專利名稱：用于干擾素治療的方法和組合物的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請是2003年6月4日提交的美國專利申請?zhí)?0/455,215的后續(xù)部分，該申請是2002年1月22日提交的美國專利申請?zhí)?0/055,863的后續(xù)部分，該申請是1998年7月8日提交的美國專利申請?zhí)?9/112,074(2002年5月21日出版的美國專利號6,392,069)的后續(xù)部分，該申請是1997年7月8日提交的美國專利申請?zhí)?8/889,355的后續(xù)部分，該申請是1996年1月8日提交的美國專利申請?zhí)?8/584,077(1998年8月4日出版的美國專利號5,789,244)的后續(xù)部分；本申請也是2003年6月3日提交的有待授權(quán)的美國專利申請?zhí)?Townsend & Townsend &Crew LLP律師事務(wù)所代理人審理號016930-000815)的后續(xù)部分，該申請是2000年8月28日提交的美國專利申請?zhí)?9/650,359的后續(xù)部分，該申請是1997年1月7日提交的美國專利申請?zhí)?8/779,627(2000年12月26日出版的美國專利號6,165,779)的后續(xù)部分，該申請是1996年1月8日提交的美國專利申請?zhí)?8/584,077的后續(xù)部分；本申請要求2004年6月4日提交的有待授權(quán)的美國專利申請?zhí)?Townsend & Townsend & Crew LLP律師事務(wù)所代理人審理號016930-000831US)的優(yōu)先權(quán)，該申請要求2003年6月4日提交的美國專利申請?zhí)?0475926的權(quán)益。本申請含有2002年12月20日提交的美國專利申請?zhí)?029,043的相關(guān)主題，該申請要求2001年12月20日提交的美國專利申請?zhí)?0/342329的權(quán)益。出于所有目的，這些優(yōu)先權(quán)申請的內(nèi)容納入文中作為參考。
背景技術(shù)：
美國每年診斷出超過45,000例淺表性膀胱癌(“癌癥事實與數(shù)據(jù)”(Cancer Factsand Figures)2002)。淺表性疾病通常局限于表面粘膜(Ta)或以原位癌(CIS)(一種平坦表面擴散變體)存在。雖然一些類型的疾病最初可通過經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除(TURBT來)除去，但是仍維持高的新腫瘤形成趨勢，可能是因為可見腫瘤的宏觀去除會遺留最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的微觀病灶。此外，手術(shù)介入不能用于治療原位癌(CIS)。因此，開發(fā)了作為手術(shù)的輔佐手段的膀胱內(nèi)治療來防止腫瘤復(fù)發(fā)，或消除小的殘留疾病和/或無法接近的疾病，例如CIS。
現(xiàn)在用于淺表性膀胱癌治療的兩種常規(guī)類型的膀胱內(nèi)治療是化療和BCG免疫治療。僅有3種化療藥物經(jīng)由膀胱內(nèi)施用有效塞替哌、阿霉素(及其衍生物表柔比星和戊柔比星)和絲裂霉素。比較單用這些化療藥物對TURBT的多重隨機試驗表明腫瘤復(fù)發(fā)凈降低12-15％(即TURBT的60％復(fù)發(fā)率對TURBT加上化療的45％復(fù)發(fā)率)并且一種藥物對另一種藥物沒有明顯優(yōu)勢(Traynelis等.，“用于膀胱癌的膀胱內(nèi)治療的現(xiàn)狀”(Current status of intravesical therapy for bladdercancer)，S.N.Rous編，《泌尿外科學(xué)年鑒》(Urology Annual)，第8卷，113-143頁，紐約WW Norton和Co，1994)。更重要的是，盡管在復(fù)發(fā)率上有統(tǒng)計學(xué)顯著的降低，沒有證據(jù)表明化療降低了最終疾病進展的概率或改善了存活率(Lamm等.，J Urol，1531444-50(1995))。
免疫治療通常包括膀胱內(nèi)施用牛分枝桿菌卡介苗(“BCG”)的活疫苗株。TURBT后使用BCG將腫瘤復(fù)發(fā)率降低約30％(或約是膀胱內(nèi)化療的兩倍)(O′Donnell MA，“在淺表性膀胱癌的治療中使用膀胱內(nèi)BCG”(Use ofIntravesical BCG in Treatment of Superficial Bladder Cancer)，刊于《膀胱癌當前的診斷和治療》(Bladder CancerCurrent Diagnosis and Treatment)，淺表性Droller編，Totowa NJHumana Press Inc.，2001)。當前，55-60％小乳頭瘤(＜2cm)可實現(xiàn)消融，對CIS多達75％(Kavoussi等.，J Urol.，139935(1988))。膀胱內(nèi)BCG已成為具有高危險性的復(fù)發(fā)或疾病進展的淺表性膀胱癌患者的治療標準。在這方面，BCG的膀胱內(nèi)治療可提供一定程度的疾病控制和保留膀胱功能，這是每位淺表性膀胱癌的患者所希望的。然而，雖然這種BCG-介導(dǎo)使高危性淺表性膀胱癌的早期治療獲益，但約50％的患者在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)。這種復(fù)發(fā)通常用BCG再治療。然而，觀察到用多次膀胱內(nèi)BCG滴注法治療的患者會經(jīng)受劑量-限制的毒性，例如膀胱炎、排尿困難、發(fā)熱和偶爾的BCG敗血癥。因此，需要耐受性好且有效的BCG治療的替代方法。
近來，研究者評價了用于淺表性膀胱癌治療的重組干擾素α2b蛋白(IntronA)治療。人II期臨床研究表明，將Intron A作為單一藥物以50-100MIU劑量進行膀胱內(nèi)滴注在40％患有淺表性膀胱癌的患者中導(dǎo)致完全應(yīng)答(O′Donnell等.，J Urol.，2001年10月，166(4)1300-5)。
鑒于上述，改善治療性蛋白、多肽(例如，干擾素，Intron A)或基因傳遞系統(tǒng)或核酸傳遞至上皮細胞(特別是尿路上皮)的方法是有利的。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個方面提供了用于向具有上皮細胞層的組織或器官施用蛋白質(zhì)治療的方法和藥物組合物。一方面，向靶組織或器官施用蛋白質(zhì)治療聯(lián)合使用蛋白質(zhì)治療傳遞增強試劑治療，后者通過載體增加靶組織或器官細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。該方法和組合在治療癌癥和其它對使用生物活性蛋白治療有應(yīng)答的疾病中有用。在優(yōu)選的實施方案中，傳遞增強試劑是SYN3。
在一些實施方案中，蛋白質(zhì)治療通過施用干擾素蛋白自身或通過施用干擾素基因傳遞系統(tǒng)來提供干擾素蛋白，其中基因編碼要在轉(zhuǎn)導(dǎo)的上皮細胞或尿路上皮細胞中表達的干擾素蛋白。在一個示范性實施方案中，該方法包括將治療有效量的藥物組合物經(jīng)尿道膀胱內(nèi)施用至膀胱，該藥物組合物含有SYN3或SYN3同系物或類似物與干擾素或編碼干擾素的腺病毒載體。在另一個實施方案中，干擾素是α-干擾素。
在另一個方面，本發(fā)明提供了提高核酸傳遞至上皮組織的組合物和方法。在一個實施方案中，該方法使得組織或器官的細胞與結(jié)合了傳遞增強試劑的基因傳遞系統(tǒng)接觸，其中基因編碼干擾素。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供含有編碼干擾素基因的重組腺病毒和傳遞增強試劑的藥物制劑。在一個示范性實施方案中，傳遞增強試劑是SYN3，并且該系統(tǒng)含有編碼生物活性人干擾素多肽的腺病毒載體。
在又一個方面，本發(fā)明提供通過提高治療性蛋白或具有編碼蛋白的基因的基因傳遞系統(tǒng)傳遞到膀胱上皮來治療膀胱癌的組合物和方法，而提高傳遞的方法是通過膀胱內(nèi)施用傳遞增強試劑和治療性蛋白。在一些實施方案中，治療性蛋白是干擾素。在還有的實施方案中，治療性蛋白是干擾素α2b或干擾素α2α1。又在其它實施方案中，傳遞增強試劑是SYN3或SYN3同系物。在一個示范性實施方案中，傳遞增強試劑是SYN3并且蛋白是干擾素(例如，生物活性人干擾素多肽)。在其它實施方案中，蛋白可作為蛋白或通過編碼高蛋白的基因傳遞系統(tǒng)施用。還有在其它實施方案中，蛋白是抗體或抗體片段。在其它實施方案中，抗體定向于細胞因子。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于施用治療性蛋白和傳遞增強試劑的藥物組合物。在一些實施方案中，蛋白是干擾素并且傳遞增強試劑是SYN3或SYN3同系物。在一個示范性實施方案中，傳遞增強試劑是SYN3并且蛋白是生物活性人干擾素多肽。在其它實施方案中，干擾素是干擾素α2b或干擾素α2α1。
在一些方面，本發(fā)明的方法包括通過膀胱內(nèi)施用傳遞增強試劑和治療性蛋白或編碼治療性蛋白的核酸來處理確定了內(nèi)部空間、竇、心室、通路、體積、腔、空隙或排列有或含有上皮膜的腔的任何器官或組織。確定這種器官或組織的表面或壁用于保留或延遲或限制大量液體流動或藥物組合物向身體另一部分的轉(zhuǎn)移并且允許上皮膜與藥物組合物接觸更長時間。該器官或組織可是在內(nèi)表面具有上皮膜的囊(例如，膀胱)。在一些實施方案中，器官是胃、子宮、腸、食道、口、結(jié)腸、上或下GI道、上或下呼吸道。在一些實施方案中，器官或組織確定了如腹膜腔的空間，并且上皮表面位于能與腹膜腔內(nèi)空間進行液體接觸的上皮表面。在一些實施方案中，器官或組織具有癌癥、增生性疾病或感染性疾病，治療性蛋白是干擾素并且傳遞增強試劑是SYN3或SYN3類似物。
附圖簡述

圖1是文中所述實驗中使用的復(fù)制缺陷型重組腺病毒基因傳遞系統(tǒng)的示意圖，這些實驗證實傳遞增強試劑在腫瘤細胞內(nèi)提高基因表達的作用。
圖2描述了含有重組腺病毒干擾素基因傳遞系統(tǒng)和SYN3的藥物組合物在皮下異種移植腫瘤模型中的抗腫瘤效力。在攜帶有得自成膠質(zhì)細胞瘤(LN229，U87MG)、肝細胞瘤(HEP3B)和CML(K562)的腫瘤的裸鼠中腫瘤內(nèi)施用rAd-IFN后觀察對腫瘤生長的抑制作用。通過腫瘤內(nèi)施用抑制皮下異種移植腫瘤的生長。5只小鼠的各組3天/周注射載體、rAd-對照或rADd-IFN(1×1010顆粒/劑量；總劑量為6×1010個顆粒)，共進行兩周。
圖3顯示了SYN3在大鼠中提高重組腺病毒基因傳遞系統(tǒng)的傳遞能力。雌性Sprague-Dawley大鼠接受45分鐘的膀胱內(nèi)施用SYN3制劑(載體配制成1mg/ml)配制的或單用載體(0.1％吐溫-80)的rAd-β-gal(7.6×1010P/ml)。48小時后處死大鼠，收集其膀胱，固定并用X-gal染色用于lacZ表達。
圖4顯示了含有干擾素基因傳遞系統(tǒng)和SYN3的藥物組合物在小鼠膀胱腫瘤模型中對腫瘤的作用。雌性裸鼠經(jīng)尿道插入導(dǎo)尿管并接受100ml胰蛋白酶-EDTA(0.25％)30分鐘，然后接受UMUC-3細胞(1×107；100ml)3小時。6天后，通過膀胱內(nèi)施用對動物給藥2×(24小時間隔，第6天、第7天)rAd-IFN或rAd-對照(1×1011/100μl)或僅是SYN3(1mg/ml)。腫瘤細胞植入21天后，處死動物，將其膀胱收集入福爾馬林進行宏觀檢查并對腫瘤荷載評分。腫瘤按以下標準評分0＝無腫瘤；1＝＜25％的膀胱腔封閉；2＝25-50％的膀胱腔封閉；3＝＞50％的膀胱腔封閉。
圖5提供了有關(guān)于基因傳遞提高系統(tǒng)結(jié)合的SYN3在淺表性膀胱癌的常位腫瘤模型中的效力的數(shù)據(jù)，其中淺表性腫瘤是通過胰蛋白酶預(yù)處理后膀胱內(nèi)施用綠色熒光蛋白(GFP)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人KU-7膀胱癌細胞在無胸腺小鼠的膀胱中建立的。通過手術(shù)暴露與照射膀胱來激活GFP熒光，其后對腫瘤大小的評價可不處死動物而在體內(nèi)監(jiān)測。允許腫瘤細胞生長10天，在此基礎(chǔ)上利用手術(shù)暴露膀胱并照射，拍下每只動物的熒光腫瘤荷載的照片。處理前后含有腫瘤細胞的膀胱的面積相對于膀胱總面積的百分率也用圖形分析軟件確定。小鼠連續(xù)兩天接受膀胱內(nèi)施用100μlrAd(1×1011P/ml)，1小時。比較4個處理組rAd-IFN/SYN3、rAd-β-gall/SYN3、單用rAd-IFN或單用SYN3。處理21天(引發(fā)腫瘤生長后第31天)后，再次使膀胱膨脹，手術(shù)暴露并再次按照上述方法測量GFP腫瘤荷載。接受rAd-IFN/SYN3的動物在一段時間后腫瘤荷載顯著縮小。
圖6顯示了含有SYN3和干擾素基因傳遞系統(tǒng)的藥物組合物對血液、尿液和膀胱組織中干擾素水平的作用。小鼠接受膀胱內(nèi)施用SYN3制劑(1mg/ml)配制的rAd-IFN(IACB)或rAd-對照(ZZCB)(100μl；7.4×1010P/ml)。處理兩天后，從每只動物中獲取尿液和血清，然后在此基礎(chǔ)上處死動物并收集其膀胱，勻漿化并分析IFN的水平。該數(shù)據(jù)表明干擾素的表達水平可通過尿液測定來確定并且在膀胱內(nèi)施用編碼干擾素的基因傳遞系統(tǒng)后未觀察到動物系統(tǒng)性暴露于干擾素蛋白。
圖7描述了一種合成SYN3的方法，圖8顯示了與PBS相比，各種時間點的SYN3制劑在大鼠中對通過膀胱上皮攝取干擾素的作用。由于雜交IFN蛋白的供應(yīng)有限，基本上使用IFNα2b(Intron A)。出于比較目的，時間t＝0的時間點處也包括雜交蛋白。
圖9顯示了與PBS相比，SYN3制劑在大鼠中對2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)的干擾素表達的作用。
圖10顯示了與PBS相比，SYN3制劑在大鼠中對干擾素誘導(dǎo)的MX1表達的作用。
圖11顯示了與PBS相比，SYN3制劑在大鼠中對干擾素誘導(dǎo)的IRF1表達的作用。
圖12顯示了與PBS相比，SYN3制劑在大鼠中對INFγ的干擾素表達的作用。
發(fā)明詳述除非另有說明，文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。文中引用的每種出版物、專利申請、專利和其它參考文獻在不與本發(fā)明內(nèi)容沖突的程度上全文納入作為參考。
如本說明書和附加的權(quán)利要求中所用，除非另有明確指出，單數(shù)形式的“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)形式。
在一方面，本發(fā)明提供提高蛋白或核酸傳遞到具有上皮層或尿路上皮的組織的組合物和方法。在一個實施方案中，該方法使得組織或器官的細胞與結(jié)合了傳遞增強試劑的干擾素或編碼干擾素的基因傳遞系統(tǒng)接觸。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過使上皮與傳遞增強試劑(例如，SYN3)接觸來提高蛋白(例如，干擾素)傳遞至上皮的組合物和方法。在一個實施方案中，該方法使得膀胱的尿路上皮與1)干擾素或干擾素基因傳遞系統(tǒng)和2)SYN3或SYN3同系物接觸。本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)，即SYN3提高基因傳遞系統(tǒng)和蛋白傳遞至膀胱是高度有效的傳遞蛋白(例如，干擾素)生物活性的方法，其量和那些使用SYN3通過重組腺病毒基因治療獲得的量相當。這些結(jié)果特別表明SYN3提高干擾素的傳遞可用于治療膀胱癌。這些結(jié)果也表明，總體上，SYN3及其同系物在穿過上皮障礙傳遞其它治療性蛋白到上皮組織的細胞中也是有效的，特別是與尿路上皮相關(guān)的組織。
基因傳遞系統(tǒng)“基因傳遞系統(tǒng)”包括編碼生物活性蛋白的重組多核苷酸，該多核苷酸操作性連接于表達控制序列來實現(xiàn)細胞中蛋白基因的表達。干擾素基因傳遞系統(tǒng)包括編碼干擾素的重組多核苷酸，該多核苷酸操作性連接于表達控制序列來實現(xiàn)細胞中蛋白基因的表達。
術(shù)語多核苷酸指由核苷酸單體組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如脫氧核糖核苷酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)以及核酸類似物。核酸類似物包括那些非天然存在的堿基，通過非天然存在的磷酸二酯鍵與其它核苷酸相連的核苷酸或包括通過非磷酸二酯鍵相連的堿基的核苷酸。所以，核苷酸類似物包括，例如(但不限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、亞磷酰胺、硼并磷酸鹽、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。這種多核苷酸可合成，例如使用自動DNA合成儀。術(shù)語“核酸”通常指大的多核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”通常指短的多核苷酸，一般是少于50個核苷酸。應(yīng)該理解的是，當核苷酸序列是DNA序列(即A、T、G、C)時，該核苷酸序列也包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”?！爸亟M多核苷酸”指具有未天然連接在一起的序列的多核苷酸。擴增或裝配的重組多核苷酸可包含在合適的載體中，并且該載體可用于轉(zhuǎn)化對象的合適宿主細胞。含有重組多核苷酸的宿主細胞指“重組宿主細胞”。然后該基因在重組宿主細胞內(nèi)表達來生產(chǎn)，例如“重組干擾素多肽”。
術(shù)語“編碼”指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定的核苷酸序列的固有特性，所述多核苷酸是在生物過程中用作合成具有確定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或氨基酸序列以及從中獲得的生物特性的其它聚合物和大分子的模板。所以，如果轉(zhuǎn)錄并翻譯基因產(chǎn)生的mRNA，則該基因在細胞或其它生物系統(tǒng)中編碼蛋白質(zhì)。一個基因或cDNA的編碼鏈(與mRNA序列相同和一般提供于序列列表中的核苷酸序列)和非編碼鏈(用作轉(zhuǎn)錄的模板)可涉及編碼該基因或cDNA的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。除非另有說明，“編碼干擾素氨基酸序列或多肽的核苷酸序列”包括相互的簡并變體以及編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可含有內(nèi)含子。
“表達控制序列”指調(diào)節(jié)操作性與其連接的核苷酸序列表達(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的多核苷酸中的核苷酸序列?！安僮餍赃B接的”指兩部分之間的功能性關(guān)系，其中一部分的活性(例如，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力)導(dǎo)致對另一部分起作用(例如，序列的轉(zhuǎn)錄)。表達控制序列可含有，例如(但不限于)啟動子(例如，可誘導(dǎo)的或組成型的)、增強子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密碼子(即，ATG)、內(nèi)含子的剪接信號和終止密碼子的序列。
表達載體含有用于表達的足夠的順式-作用元件；其它用于表達的元件可由宿主細胞的表達系統(tǒng)提供。表達載體包括所有本領(lǐng)域已知的載體，例如引入重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(例如，裸露或包含于脂質(zhì)體中)和病毒。
在一個實施方案中，通過使用啟動子和/或感興趣的組織優(yōu)選使用的其它表達元件來利用特定的表達控制序列在特定類型的組織中提供干擾素基因的選擇性表達。已知的組織特異性啟動子的例子包括用于指導(dǎo)抗肌萎縮蛋白cDNA在肌肉和心臟組織中表達的肌酸激酶的啟動子(Cox等.，Nature，364725-729(1993))；用于在B細胞中表達基因的免疫球蛋白重鏈和輕鏈啟動子；分別靶向肝臟譜系細胞和肝細胞瘤細胞的白蛋白或α胎蛋白啟動子。用于肝臟的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)HMG-CoA還原酶啟動子(Luskey，Mol.Cell.Biol.，7(5)1881-1893(1987))甾醇調(diào)節(jié)元件1(SRE-1；Smith等.，J.Biol.Chem.，265(4)2306-2310(1990))；烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)啟動子(Eisenberger等.，Mol.Cell.Biol.，12(3)1396-1403(1992))；人C反應(yīng)蛋白(CRP)啟動子(Li等.，J.Biol.Chem.，265(7)4136-4142(1990))；人葡糖激酶啟動子(Tanizawa等.，Mol.Endocrinology，6(7)1070-81(1992))；膽固醇7-α羥化酶(CYP-7)啟動子(Lee等.，J.Biol.Chem.，269(20)14681-9(1994))；β-半乳糖苷酶α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶啟動子(Svensson等.，J.Biol.Chem.，265(34)20863-8(1990))；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP-1)啟動子(Babajko等.，BiochemBiophys.Res.Comm.，196(1)480-6(1993))；醛縮酶B啟動子(Bingle等.，BiochemJ.，294(Pt2)473-9(1993))；人轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動子(Mendelzon等.，Nucl.Acids Res.，18(19)5717-21(1990))；I型膠原啟動子(Houglum等.，J.Clin.Invest.，94(2)808-14(1994))。用于前列腺的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)前列腺酸磷酸酶(PAP)啟動子(Banas等.，Biochim.Biophys.Acta.，1217(2)188-94(1994))；94前列腺分泌蛋白(PSP94)啟動子(Nolet等.，Biochim.Biophys.ACTA，1098(2)247-9(1991))；前列腺特異性抗原復(fù)合物啟動子(Casper等.，J.SteroidBiochem.Mol.Biol.，47(1-6)127-35(1993))；人腺體激肽釋放酶基因啟動子(hgt-1)(Lilja等.，World J.Urology，11(4)188-91(1993))。用于胃組織的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)人H+/K+-ATP酶α亞基啟動子(Tanura等.，F(xiàn)EBS Letters，298(2-3)137-41(1992))。用于胰腺的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)胰腺炎相關(guān)蛋白啟動子(PAP)(Dusetti等.，J.Biol.Chem.，268(19)14470-5(1993))；彈性蛋白酶1轉(zhuǎn)錄增強子(Kruse等.，Genes andDevelopment，7(5)774-86(1993))；胰腺特異性淀粉酶和彈性蛋白酶增強子啟動子(Wu等.，Mol.Cell.Biol.，11(9)4423-30(1991)；Keller等.，Genes & Dev.，4(8)1316-21(1990))；胰腺膽固醇酯酶基因啟動子(Fontaine等.，Biochemistry，30(28)7008-14(1991))。用于子宮內(nèi)膜的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)子宮球蛋白啟動子(Helftenbein等.，Annal.NY Acad.Sci.，62269-79(1991))。用于腎上腺細胞的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)膽固醇側(cè)鏈切割(SCC)啟動子(Rice等.，J.Biol.Chem.，26511713-20(1990))。用于常規(guī)神經(jīng)系統(tǒng)的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)γ-γ烯醇化酶(神經(jīng)元特異性烯醇化酶，NSE)啟動子(Forss-Petter等.，Neuron，5(2)187-97(1990))。用于大腦的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)神經(jīng)絲重鏈(NF-H)啟動子(Schwartz等.，J.Biol.Chem.，269(18)13444-50(1994))。用于淋巴細胞的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)人CGL-1/粒酶B啟動子(Hanson等.，J.Biol.Chem.，266(36)24433-8(1991))；末端脫氧轉(zhuǎn)移酶(TdT)、λ5、VpreB和lck(淋巴細胞特異性酪蛋白激酶p561ck)啟動子(Lo等.，Mol.Cell.Biol.，11(10)5229-43(1991))；人CD2啟動子及其3′轉(zhuǎn)錄增強子(Lake等.，EMBO J.，9(10)3129-36(1990))與人NK和T細胞特異性激活(NKG5)啟動子(Houchins等.，Immunogenetics，37(2)102-7(1993))。用于結(jié)腸的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)pp60c-src酪氨酸激酶啟動子(Talamonti等.，J Clin.Invest，91(1)53-60(1993))；器官特異性新抗原(OSNs)、分子量40kDa(p40)啟動子(Ilantzis等.，Microbiol.Imnmunol.，37(2)119-28(1993))；結(jié)腸特異性抗原-P啟動子(Sharkey等.，Cancer，73(3增刊)864-77(1994))。用于乳房細胞的示范性組織特異性表達元件包括(但不限于)人α-乳白蛋白啟動子(Thean等.，BritishJ.Cancer.，61(5)773-5(1990))。
術(shù)語“干擾素基因”用于指指導(dǎo)干擾素表達的基因。
文中使用的術(shù)語“基因”是指編碼多肽的核酸序列。該定義包括各種序列多態(tài)性、突變和/或序列變體，其中這種改變不影響基因產(chǎn)物的功能。術(shù)語“基因”不僅包括編碼序列，也包括調(diào)節(jié)區(qū)域，例如啟動子、增強子和終止區(qū)域。該術(shù)語還包括所有內(nèi)含子和剪接自mRNA轉(zhuǎn)錄物的其它DNA序列以及得自其它剪接位點的變體。編碼多肽的核酸序列可是指導(dǎo)特定蛋白質(zhì)或肽表達的DNA或RNA。這些核酸序列可是轉(zhuǎn)錄為RNA的DNA鏈序列或翻譯為蛋白質(zhì)的RNA序列。核酸序列包括全長核酸序列以及得自全長蛋白質(zhì)的非全長序列。還要理解的是，序列包括天然序列的簡并密碼子或引入特定的宿主細胞來提供密碼子優(yōu)先選擇的序列。
一方面，本發(fā)明提供通過使上皮細胞與傳遞增強試劑(例如，SYN3或SYN3同系物)接觸來提高蛋白質(zhì)(例如，干擾素)傳遞至上皮的一種組合物和方法。蛋白質(zhì)可是細胞因子(例如，白介素、干擾素、集落刺激因子)、抗轉(zhuǎn)移因子或腫瘤抑制蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是任何一種或多種巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)、粒細胞集落刺激因子(MCSF)、巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-9(IL-9)、白介素-11(IL-11)、白介素-12(IL-12)、白介素-13(IL-13)、白介素-18(IL-18)、熱激蛋白(HSP)、p53和抗血管生成因子(抗血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的血管生成作用的蛋白質(zhì)藥物)、抗轉(zhuǎn)移因子(例如，金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP))與增加BCG活性的因子。
在一些實施方案中，蛋白質(zhì)治療的蛋白質(zhì)是抗體，該抗體可是單克隆抗體或多克隆抗體或Fab片段。抗體可是嵌合的或人源化的。這些抗體包括(但不限于)細胞因子與I型及和II型干擾素(例如，抗干擾素-α、抗干擾素-β、抗干擾素-δ、抗干擾素-γ)的抗體，和抗白介素的抗體(例如，抗IL-1、抗IL-2、抗IL-4、抗IL-6、抗IL-7和抗IL-10)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，抗體應(yīng)理解為包括，例如單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如，F(xiàn)ab和F(ab’)2)與重組產(chǎn)生的結(jié)合配偶體?？贵w應(yīng)理解為如果Ka大于或等于10-7M，可對靶反應(yīng)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易地從各種溫血動物生產(chǎn)多克隆抗體。使用常規(guī)技術(shù)也可容易地生產(chǎn)單克隆抗體(參見，例如美國專利號RE 32,011；4,902,614；4,543,439和4,411,993；也參見，Kennett，McKearn和Bechtol編，《單克隆抗體，雜交瘤生物分析的新量綱》(Monoclonal Antibodies，HybridomasA NewDimension in Biological Analyses)，Plenum Press，(1980)；與Harlow和Lane編，《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社，(1988))。一些實施例中將進一步描述優(yōu)選抗體的制備。
文中使用的術(shù)語干擾素是指包括所有類型和亞類的干擾素多肽以及缺失、插入或取代變體，包括其保守的氨基酸取代、生物活性多肽片段和等基因形式。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知各種合適的干擾素多肽。在一些實施方案中，干擾素多肽是I型或II型干擾素，包括通常命名為alpha-干擾素、beta-干擾素、gamma-干擾素和omega-干擾素(例如，α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素和ω-干擾素)及其組合(包括α-干擾素的共有序列)。在一些實施方案中，α-干擾素是α或α2-干擾素。在一些實施方案中，基因編碼干擾素α-2b。
在一些實施方案中，干擾素蛋白質(zhì)(以蛋白質(zhì)施用或由基因傳遞系統(tǒng)編碼)是野生型干擾素多肽。在其它實施方案中，干擾素是與野生型干擾素多肽基本上相同或是其融合蛋白。在兩條或多條多核苷酸或多肽序列的上下文中的術(shù)語“相同”或“同一性”百分率指當比較或比對最大一致性時，兩條或多條序列是相同的或具有特定百分率的核苷酸或氨基酸殘基相同。在兩條核酸或多肽的上下文中的術(shù)語“基本上相同”指如同使用BLAST算法(如Altschul等所述，J.Mol.Biol.，215403-410(1990))測量到的，當比較或比對最大一致性時，兩條或多條序列具有至少70％的核苷酸或氨基酸殘基同一型。用于進行BLAST分析的軟件通過國家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/))為公眾可用。除了計算序列同一性百分率，BLAST算法也用于在兩條序列之間進行統(tǒng)計學(xué)分析(參見，例如，Karlin& Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.美國，905873-5787(1993))。BLAST算法提供的一種相似性測量是最小概率總和(P(N))，該總和說明在兩條核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的可能性。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中最小概率總和小于約0.1、更優(yōu)選小于約0.01、最優(yōu)選小于約0.001，則該核酸被認為與參考核酸相似。
在其它實施方案中，干擾素多肽(以蛋白質(zhì)施用或由基因傳遞系統(tǒng)編碼)基本上與天然或野生型多肽在跨越50個氨基酸、100個氨基酸、150個氨基酸的延伸段序列相同或與全長天然多肽的序列相同。在一些實施方案中，干擾素多肽(以蛋白質(zhì)施用或由基因傳遞系統(tǒng)編碼)與野生型干擾素多肽在跨越50個氨基酸、100個氨基酸的延伸段或與全長天然多肽序列的99％、98％、95％或90％相同。在一些實施方案中，干擾素多肽(以蛋白質(zhì)施用或由基因傳遞系統(tǒng)編碼)與人野生型α-干擾素多肽在跨越50個氨基酸、100個氨基酸的延伸段或與全長天然多肽序列基本相同。在一些實施方案中，基因傳遞系統(tǒng)編碼的干擾素多肽(以蛋白質(zhì)施用或由基因傳遞系統(tǒng)編碼)與人野生型多肽在跨越50個氨基酸、100個氨基酸、150個氨基酸的延伸段或與全長天然多肽序列的99％、98％、95％或90％相同。
在一些實施方案中，干擾素(以蛋白質(zhì)施用或由基因傳遞系統(tǒng)編碼)是雜交干擾素。含有不同的干擾素亞型序列的雜交α-干擾素基因的構(gòu)建披露于美國專利號4,414,150；4,456,748和4,678,751。美國專利號4,695,623；4,897,471和5,831,062披露了新穎的人白細胞干擾素多肽，該多肽具有的氨基酸序列含有在天然存在的α干擾素亞型多肽中各位置發(fā)現(xiàn)的普通或主要氨基酸并涉及共有人白細胞干擾素。在本發(fā)明的一個實施方案中，雜交干擾素是干擾素α2α1。
在一些實施方案中，干擾素(以蛋白質(zhì)施用或由基因傳遞系統(tǒng)編碼)是干擾素-α。例如，重組干擾素α在大腸桿菌中克隆或表達(例如，Weissmann等.，Science，2091343-1349(1980)；Sreuli等.，Science，2091343-1347(1980)；Goeddel等.，Nature，29020-26(1981)；Henco等.，J.Mol.Biol.，185227-260(1985))。在一些這樣的實施方案中，干擾素是人干擾素α。在一些實施方案中，干擾素α是干擾素2a或2b(參見，例如WO91/18927)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是具有抗癌、抗感染或免疫系統(tǒng)調(diào)制生物活性的干擾素。在一些實施方案中，施用的干擾素蛋白是半合成的蛋白質(zhì)-聚合物偶聯(lián)物(例如，PEG化的干擾素)。在一些示范性實施方案中，干擾素是具有抗感染和抗腫瘤活性的I型干擾素-α(IFN-α)或PEG化的IFN-α2b?？蛇B接上12,000-Da的單甲氧基聚乙二醇(PEG-12000)聚合物。PEG偶聯(lián)被認為增加了血清半衰期并藉此延長了患者與IFN-α2b的接觸而不改變該蛋白的生物效力。
術(shù)語“多肽”指由氨基酸殘基、相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變體、通過肽鍵相連的其非天然存在的合成類似物、相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)類似物及其非天然存在的合成類似物組成的聚合物。合成的多肽可例如使用自動多肽合成儀合成。術(shù)語“蛋白質(zhì)”一般指大的多肽。術(shù)語“肽”一般指短的多肽。術(shù)語“保守取代”指在多肽中用功能或結(jié)構(gòu)類似的氨基酸取代某氨基酸。以下6組各含有可互相保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
文中使用的術(shù)語“生物活性”指通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)測量的任何抗病毒或抗增生或抗癌癥活性(參見，例如，Openakker等，同上；Mossman，J.Immunol.Methods，6555(1983))。
“等位基因形式”指占據(jù)同一遺傳座的多肽的兩種或多種多態(tài)性形式中的任一種。等位基因變體可通過突變天然發(fā)生，并且可在群體內(nèi)導(dǎo)致表型多態(tài)性?；蛲蛔兛墒浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽?！暗任换蛐问健币仓傅米赃z傳等位基因變體的mRNA轉(zhuǎn)錄物的cDNA多肽。在一些實施方案中，干擾素是等位基因形式的。
文中使用的術(shù)語“烷基”表示具有指定碳原子數(shù)(即，C1-C10指1到10個碳原子)的支鏈、非支鏈或環(huán)狀的烴取代基或其組合，這些烴類取代基可是完全飽和的、單或多不飽和的并可含有二和多價取代基。飽和的烴取代基的例子包括(但不限于)甲基、乙基、正-丙基、異-丙基、正-丁基、仲-丁基、異-丁基、叔-丁基、十八烷基、2-甲基戊基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)戊基甲基。這些取代基可任選用一種或多種通常連接到這種鏈上的官能團取代(例如羥基、溴、氟、氯、碘、巰基、或硫代、氰基、硫代烷基、芳基、雜芳基、羧基、硝基、氨基、烷氧基、酰氨基等)來形成烷基取代基，例如羧甲基、三氟甲基、3-羥基己基、2-羧基丙基等。未飽和的烷基取代基具有一個或多個雙鍵或三鍵。未飽和烷基基團的例子包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高的同系物和異構(gòu)體。取代基可用通常連接到所述用于飽和烴類的這種鏈上的一種或多種官能團取代。
術(shù)語“芳基”指多不飽和的(通常是芳香的)烴取代基，所述取代基是融合在一起或共價連接的單環(huán)或多環(huán)(達3個環(huán))。
術(shù)語“雜芳基”指含有0到4個選自N、O和S的雜原子的芳基(或環(huán))，其中N和S原子可任選被氧化，并且氮原子可任選被季胺化。雜芳基可通過雜原子連接到分子的剩余部分。芳基和雜芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4唑基、5-唑基、3-異唑基、4-異唑基、5-異唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。以上芳基和雜芳基環(huán)系統(tǒng)還可被一種或多種通常連接于這種環(huán)系統(tǒng)的官能團取代，所述的官能團例如羥基、溴、氟、氯、碘、巰基、硫代、氰基、硫代烷基、羧基、硝基、氨基、烷氧基或酰氨基。
術(shù)語“?；北硎?C(O)R-取代基，其中R是如上定義的烷基或芳基，例如(但不限于)苯甲?；?、琥珀?；⒁阴；⒈；蚨□；?。
術(shù)語“羥基”表示取代基-OH-。
術(shù)語“烷氧基”表示取代基-OR-，其中R是烷基。
術(shù)語“氨基”表示胺鍵(-NRR′)，其中R和R’獨立地是氫取代基、烷基取代基或芳基取代基。
術(shù)語“羧酸酯”表示取代基-OC(O)R-，其中R是任選取代的烷基或芳基。
術(shù)語“酰氧基”表示取代基-(CRR’)mC(O)OR”-，其中R和R’獨立地選自烷基取代基、芳基取代基或氫取代基，R”是氫或烷基取代基，m是1-8之間包括1和8的整數(shù)。
術(shù)語“鹵素”或“鹵代”指取代基F、Cl、Br或I。
術(shù)語“糖殘基”指包括連接有多個作為同源-寡糖取代基(含有一種類型的單糖的寡糖)或異源寡糖取代基(含有多種類型的單糖的寡糖)的單糖取代基的單糖取代基。在一個優(yōu)選的實施方案中，同源和異源-寡糖取代基由2到10個單糖單元組成。單糖可含有戊糖或己糖殘基，并且這些殘基可以環(huán)化或未環(huán)化(開鏈)形式存在。當單糖呈開鏈形式時，羰基碳的氧原子可被-RR’-取代，其中R和R’獨立地選自烷基取代基、鹵素取代基、羥基取代基、氫取代基、氨基取代基或烷氧基取代基。優(yōu)選的寡糖包括戊糖-戊糖二糖基團，己糖-己糖二糖基團、戊糖-己糖二糖基團和己糖-戊糖二糖基團。單糖可選自核糖、阿拉伯糖、木糖和來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖或塔羅糖，藉此單糖上的一個或多個羥基可被氫、鹵素、烷基取代基、烷氧基取代基、氨基取代基或?；〈〈?br> 膀胱上皮或“尿路上皮”排列于膀胱內(nèi)表面并接近其內(nèi)含物。尿路上皮也排列在腎盂、輸尿管和膀胱的內(nèi)表面并形成保留尿液的牢固屏障，同時防止離子、溶質(zhì)和有毒代謝物穿過上皮屏障的未調(diào)節(jié)運動。當器官在壓力下隨著其注入和清空經(jīng)歷循環(huán)變化時，通常該滲透性屏障必須維持均勻。大多數(shù)膀胱癌發(fā)生于這種上皮細胞。由于尿路、輸尿管和腎盂也排列有這種過渡上皮，在這些位點也可發(fā)生膀胱中相同類型的癌癥。在一些實施方案中，方法和組合物可用于治療位于尿路、輸尿管和腎盂的這些位點的癌癥。
基因傳遞系統(tǒng)一般以能在真核細胞中指導(dǎo)干擾素基因表達的真核表達載體的形式提供。真核表達載體的例子包括病毒和非病毒載體。術(shù)語“真核表達載體”指通過常規(guī)重組DNA技術(shù)制備的含有干擾素表達盒的病毒或非病毒載體。文中使用術(shù)語“表達盒”來定義能指導(dǎo)干擾素編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的核苷酸序列，而該核苷酸序列含有操作性連接于干擾素編碼序列的表達控制元件來使得干擾素序列在轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動物細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。用于實現(xiàn)核苷酸序列在轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中表達的各種病毒和非病毒傳遞載體是本領(lǐng)域已知的。參見，例如Boulikas，T在《基因治療和分子生物學(xué)》(Gene Therapy and Molecular Biology)，卷1(Boulikas，T.編)1998 Gene Therapy Press，Palo Alto，CA 1-172頁。
用于將干擾素基因引入靶細胞的非病毒傳遞系統(tǒng)的例子包括能指導(dǎo)干擾素表達的表達質(zhì)粒。表達質(zhì)粒是自發(fā)復(fù)制的、染色體外的環(huán)狀DNA分子，其不同于常規(guī)基因組，在非選擇性條件下對細胞生存不重要，并且在靶細胞中可實現(xiàn)DNA序列的表達。表達質(zhì)粒也含有啟動子、增強子或者幫助治療性基因表達和/或分泌的其它序列也可包括于表達載體中?？砂~外基因，例如編碼藥物抗性的基因來選擇或篩選重組載體。這種額外基因可含有，例如編碼新霉素抗性、多藥抗性、胸腺嘧啶激酶、β-半乳糖苷酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因。
含有干擾素基因的表達質(zhì)?？砂以谥|(zhì)體中。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫、膠束、不溶性單層、液晶、磷脂分散體、薄片層等。使用脂質(zhì)體載體將核酸傳遞至細胞是本領(lǐng)域熟知的。如Szoka等.，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，Szoka等.，1983年7月19日出版的美國專利號4,394,448以及美國專利號4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369所述，各種方法可用于制備脂質(zhì)體。在實踐本發(fā)明中有用的脂質(zhì)體可從一種或多種標準的成泡脂質(zhì)形成，該脂質(zhì)通常含有中性和帶負電荷的磷脂和甾醇，例如膽固醇。這種成泡脂質(zhì)的例子包括美國專利號5,650,096中披露的DC-chol、DOGS、DOTMA、DOPE、DOSPA、DMRIE、DOPC、DOTAP、DORIE、DMRIE-HP、正-亞精胺膽固醇氨基甲酸酯和其它陽離子脂質(zhì)。一般考慮到，例如脂質(zhì)體大小、酸不穩(wěn)定性和脂質(zhì)體在血流中的穩(wěn)定性來指導(dǎo)選擇脂質(zhì)。其它成分可加入脂質(zhì)體制劑來增加血清半衰期，例如于1991年5月7日出版的美國專利號5,013,556和1993年5月25日出版的美國專利號5,213,804中所述的聚乙二醇包膜(稱為“PEG化”)。
為將非病毒干擾素基因傳遞系統(tǒng)直接傳遞至特定的細胞，把有助于細胞靶向的元件摻入非病毒傳遞系統(tǒng)是有利的。例如，包囊表達質(zhì)粒的脂質(zhì)可含有修飾的細胞表面受體配體來幫助靶向。雖然可施用簡單的脂質(zhì)體制劑，注入或修飾有所需的本發(fā)明組合物的脂質(zhì)體可系統(tǒng)傳遞或?qū)蚋信d趣的組織，然后脂質(zhì)體在該處傳遞選擇的治療性/免疫原性肽組合物。這種配體的例子包括抗體、單克隆抗體、人源化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體或其功能片段(Fv、Fab、Fab’)。此外，如Wu等.，1992年11月24日出版的美國專利號5,166,320和Wu等.，1997年6月3日出版的美國專利號5,635,383中所述，本發(fā)明的DNA構(gòu)建物可通過聚賴氨酸部分連接于靶向部分。
如本發(fā)明的一個實施方案說明的，載體是病毒載體。文中使用的術(shù)語病毒和病毒載體可互換。在實踐本發(fā)明中有用的病毒包括重組修飾的包被或非包被DNA和RNA病毒，優(yōu)選選自桿狀病毒科、細小病毒科、picornoviridiae、皰疹病毒科、痘病毒科、腺病毒科或小RNA病毒科。病毒基因組可通過常規(guī)重組DNA技術(shù)修飾來提供干擾素的表達并且可改造成復(fù)制缺陷的、有條件地復(fù)制或具有復(fù)制能力。利用每種親本載體性能的有利元件的嵌合病毒載體(參見，例如，F(xiàn)eng等.，(1997)Nature Biotechnology 15866-870)也可用于實踐本發(fā)明。最小載體系統(tǒng)也可用于實踐本發(fā)明，該系統(tǒng)中的病毒骨架僅含有包裝病毒載體所需的序列，可任選含有干擾素表達盒。在一些實例中，使用衍生自有待處理的不同種類的載體是有利的，這些載體具有有利的致病性特征，例如避免先存在的免疫應(yīng)答。例如，1998年8月5日公布的WO98/27216中描述的用于人基因治療的馬皰疹病毒載體。由于馬皰疹病毒對人沒有致病性，這些載體描述為可用于治療人。類似地，由于據(jù)稱羊腺病毒可避免抗人腺病毒載體的抗體，它可用于人基因治療。這種載體描述于1997年4月10日公布的WO97/06826。
許多病毒表現(xiàn)出感染廣范圍的細胞類型的能力。然而，在一些應(yīng)用中可能需要僅感染某些細胞的亞群。因此，開發(fā)了各種技術(shù)來幫助選擇性或“靶向”載體以導(dǎo)致特定細胞類型的成熟病毒顆粒的優(yōu)先感染性。細胞類型特異性或細胞類型靶向也可通過修飾病毒包被蛋白質(zhì)從具有廣泛感染性特征的病毒衍生的載體來實現(xiàn)，例如腺病毒。例如，可通過選擇性修飾病毒基因組染色質(zhì)結(jié)和纖維編碼序列來表達修飾染色質(zhì)結(jié)和具有與獨特的細胞表面受體相互作用的纖維結(jié)構(gòu)域，從而用腺病毒載體實現(xiàn)細胞靶向。這種修飾的例子描述于Wickham等，(1997)J.Virol.71(11)8221-8229，“將RGD肽摻入腺病毒纖維蛋白中”(incorporation of RGD peptides into adenoviral fiber proteins)；Arnberg等，(1997)Virology 227239-244，“修飾腺病毒纖維基因來實現(xiàn)對眼睛和生殖道的趨向性”(modification of adenoviral fiber genes to achieve tropism to the eye andgenital tract)；Harris和Lemoine，(1996)TIG 12(10)400-405；Stevenson等，(1997)J.Virol.71(6)4782-4790；Michael等，(1995)gene therapy 2660-668，“將胃泌素釋放肽片段摻入腺病毒纖維蛋白”(incorporation of gastrin releasing peptidefragment into adenovirus fiber protein)和Ohno等，(1997)Nature Biotechnology15763-767，“將蛋白質(zhì)A-IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域摻辛德畢斯病毒”(incorporation ofProteinA-IgG binding domain into Sindbis virus)。其它細胞特異性靶向的方法通過將抗體或抗體片段偶聯(lián)至包被蛋白來實現(xiàn)(參見，例如Michael等，(1993)J.Biol.Chem.2686866-6869；Watkins等，(1997)Gene Therapy 41004-1012；Douglas等，(1996)Nature Biotechnology 141574-1578)。含有一個或多個這種靶向修飾的病毒載體可任選用于實踐本發(fā)明來提高選擇性感染和干擾素在肺組織中表達，特別是肺的上皮組織。
如本發(fā)明的一個實施方案所說明的，載體是腺病毒載體。術(shù)語腺病毒載體總體指乳腺腺病毒屬的動物腺病毒，包括(但不限于)人、牛、羊、馬、犬、豬、鼠和猿腺病毒亞屬。特別是，人腺病毒包括A-F亞屬及其獨立的血清型、獨立的血清型和A-F亞屬，包括(但不限于)人腺病毒類型1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad 11A和Ad 11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91。術(shù)語牛腺病毒包括(但不限于)牛腺病毒類型1、2、3、4、7和10。術(shù)語犬腺病毒包括(但不限于)犬類型1(毒株CLL，Glaxo，RI261，Utrect，Toronto 26-61)和2。術(shù)語馬腺病毒包括(但不限于)馬類型1和2。術(shù)語豬腺病毒包括(但不限于)豬類型3和4。腺病毒用于傳遞外源性轉(zhuǎn)基因是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如Zhang，W-W，(1999)Cancer Gene Therapy 6113-138。在一個實施方案中，表達干擾素序列的腺病毒載體是血清亞型2或5的復(fù)制缺陷型人腺病毒，該病毒通過消除腺病毒E1基因產(chǎn)生得到基本上在靶組織中不能復(fù)制的病毒并任選包括缺失蛋白質(zhì)IX功能。優(yōu)選的重組病毒載體是缺失蛋白質(zhì)IX基因的腺病毒載體傳遞系統(tǒng)。這種系統(tǒng)參見美國專利號6,210,939所披露的，該專利轉(zhuǎn)讓給與本發(fā)明相同的受讓人并出于所有的目的全文納入作為參考。
優(yōu)選的載體衍生自腺病毒、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。在最優(yōu)選的本發(fā)明實踐中，載體衍生自人腺病毒基因組。優(yōu)選的載體衍生自人腺病毒血清型2或5?？赏ㄟ^在E1a和/或E1b編碼區(qū)域修飾或缺失來減弱這種載體的復(fù)制能力(到被認為是“復(fù)制缺陷型”的程度)。實現(xiàn)特定的表達特性或允許反復(fù)施用或降低免疫應(yīng)答的對病毒基因組的其它修飾是優(yōu)選的。
此外，病毒基因組可是有條件復(fù)制或具有復(fù)制能力。有條件復(fù)制的病毒載體用于實現(xiàn)在特定細胞類型中選擇性表達而避免難對付的廣譜感染?？尚揎棽《净蚪M使之含有僅在某些條件下復(fù)制或表達的可誘導(dǎo)啟動子?？烧T導(dǎo)啟動子的例子是本領(lǐng)域已知的(參見，例如Yoshida和Hamada(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.230426-430；Iida等，(1996)J.Virol.70(9)6054-6059；Hwang等，(1997)J.Virol 71(9)7128-7131；Lee等，(1997)Mol.Cell.Biol.17(9)5097-5105和Dreher等，(1997)J.Biol.Chem.272(46)29364-29371)。這些病毒也可被設(shè)計為選擇性復(fù)制病毒，例如描述于Ramachandra等，PCT國際公布號WO00/22137、2000年4月20日公布的國際申請?zhí)朠CT/US99/21452和Howe，J.，PCT國際公布號WO WO0022136、2000年4月20日公布的國際申請?zhí)朠CT/US99/21451中的那些病毒。這些病毒也可被修飾為減弱其在某些細胞類型中的復(fù)制。例如在E1b55K基因中含有特定缺失的腺病毒d11520(Barkerh Berk(1987)Virology 156107)在人類中使用具有療效。這種載體也描述于McCormick(1997年10月14日出版的美國專利號5,677,178)和McCormick，1998年12月8日出版的美國專利號5,846,945。
修飾本發(fā)明的載體通過使用IRES元件或通過獨立地調(diào)節(jié)啟動子以串聯(lián)形式將額外的轉(zhuǎn)基因編碼進干擾素基因。
本發(fā)明提供傳遞增強化合物，當其與蛋白質(zhì)(例如干擾素)或核酸配制時可提高蛋白質(zhì)或核酸傳遞至靶組織或器官的上皮?！耙环N傳遞增強化合物”或“傳遞增強試劑”包括膀胱內(nèi)施用時可提高蛋白質(zhì)或核酸傳遞至上皮或尿路上皮的任何化合物。就蛋白質(zhì)而言，提高的傳遞可通過與靶組織或器官的上皮細胞接觸或進入上皮細胞(例如，尿路上皮)的蛋白質(zhì)量的增加來確定。測定特定化合物在提高蛋白質(zhì)傳遞中是否有效可容易地被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定。尿路上皮對蛋白質(zhì)的滯留可通過任何方法測量，例如ELISA、檢測熒光標記、調(diào)制包括基因表達在內(nèi)的細胞活性。
就基因傳遞系統(tǒng)而言，本發(fā)明提供一種傳遞增強化合物，該化合物提高干擾素基因傳遞至靶細胞、組織或器官。提高的傳遞可通過干擾素基因的拷貝數(shù)或進入每個細胞的基因傳遞系統(tǒng)數(shù)的增加或攝取干擾素基因或干擾素基因傳遞系統(tǒng)的細胞群體在，例如組織或器官中比例的增加來確定。相對于當無傳遞增強化合物的情況下施用時在細胞中傳遞和表達的基因量，結(jié)合了傳遞增強化合物的干擾素基因傳遞系統(tǒng)施用至組織或器官導(dǎo)致細胞內(nèi)傳遞和表達的干擾素基因量的增加。特定化合物在提高核酸傳遞系統(tǒng)的傳遞中是否有效可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來確定。為評價翻譯和蛋白質(zhì)表達，可將報道基因，例如β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白滲入核酸傳遞系統(tǒng)來產(chǎn)生容易分析的信號以評價提高基因表達的水平。為評價轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，可通過PCR分析評價DNA拷貝的存在。
某些傳遞增強化合物可具有不對稱的碳原子(光學(xué)中心)或雙鍵；外消旋體、非對映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體和獨立的異構(gòu)體均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。成雙對映異構(gòu)體的單一非對映異構(gòu)體，例如可通過分部結(jié)晶從合適的溶劑中獲得，例如甲醇或乙酸乙酯或其混合物。如此獲得的成雙對映異構(gòu)體可通過常規(guī)方法分為單獨的立體異構(gòu)體，例如通過使用光學(xué)活性酸作為拆分試劑。此外，本發(fā)明化合物的任何對映異構(gòu)體可使用已知構(gòu)型的光學(xué)純的起始材料或試劑通過立體特異性合成獲得。
傳遞增強化合物可有不同的氫連接位點，稱為互變異構(gòu)體。例如稱為酮-烯醇互變異構(gòu)體的酮與其烯醇形式。單獨的互變異構(gòu)體及其混合物包括在本發(fā)明的分子式中。
傳遞增強化合物可在一個或多個其原子中含有非天然比例的原子同位素。例如，化合物可用同位素進行放射性標記，例如氚或碳-14。本發(fā)明的化合物的所有同位素變化，無論是否具有放射性均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當在化合物的分子式中描述到一個“基團”或“部分”連接于該化合物的另一部分時，應(yīng)理解為對應(yīng)于“基團”或“部分”的基團的一個氫原子被除去以形成該基團。傳遞增強化合物可以其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的形式分離，例如使用無機或有機酸得到的鹽。這種酸可包括鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、馬來酸、琥珀酸、丙二酸等。此外，含有酸性功能的某些化合物可是其無機鹽的形式，其中平衡離子可選自鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等，以及選自有機堿。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指從藥學(xué)上可接受的非毒性堿或酸制備的鹽，包括無機堿或酸和有機堿或酸。
示范性的傳遞增強化合物見美國專利號6,165,779和1997年7月8日提交的美國專利申請?zhí)?8/889,355和2000年8月28日提交的美國專利申請?zhí)?9/650,359，這些專利均轉(zhuǎn)讓給與本申請相同的受讓人并全文納入作為參考。這種化合物包括(但不限于)洗滌劑、醇類、乙二醇、表面活性劑、膽汁鹽、肝素拮抗劑、環(huán)加氧酶抑制劑、高滲鹽溶液和乙酸鹽。醇類包括(但不限于)，例如脂肪族醇，如乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇、乙酰醇(acetyl alcohol)。乙二醇包括，例如甘油、丙二醇、聚乙二醇和其它低分子量的二醇(例如甘油和硫甘油)。乙酸鹽(例如乙酸、葡糖酸)和乙酸鈉還是傳遞增強化合物的例子。高滲鹽溶液(例如1M NaCl)也是傳遞增強化合物的例子。表面活性劑的例子包括十二烷基硫酸鈉(SDS)和溶血卵磷脂、聚山梨酯80、壬基苯氧基-聚氧乙烯、溶血磷脂酰膽堿、聚乙二醇400、聚山梨酯80、聚氧乙烯醚、聚乙二醇醚表面活性劑和DMSO。也可使用膽汁鹽，例如?；悄懰猁}、?；敲撗跄懰徕c、脫氧膽酸鹽、鵝脫氧膽酸鹽、甘氨膽酸鹽、甘氨鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid)和其它收斂劑(如硝酸銀)。可使用的肝素-拮抗劑是季胺類，例如魚精蛋白硫酸鹽。環(huán)加氧酶抑制劑，例如水楊酸鈉、水楊酸和非甾體消炎藥(NSAID)，例如吲哚美辛、萘普生和雙氯芬酸也是合適的。
可用作傳遞增強化合物的洗滌劑包括，例如陰離子、陽離子、兩性離子和非離子洗滌劑。示范性的洗滌劑包括(但不限于)?；悄懰猁}、脫氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、十六烷基吡啶鎓、苯扎氯銨、ZWITTERGENT3-14洗滌劑、CHAPS(3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸酯水合物，Aldrich)、BigCHAP、脫氧Big CHAP、TRITON-X-100洗滌劑、C12E8、辛基-B-D-吡喃葡糖苷、普朗尼克-F68洗滌劑、TWEEN20洗滌劑和TWEEN80洗滌劑(CALBIOCHEMBiochemicals)。
優(yōu)選的傳遞增強化合物的例子是，膽酸鹽衍生物的Big CHAP(參見，例如，Helenius等.，(1979)“洗滌劑的性能”(Properties of Detergents)，Methods inEnzymology，66卷，734-749。特別優(yōu)選的傳遞增強化合物是式I、II、III、VI和VII所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽。
在其它的實施方案中，本發(fā)明提供含有干擾素和至少一種如式I所示的傳遞增強化合物的組合物 其中X1和X2選自
和 并且X3是糖類基團，其中糖類基團可選自戊糖單糖基團、己糖單糖基團、戊糖-戊糖二糖基團、己糖-己糖二糖基團、戊糖-己糖二糖基團和己糖-戊糖二糖基團。其它糖類基團可包括連接為同源寡糖或異源寡糖的多個單糖。優(yōu)選的單糖包括戊糖和/或己糖殘基。例如，糖類基團可選自戊糖單糖基團、己糖單糖基團、戊糖-戊糖二糖基團、己糖-己糖二糖基團、戊糖-己糖二糖基團和己糖-戊糖二糖基團。X3的優(yōu)選糖類基團的一個實例是乳糖。
在一些實施方案中，式I所示的傳遞增強化合物具有由3個或更多個單糖組成的X3糖類基團。糖類基團優(yōu)選具有1個到8個之間的單糖，更優(yōu)選1個到4個之間的單糖，最優(yōu)選約2到3個之間的單糖。使用三糖，例如可提供具有增加溶解性的化合物。
在其它實施方案中，X1和X2均是 并且X3是葡萄糖基團。
本發(fā)明使用的示范性傳遞增強化合物包括式II所示的化合物 其中R1和R2各自獨立地選自氫和羥基基團；m和n各自獨立地選自約0-2；R3選自-NR4R5，其中R4和R5各自獨立地選自氫、糖類殘基、任選取代的烷基、任選取代的酰基、任選取代的酰氧基、和季胺鹽-NR6R7R8X，其中R6、R7和R8獨立地選自氫和C1-C4烷基并且X是選自藥學(xué)上可接受的平衡離子的帶負電荷的離子結(jié)合平衡離子。在一些實施方案中，平衡離子是鹵素或任選取代的酸酸酯。
在一個實施方案中，式II所示的示范性化合物具有均為羥基基團的R1和R2。在另一個實施方案中，式II所示化合物的m和n各自等于1。在另一個實施方案中，式II所示化合物的R4是氫；R5選自氫、糖類殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；?、任選取代的酰氧基。
在一個實施方案中，傳遞增強化合物如式VI所示 在另一個實施方案中，傳遞增強化合物如式VII(SYN3)所示 在另一個實施方案中，R4或R5中至少一個是琥珀?；蛞阴；?。在另一個實施方案中，R3是三甲基銨鹽。
在另一個實施方案中，R4和R5各自獨立地選自氫、任選取代的烷基、任選取代的酰基、任選取代的酰氧基、和季胺鹽-NR6R7R8X，其中R6、R7和R8獨立地選自氫和C1-C4烷基并且X是選自藥學(xué)上可接受的平衡離子的帶負電荷的離子結(jié)合的平衡離子。
用于本發(fā)明方法和組合物的優(yōu)選的傳遞增強化合物的一個例子是式VII所示的SYN3。生產(chǎn)SYN3及其同系物的方法見美國專利號6,392,069，該專利轉(zhuǎn)讓給本申請相同的受讓人并且全文納入作為參考。
對于一些應(yīng)用，需要使用相比于其它化合物其水溶解性和/或傳遞增強活性增加的本發(fā)明方法和組合物中的傳遞增強化合物。示范性傳遞增強化合物如式I所示，其中R是陽離子基團。合適的陽離子基團包括，例如四甲基和銨部分及其鹽。
在另一方面，本發(fā)明提供用于將蛋白質(zhì)膀胱內(nèi)施用至膀胱的藥物組合物，該組合物含有蛋白質(zhì)和傳遞增強試劑。在一些實施方案中，傳遞增強試劑含有SYN3或SYN3同系物。在一些實施方案中，傳遞增強試劑是SYN3或SYN3同系物。在一些實施方案中，傳遞增強試劑是SYN3而蛋白質(zhì)是干擾素。在一些實施方案中，該組合物含有干擾素和SYN3(例如，一種干擾素，約0.1到10mg/ml SYN3，一種SYN3增溶劑(例如，一種表面活性劑，包括Big CHAP或羥丙基β環(huán)糊精(HPβCG)或TRITONTM-X-100洗滌劑/一種辛基苯氧基聚乙氧基乙醇))，緩沖液和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，干擾素是α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素或ω-干擾素或其融合體。在一個實施方案中，制劑中SYN3的量是1-10mg/ml。組合物可凍干并在使用前用合適的藥學(xué)載體稀釋。
在一些實施方案中，本發(fā)明也提供一種含有蛋白質(zhì)和傳遞增強化合物的藥物組合物。制劑中傳遞增強化合物的濃度取決于許多因素，例如使用的具體蛋白質(zhì)和傳遞增強化合物、緩沖液、pH和施用方案。傳遞增強化合物的濃度基本上取決于蛋白質(zhì)及其溶解性。就在較高濃度有效的試劑而言，濃度范圍通常在1％到50％(v/v)，優(yōu)選10％到40％(v/v)，最優(yōu)選15％到30％(v/v)。就在較低濃度有效的傳遞增強試劑而言，本發(fā)明具體的傳遞增強化合物在本發(fā)明試劑中使用的優(yōu)選范圍約為0.002到2mg/ml，更優(yōu)選約0.02到2mg/ml，最優(yōu)選約0.1到1mg/ml。含有SYN3或其同系物或類似物的本發(fā)明的傳遞增強化合物在本發(fā)明試劑中的優(yōu)選使用范圍約是0.002到20mg/ml，更優(yōu)選約0.02到2mg/ml，最優(yōu)選約0.1到1mg/ml。
在另一方面，本發(fā)明提供用于施用編碼干擾素基因的重組腺病毒和傳遞增強試劑的藥物制劑。在一些實施方案中，傳遞增強試劑含有SYN3或SYN3同系物。在一些實施方案中，基因傳遞系統(tǒng)含有編碼干擾素基因的約109-1012個顆粒(PN)/ml重組腺病毒，約0.1到10mg/ml SYN3，一種SYN3增溶劑(例如，一種表面活性劑，包括Big CHAP或羥丙基β環(huán)糊精(HPβCG)或TRITONTM-X-100洗滌劑/一種辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，一種緩沖液和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，干擾素基因是α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素或ω-干擾素基因或其融合體或編碼具有干擾素的抗癌癥、抗感染或免疫系統(tǒng)調(diào)制生物活性的多肽的一部分。在一個實施方案中，制劑中SYN3的量是1-10mg/ml。組合物可凍干并在使用前用合適的藥學(xué)載體稀釋。
在一些實施方案中，本發(fā)明也提供含有干擾素基因傳遞系統(tǒng)和傳遞增強化合物的制劑。傳遞增強化合物的濃度取決于許多因素，例如使用的具體基因傳遞系統(tǒng)和傳遞增強化合物、緩沖液、pH、靶組織或器官和施用方式。傳遞增強化合物的濃度基本上取決于所使用的試劑。就在較高濃度有效的試劑而言，濃度范圍通常在1％到50％(v/v)，優(yōu)選10％到40％(v/v)，最優(yōu)選15％到30％(v/v)。就在較低濃度有效的傳遞增強試劑而言，本發(fā)明具體的傳遞增強化合物在本發(fā)明試劑中使用的優(yōu)選范圍約為0.002到2mg/ml，更優(yōu)選約0.02到2mg/ml，最優(yōu)選約0.1到1mg/ml。含有SYN3或其同系物或類似物的本發(fā)明的傳遞增強化合物在本發(fā)明試劑中的優(yōu)選使用范圍約是0.002到20mg/ml，更優(yōu)選約0.02到2mg/ml，最優(yōu)選約0.1到1mg/ml。
用于本發(fā)明的方法和組合物的傳遞增強化合物通常在化合物可溶的溶劑中配制，盡管化合物僅是部分溶解的制劑也是合適的。磷酸緩沖鹽水(PBS)是這些化合物合適的增溶劑的例子之一，并且其它增溶劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。人們可認識到需要某些的額外賦形劑和添加劑來實現(xiàn)用于各種藥物制劑的這些試劑的溶解性特征。例如，熟知的增溶劑(例如洗滌劑、脂肪酸酯和表面活性劑)可以適當?shù)臐舛燃尤雭韼椭褂玫母鞣N溶劑中化合物的溶解。當制劑中含有洗滌劑時，在施用于患者的最終制劑中洗滌劑的濃度優(yōu)選約是0.5-2×臨界膠束濃度(CMC)。合適的洗滌劑包括以上所列出的。對使用的合適洗滌劑及其合適的濃度的鑒定可如文中所述測定。用于化合物(例如SYN3及相關(guān)化合物)的增溶劑的一個例子是吐溫80，其濃度約為0.05％到0.3％，更優(yōu)選約為0.10％到0.15％。Big CHAP也是SYN3和相關(guān)化合物的增溶劑。
當用于制藥目的時，本發(fā)明的制劑包括含有傳遞增強化合物的緩沖液。緩沖液可是任何藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如磷酸緩沖鹽水或磷酸鈉/硫酸鈉，Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、無菌水和其它本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的緩沖液，例如描述于Good等.，Biochemistry，(1966)5467的那些緩沖液。含有調(diào)制的治療性蛋白質(zhì)的藥物組合物中緩沖液的pH，例如通常是6.4到8.4，優(yōu)選7到7.5，最優(yōu)選7.2到7.4。
本發(fā)明的組合物可額外含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑或增溶劑、增強劑或其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。生理上可接受的化合物包括，例如糖類(葡萄糖、蔗糖或右旋糖)、抗氧化劑(例如抗壞血酸或谷胱甘肽)、螯合劑、低分子量蛋白質(zhì)或其它穩(wěn)定劑或賦形劑。其它生理上可接受的化合物包括濕潤劑、乳化劑、分散劑或防腐劑，這些化合物在防止微生物的生長或作用中尤其有用。各種防腐劑是熟知的并且包括，例如苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道選擇藥學(xué)上可接受的載體取決于施用的途徑和治療性蛋白質(zhì)的具體理化性質(zhì)。載體、穩(wěn)定劑或佐劑的例子見Martin，《雷明頓制藥科學(xué)》(Remington′s Pharm.Sci.)，第15版，(Mack Publ.Co.，Easton，PA 1975)和《雷明頓藥劑學(xué)科學(xué)與實踐》(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，第19版，(Lippincott，Williams & Wilkins Publisher，1995年12月)，這些文獻納入文中作為參考。
本發(fā)明的另一方面是含有干擾素和SYN3的藥物組合物，該組合物聯(lián)合藥學(xué)上可接受的水性載體、至少一種藥學(xué)上可接受的增溶劑和至少一種藥學(xué)上可接受的膨脹劑。這種藥物組合物還可含有聯(lián)合藥學(xué)上可接受的載體和蛋白質(zhì)的SYN3。參見2002年12月20日提交并轉(zhuǎn)讓給與本申請相同的受讓人的美國專利申請?zhí)?0/329,043[題為“SYN3組合物及方法”(SYN3 COMPOSITIONS ANDMETHODS)，代理人審理號016930-000841US]，并且全文納入作為參考。
用于施用重組腺病毒的一種示范性制劑是以磷酸緩沖鹽水(PBS)配制的約含109-1011PN/ml病毒，約0.1到1.0mg/ml SYN3與合適的SYN3增溶劑(例如，約2-10mM Big CHAP或約0.1-1.0mM TRITONX-100洗滌劑)，加上約2-3％蔗糖(w/v)和約1-3mM MgCl2，pH約為6.4-8.4。
本發(fā)明的另一方面是含有干擾素基因傳遞系統(tǒng)和SYN3的藥物組合物，該組合物聯(lián)合藥學(xué)上可接受的水性載體、至少一種藥學(xué)上可接受的增溶劑和至少一種藥學(xué)上可接受的膨脹劑。這種藥物組合物還可含有SYN3聯(lián)合藥學(xué)上可接受的載體和表達載體或含有插入載體中的干擾素DNA序列的基因傳遞系統(tǒng)，該干擾素DNA序列是外源性的。在一些實施方案中，干擾素的核酸序列在對象的預(yù)期靶組織或器官中是外源性的或者未顯著表達。序列參見2002年12月20日提交并轉(zhuǎn)讓給與本申請相同的受讓人的美國專利申請?zhí)?0/329,043[題為“SYN3組合物及方法”(SYN3 COMPOSITIONS AND METHODS)，代理人審理號016930-000841US]，并且全文納入作為參考。
本發(fā)明的制劑中可用的溶劑包括優(yōu)選按照USP標準制備的，例如水性溶劑，如注射用水；和/或非水性溶劑，如DMSO和N，N-二甲基乙酰胺(也稱為DMF)；和共溶劑混合物，例如甘油和水。
這些制劑優(yōu)選含有聚山梨酯或聚氧乙烯山梨醇酯(一類非離子表面活性劑)，其中包括例如聚山梨酯80和聚山梨酯20、普朗尼克或聚乙烯聚丙二醇嵌段共聚物(一類非離子表面活性劑)，其中包括例如普朗尼克L68和L92，和羥丙基-β-環(huán)糊精，多取代的羥烷基-β-環(huán)糊精(一類非離子的絡(luò)合劑)，包括例如HPβCD和Big CHAP。優(yōu)選作為加溶劑的是HPβCD、Big CHAP、聚山梨酯80、聚山梨酯20、普朗尼克L64和普朗尼克L92。增溶劑可，例如單獨使用或組合使用。增溶劑的濃度列于下文。HPβCD的濃度約是50到500mg/ml，Big CHAP的濃度約是20到360mg/ml，聚山梨酯80的濃度約是1到36mg/ml，普朗尼克的濃度約是1到150mg/ml，并且其它成分可存在的濃度列于下文。
凍干的SYN3制劑優(yōu)選含有檸檬酸鹽緩沖系統(tǒng)。更優(yōu)選檸檬酸鹽緩沖系統(tǒng)含有至少一種檸檬酸緩沖液，例如檸檬酸單水合物USP或檸檬酸鈉二水合物USP。更優(yōu)選檸檬酸鹽緩沖液系統(tǒng)含有檸檬酸一水合物USP和檸檬酸鈉二水合物USP的組合。當組合使用時，檸檬酸一水合物USP存在量的濃度約為0.005到約2mg/ml，更優(yōu)選0.016到約1.35mg/ml，優(yōu)選0.016到約0.72mg/ml，優(yōu)選約0.005到約1.35，并且檸檬酸鈉二水合物USP存在量的濃度約為0.02到約5.37mg/ml，優(yōu)選0.05到3.00mg/ml，優(yōu)選0.05到2.31mg/ml。其它合適的緩沖系統(tǒng)包括，例如磷酸鹽、甘氨酸，這些緩沖系統(tǒng)可替代檸檬酸鹽緩沖系統(tǒng)或與其組合使用，并且是以上各不相同的組合。
緩沖系統(tǒng)可提供凍干制劑的pH，從而提高了穩(wěn)定性。pH優(yōu)選在約5到約6。SYN3的混合水性制劑優(yōu)選緩沖在pH約7到約8.5，更優(yōu)選約7.4，并且40℃時SYN3在脫水粉末中可維持穩(wěn)定至少3個月。
凍干的制劑優(yōu)選含有甘氨酸或甘露醇作為凍干膨脹劑。其它可用的合適凍干膨脹劑包括，例如乳糖、重組明膠和甲基纖維素。當凍干膨脹劑是甘露醇時，其濃度從約5到100mg/ml，而當試劑是甘氨酸時，其濃度從約10到200mg/ml。
凍干制劑優(yōu)選含有抗壞血酸作為抗氧化劑。其它可用的合適抗氧化劑包括，例如檸檬酸。當抗壞血酸是抗氧化劑時，其濃度是約0.001到約0.6mg/ml。
本發(fā)明的組合物可額外含有，例如穩(wěn)定劑、增強劑或其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。藥學(xué)上可接受的載體可含有生理上可接受的化合物，這些化合物的作用是，例如穩(wěn)定含有腫瘤抑制基因的重組腺病毒載體傳遞系統(tǒng)。生理上可接受的化合物包括，例如糖類，如葡萄糖、蔗糖或右旋糖，羥丙基-β-環(huán)糊精，抗氧化劑，例如抗壞血酸或谷胱甘肽，鰲合劑，低分子量蛋白質(zhì)或其它穩(wěn)定劑或賦型劑。
其它生理上可接受的化合物包括，例如潤濕劑、乳化劑、分散劑或防腐劑，這些化合物在防止微生物生長或作用中尤其有用。各種防腐劑是熟知的并且包括，例如苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道選擇藥學(xué)上可接受的載體取決于施用的途徑和治療性蛋白質(zhì)的具體理化性質(zhì)。載體、穩(wěn)定劑或佐劑的例子見Gennaro，《雷明頓藥劑學(xué)的科學(xué)與實踐》(Remington’sThe Science andPractice of Pharmacy)，第19版，(Mack Publishing.Co.，Easton，Pa.1995)，這些文獻納入文中作為參考。
本發(fā)明的對象是哺乳動物，包括(但不限于)小鼠、大鼠、靈長類、特別是人。
用于核酸和蛋白質(zhì)傳遞的示范性傳遞增強化合物包括本發(fā)明使用的SYN3的同系物，包括式II所示的化合物。
在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物含有一種緩沖液配制的“治療有效”量的治療劑(例如，蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的基因傳遞系統(tǒng))，該試劑中含有傳遞增強化合物。文中使用的“治療有效”指防止、減少或治愈疾病狀態(tài)，例如癌癥或病毒感染或其癥狀。
傳遞增強化合物可單獨使用或與干擾素或干擾素基因傳遞系統(tǒng)聯(lián)合使用或與額外的試劑聯(lián)合使用。例如，制劑在治療疾病和病癥中有用，包括癌癥、細胞增生性疾病和慢性感染?！鞍┌Y”通常涉及組織或器官內(nèi)細胞不受限制的增生。這要包括其中一種或多種細胞被分類為癌性、惡性、腫瘤性的、癌前期的、轉(zhuǎn)化的，或分類為腺瘤或癌的疾病，或是通常在這些疾病領(lǐng)域使用的任何其它同義詞。
含有干擾素基因的治療有效量藥物組合物可按照本發(fā)明的指導(dǎo)施用，所述基因在含有傳遞增強試劑的緩沖系統(tǒng)配制的重組病毒載體傳遞系統(tǒng)中。例如，在含有傳遞增強試劑的緩沖系統(tǒng)配制的重組腺病毒載體傳遞系統(tǒng)中治療有效量的干擾素基因約為108個顆粒/ml到1012個顆粒/ml，更常見的約是108個顆粒/ml到5×1011個顆粒/ml，最常見的是109個顆粒/ml到1011個顆粒/ml(PN/ml)或1010個顆粒/ml到1011個顆粒/ml(PN/ml)。上述劑量一般以對象能耐受的頻率施用。腫瘤學(xué)領(lǐng)域中常見的實踐以最大耐受劑量或接近最大耐受劑量提供劑量是。
根據(jù)本發(fā)明所述，可施用在含有傳遞增強劑的緩沖液中配制的含有蛋白質(zhì)(如干擾素)的治療有效量的藥物組合物。例如，治療有效量的干擾素或干擾素傳遞系統(tǒng)容易由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定。一般施用的劑量是對象通常耐受的。如上所述，在腫瘤學(xué)領(lǐng)域中常見的實踐是以最大耐受劑量或接近最大耐受劑量提供劑量。
在本發(fā)明的一個用于治療膀胱癌的實施方案中，干擾素結(jié)合作為多進程治療方案的一部分的傳遞增強試劑提供，該方案由3周的治療周期組成，每個周期在第1天或任選每個周期的第1天和第2天提供一次膀胱內(nèi)施用。典型的治療膀胱癌的方式，醫(yī)師將導(dǎo)尿管插入尿道使對象排尿。制備含有配制的傳遞增強試劑和治療性干擾素蛋白或干擾素基因傳遞系統(tǒng)的溶液并將其滴注入膀胱。夾住導(dǎo)尿管使溶液維持于膀胱中約1小時。應(yīng)該注意的是，需要較長時間的接觸以提高試劑傳遞至上皮，但是實際情況往往限制了這種實踐。例如，1小時一般是對象感到要排尿的時刻。傳遞增強試劑的作用已證實產(chǎn)生了延長作用，因此，膀胱在滴注蛋白質(zhì)之前與傳遞增強試劑預(yù)接觸可提高傳遞。這可在考慮蛋白質(zhì)制劑與傳遞增強試劑之間的相容性時使用。所需的接觸之后，去除導(dǎo)尿管夾并允許對象排尿。以上過程在患者耐受的情況下可重復(fù)多次來達到治療作用。通過常規(guī)方法可容易地評價治療作用，例如插入膀胱的膀胱鏡檢查。
這些制劑可以對應(yīng)于有待注入的空腔或有待治療的器官或組織的大小施用。就人膀胱而言，合適的施用體積取決于對象的年齡和身材，特別是其膀胱的大小。施用體積一般從50到500ml，更常見的是從50到250ml或從100到200ml。在一些施用方法中，可通過以下方式經(jīng)濟地節(jié)約施用量，將球囊導(dǎo)管插入有待治療的膀胱或囊并膨脹導(dǎo)管的球囊部分來減少被施用的組合物占據(jù)的空腔體積。
此外，上述治療方案可用其它治療方案補充或與其結(jié)合使用來提高治療效果。本發(fā)明的方法可用，例如常規(guī)BCG和/或化療治療方案來補充。向個體提供多種治療方案以達到最大的效果是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的標準實踐方式。
在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒在第一容器中有傳遞增強化合物并且在第二容器中有蛋白質(zhì)或基因傳遞系統(tǒng)。在一個實施方案中，結(jié)合容器的內(nèi)含物以制備含有傳遞增強試劑和蛋白質(zhì)或基因傳遞系統(tǒng)的制劑，然后將該制劑施用于對象。在另一個實施方案中，容器中的內(nèi)含物作為獨立的制劑施用于患者。傳遞增強試劑可在施用蛋白質(zhì)或基因傳遞系統(tǒng)之前、期間或之后施用。在一示范性實施方案中，二者同時施用或幾乎同時施用。任一個容器或兩個容器中的制劑可是配制于藥學(xué)上可接受的液體載體中的凍干粉末。
在另一個實施方案中，試劑盒提供含有能提高蛋白質(zhì)或基因傳遞系統(tǒng)的SYN3或SYN3同系物或類似物的第一容器以及含有蛋白質(zhì)或基因傳遞系統(tǒng)的第二容器。在其它實施方案中，第一容器含有SYN3或SYN3同系物或類似物的凍干制劑。在另一個實施方案中，第二容器含有蛋白質(zhì)的凍干制劑。在其它實施方案中，第一個和第二容器均含有其各自內(nèi)含物的凍干制劑。在其它示范性實施方案中，蛋白質(zhì)是基本上與人α-干擾素多肽相同的多肽或是人α-干擾素多肽，或基因傳遞系統(tǒng)相同編碼這樣的蛋白質(zhì)。
在一些實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可在不同的時間間隔重復(fù)施用，從而增加治療效果。這些間隔可以大約是天、周或月。施用的次數(shù)可依治療方案及其持續(xù)時間而變。通常，本發(fā)明的施用可每半周、一周、兩周、一月或兩月進行兩個月、四個月、六個月或甚至更長的時間。通過檢測對象中干擾素的生產(chǎn)或釋放或評價患者的臨床應(yīng)答(例如，如果治療的疾病是癌癥，則檢測腫瘤的減少)來設(shè)計個體對象的施用頻率。
在另一個實施方案中，當有待治療的疾病是膀胱癌并且膀胱內(nèi)施用治療性蛋白質(zhì)(例如，干擾素)或基因傳遞系統(tǒng)(例如，用于編碼干擾素的基因)時，通過檢測膀胱中腫瘤塊的大小和數(shù)量來評價患者對本發(fā)明的治療方法以及組合物的應(yīng)答。這種檢測可通過直接成像方法(例如MRI或放射性同位素成像技術(shù))來檢測體液(例如血液或尿液)中的腫瘤特異性抗原或產(chǎn)物來進行。
用傳遞增強試劑和干擾素或編碼干擾素的基因配制的組合物可用于向細胞提供干擾素，包括(特別是)器官和組織的上皮細胞。干擾素的治療作用和用途是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。例如，本發(fā)明的組合物在治療癌癥中有用。適用于本發(fā)明的治療方法和組合物的癌性組織和器官包括任何具有上皮膜的組織或器官，例如胃腸道、膀胱、呼吸道和肺。例子包括(但不限于)膀胱和上呼吸道、女陰、子宮頸、陰道、子宮或支氣管癌；腹膜的局部轉(zhuǎn)移性腫瘤；細支氣管肺泡癌、轉(zhuǎn)移性胸膜癌；口腔和扁桃體癌；鼻咽、鼻、喉、食道、胃、結(jié)腸和直腸、膽囊或皮膚癌或黑色素瘤。
本發(fā)明的方法和組合物在治療哺乳動物(更尤其是人)膀胱癌中特別有用。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療的患者已用各種膀胱癌療法治療過并且通過未能減少膀胱腫瘤塊的大小或數(shù)量或通過該腫瘤之后的復(fù)發(fā)或再生或重現(xiàn)測定未能產(chǎn)生滿意的應(yīng)答。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法或組合物施用至對BCG治療未產(chǎn)生滿意應(yīng)答的對象。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物與另一種癌癥療法(例如BCG治療)結(jié)合治療膀胱癌。在這種實施方案中，對象可在其BCG治療之前、之后或期間接受本發(fā)明的方法和組合物。
在一些實施方案中，可通過細胞檢查或更優(yōu)選測量尿液中的微衛(wèi)星DNA來評價膀胱癌的重現(xiàn)或治療效果。參見Steiner G，Schoenberg MP，Linn JF，Mao L，Sidransky D，“通過尿液的微衛(wèi)星分析檢測膀胱癌重現(xiàn)”(Detection ofbladder cancer recurrence by microsatellite analysis of urine)，Nat Med.，1997 6月；3(6)621-4。在一個治療膀胱癌的實施方案中，通過球囊導(dǎo)管施用治療組合物。導(dǎo)管具有可通過尿道插入膀胱空腔的球囊，球囊在空腔中膨脹占據(jù)空腔的一部分，優(yōu)選絕大部分，從而給施用的本發(fā)明組合物留下有待占據(jù)的最小空間。導(dǎo)管有將組合物轉(zhuǎn)移入膀胱的另一部分以便與膀胱空腔接觸。球囊導(dǎo)管是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。
在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物可以減少或避免稀釋傳遞增強試劑，或者考慮到預(yù)計的稀釋體積可增加制劑中傳遞增強試劑的量的方式施用。避免稀釋的方式包括通過生理方法(例如，排尿、禁食)或藥物介入(例如，泄藥)或醫(yī)療介入(通過導(dǎo)管引流)清空靶空間。球囊導(dǎo)管或其它方式可用于分離腔內(nèi)空間的體積或組合物要占據(jù)的通道。在一些實施方案中，球囊導(dǎo)管也可用于部分占據(jù)有待注入的空間，從而減少組合物要占據(jù)的空間。在其它實施方案中，制劑自身配制為制劑的儲器或粘附在靶空間的表面并因此避免了大量混合導(dǎo)致的即刻稀釋或大量流動導(dǎo)致的損失。
膀胱內(nèi)施用至膀胱時傳遞增強試劑和干擾素或干擾素基因療劑之間的協(xié)同作用有助于減少或避免通常與干擾素治療相關(guān)的副作用。
可通過本領(lǐng)域已知的任何方式施用合適量的組合物，例如表面、局部、口服或直腸、胃腸外、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、真皮下、真皮、鼻內(nèi)、眼部、肺部、透皮或經(jīng)尿道、膀胱內(nèi)、肌肉內(nèi)、或經(jīng)尿道和膀胱內(nèi)施用。在一些實施方案中是透皮施用。如本領(lǐng)域已知的，合適量或劑量的組合物可憑經(jīng)驗確定。
藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的鹽包括(但不限于)金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等；堿土金屬鹽，例如鈣鹽。鎂鹽等；有機胺鹽，例如三乙胺鹽、乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、二環(huán)己胺鹽等；無機酸鹽，例如鹽酸鹽、氫溴化物、硫酸鹽、磷酸鹽等；有機酸鹽，例如甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽等；磺酸鹽，例如甲基酸鹽、苯磺酸鹽、對-甲苯磺酸鹽等；氨基酸鹽，例如精氨酸鹽、天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽等。
實施例提供以下實施例僅是說明性目的，并非要限制文中要求的本發(fā)明的范圍。技術(shù)人員在舉出的實例和/方法中做出的任何改變要包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例1美國專利號6,312,681披露了傳遞含有針對膀胱上皮膜中癌細胞的轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體的方法，所述方法包括向上皮膜施用腺病毒載體和1％和50％(v/v)之間的乙醇或另一種傳遞增強試劑，其中腺病毒載體感染細胞并且在感染的細胞中表達轉(zhuǎn)基因。美國專利號6,312,681轉(zhuǎn)讓給與本申請相同的受讓人，并全文納入作為參考。
實施例2下表顯示了本發(fā)明的非水性液體SYN3制劑的成分的示范性范圍。施用之前(例如，用于膀胱癌)，SYN3溶液按1∶50v/v的比例與重組腺病毒制劑結(jié)合來形成要施用于患者的混合物。
為制備組合物，稱取約75％DMA到玻璃燒杯。向另一個燒杯中裝入表面活性劑(聚山梨酯80、聚山梨酯20、普朗尼克L64或普朗尼克L92)并溶解在小體積(約是10％的終體積)的DMA中。恒速攪拌的同時將DMA/表面活性劑溶液加入DMA。預(yù)先在另一個燒杯中稱取SYN3。攪拌的同時緩慢地將SYN3加入溶液。一旦SYN3溶解，加入足夠的DMA至最終的重量體積比(25℃時密度＝0.962g/ml)。使用與裝有非乳膠活塞的注射器相連的0.22濾器過濾溶液并于4℃將溶液保存在牢固密封的容器內(nèi)。
以下其它的組合物可按照類似于實施例1的方式制備。

按照相同的方法制備以下25ml的批次。
實施例3下表顯示了本發(fā)明的凍干SYN3制劑的成分的示范性范圍。所示的復(fù)合溶液注入容積為20ml的II型玻璃小瓶中并凍干。用于施用的制劑需要向含有凍干餅狀物的小瓶中加入20ml WFI來再溶解SYN3。SYN3溶液按照1∶5v/v的比例與p53或任何重組腺病毒制劑結(jié)合。然后將混合物施用于患者，例如膀胱癌的患者。
以下實施例是制備凍干制劑的方法。
實施例4
SYN3的實際用量使用下式按照每批藥物的純度調(diào)整克，SYN3＝24.0×100/(％純度)。
例如，SYN3藥物＝97.0％純。
24.0×100/97.0＝每批1升要用24.7克SYN3。
因此，按照下式確定每批的SYN3用量克SYN3/升＝24.0克/升×[100/(％SYN3批純度)]。
按照下式確定每批使用的注射用水體積注射用水體積(升)＝批體積(升)×0.5。
將使用上式計算的注射用水的體積裝入裝配有攪拌器的配衡的復(fù)合容器。一邊攪拌一邊加入并溶解Big CHAP。可使用注射無菌水來沖洗稱重容器以回收所有物質(zhì)。完全溶解Big CHAP可能需要以中等攪拌速率繼續(xù)攪拌約30-60分鐘。一邊攪拌(中等攪拌速率)一邊向Big CHAP溶液中加入并溶解SYN3?？墒褂米⑸溆盟畞頉_洗稱重容器以回收所有物質(zhì)。完全溶解SYN3可能需要攪拌1小時。一邊攪拌一邊向含有Big CHAP和SYN3的溶液中依次加入并溶解甘氨酸、抗壞血酸、檸檬酸一水合物和檸檬酸鈉二水合物?？墒褂米⑸溆盟畞頉_洗稱重容器以回收所有物質(zhì)。加入注射用水使該批次至終體積(25℃時，溶液的密度約是1.051g/ml)。溶液至少攪拌15分鐘。
取出少許溶液樣品(＜5ml)來測量pH。pH應(yīng)在5.0和6.0之間。無需調(diào)節(jié)pH。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易地確定所得產(chǎn)物的pH。
無菌過濾溶液以完成混合。如果需要，在注入小瓶之前，混合的批次可在2℃到8℃保存于密封、無菌、不銹鋼壓力容器內(nèi)達24小時。批料可多次過濾以保持無菌。
向已清洗并滅菌的20-ml I型火石玻璃小瓶中注入5.3±0.1ml溶液。給凍干狀態(tài)的小瓶中無菌裝上已清洗、硅化和滅菌的20-mm West4416/50lyo-形橡膠塞。
凍干機擱板預(yù)冷至4±2℃。將裝有小瓶的托盤無菌放置于凍干機擱板上。放好所有的托盤后，在1小時內(nèi)使擱板冷至-40℃并使產(chǎn)品在處理前維持于-35℃或更低至少4小時。開始冷卻冷凝機。當冷凝機溫度為-45℃或更低時，開始抽空小室。當?shù)竭_50-70mm Hg的真空壓時，在0.5小時期間將擱板的溫度升至-20℃。在壓力約是150mm Hg(100到200mm Hg壓力)條件下維持擱板的溫度在-20℃，36小時。產(chǎn)品在處理之前必須維持于或高于-20℃至少6小時。在1小時內(nèi)使擱板溫度升至25℃并降低壓力至約50mm Hg壓力。約50mm Hg壓力下，擱板溫度于25℃維持14小時。使用無菌過濾的氮氣對小室通氣至約950mm Hg。在凍干機內(nèi)給小瓶塞上塞子。從凍干機中取出小瓶并用20-mm鋁密封條繞住小瓶。小瓶應(yīng)保存于2℃到8℃直至檢查完畢。
產(chǎn)品是白色至灰白色的餅狀物。檢查后小瓶應(yīng)保存于2℃到8℃之間。出于標記和檢查的目的，小瓶應(yīng)暴露于19℃-25℃，6小時。
實施例5以下實施例按照以上實施例4列出的批次制劑制備。
所得產(chǎn)品的pH是5.34。
所得產(chǎn)品的pH是5.45。
所得產(chǎn)品的pH是5.76。
得到的凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性測試顯示這些產(chǎn)品相對于SYN3是高度穩(wěn)定。穩(wěn)定性測試通過HPLC完成。
凍干制劑用19.5ml WFI重建(再溶解)樣品置于所示溫度條件，孵育特定的時間，并通過HPLC測定濃度并與初始濃度相比較。
實施例6
SYN3的實際用量使用下式按照每批藥物的純度調(diào)整克，SYN3＝24.0×100/(％純度)。
樣品計算SYN3藥物＝97.0％純。
24.0×100/97.0＝每批1升要用24.7克SYN3。
以下實施例如此制備首先，按照下式確定每批的SYN3用量克SYN3/升＝24.0克/升×[100/(％SYN3批純度)]。
接著，按照下式確定每批使用的注射用水體積注射用水體積(升)＝批體積(升)×0.5。
將注射用水的體積裝入裝配有攪拌器的配衡的復(fù)合容器。一邊攪拌一邊加入并溶解羥丙基-β-環(huán)糊精。注意，完全溶解羥丙基-β-環(huán)糊精可能需要以中等攪拌速率繼續(xù)攪拌約30-45分鐘。可使用注射用水來沖洗稱重容器以回收所有物質(zhì)。向溶液中加入并溶解聚山梨酯80。聚山梨酯80可預(yù)先溶解于0.1×總批次體積的注射用水(升)并加入溶液。
一邊攪拌一邊向溶液中加入并溶解SYN3。完全溶解SYN3可能需要攪拌1小時?？墒褂米⑸溆盟畞頉_洗稱重容器以回收所有物質(zhì)。
一邊攪拌一邊向溶液中依次加入并溶解抗壞血酸、檸檬酸一水合物和檸檬酸鈉二水合物?？墒褂米⑸溆盟畞頉_洗稱重容器以回收所有物質(zhì)。加入注射用水使該批次至終體積(25℃時，溶液的密度是1.058g/ml)。溶液至少攪拌15分鐘。
取出少許溶液樣品(＜5ml)來測量pH。pH應(yīng)在5.0和6.0之間。無需調(diào)節(jié)pH。將已洗滌和測試過完整性的溶液無菌過濾進無菌、不銹鋼壓力容器或應(yīng)使用的等價物。如果需要，在注入小瓶之前，混合的批次可在2℃到8℃保存于密封、無菌、不銹鋼壓力容器內(nèi)達24小時。該批料可過濾多次以保證無菌。
向已清洗并滅菌的20-ml I型火石玻璃小瓶中注入5.3±0.1ml溶液。給凍干狀態(tài)的小瓶中無菌裝上已清洗、硅化和滅菌的lyo-形橡膠塞。
為進行凍干，凍干機擱板預(yù)冷至4±2℃。將裝有小瓶的托盤無菌放置于凍干機擱板上。放好所有的托盤后，在1小時內(nèi)使擱板冷至-40℃并使產(chǎn)品在處理前維持于-35℃或更低至少4小時。開始冷卻冷凝機。當冷凝機溫度為-45℃或更低時，開始抽空小室。當?shù)竭_50-70mm Hg的真空壓時，在0.5小時期間將擱板的溫度升至-20℃。在壓力約是150mm Hg(100到200mm Hg壓力)條件下維持擱板的溫度在-20℃，36小時。產(chǎn)品在處理之前必須維持于或高于-20℃至少6小時。在1小時內(nèi)使擱板溫度升至25℃并降低壓力至約50mm Hg壓力。
在約50mm Hg壓力下，擱板溫度于25℃維持14小時。使用無菌過濾的氮氣對小室通氣至約950mm Hg。在凍干機內(nèi)給小瓶塞上塞子。從凍干機中取出小瓶并用20-mm鋁密封條繞住小瓶。小瓶應(yīng)保存于2℃到8℃直至檢查完畢。
產(chǎn)品是白色至灰白色的餅狀物。檢查后小瓶應(yīng)保存于2℃到8℃之間。出于標記和檢查的目的，小瓶應(yīng)暴露于19℃-25℃，6小時。
當重組腺病毒載體(例如，p53(rAD/p53))結(jié)合SYN3的凍干制劑時，它在37℃至少可維持2小時穩(wěn)定、在25℃至少可維持24小時穩(wěn)定。當p53結(jié)合SYN3的水溶液制劑時，它在37℃至少可維持4小時穩(wěn)定、在25℃至少可維持24小時穩(wěn)定。
實施例7.合成化合物A-LB在以下實施例中，“g”指克、“ml”指毫升、“mol”指摩爾、“℃”指攝氏度、“min”指分鐘、“DMF”指二甲基甲酰胺，“PN”指顆粒數(shù)目。除非另有說明，所有的溫度是攝氏度。
下文涉及在合成化合物VII(也稱為A-LB)中使用的方法。以下提供了化合物5-6的合成細節(jié)和純化所需的步驟。
使用的方法和試劑N-(3-氨丙基)-1，3-二氨基丙烷膽酸二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)氯甲酸異丁酯三乙胺乳糖酸實驗合成化合物A-LB下文涉及在合成化合物VII(也稱為A-LB)中使用的方法。以下提供了化合物5-6的合成細節(jié)和純化所需的步驟。
使用的方法和試劑N-(3-氨丙基)-1，3-二氨基丙烷膽酸二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)氯甲酸異丁酯三乙胺乳糖酸化合物5甲醇(60ml)配制的乳糖酸(716mg，2毫摩爾)溶液加熱回流。向溶液中加入DCC(500mg，2.5毫摩爾)并在回流時攪拌得到的溶液。2小時后，加入N-(3-氨丙基)-1，3-二氨基丙烷(800ml，5.7毫摩爾)并繼續(xù)攪拌得到的溶液1小時。反應(yīng)溶液冷至室溫并濃縮以獲得粗產(chǎn)物5。用和二氯甲烷搗碎時純化粗酰胺化合物5，得到粘性吸濕性固體5(2.72g，5.7毫摩爾)。
化合物6DMF(60ml)配制的膽酸(4.1g，10毫摩爾)溶液冷至0℃。向該溶液中加入氯甲酸異丁酯(1.2ml，10.2毫摩爾)和三乙胺(1.4ml，10.4毫摩爾)并攪拌得到的溶液10分鐘，然后加入DMF(40ml)配制的5(2.5g，5.3毫摩爾)。反應(yīng)溶液攪拌72小時，然后濃縮得到粗產(chǎn)物6。柱層析純化粗產(chǎn)物得到純的6(A-LB)。

實施例8膀胱癌的干擾素治療在本實施例中，含有人干擾素α轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體的用途在臨床前動物模型中進行評價。接受膀胱內(nèi)施用SYN3制劑配制的rAd-IFN的動物在其尿液中具有非常高的局部濃度和最低的全身性干擾素水平。我們也使用無胸腺小鼠在常位腫瘤模型中測試了rAd-IFN/SYN3對淺表性膀胱癌的效果。與對照相比，接受rAd-IFN/SYN3的小鼠的膀胱腫瘤的大小顯著降低?；谶@些結(jié)果，rAd-IFN/SYN3代表了用于淺表性膀胱癌的新替代療法。
實施例8A.rAd-IFN的抗腫瘤活性構(gòu)建編碼人干擾素(IFN)(rAd-IFN)的E1-區(qū)域缺失的腺病毒。為進行體內(nèi)膀胱內(nèi)傳遞研究，我們使用編碼人α2b干擾素基因(IACB)的腺病毒載體。用這種載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞產(chǎn)生了一級氨基酸序列相同于INTRON A的人α2b干擾素蛋白。該蛋白含有連接于165個氨基酸的干擾素蛋白的23個氨基酸分泌前導(dǎo)肽。N-末端氨基酸測序證實分泌前導(dǎo)肽在翻譯后修飾過程中被適當?shù)厍谐?。與大腸桿菌(E.Coli)產(chǎn)生的重組INTRON A相反，從rAd-IFN轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)的干擾素蛋白是糖基化的。IFN明顯的糖基化不影響通過免疫測定或抗病毒生物測定來檢測rAd-IFN介導(dǎo)的IFN表達。使用電化學(xué)發(fā)光免疫測定開發(fā)了生物分析方法來檢測血清和尿液中的IFN。
α種類的干擾素通常在其生物性能中表現(xiàn)出高水平的種類特異性。為在含有人腫瘤異種移植物的小鼠腫瘤模型中評價干擾素α的抗腫瘤效力，最好具有能結(jié)合人和小鼠干擾素受體的α種類干擾素。為進行使用小鼠腫瘤模型的體內(nèi)效力實驗，我們利用了含有雜種形式的干擾素(α2/α1)的腺病毒載體。雜種干擾素蛋白具有針對人腫瘤細胞以及小鼠腫瘤細胞的抗腫瘤活性(Rehberg等，J Biol Chem.，257(19)11497-502(1982))。既然雜交干擾素對小鼠細胞和人細胞有活性(Rehberg等.，J Biol Chem.，257(19)11497-502(1982))，雜交干擾素的構(gòu)象必須能結(jié)合并激活小鼠IFN受體。因此，據(jù)信雜交IFN蛋白可在人中更密切地模擬干擾素(α2b的抗腫瘤效力。
干擾素轉(zhuǎn)基因摻入和美國專利號6,210,939描述的A/C/N 53載體相同的腺病毒骨架中，該專利引作參考。圖1描述了該載體的示意圖。通過rAd-IFN在細胞培養(yǎng)物和動物中證實了IFN表達和IFN的生物活性后，評價了rAd-IFN在皮下異種移植腫瘤模型中的抗腫瘤活性(圖2)。在攜帶有得自成膠質(zhì)細胞瘤(LN229，U87MG)、肝細胞瘤(HEP3B)和CML(K562)的腫瘤的裸鼠中腫瘤內(nèi)施用rAd-IFN后觀察對腫瘤生長的抑制作用。
在K562模型中，5只小鼠中的3只無腫瘤，U87MG模型中，5只小鼠的4只無腫瘤?；谶@些結(jié)果，在各種腫瘤亞型的皮下固體腫瘤模型中rAd-IFN明顯具有強有力的抗腫瘤活性。參見圖2。
實施例8B.
SYN3提高腺病毒基因表達在本實施例中，膀胱內(nèi)施用重組腺病毒可局部應(yīng)用進膀胱腔而僅有極少的全身性暴露。然而，在早期研究中，單獨膀胱內(nèi)施用人重組復(fù)制缺陷型腺病毒(rAd)僅表現(xiàn)出有限的基因轉(zhuǎn)移和表達(Bass等.，Cancer Gene Ther.，2(2)97-104(1995))。據(jù)信，膀胱的結(jié)構(gòu)造成病毒載體不能轉(zhuǎn)導(dǎo)。膀胱必須作為抵御致病性細菌和病毒的初級天然防御系統(tǒng)，同時也起著容納尿液的作用。膀胱腔上皮覆蓋有阻止尿液從膀胱腔進入組織的親水性糖胺聚糖(GAG)層。相比于其它上皮保護性機制(例如，胃腸道)，GAG層抵御細菌粘附(Parsons CL，World J Urol.，12(1)38-42(1994))。人們致力于鑒定能修飾該層來提高腺病毒連接和轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑。盡管乙醇首先鑒定為能增加腺病毒基因轉(zhuǎn)移的試劑(Engler等.，Urology，53(5)1049-53(1999))，但施用后也發(fā)現(xiàn)了出血性膀胱炎并且該制劑被視為不合適。在Canji進行了篩選替代制劑的其它研究來鑒定能提高腺病毒基因轉(zhuǎn)移至膀胱而無乙醇副作用的試劑。評價各種洗滌劑(陽離子、陰離子、兩性離子和非離子)提高腺病毒傳遞的能力。發(fā)現(xiàn)非離子洗滌劑Big CHAP能強烈提高用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)膀胱上皮而無膀胱炎。Big CHAP以濃度依賴的方式改善基因轉(zhuǎn)移，Big CHAP濃度為30mg/ml(34mM)達到最高轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達的飽和。
對Big CHAP的提高活性的其它鑒定顯示出在不同市售可得的制劑之間有易變性，說明洗滌劑的組成中有異質(zhì)性。事實上，一些Big CHAP制劑未能完全提高病毒轉(zhuǎn)基因表達。當通過薄層層析比較有生物活性的一批Big CHAP與無生物活性的一批時，在有生物活性的一批中至少存在三個額外的化合物。MALDI-MS、1H-NMR和13C-NMR結(jié)構(gòu)分析顯示這三個額外的化合物最可能是Big CHAP生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物。分離每個雜質(zhì)并通過與rAd-β-gal雜志#2共施用來測定其在膀胱中提高病毒轉(zhuǎn)基因表達的能力。雜質(zhì)#2是最強有力的化合物，但也是極端難溶的。參見全文納入作為參考的美國專利號6,392,069。
測試了SYN3在膀胱上皮中提高rAd基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。大鼠接受膀胱內(nèi)施用SYN3制劑或載體制劑(0.1％吐溫-80)配制的rAd-β-gal(0.5ml；7.6×1010P/ml)。45分鐘后取出測試物品，并允許動物恢復(fù)。2天后，處死動物，收集其膀胱并進行X-gal染色來測定rAd基因表達的程度。與在載體制劑中傳遞相同病毒相比，接受SYN3制劑配制的rAd-β-gal的大鼠的lacZ基因表達得到顯著提高(圖3)。
實施例8C.
聯(lián)合治療對膀胱中干擾素表達的影響用SYN3和含有干擾素基因的重組腺病毒載體聯(lián)合治療膀胱出乎意料地增加了轉(zhuǎn)基因干擾素的表達。臨床前測試證實，SYN3能顯著提高各種重組腺病毒載體到膀胱上皮的傳遞和表達。在小鼠中進行研究來定量使用SYN3制劑導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)移至膀胱上皮的增加情況。小鼠膀胱內(nèi)施用SYN3或載體制劑配制的rAd-IFN。治療兩天后，處死小鼠，收集其膀胱并在干冰上快速冷凍。然后從每個膀胱中提取核酸，并分別使用PCR和RT-PCR測定存在的rAd-IFN DNA和RNA的水平。接受SYN3制劑配制的rAd-IFN的小鼠相比于接受運載體制劑配制的rAd-IFN的小鼠，其rAd-IFN DNA拷貝數(shù)高了約一千倍(圖4a)，其在膀胱勻漿中檢測到的RNA比接受載體制劑配制的rAd-IFN的小鼠至少高了一萬倍。
表1.小鼠接受45分鐘的膀胱內(nèi)施用SYN3制劑(100μl；7.4×1010P/ml)或載體制劑配制的rAd-IFN。治療兩天后，處死小鼠，收集其膀胱并在干冰上快速冷凍。然后從每個膀胱中提取核酸，并分別使用PCR和RT-PCR測定存在的rAd-IFN DNA和RNA的水平。BQL低于定量水平；DNA10拷貝/mg組織；RNA1000MEQ/mg組織。為進行比較，也顯示了單獨施用SYN3獲得的水平?；谶@些結(jié)果，可明顯看出，需要SYN3制劑在膀胱上皮中提高rAd-IFN的傳遞和表達。
實施例8D.
rAd-IFN/SYN3用于淺表性膀胱癌的效力使用原位腫瘤模型評價rAd-IFN/SYN3的效力(Watanabe等.，Cancer GeneTher.，7(12)1575-80(2000))。在簡單的胰蛋白酶預(yù)處理來提高腫瘤細胞附著后，通過膀胱內(nèi)施用人UNUC-3移行癌細胞(TCC)在無胸腺小鼠的膀胱中建立淺表性腫瘤。治療開始前，小鼠生長6天使腫瘤形成。然后小鼠接受膀胱內(nèi)施用rAd-IFN/SYN3、rAd-對照/SYN3或單獨施用SYN3-載體。既然rAd-IFN產(chǎn)生一種分泌的基因產(chǎn)物，在這些研究中使用兩種不同的對照腺病毒構(gòu)建物進行比較，一種不含轉(zhuǎn)基因(ZZCB)，而一種含有人分泌堿性磷酸酶基因(APCB)。連續(xù)兩天對小鼠施用100μl SYN3制劑配制的rAd(1.1×1011P/ml)，1小時。治療14天后(腫瘤起始20天后)，處死小鼠，收集其膀胱，固定于福爾馬林中，并通過目測檢查其腫瘤荷載。對具有腫瘤的膀胱總百分率以及腫瘤的相對大小進行評分?；诎螂浊槐荒[瘤封閉的百分率按0-4比例對腫瘤評分。rAd-IFN/SYN3治療組的腫瘤總發(fā)病率顯著低于僅用rAd-對照或SYN3組的腫瘤發(fā)病率(圖4)。要注意的是，與對照相比，rAd-IFN的治療動物少數(shù)還有腫瘤的例子中腫瘤大小顯著減少。這些結(jié)果表明，rAd-IFN/SYN3在原位腫瘤模型中極大降低了淺表性膀胱腫瘤的生長。
其它研究中也使用了原位腫瘤模型，其中淺表性腫瘤是在胰蛋白酶預(yù)處理后，通過膀胱內(nèi)施用綠色熒光蛋白(GFP)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人KU-7膀胱癌細胞在無胸腺小鼠的膀胱中建立的。通過手術(shù)暴露并用光照射膀胱來激發(fā)GFP熒光，對腫瘤大小的順序評價可在體內(nèi)監(jiān)測而無需處死小鼠。腫瘤細胞生長10天，隨后手術(shù)暴露并照射膀胱，拍下每只小鼠熒光腫瘤載荷的照片。使用圖形分析軟件確定治療前后含有腫瘤細胞的膀胱的面積相對于膀胱總面積的百分率。連續(xù)兩天小鼠接受膀胱內(nèi)施用100μl rAd(1×1011P/ml)，1小時。比較4組治療組rAd-IFN/SYN3、rAd-β-gall/SYN3、僅用rAd-IFN或僅用SYN3。治療后21天(腫瘤生長起始31天后)，按上述方法再次使膀胱膨脹，手術(shù)暴露并再次測量GFP腫瘤的荷載。
過了一段時間后，接受rAd-IFN/SYN3的小鼠的腫瘤荷載有顯著降低(圖5)。相反，在所有其它治療組中腫瘤的大小繼續(xù)增加。僅施用rAd-IFN未導(dǎo)致腫瘤生長顯著降低，這表明制劑中需要包括增強試劑SYN3。既然在rAd-p-gal/SYN3組中未觀察到腫瘤生長的降低，在rAd-IFN/SYN3組中觀察到腫瘤生長的降低肯定是干擾素轉(zhuǎn)基因表達的結(jié)果，并且不僅是由于施用腺病毒載體的非特異性作用。總之，在該原位腫瘤模型中rAd-IFN/SYN3似乎顯著降低淺表性膀胱腫瘤。為目測使用SYN3/rAd-IFN相比于對照所實現(xiàn)的腫瘤邊界降低，提供了每個治療組的每只小鼠在治療前后的腫瘤荷載的照片。
實施例8E.測定大鼠膀胱中rAd-IFN的表達當用rAd-IFN轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞時，產(chǎn)生了分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。因此，假設(shè)通過分泌到尿液中的干擾素的量可估計在膀胱上皮中得到的病毒轉(zhuǎn)基因表達的水平。最初實驗比較了接受膀胱內(nèi)施用SYN3制劑配制的rAd-IFN或rAd-對照(ZZCB)的雌性Sprague-Dawley大鼠尿液中的干擾素水平。大鼠接受膀胱內(nèi)施用SYN3(1mg/ml)配制的rAd(5×1010P/ml)，45分鐘并且允許大鼠恢復(fù)。治療48小時后使用代謝籠收集每只小鼠的尿液(4小時收集)。接受SYN3制劑配制的rAd-IFN的大鼠在其尿液中具有極高水平的干擾素蛋白(～25ng/ml)，而在其血清中僅有微量水平的干擾素(圖5)。相反，接受SYN3制劑配制的rAd-對照的大鼠在其尿液或血清中無干擾素蛋白。48小時后，處死大鼠，收集其膀胱并勻漿來測定其干擾素水平。在接受SYN3/rAd-IFN的大鼠的膀胱勻漿物中檢測到顯著高水平的IFN蛋白。在接受SYN3/rAd-對照的大鼠的膀胱勻漿物中未檢測到干擾素。這些結(jié)果與PCR/RT-PCR結(jié)果一致，并且說明尿液可用作檢測膀胱中病毒轉(zhuǎn)基因表達的水平和持續(xù)時間的工具。
實施例9部分1合成化合物3SYN3的合成路線示于圖7，該路線采納美國專利號6,392,069。通過將1g(2.8毫摩爾)乳糖酸(1)溶解于50ml甲醇，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干并重復(fù)該過程6次來合成乳糖酸內(nèi)酯(2)。為得到化合物3，將得到的殘留物(2)加熱至50℃溶解于50ml異丙醇。向該溶液加入1.2ml(8.4毫摩爾)N-(3-氨丙基)-1，2-丙二胺。溫度增加至100℃并攪拌該溶液3小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用氯仿洗滌所得殘留物數(shù)次以除去多余未反應(yīng)的N-(3-氨丙基)-1，2-丙二胺。剩下的殘留物(3)用于以下部分3中。
部分2；合成化合物4將2.28g膽酸(5.6毫摩爾)加熱至60℃溶解于N，N-二甲基甲酰胺來合成化合物4。加入三乙胺(0.78ml，5.6毫摩爾)并將溶液在冰浴中冷卻。然后加入氯甲酸異丙酯(0.73ml，5.6毫摩爾)并且隨著繼續(xù)攪拌10分鐘形成一種白色的沉淀物。
部分3合成SYN3(化合物5)化合物III溶解于N，N-二甲基甲酰胺，在冰浴中冷卻并攪拌。從化合物4合成獲得的懸浮液過濾進含有化合物3的溶液。得到的溶液于室溫攪拌6小時。使用高真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑并將殘留物溶解于100ml氯仿/甲醇(50/50)。25ml該溶液通過使用氯仿/甲醇(60/40)作為洗脫溶劑的硅膠急驟層析純化。通過使用由氯仿/甲醇/水/濃氨水(100/80/10/5)組成的流動相的硅膠薄層層析分析從柱上洗下的組分。用乙醇硫酸(ethanolic sulfric acid)噴霧炭化化合物來目測。使用急驟層析和氯仿/甲醇/水/濃氨水(100/80/10/5)作為洗脫溶劑來固定和再純化含有產(chǎn)物的組分。含有產(chǎn)物的組分被固定并蒸干至白色粉末(300mg化合物5)。1H-NMR和MALDI質(zhì)譜光譜分析與所示結(jié)構(gòu)一致。
實施例11優(yōu)選的傳遞增強化合物列于下表。雖然該表舉出了具有膽酸取代基的化合物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地意識到其它甾體取代基可取代膽酸而不影響化合物的傳遞增強性能。制備這種化合物的方法見2003年6月4日提交的臨時申請，Townsend & Townsend & Crew LLP代理人審理號016930-000830US，該申請轉(zhuǎn)讓給與本申請相同的受讓人，該申請全文納入作為參考并且尤其是參考文中披露的轉(zhuǎn)染試劑和傳遞增強試劑及其制備方法和用途。
實施例12膀胱內(nèi)施用SYN3制劑后IFN蛋白的攝取本實施例通過測定當施用SYN3制劑時，SYN3是否增加了干擾素蛋白的組織水平來檢測SYN3是否提高干擾素蛋白的攝取。
方法.由于雜交IFN蛋白的供應(yīng)有限，主要使用IFBα2b蛋白(Intron A)。出于比較目的，雜交蛋白也包括于時間t＝0的時間點。使用異氟烷麻醉雜交HSD大鼠。收集治療前的尿液。使用導(dǎo)管和潤滑劑經(jīng)尿道插入導(dǎo)管至膀胱。測試物施用至膀胱，用2.0G縫合線結(jié)扎尿道而不取出導(dǎo)尿管。45分鐘(0小時)后，取出測試物并允許大鼠在籠中恢復(fù)。處死之前立即從大鼠獲得尿液樣品。尿液收集后，收集該日大鼠的膀胱。冷凍組織并測定IFN應(yīng)答基因的上調(diào)節(jié)。
材料38只雌性Harlan Sprague-Dawley大鼠；IACBTris-甘油制劑7.57×1011P/mlIHCBvPBS制劑1.10×1012P/mlSYN36×原液(6mg/ml)Intron A使用的參考小瓶用3,008μl PBS(2.4MIU/ml)稀釋的950μl IntronA在1ml無菌納純(nanopure)蒸餾水中水合(10MIU/ml)
IFNα2α1蛋白105μg/ml＝105×106pg/ml1.34×107IU/ml1.28×108IU/mgIACB是用于干擾素α2b的重組腺病毒載體并具有CMV啟動子和E1-缺失區(qū)域。IHCB也是具有CMV啟動子和E1缺失區(qū)域的用于雜交干擾素α2α1的重組腺病毒載體。
制備測試物制備終濃度為2.4MIU/ml的IFNα2b(一個參考小瓶水合于1ml注射用無菌水)950μl Intron A濃縮液3,008μl PBS制備PBS配制的IFNα2b625μl Intron A@2.4MIU/ml125μl PBS制備SYN3配制的IFNα2b625μl Intron A@2.4MIU/ml125μl SYN3制備SYN3配制的rAd-IFNα2b(IACB)66μl IACB250μl SYN31184μl Tris-甘油緩沖液制備IFNα2α1蛋白濃縮液(2.2ml)243μl IFNα2α1蛋白1957μl PBS
IFNα2α1/PBS625μl IFNα2α1蛋白125μl PBSIFNα2α1/SYN3625μl IFNα2α1蛋白125μl SYN3
所以，賦形劑的終濃度是SYN3(120mg/20ml)/6＝1mg/ml檸檬酸一水合物(1.6mg/20ml)/6＝0.01333mg/ml檸檬酸鈉二水合物(5.1mg/20ml)/6＝0.0425mg/ml羥基-環(huán)糊精(1000mg/20ml)/6＝8.33mg/ml聚山梨酯80(吐溫-80)(60mg/20ml)/6＝0.5mg/ml使用ELISA測定(PBL)確定存在于組織勻漿中的IFNα2b量。使用Bradford蛋白質(zhì)測定測量蛋白質(zhì)的濃度。組織中蛋白質(zhì)的水平以pg IFN/mg組織表示(見圖8)。如圖8所示，處理24小時后，SYN3制劑配制的IFNα2b的傳遞導(dǎo)致可檢測的IFNα2b蛋白的量增加約15倍。SYN3制劑傳遞也提高了雜交IFN蛋白(IFNα2α1)的傳遞并且檢測到類似于IFNα2b蛋白的組織濃度水平。
實施例13分析施用SYN3制劑配制的IFN蛋白后干擾素對膀胱上皮的生物作用本實施例檢測了IFN組織濃度增加是否導(dǎo)致可測量的生物應(yīng)答。為評價生物活性，我們使用RT-PCR來檢測用IFN蛋白(Intron A和“通用”干擾素(IFNA/D；IFNα2α1)處理后IFN應(yīng)答基因在大鼠膀胱勻漿中的表達。測定了以下大鼠基因2′，5′-寡腺苷酸合成酶(2′，5′-OAS)；編碼干擾素誘導(dǎo)的p78蛋白質(zhì)(MxAMX1)(MX1)的基因；干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-1)和干擾素γ(IFNγ)。(通常不認為IFNγ是IFN應(yīng)答基因，但通常在接觸病原體(例如BCG)后表達并且用于確定重組腺病毒是否誘導(dǎo)了類似的IFNγ應(yīng)答)。方法一般如實施例12所述。1小時后，取出測試物并允許動物在籠中恢復(fù)。在指示時間(0小時＝處理后立即)處死大鼠，在液氮中快速冷凍樣品并交付RT-PCR分析。
所需材料38只雌性Harlan Sprague-Dawley大鼠；從方案04-634轉(zhuǎn)移IACBTris-甘油制劑7.57×1011P/mlIHCBvPBS制劑1.10×1012P/mlSYN36×原液(6mg/ml)D-PBSTris-甘油緩沖液無菌WFIIFNα2α1蛋白105μg/ml＝105×106pg/ml1.34×107IU/ml1.28×108IU/mg制備測試物1)IFNα2b/PBS5ml@2MIU/ml終濃度·在1ml注射用無菌水中水合一個參考小瓶(10MIU/小瓶)1,000μl Intron A濃縮液4,000μl PBS2)IFNα2b/SYN310ml@2MIU/ml終濃度·在2ml注射用無菌水中水合兩個參考小瓶(10MIU/小瓶)2,000μl Intron A濃縮液6,334μl PBS1,666μl SYN3IACB/SYN3SYN3配制的4.5ml@1.0×1011P/ml660μl IACB750μl SYN33,090μl Tris-甘油緩沖液
IFN α2α/PBS4ml@1MIU/ml終濃度298μl IFNα2α1蛋白3,702μl PBSIFNα2α1/SYN36ml@1MIU/ml終濃度444μl IFNα2α1蛋白4,556μl PBS1,000μl SYN3IHCB/SYN3 SYN3配制的4.0ml@1.0×1011P/ml364μl IHCB667μl SYN32,969μl Tris-甘油緩沖液在指示時間(見圖9-11)處死動物并在液氮上收集其膀胱用于RT-PCR分析。初步分析用于比較上述基因的mRNA水平與Intron A/PBS傳遞后觀察到的水平。因此，在提供的附圖中，基因激活的水平被標準化至Intron A/PBS組(1.0)。
如圖9-12所示，與傳遞相同量的PBS制劑配制的蛋白質(zhì)相比，加入SYN3增加了已知下游IFN-激活的基因(2′-5′OAS，MX1)的表達。即使以1MIU/ml劑量替代2MIU/ml的IFNα2b，SYN3配制的雜交蛋白(BSIFNα2α1/SYN3)以乎提供更強有力的生物應(yīng)答。盡管施用SYN3制劑配制的Intron A(IFNα2b)和雜交IFN(IFNα2α1)增加了大鼠OAS和MX1基因表達，二者有點低于施用rAd-IFNα2b或rAd-IFNα2α1后得到的水平。
應(yīng)該理解的是，文中所述的實施例和實施方案僅是說明性目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可做出各種改進或變化，并且這些改進或變化也包括于本申請的精神和范圍以及附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。如同每個單獨出版物或?qū)＠暾埍痪唧w且獨立地納入?yún)⒖?，本說明書中引用的所有出版物和專利申請均出于所有目的全文納入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有1)選自SYN3和SYN3同系物的傳遞增強試劑和2)干擾素蛋白或干擾素基因傳遞系統(tǒng)，其中所述基因傳遞系統(tǒng)含有干擾素基因并且所述干擾素基因可操作連接于調(diào)制該基因表達的遺傳調(diào)節(jié)元件。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載體。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物是凍干的。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有SYN3。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述干擾素選自α-干擾素、β-干擾素、δ-干擾素、γ-干擾素和其融合干擾素。
6.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述干擾素選自干擾素α-2b、融合干擾素α-/2α-1和干擾素α-2e。
7.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述試劑是SYN3并且所述干擾素是人α干擾素或其融合干擾素。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述α干擾素是α1干擾素或α2干擾素。
9.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述干擾素是人干擾素。
10.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述同系物是下式所示的化合物 式中，R1和R2各自獨立地選自氫和羥基；m和n各自獨立地選自約0-2；R3選自-NR4R5，其中R4和R5各自獨立地選自氫、糖類殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；?、任選取代的酰氧基和季胺鹽-NR6R7R8X，其中R6、R7和R8獨立地選自氫和C1-C4烷基，X是選自鹵素或任選取代的羧酸酯的帶負電荷的離子結(jié)合平衡離子。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述R1和R2均是羥基。
12.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述m和n各自是1。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述化合物如式II所示
14.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，R4是氫；并且R5選自氫、糖類殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；腿芜x取代的酰氧基。
15如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述化合物如式III所示
16.如權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，R4是琥珀酰基。
17.如權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，R4是乙?；?br> 18.如權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，R3是三甲銨鹽。
19.如權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，R3是三乙銨鹽。
20.一種將干擾素傳遞至哺乳動物對象的方法，所述方法包括向?qū)ο蟮纳掀そM織或器官施用含有選自SYN3和SYN3同系物的傳遞增強試劑的治療有效量的藥物組合物與施用干擾素或干擾素基因傳遞系統(tǒng)，其中基因傳遞系統(tǒng)含有干擾素基因并且其中干擾素基因可操作連接于調(diào)制該基因表達的遺傳調(diào)節(jié)元件。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述試劑是SYN3。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述試劑是SYN3，并且SYN3在該組合物中的濃度是0.1-10mg/ml。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述干擾素選自α-干擾素、β-干擾素、δ-干擾素、γ-干擾素及其融合干擾素。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述干擾素選自干擾素α-2b、融合干擾素α-/2α-1和干擾素α-2e。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述對象是人，所述試劑是SYN3并且所述干擾素是人α干擾素或其融合干擾素。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述α干擾素是α1干擾素或α2干擾素。
27.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述干擾素是人干擾素。
28.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述組合物是膀胱內(nèi)施用至組織或器官。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述組織或器官是癌性的。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述組織或器官是人的膀胱。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述施用的間隔時間選自每周一次、一月兩次、一月一次和兩月一次。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，通過施用組合物的頻率或用量來調(diào)節(jié)所述施用以維持干擾素基因在預(yù)定范圍內(nèi)的表達。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述組合物施用的體積從約50到600ml。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述體積從約100到300ml。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述組合物通過導(dǎo)管施用。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述導(dǎo)管是球囊導(dǎo)管并且在插入后該導(dǎo)管的球囊部分膨脹以減少膀胱的空腔體積。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述對象是復(fù)發(fā)性或再發(fā)性膀胱癌患者。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述對象早先用BCG療法治療過。
39.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述組織或器官是氣管組織或器官、上或下消化道組織或器官或腹膜組織或器官。
40.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述組合物在約5分鐘到約2小時的期間施用。
41.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，組合物中所述SYN3的濃度是0.1-10mg/ml。
42.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述同系物如下式所示 式中R1和R2各自獨立地選自氫和羥基；m和n各自獨立地選自約0-2；R3選自-NR4R5，其中R4和R5各自獨立地選自氫、糖類殘基、任選取代的烷基、任選取代的?；⑷芜x取代的酰氧基和季胺鹽-NR6R7R8X，其中R6、R7和R8獨立地選自氫和C1-C4烷基，X是選自鹵素或任選取代的羧酸酯的帶負電荷的離子結(jié)合平衡離子。
43.如權(quán)利要求20所述方法。其特征在于，所述SYN3或SYN3同系物以與干擾素或基因傳遞系統(tǒng)的共同制劑施用。
44.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述SYN3或SYN3同系物組合物與干擾素或干擾素基因傳遞系統(tǒng)獨立施用。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述SYN3或SYN3同系物組合物在干擾素或干擾素基因傳遞系統(tǒng)施用之前施用。
46.一種含有以下成分的試劑盒含有能提高干擾素傳遞的SYN3或SYN3同系物的第一容器；和含有干擾素或基因傳遞系統(tǒng)的第二容器，其中所述基因傳遞系統(tǒng)含有干擾素基因，其中干擾素基因可操作連接于調(diào)制該基因表達的遺傳調(diào)節(jié)元件。
47.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其特征在于，所述第一容器含有SYN3的凍干制劑。
48.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其特征在于，所述第二容器含有干擾素或基因傳遞系統(tǒng)的凍干制劑。
49.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其特征在于，所述干擾素基因是α-干擾素基因。
50.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其特征在于，所述干擾素基因是人的基因。
51.一種含有選自SYN3和SYN3同系物的基因傳遞增強試劑與基因傳遞系統(tǒng)的藥物組合物，其中所述基因傳遞系統(tǒng)含有干擾素基因，且其中所述干擾素基因可操作連接于調(diào)制該基因表達的遺傳調(diào)節(jié)元件。
52.如權(quán)利要求51所述的藥物組合物，其特征在于，所述基因傳遞系統(tǒng)含有重組病毒載體。
53.如權(quán)利要求52所述的藥物組合物，其特征在于，所述重組病毒載體選自皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、牛痘病毒載體和腺病毒載體。
54.如權(quán)利要求53所述的藥物組合物，其特征在于，所述試劑是SYN3，所述干擾素是人α干擾素或其融合干擾素，所述基因傳遞系統(tǒng)是重組腺病毒基因傳遞系統(tǒng)。
55.如權(quán)利要求51所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物是單位劑量形式并且含有其中所述試劑的量為1到2000mg的治療量的組合物。
56.一種將干擾素傳遞至哺乳動物對象的方法，所述方法包括向?qū)ο蟮纳掀そM織或器官施用含有選自SYN3和SYN3同系物的傳遞增強試劑和基因傳遞系統(tǒng)的治療有效量的藥物組合物，其中所述基因傳遞系統(tǒng)含有干擾素基因，且其中所述干擾素基因可操作連接于調(diào)制該基因表達的遺傳調(diào)節(jié)元件。
57.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述基因傳遞系統(tǒng)含有DNA和陰離子脂質(zhì)。
58.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，監(jiān)測尿液以測定干擾素的表達。
全文摘要
本發(fā)明提供將蛋白質(zhì)或基因治療施用至具有上皮細胞層的組織或器官的方法和藥物組合物。蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)的核酸施用至靶組織或器官聯(lián)合傳遞增強試劑治療，該傳遞增強試劑增加干擾素或核酸傳遞至靶組織或器官的細胞。該方法和組合在治療癌癥或其它對干擾素治療有應(yīng)答的疾病中尤其有用。示范性的方法包括經(jīng)尿道膀胱內(nèi)施用治療有效量的藥物組合物至膀胱，該藥物組合物含有α－干擾素或編碼干擾素的基因傳遞系統(tǒng)與SYN3或SYN3同系物或類似物。與相同干擾素蛋白或干擾素基因傳遞系統(tǒng)的PBS制劑相比，使用SYN3制劑在膀胱內(nèi)觀察到干擾素水平與活性增加了10到1000倍。
文檔編號A61K31/56GK1852918SQ200480019098
公開日2006年10月25日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者H·英格勒, T·L·納加布沙, S·楊斯特, R·康納 申請人:坎基股份有限公司