專利名稱：石杉堿及其衍生物的注射用緩釋微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及石杉堿及其衍生物的注射用緩釋微球的制備方法。
背景技術(shù)：
石杉堿甲(Huperzine A)系從石杉科植物千層塔全草提取得生物堿，化學(xué)名為(5R，9R，11E)-5-氨基-11-亞乙基-5，6，9，10-四氫-7-甲基-5，9-亞甲基環(huán)辛四烯并[b]吡啶-2(1H)-酮。石杉堿甲為強(qiáng)效可逆性膽堿酯酶抑制劑，早期臨床曾用于治療重癥肌無力。近年來發(fā)現(xiàn)石杉堿甲可顯著改善老年患者記憶，劑量僅為重癥肌無力治療劑量的1/4左右，具有安全性好，療效明顯等優(yōu)點，受到各國好評。石杉堿甲是我國自行研制的很有前途的治療早老性阿爾茨海默的藥物。開發(fā)適用臨床治療需要的制劑具有很大的社會價值。美國FDA于1993年即批準(zhǔn)石杉堿甲作為類膽堿能制劑。制劑為膠囊，劑量60μg/粒，每日二次口服，日總用量150μg～450μg。近年來科研人員對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，發(fā)現(xiàn)它的一些衍生物也具有相似療效，涉及本發(fā)明的石杉堿衍生物結(jié)構(gòu)如下 其中，結(jié)構(gòu)式(I)即為石杉堿甲，目前中國藥典2005版收載的石杉堿甲劑型有片劑(50μg/粒)，膠囊(50μg/粒)和注射劑(1ml∶0.2mg)等。研究中劑型還有透皮控釋貼片，鼻腔給藥劑型，長效注射劑等。常規(guī)制劑如口服制劑和溶液注射劑，除了給藥頻繁不便治療外，藥物濃度峰谷現(xiàn)象也是個問題。據(jù)報道，由于血藥濃度過高，可能過度抑制乙酰膽堿酯酶，將引起消化道及血管平滑肌等不良反應(yīng)，其不良反應(yīng)隨著劑量的增大而加大，相對比較，緩釋制劑，特別是可緩釋半月至一月，從實際治療應(yīng)用講，具有現(xiàn)實的意義。
國內(nèi)已有石杉堿甲微球注射劑發(fā)明專利公開的報道(CN 1393220A)，專利發(fā)明者采用分子量(MW)為12000～15000道爾頓的生物降解聚合物——聚丙交酯—乙交酯為骨架材料，采用噴霧干燥法和油/水(O/W)乳劑溶劑揮發(fā)法制成可緩釋約20日的石杉堿甲微球注射劑。
從專利公開的內(nèi)容來看，發(fā)明者研究的方法主要采用噴霧干燥途徑制備石杉堿甲微球。這在專利第7頁第二行“優(yōu)選噴霧干燥法”及專利第11，12，13，14頁體外溶出試驗結(jié)果與數(shù)據(jù)可以表明。
專利發(fā)明者未公開動物體內(nèi)藥動學(xué)數(shù)據(jù)，盡管他已作了兔和犬藥動學(xué)試驗。而取而代之的是在體外pH4.0和pH5.5緩沖液的釋放數(shù)據(jù)。我們分析了這些試驗結(jié)果，認(rèn)為用噴霧干燥法制備的微球不適合用作某些藥物微球注射劑，特別像石杉堿甲這種由于藥物突釋作用(Burst effect)可能引起體內(nèi)不良反應(yīng)的緩釋制劑的制備，這從公開專利的以下內(nèi)容可見專利CN1393220A的P12附圖一，藥物首日突釋約25～30％，第2～8日藥物基本處于停滯釋放狀態(tài)，其中有可能釋放藥物的時間是第8日至第20日，但是釋藥過程不規(guī)則是個問題。P13附圖二藥物首日突釋也達(dá)到近30％，第2～8日也基本處于停滯釋放狀態(tài)，第8日至第16日也是一不規(guī)則的釋藥過程。P14附圖三藥物首日突釋大于30％，第2～8日也基本處于停滯釋放狀態(tài)，第8日至第16日也是一不規(guī)則的釋藥過程。上述情況，如與體內(nèi)數(shù)據(jù)相關(guān)的話，對作為一個緩釋注射劑來講，釋藥模式并不是合理的臨床治療需要的血濃—時間曲線。究其原因，這種釋藥模式與噴霧干燥工藝的特性相關(guān)。顯然用噴霧干燥制備的微球因為具有較大的比表面積和骨架多孔性，要求藥物均勻緩慢釋放是不太可能的。
專利CN1393220A發(fā)明人也提到，用油/水(O/W)乳劑—溶劑揮發(fā)法制備石杉堿甲微球內(nèi)容。從專利內(nèi)容分析，發(fā)明人對這種方法未作過深入的工作，這從以下跡象可以表明(1)P11中舉出的體外釋放試驗結(jié)果的三個實例，都是噴霧干燥法作的微球數(shù)據(jù)，未見到任何用O/W乳劑—溶劑揮發(fā)法作的微球的試驗數(shù)據(jù)。
(2)藥物包裹率(Efficiency of microencapsulation)和釋藥模式是檢驗藥物微囊化兩個最重要的質(zhì)量指標(biāo)，CN1393220A發(fā)明專利都未提供這個方法的成功的試驗數(shù)據(jù)。
由于石杉堿甲本身具有一定的水溶解度(0.8mg/ml，25℃)，用O/W乳劑—溶劑揮發(fā)法是很難制備有使用價值的微球。由于水溶性，在溶媒蒸發(fā)時，分散相(油相)中的藥物會逐漸擴(kuò)散并分配至外水相中，往往出現(xiàn)包裹率過低或者嚴(yán)重的微球藥物突釋作用。所以，這個方法對石杉堿甲微囊化是不可取的。在我們初期進(jìn)行的大量試驗結(jié)果也證明了這一點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種制備石杉堿及其衍生物的注射用緩釋微球的新方法，以較好地解決上述兩種石杉堿衍生物微囊化方法存在的問題。
本發(fā)明采用油/油(O/O)乳劑—液中干燥法。該方法包括下列步驟a)將生物降解聚合物溶解在有一定極性的有機(jī)溶媒中，加入石杉堿及其衍生物，超聲振蕩制成均勻的混懸液作為分散相；b)分散相滴入含乳化劑的油性惰性介質(zhì)組成的連續(xù)相中，(分散相有機(jī)溶媒與連續(xù)相介質(zhì)的油不相互溶)，在快速攪拌下乳化；c)使上述有機(jī)溶媒逐漸蒸發(fā)，析出載藥微球；d)將離心分離得到的微球洗滌，干燥即得。
本發(fā)明中，分散相中揮發(fā)性的溶媒可用丙酮，乙酸乙酯，乙腈或者兩者混和物等極性有機(jī)溶媒；連續(xù)相為高沸點非極性溶媒，可采用礦物油，如液狀石蠟，二甲硅油等；植物油，如茶油，花生油，豆油以及如甘油或多元醇等。如采用甘油或多元醇為連續(xù)相介質(zhì)時，揮發(fā)性溶劑可用介電常數(shù)約等于或小于10的有機(jī)溶媒，如二氯甲烷，氯仿，乙醚或乙酸甲酯等。連續(xù)相中必須有乳化劑以幫助分散相在連續(xù)相中的均勻分散作用。如連續(xù)相是非極性的油，乳化劑應(yīng)是親油的，其HLB值范圍為1.8～12.4。這些乳化劑使丙酮、醋酸乙酯或乙腈/液狀石蠟表面張力維持在一定值，有助于親水性藥物的包裹率。本發(fā)明中采用span類表面活性劑，首選span80。其濃度為連續(xù)相體積的0.02～5％(W/V)，首選0.1～1.5％(W/V)。
本發(fā)明中，聚合物濃度1～30％(W/V)，聚合物溶液與連續(xù)相體積比為1∶5～1∶50，首選1∶15～1∶30。
分散相加入攪拌著的連續(xù)相中，攪拌速度是控制微球粒徑很重要的參數(shù)，攪拌采用三葉垂直不銹鋼攪拌漿，轉(zhuǎn)速500～2000rpm，優(yōu)選800～1200rpm。微球粒徑分布范圍10μm～150μm。篩選20μm～100μm為注射用微球。
微球混懸液可經(jīng)離心收集，去除上清液，微球表面的油跡可用石油醚，己烷或環(huán)己烷少量多次洗凈。微球于室溫下進(jìn)行減壓干燥或經(jīng)冷凍干燥而得。
由于本制備方法在無水系統(tǒng)中進(jìn)行，避免了石杉堿甲在水中的溶解，所以與其它方法相比，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的石杉堿甲微球在藥物包裹率，體內(nèi)外釋藥模式(特別是突釋作用及維持較均勻的釋放方面)有明顯的優(yōu)勢。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的石杉堿甲微球可以均勻釋放藥物長達(dá)14天，可以大大減少給藥次數(shù)，同時有效控制了劑量，避免了副作用的出現(xiàn)。以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明所述的石杉堿甲及其衍生物的微球的制備方法和釋藥模式。


圖1為大鼠體內(nèi)注射O/O法制備石杉堿甲微球藥物濃度時間曲線。
具體實施例方式
實施例1將780mg聚丙交酯—乙交酯溶于3.5ml乙腈中，加入20mg石杉堿甲，攪拌使其均勻分散。在一裝有攪拌漿的平底燒杯中，加入含0.2％span80的液狀石蠟。恒溫(35℃)后，攪拌下將上述聚合物溶液滴入其中，以1000rpm轉(zhuǎn)速攪拌20小時，也可采用減壓蒸法，使O/O乳劑中有機(jī)溶媒逐漸蒸干。整個過程不斷抽樣鏡檢，觀察各階段微球形成過程。
上述溶液離心分離，傾去上清液，于濾膜上減壓收集微球，用石油醚少量多次洗滌，微球于減壓條件下，在室溫中干燥，即得。
實施例2將780mg聚DL—丙交酯溶于乙酸乙酯中，加入20mg石杉堿甲，攪拌使其均勻分散。在一裝有攪拌漿的平底燒杯中，加入含0.2％span80的花生油。恒溫(35℃)后，攪拌下將上述聚合物溶液滴入其中，以1000rpm轉(zhuǎn)速攪拌20小時，使O/O乳劑中有機(jī)溶媒逐漸蒸干。其它操作同例1。
實施例3對采用實施例1方法制備的石杉堿甲微球檢測，其包裹率，粒徑如下

稱取石杉堿甲微球50mg，加入100ml pH7.4磷酸緩沖液(0.02％Tween80+0.02％Tween20)為釋放介質(zhì)，于37℃，110rpm的水浴搖床中振搖。分別于1，3，7，10，14天取樣，并補(bǔ)充相應(yīng)的釋放介質(zhì)，經(jīng)HPLC測定其釋放量，其結(jié)果見表1。
表1 石杉堿甲微球體外釋藥

實施例4石杉堿甲微球體內(nèi)釋藥速度檢測方法將石杉堿甲生物降解微球注入大鼠腹部皮下后，于不同的時間間隔，小心切取殘余微球及其周圍肌肉組織，勻漿化后測定微球內(nèi)殘留的藥量，從而間接檢測微球的體內(nèi)釋藥速度。
實施例1微球大鼠腹部皮下一次性注射適量微球混懸液，分別于給藥后1，3，7，10，14天處死動物，測定注射部位殘余藥量。微球首日釋藥16.7％后能緩慢釋放14天。
表2.石杉堿甲微球體內(nèi)釋藥(n＝5)

由表2的數(shù)據(jù)制得的大鼠體內(nèi)注射O/O法制備石杉堿甲微球藥物濃度時間曲線請看說明書附1。
實施例5石杉堿甲微球藥效學(xué)試驗分別用東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙模型和45％乙醇所致小鼠記憶再現(xiàn)障礙模型驗證石杉堿甲微球注射劑對小鼠改善學(xué)習(xí)記憶作用。選用50和100μg/kg/日兩種藥物劑量，分別作一次性皮下注射給藥(n＝10)，測定小鼠給藥后1、7、14、16、19日學(xué)習(xí)記憶的改善作用，以觀察給藥一次能維持兩周的每日有效藥物劑量。
結(jié)果證明1、在對由東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙試驗中，100μg/kg/日微球注射劑藥效強(qiáng)度與常規(guī)口服制劑(同劑量，每日給藥一次)相當(dāng)，給藥24小時顯效。此作用維持至第14天；50μg/kg/日石杉堿甲微球注射劑也顯示一定改善小鼠記憶障礙作用，但藥效強(qiáng)度弱于100μg/kg/日者。2、在對由45％乙醇所致記憶再現(xiàn)障礙試驗中，石杉堿甲微球注射劑顯示了同記憶獲得障礙相似的量效關(guān)系和時效關(guān)系。
權(quán)利要求
1.制備石杉堿及其衍生物的注射用緩釋微球的方法，采用無水系統(tǒng)的油/油乳劑—液中干燥法，該方法包括下列步驟a)將生物降解聚合物溶解在有一定極性的有機(jī)溶媒中，加入石杉堿及其衍生物，超聲振蕩制成均勻的混懸液作為分散相；b)分散相滴入含乳化劑的油性惰性介質(zhì)組成的連續(xù)相中，其中分散相中有機(jī)溶媒與連續(xù)相介質(zhì)的油不相互溶，在快速攪拌下乳化；c)使上述有機(jī)溶媒逐漸蒸發(fā)，析出載藥微球；d)將離心分離得到的微球洗滌，干燥即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分散相中的機(jī)溶媒為丙酮，乙腈，二氯甲烷，氯仿，乙醚，乙酸乙酯或乙酸甲酯中的一種或任意混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中連續(xù)相的油性惰性介質(zhì)為礦物油、植物油或多元醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中礦物油為液狀石蠟或二甲硅油。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中植物油茶油、花生油或豆油。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中多元醇為甘油。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中生物降解聚合物與有機(jī)溶媒的重量體積比為1～30％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中生物降解聚合物溶液與連續(xù)相體積比為1∶5～1∶50。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中生物降解聚合物溶液與連續(xù)相體積比為1∶15～1∶30。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)中乳化劑為HLB值范圍在1.8～12.4之間的非離子表面活性劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，所述的非離子表面活性劑為span類。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，所述的非離子表面活性劑為span80。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，span80的濃度為連續(xù)相體積的0.02～5％(W/V)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，span80的濃度為連續(xù)相體積的0.1～1.5％(W/V)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)的攪拌速度為500～2000rpm。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中攪拌速度為800～1200rpm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備石杉堿及其衍生物的注射用緩釋微球的方法。該方法采用油/油(O/O)乳劑－液中干燥原理微囊化。由于始終在無水環(huán)境中操作，本方法制備的石杉堿甲微球，在藥物包裹率，降低突釋作用，均勻緩慢釋藥方面比其它方法有明顯的優(yōu)勢。
文檔編號A61K9/10GK1981744SQ20051011139
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月12日
發(fā)明者陳慶華, 潘峰, 包泳初, 瞿挺, 朱大元, 蔣山好 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院