專利名稱：鬼針草醇提取物在制備防治非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鬼針草醇提取物的新用途，尤其涉及鬼針草醇提取物在制藥領(lǐng)域中的用途，確切的說是在制備防治非酒精性脂肪肝藥物中的用途。
背景技術(shù)：
鬼針草又名婆婆針、鬼杈草、小鬼針、粘身草等，其藥用歷史悠久，始載于唐·陳藏器《本草拾遺》，謂“鬼釵草，味苦平，無毒，主蛇及蜘蛛咬，杵碎傅之，亦杵絞汁服。生地畔，有椏，方莖，子作釵腳，著人如衣針，北方呼之為鬼針?！惫磲槻蓊愃幉娜菥捎盟帲犊嘈云蕉鵁o毒，具有清熱解毒，散瘀消腫等功效，主治瘧疾、腹瀉、痢疾、肝炎、急性腎炎、胃痛、噎膈、腸癰、咽喉腫痛、跌打損傷、蛇蟲咬傷等。為了更好的認識和了解這一自然資源，更好的開發(fā)與利用，現(xiàn)將鬼針草的研究與開發(fā)現(xiàn)狀綜述如下。
鬼針草為菊科(Compositae)管狀花亞科鬼針草屬(Bidens L.)植物為一年生草本，其藥材資源非常豐富，主要分布于我國東北、河北、山東、山西、河南、江蘇、云南、四川、兩廣等地，生于水邊、河岸、濕地、荒地及山坡等處，極易采集。
鬼針草的化學(xué)成分鬼針草所含化學(xué)成分種類較多，文獻報道曾從該植物中分離得到揮發(fā)油類、甾醇、查耳酮、橙酮、聚乙炔類等，其活性成分以聚乙炔類和黃酮類成分為主。已分離出多種聚乙炔類成分。乙醇提取物的正丁醇部分鑒定出4個黃酮成分，為金絲桃甙(hyperoside)、奧卡寧(okanin)、異奧卡寧-7-O-葡萄糖甙和海生菊甙(maritimein)。鬼針草各部位中黃酮類成分有較大差異，在花果期，葉和花序中總黃酮含量較高(分別為6.67％和6.68％)，莖枝中含量較低(0.89％)。葉中分離鑒定了21種揮發(fā)性成分，主要為脂肪烷和脂肪酸類，另外含少量的醛、酮烯、腈、胺及呋喃類成分；其中脂肪類化合物占相當(dāng)比例。分離出的4種酚酸類成分，經(jīng)理化測試及光譜分析，分別鑒定為水楊酸、原兒茶酸、沒食子酸、脂肪酸類化合物。還有甾體類化合物如菠甾醇、胡蘿卜苷，谷甾醇、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷。
鬼針草含有豐富的氨基酸，如天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、賴氨酸等17種氨基酸，其中8種為人體必需氨基酸，總蛋白質(zhì)157.89g/kg，總游離氨基酸含量達139.89g/kg，必需氨基酸總量57.09g/kg。鬼針草所含氨基酸與傳統(tǒng)名貴藥材亞香棒蟲草、冬蟲夏草相比，在種類上多了胱氨酸，在含量上脯氨酸、谷氨酸高于兩者，其他氨基酸含量相當(dāng)另外鬼針草中還含有11種人體必需微量元素，測定結(jié)果表明，Mg含量最高，P、Fe、Ca含量較高，Cu、Zn次之，Mn、Co、Ni、Mo、Cr含量最低，鬼針草中含有豐富的P，是其調(diào)節(jié)神經(jīng)、催眠、鎮(zhèn)靜等作用的內(nèi)在原因。
維生素在鬼針草中也有分布，如維生素B1、維生素B2、β-胡蘿卜素。
鬼針草藥材資源豐富，藥用歷史悠久，在民間驗方中有小人參之稱。其生物活性多樣，且作用溫和持久，具有較高的藥用價值，尤其對消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)顯示較強的藥理作用。近年來對鬼針草藥材進行了一些開發(fā)和利用，目前國內(nèi)的鬼針草產(chǎn)品有悅年片、鬼針草口服液、鬼針草保健沖劑等，但也僅限于防治高血壓等心血管疾病，還未見對鬼針草醇提取物在制備防治非酒精性脂肪肝藥物方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鬼針草醇提取物的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用。
實際上，本發(fā)明提供了鬼針草醇提取物在制備預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應(yīng)用。
近年來，隨著我國人民物質(zhì)生活的不斷提高，非酒精性脂肪肝(NASH)的發(fā)病率逐年上升，在某些地區(qū)非酒精性脂肪肝NASH已超過病毒性肝炎而成為第一大肝病。非酒精性脂肪肝NASH是一類與酒精性肝病相似的肝臟組織學(xué)改變，但無過量飲酒史(攝入酒精＜40g/d)的臨床病理綜合征，通常原發(fā)于與胰島素抵抗相關(guān)的肥胖、II型糖尿病、高脂血癥、高血壓等代謝紊亂。既往認為，脂肪肝為良性病變，不會發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，但大量臨床肝活檢研究證實，非酒精性脂肪肝NASH在脂肪性肝炎的基礎(chǔ)上約40％-50％會發(fā)展為肝纖維化，15％-20％可發(fā)展為肝硬化，甚至?xí)?dǎo)致肝細胞癌的發(fā)生。因此NASH的積極防治可阻止慢性肝病的進展，改善NASH患者的預(yù)后。
目前臨床上用于治療非酒精性脂肪肝NASH的措施主要包括(1)去除病因和誘因；(2)控制飲食；(3)運動療法；(4)藥物干預(yù)等。近年來治療NASH的藥物發(fā)展很快，其主要治療藥物有A、針對改善胰島素抵抗，增加胰島素敏感的藥物。如二甲雙呱，能明顯改善患者的糖耐量和高胰島素血癥，降低血漿游離脂肪酸和血漿甘油三酯水平。其主要不良反應(yīng)是消化道癥狀，有心、腎功能障礙的老年患者有發(fā)生乳酸中毒的危險，目前尚無隨機雙盲對照實驗研究證實該藥可以安全用于治療非酒精性脂肪肝。
B、抑制過氧化作用藥物。如維生素類，主要通過抑制過氧化自由基的形成，防止細胞受損，但維生素A、E均屬于脂溶性維生素，大劑量補充易產(chǎn)生蓄積中毒而加重肝損害。
C、針對高脂血癥的藥物，但許多降血脂藥可促進血脂更集中于肝臟進行代謝，反而可能促進脂質(zhì)在肝內(nèi)的蓄積，并進一步損害肝功能。
D、熊去氧膽酸，能夠降低非酒精性脂肪肝患者血清酶水平，但是不能改變肝臟脂肪沉積。
總的來說，雖然目前有大批治療非酒精性脂肪肝的藥物，但是尚缺乏安全有效、作用肯定的藥物供臨床使用。因此，積極尋找具有保肝、降血脂、抗脂肪肝的藥物是非常必要的，而發(fā)揮中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢尤為重要。中醫(yī)藥治療慢性脂肪性肝疾患的最大優(yōu)點是副作用小，且在治療的同時，對其相關(guān)聯(lián)疾病如肥胖、高脂血癥、高血壓、糖尿病等有一定的治療作用，故具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。
根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，大多數(shù)慢性肝病患者的中醫(yī)辯證診斷證型為肝郁脾虛證及淤血阻絡(luò)證，相應(yīng)的治療應(yīng)為益氣養(yǎng)血，活血化瘀，舒肝健脾。本發(fā)明遵循這一治療原則，基于長期治療經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)鬼針草具有清熱解毒，散瘀消腫等功效，不僅具有抗高血壓、降血糖等作用，而且對非酒精性脂肪肝也有很好的治療作用，為將其開發(fā)成對肝病作用的有效藥物提供非常珍貴的依據(jù)。我們提取其有效部位，通過動物實驗證實其有顯著的防治非酒精性脂肪肝的作用。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用鬼針草醇提取物的藥理實驗及結(jié)果來說明其在防治非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用。
鬼針草醇提取物防治非酒精性脂肪肝試驗如下(一)鬼針草醇提取物的制備取鬼針草生藥粉碎，40-80％的乙醇回流提取2-3次，提取液合并，回收乙醇，減壓濃縮得浸膏。浸膏水溶，靜置，過濾，澄清液上樹脂柱，水洗后收集40-95％乙醇洗脫部分，回收乙醇，減壓濃縮，干燥即得鬼針草醇提取物。該醇提取物為黃綠色粉末，具有芳香味，易潮解；其主要成分為總黃酮，含量為20-60％。該醇提取物可加入相應(yīng)輔料，制成片劑、膠囊、緩釋片、滴丸、沖劑、微粒劑，并進一步純化制成針劑。
(二)實驗1.鬼針草醇提取物對四氯化碳致小鼠急性化學(xué)性肝損傷的保護作用(1)材料及試劑鬼針草醇提取物；0.1％CCl4；聯(lián)苯雙酯；ALT，AST試劑盒南京建成生物技術(shù)公司；昆明種雄性小鼠60只，體重18-22g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。
(2)方法正常小鼠60只隨機分6組，灌胃給藥(鬼針草醇提取物80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg，陽性藥對照組聯(lián)苯雙酯100mg/kg)或等體積生理鹽水(正常對照、模型)，每天2次，連續(xù)7d，于末次給藥后2h，正常對照組ip10ml/kg花生油，其余5組均ip0.1％CCl410ml/kg，禁食16h后自小鼠后眼眶靜脈從取血，測定血清ALT，AST活性，并取肝臟左葉同一部位，固定，做病理切片，進行肝臟病理組織學(xué)HE染色檢查，結(jié)果以光鏡下肝臟病理損傷程度評分和病理照片作為標準。
肝組織病變程度分級方法光鏡下檢查，按肝臟壞死程度分為5級0級，正?；蚋闻K有輕微變性，肝細胞無壞死；I級，點狀壞死，壞死占肝小葉＜1/4；II級，點灶狀壞死，壞死占肝小葉1/4-1/3；III級，灶狀壞死，壞死占肝小葉＜1/2；IV級，片狀壞死，壞死占肝小葉＞1/2(3)結(jié)果表1結(jié)果表明，CCl4顯著升高小鼠血清中ALT、AST活性，而鬼針草醇提取物顯著降低CCl4致急性化學(xué)性肝損傷小鼠血清中過高的ALT、AST活性。
表1鬼針草總黃酮對小鼠血清中ALT、AST的影響(n＝10，x±s)

**p＜0.01與對照組相比；##p＜0.01與模型組相比表2結(jié)果顯示，模型組肝組織可見炎癥細胞浸潤，出現(xiàn)不同程度的壞死。鬼針草醇提取物可明顯減輕肝臟炎癥細胞浸潤和壞死。
表2鬼針草醇提取物對CCl4致急性化學(xué)性肝損傷小鼠病理組織學(xué)的影響

1、鬼針草醇提取物對大鼠高脂血癥性脂肪肝的治療作用(1)材料與試劑SD大鼠66只，雌雄各半，體重180-200g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；鬼針草醇提取物；東寶肝泰片(上海九福藥業(yè)有限公司)；TG、TC、HDL-C測定試劑盒購自北京福瑞生物工程公司；ALT、MDA、SOD、GLU、FFA測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；脂肪乳劑的制備取豬油25g加入200mL的燒杯里，加熱攪拌，加入10g膽固醇，溶化，再加入1g丙賽優(yōu)，充分攪勻，然后加入25mL吐溫80，制成油相。同時在另一燒杯中加入30mL蒸餾水和1-2丙二醇20mL，加熱，然后加入2g脫氧膽酸鈉，充分攪拌直到完全溶解，制成水相。然后將水相加入油相，充分混勻，即制成脂肪乳劑，使用前37℃水浴加熱。
(2)方法SD大鼠在實驗室飼養(yǎng)一周后，隨機分為2組正常組(n＝12)、脂肪乳劑組(n＝54)。脂肪乳劑組每天給予脂肪乳劑灌胃，同時正常組給予等體積CMC-Na。3W后，斷尾取血測定TG，脂肪乳劑組取50只按血脂水平分為東寶肝泰組、鬼針草醇提取物(320、160、80mg·kg-1)組、模型組，除對照組和模型組給予等體積CMC-Na，其它各組分別給予相應(yīng)藥物。給藥3周后處死動物，取出血清和肝臟，測定血清TG、TC、HDL-C、ALT、MDA、SOD、FFA和肝勻漿TG、MDA、SOD。
(3)結(jié)果造摸3周時，脂肪乳劑組血脂已顯著升高。從表3可見造摸6周時模型組血清TC和TG均顯著高于對照組；與模型組相比，東寶肝泰組和鬼針草總黃酮組血清TG明顯降低，血清HDL-C升高。表4血清ALT、SOD、MDA、FFA的變化中可見，與對照組相比，模型組ALT、FFA、MDA明顯升高；與模型組相比，東保肝泰組和鬼針草醇提取物組FFA、MDA、ALT明顯下降。表5可見肝勻漿中與對照組相比，模型組TG、MDA顯著升高，SOD則降低；與模型組相比，東寶肝泰組和鬼針草醇提取物組能降低TG，MDA，鬼針草醇提取物組還能升高SOD。由此表明鬼針草醇提取物具有明顯的抗大鼠高脂血癥性脂肪肝的作用。
表3第6周時各組血清脂質(zhì)變化(x±s，n＝10)

*p＜0.05，**p＜0.01與對照組相比；#p＜0.05，##p＜0.01與模型組相比表4各組血清ALT、MDA、SOD、FFA的變化(x±s，n＝10)

*p＜0.05，**p＜0.01與對照組相比；#p＜0.05，##p＜0.01與模型組相比表5各組肝勻漿中TG、MDA、SOD的變化(x±s，n＝10)

*p＜0.05，**p＜0.01與對照組相比；#p＜0.05，##p＜0.01與模型組相比2、鬼針草醇提取物對乙硫氨酸致大鼠脂肪肝的影響(1)方法取SD大鼠66只，雌雄各半，體重為180-200g，分為6組，即空白對照組和模型組(灌胃給予等體積CMC-Na)、東寶肝泰組、鬼針草醇提取物(320、160、80mg·kg-1)。從試驗第1天起，每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥3天，實驗第4天起，除空白對照組外，其余5組分別按0.25g/kg體重灌胃給予乙硫氨酸一次，隨后，按前法每12h給藥一次，共4次。給予乙硫氨酸后48h，取血測定TC、TG和肝勻漿TC、TG。
(2)結(jié)果表6鬼針草醇提取物對乙硫氨酸致大鼠脂肪肝的影響(x±s)

*p＜0.05，**p＜0.01與模型組相比由表6結(jié)果可見鬼針草醇提取物可明顯降低總膽固醇和甘油三酯含量，具有一定的抗乙硫氨酸致脂肪肝的作用。
上述實驗結(jié)果表明，本發(fā)明具有幾個方面的優(yōu)點1、本發(fā)明鬼針草醇提取物是從中藥材鬼針草中提取的有效成分，可明顯降低高脂飲食脂肪肝動物模型和藥物中毒性脂肪肝動物模型中的脂質(zhì)，對脂肪肝模型中的肝細胞有保護作用；發(fā)掘了鬼針草醇提取物新的藥用前景，開拓了一個新的藥用領(lǐng)域；2、本發(fā)明的鬼針草醇提取物采用口服給藥，服用方便，毒副作用小，長期服藥無危害；3、本發(fā)明鬼針草醇提取物的原藥資源非常豐富，具有良好的社會和經(jīng)濟效益；4、本發(fā)明的鬼針草醇提取物適用于非酒精性脂肪肝，作用于多個環(huán)節(jié)，療效確切；5、本發(fā)明為將鬼針草進一步開發(fā)成新藥提供了強有力的基礎(chǔ)。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步地描述。
實施例1稱取鬼針草生藥10kg，粉碎后加入80％乙醇100L，熱回流提取2次，每次1h，合并提取液，回收乙醇，減壓濃縮得浸膏。浸膏水溶，靜置，過濾，澄清液上大孔樹脂柱，水洗后收集80％乙醇洗脫部分?；厥找掖?，減壓濃縮，干燥即得鬼針草醇提取物。該醇提取物為黃綠色粉末，具有芳香味，易潮解；其主要成分為總黃酮，含量為20-60％。該醇提取物可加入相應(yīng)輔料，制成片劑、膠囊、緩釋片、滴丸、沖劑、微粒劑，并進一步純化制成針劑。
鬼針草醇提取物臨床推薦劑量300-1200mg/天，口服，一日三次。
權(quán)利要求
1.鬼針草醇提取物在制備防治非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用，其特征在于鬼針草醇提取物在制備防治非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及鬼針草醇提取物在制備防治非酒精性脂肪肝藥物中的新用途。鬼針草醇提取物是從中藥材鬼針草中提取的有效成分，可明顯降低高脂飲食脂肪肝動物模型和藥物中毒性脂肪肝動物模型中的脂質(zhì)，對脂肪肝模型中的肝細胞有保護作用。用于預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝采用口服給藥，服用方便，毒副作用小，長期服藥無危害。
文檔編號A61P1/00GK1887303SQ20051009734
公開日2007年1月3日 申請日期2005年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月31日
發(fā)明者陳飛虎, 李俊, 袁鳳來, 金涌 申請人:安徽醫(yī)科大學(xué)