)基中，按CD34-DCs與凋亡的熱休克MCF7細(xì)胞之間細(xì)胞數(shù)量比為2∶1的比例加入上述制備的凋亡的熱休克MCF7細(xì)胞，共育時間48小時后，收集負(fù)載了凋亡的熱休克MCF7細(xì)胞的CD34-DCs，懸浮于無菌PBS中，即得負(fù)載凋亡的熱休克乳腺癌細(xì)胞MCF7的CD34-DC腫瘤疫苗。
實施例4負(fù)載凋亡的熱休克的胸水腫瘤細(xì)胞的MDDCs腫瘤疫苗1.熱休克法處理轉(zhuǎn)移到胸水中的腫瘤細(xì)胞無菌采集腫瘤患者的胸水(含轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞)，離心法收集腫瘤細(xì)胞，PBS洗滌2次后將細(xì)胞懸浮于含2％混合人AB血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，于5％CO2，42℃細(xì)胞培養(yǎng)箱或42℃水浴，加熱培養(yǎng)4h。
2.誘導(dǎo)熱休克后的腫瘤細(xì)胞凋亡將上述熱休克后的腫瘤細(xì)胞移回至5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集腫瘤細(xì)胞。經(jīng)150GY γ-射線照射后，于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱無血清培養(yǎng)36小時，收集凋亡腫瘤細(xì)胞，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基中。
3.體外誘導(dǎo)異體MDDCs取肝素抗凝的與腫瘤患者HLA主要配型相符的健康志愿者外周血，經(jīng)Ficoll分離后獲得外周單個核細(xì)胞(PBMNCs)，將PBMNCs懸浮于含2％滅活人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度為2-3×106/ml；按每孔3ml接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置1h使單核細(xì)胞貼壁，用PBS緩沖液輕輕洗滌培養(yǎng)孔以除去未貼壁細(xì)胞；于每孔加入3ml含100ng/ml重組人GM-CSF、200ng/ml IFNa(R&D，USA)和5％滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基。于誘導(dǎo)第3天，輕輕吸去1ml培養(yǎng)上清，重新加入1ml新鮮配制的培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)。
4.將凋亡的熱休克胸水腫瘤細(xì)胞負(fù)載異體MDDCs于誘導(dǎo)第5天的MDDCs中，按MDDCs與凋亡的熱休克的胸水腫瘤細(xì)胞之間細(xì)胞數(shù)量比為1∶1的比例加入上述制備的凋亡的熱休克的胸水腫瘤細(xì)胞，共育48小時后，常規(guī)離心法洗滌、收集負(fù)載了凋亡的熱休克胸水腫瘤細(xì)胞的MDDCs，懸浮于生理鹽水中，即得負(fù)載凋亡的熱休克胸水腫瘤細(xì)胞的MDDC腫瘤疫苗。
實施例5負(fù)載凋亡的熱休克的CML患者白血病細(xì)胞的CD34-DCs疫苗1.熱休克法處理CML白血病細(xì)胞取肝素抗凝的CML(慢性粒細(xì)胞性白血病)患者外周血，F(xiàn)icoll分離后獲得外周單個核細(xì)胞(PBMNCs)，將PBMNCs懸浮于含2％混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，作為白血病細(xì)胞，置于5％CO2，42℃細(xì)胞培養(yǎng)箱或42℃水浴中加熱培養(yǎng)2h，將細(xì)胞置于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，同時加入MTX(氨甲蝶呤)，繼續(xù)培育24h，離心收集白血病細(xì)胞，經(jīng)100GYγ-射線照射后使用。
2.體外誘導(dǎo)CD34-DCs取新鮮肝素抗凝臍帶血(HLA主要配型相符)，F(xiàn)icoll分離后獲得外周單個核細(xì)胞(PBMNCs)，加入CD34單抗磁珠分離純化得到CD34+造血前體細(xì)胞(純度＞90％)，將其懸浮于含5％混合人AB滅活血清的X-VIVO培養(yǎng)基中。于培養(yǎng)基中加入GM-CSF(50ng/ml)、TNFa(10ng/ml)和Flt3-L(100ng/ml)。培養(yǎng)第5天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基與細(xì)胞因子，觀察并及時調(diào)整細(xì)胞密度。
3.熱休克凋亡白血病細(xì)胞負(fù)載CD34-DCs收集誘導(dǎo)第9天的CD34-DCs，懸浮于5％混合人AB滅活血清的X-VIVO培養(yǎng)基中，按1∶1細(xì)胞數(shù)量比例加入上述制備的熱休克凋亡白血病細(xì)胞，共育時間36小時。常規(guī)離心法收集負(fù)載了凋亡的熱休克白血病細(xì)胞的CD34-DCs，懸浮于生理鹽水中，即得負(fù)載凋亡的熱休克白血病細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞疫苗。
實施例6負(fù)載凋亡的熱休克腹水腫瘤細(xì)胞的MDDCs疫苗1.熱休克法處理腹水腫瘤細(xì)胞無菌采集晚期腫瘤轉(zhuǎn)移患者的腹水(含轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞)，離心法收集腫瘤細(xì)胞，PBS洗滌2次后將細(xì)胞懸浮于含2％混合人AB血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，于5％CO2，42℃細(xì)胞培養(yǎng)箱或42℃水浴，加熱培養(yǎng)4h。
2.誘導(dǎo)熱休克后的腫瘤細(xì)胞凋亡將上述熱休克后的腫瘤細(xì)胞移回至5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集腫瘤細(xì)胞，經(jīng)150GYγ-射線照射后，于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱無血清培養(yǎng)24小時，收集凋亡腫瘤細(xì)胞，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基中。
3.體外分離純化CD34+造血前體細(xì)胞，誘導(dǎo)CD34-DCs取經(jīng)G-CSF造血動員的新鮮肝素抗凝健康志愿者外周血(HLA主要配型相符)，F(xiàn)icoll分離后獲得外周單個核細(xì)胞(PBMNCs)，加入CD34單抗磁珠分離純化得到CD34+造血前體細(xì)胞(純度＞90％)，將其懸浮于含5％混合人AB滅活血清的X-VIVO培養(yǎng)基中。于培養(yǎng)基中加入GM-CSF(50ng/ml)、TNFa(10ng/ml)和Flt3-L(100ng/ml)。培養(yǎng)第5天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基與細(xì)胞因子(同前)，觀察并及時調(diào)整細(xì)胞密度。
4.凋亡的熱休克腹水腫瘤細(xì)胞負(fù)載CD34-DCs收集誘導(dǎo)培養(yǎng)第9天的CD34-DCs，懸浮于5％混合人AB滅活血清的X-VIVO培養(yǎng)基中，按1∶1細(xì)胞數(shù)量比例加入上述制備的凋亡的熱休克腹水腫瘤細(xì)胞，共育48小時。常規(guī)離心法收集負(fù)載了凋亡的熱休克腹水腫瘤細(xì)胞的CD34-DCs，懸浮于生理鹽水中，即得負(fù)載凋亡的熱休克腹水腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞的CD34-DCs疫苗。
權(quán)利要求
1.一種負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于它是通過下列步驟制備獲得的1).熱休克法處理腫瘤細(xì)胞；2).富含熱休克蛋白的凋亡腫瘤細(xì)胞的制備熱休克法處理后的腫瘤細(xì)胞回復(fù)至37℃培養(yǎng)適當(dāng)時間，得富含熱休克蛋白的腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，收集凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞，備用；3).體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞；4).富含熱休克蛋白的凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞將按上述方法制備的凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞混合培育，共同培育后按常規(guī)離心法收集負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞，制備成樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于熱休克法處理腫瘤細(xì)胞是將腫瘤細(xì)胞于39℃-43℃加熱培養(yǎng)30分鐘至4小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方法是生物法、物理法；其中生物法采用抗腫瘤藥物處理腫瘤細(xì)胞或采用無血清培養(yǎng)法處理腫瘤細(xì)胞，物理法采用同位素射線、紫外線、缺氧或加熱方式處理腫瘤細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞是通過取單個核細(xì)胞培養(yǎng)一定時間后，洗去未貼壁細(xì)胞，加入含GM-CSF和IL-4的細(xì)胞因子組合、GM-CSF和IL-15的細(xì)胞因子組合、GM-CSF和IFNα的細(xì)胞因子組合、或者GM-CSF和TNFα的細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)成單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞；或者，取CD34+前體造血細(xì)胞，加入含GM-CSF、TNFa和Flt3-L細(xì)胞因子的培養(yǎng)基誘導(dǎo)成CD34-DCs。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于單個核細(xì)胞、CD34+前體造血細(xì)胞來源于自體外周血、或者臍帶血、或者HLA主要配型相合者的外周血。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，其特征在于凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞時所加入的凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的數(shù)量比例為1∶1-3。
7.如權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于它包括下列步驟1).熱休克法處理腫瘤細(xì)胞；2).富含熱休克蛋白的凋亡腫瘤細(xì)胞的制備熱休克法處理后的腫瘤細(xì)胞回復(fù)至37℃培養(yǎng)適當(dāng)時間，得富含熱休克蛋白的腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，收集凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞，備用；3).體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞；4).富含熱休克蛋白的凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞將按上述方法制備的凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞混合培育，共同培育后按常規(guī)離心法收集負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞，制備成樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于熱休克法處理腫瘤細(xì)胞是將腫瘤細(xì)胞于39℃-43℃加熱培養(yǎng)30分鐘至4小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方法是生物法、物理法；其中生物法采用抗腫瘤藥物處理腫瘤細(xì)胞或采用無血清培養(yǎng)法處理腫瘤細(xì)胞，物理法采用同位素射線、紫外線、缺氧或加熱方式處理腫瘤細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞是通過取單個核細(xì)胞一定時間后，洗去未貼壁細(xì)胞，加入含GM-CSF和IL-4的細(xì)胞因子組合、GM-CSF和IL-15的細(xì)胞因子組合、GM-CSF和IFNα的細(xì)胞因子組合、或者GM-CSF和TNFα的細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)成單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞；或者取CD34+前體造血細(xì)胞，加入含GM-CSF、TNFa和Flt3-L細(xì)胞因子的培養(yǎng)基誘導(dǎo)成CD34-DCs。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于單個核細(xì)胞、CD34+前體造血細(xì)胞前體造血細(xì)胞來源于自體外周血、或者臍帶血、或者HLA主要配型相合者的外周血。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞時所加入的凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的數(shù)量比例為1∶1-3。
13.權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種負(fù)載凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗及其制備方法與應(yīng)用。該疫苗通過將熱休克法處理腫瘤細(xì)胞，再誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，制備樹突狀細(xì)胞，將凋亡的熱休克腫瘤細(xì)胞負(fù)載于樹突狀細(xì)胞而得到。該疫苗可減少免疫逃避，療效好，可用于抗腫瘤藥的制備；該制備工藝簡單、快速、成本低。
文檔編號A61K39/00GK1686538SQ20051003868
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月4日
發(fā)明者時宏珍 申請人:南京大陸產(chǎn)業(yè)投資集團(tuán)有限公司