專利名稱：海龍抗腫瘤活性蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的產(chǎn)品，具體的說，是涉及一種海龍抗腫瘤活性蛋白。
背景技術(shù)：
目前國內(nèi)外用于臨床的抗腫瘤藥物有很多，化學合成藥物的毒副作用都比較大，從天然產(chǎn)物中分離純化具有抗腫瘤、增強免疫活性的藥物成為研究的熱點。近年來對動物中活性蛋白和多肽的研究日趨活躍，從中尋找抗腫瘤蛋白和多肽成為研究開發(fā)新熱點。由于海洋生物和內(nèi)陸生物的差異性，來自于海洋動物的蛋白質(zhì)組分更具有開發(fā)和應(yīng)用價值，目前國際上已有數(shù)百個海洋生物多肽和蛋白質(zhì)進入臨床研究。來源于北極豹蛙卵和早期胚胎中的RNA酶-Onconase(P-30蛋白，分類號EC 3.1.27-)，成為首個進入III期臨床研究(臨床名稱Ranpirnase)的抗腫瘤核糖核酸酶藥物。海龍(Syngnathus)為一常用中藥材，2005版《中華人民共和國藥典》規(guī)定為尖海龍Syngnathus acus Linnaeus、刁海龍Solenognathus hardwickii(Gray)和擬海龍Syngnathoides biaculeatus(Bloch)干燥體，用于陽萎遺精、癥瘕積聚、瘰疬痰核、跌撲損傷及癰腫疔瘡。除藥典收載品種外，粗吻海龍Trachyrhamphus serratus(Temminck et Schlegel)在我國不少地方也常作海龍藥用。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，李士敏等在海龍的體外抗腫瘤活性研究中發(fā)現(xiàn)，粗吻海龍經(jīng)95％乙醇提取，再用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，獲得的石油醚萃取物經(jīng)皂化后再用乙醚萃取，回收乙醚得非皂化物，其非皂化物部分具有不同程度的抑制人癌細胞株KB、Hela、Bcap37、K-562、PAA細胞的作用，并有明顯的量效關(guān)系(李士敏，吳筱丹，曾蘇，等.海龍體外抗腫瘤活性研究[J].中國中藥雜志，2001，26(3)198-201)。目前粗吻海龍仍以全體入藥，用于跌打損傷和陽萎遺精的治療，未見用于抗腫瘤和增強免疫功能的相關(guān)技術(shù)文獻的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種海龍抗腫瘤活性蛋白，使其具有抗腫瘤活性，同時有低毒、增強免疫的特點。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種以粗吻海龍為原料提取的分子量為55kDa的海龍抗腫瘤活性蛋白，其中，蛋白質(zhì)含量在99-100％之間，糖含量在0-1％之間。本發(fā)明海龍抗腫瘤活性蛋白是經(jīng)乙醇-水溶液提取、樹脂分離、硫酸銨鹽析、凝膠過濾和離子交換層析制得。
本發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白外觀為白色粉末，SDS-PAGE顯示是單一條帶。
發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白，經(jīng)測試具有良好的抗腫瘤活性小鼠及人癌細胞株給藥劑量在0.1-100μg/ml范圍內(nèi)可抑制多種腫瘤細胞的生長；小鼠給藥劑量在1-100mg/kg范圍內(nèi)可抑制動物體內(nèi)移植腫瘤的生長，同時可以顯著改善荷瘤小鼠體征性狀。
本發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白，單獨或與其它藥物聯(lián)合使用均有抗腫瘤作用，主要用于各種癌癥的治療和輔助治療，如肺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、白血病等，尤其對A-549、Bel-7402、Hela、Lovo、P-388細胞株有較強殺傷作用；同時還具有增強免疫的作用。


圖1為本發(fā)明SDS-PAGE圖譜具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述。
從粗吻海龍中純化該抗腫瘤活性蛋白，具體如下(1)以粗吻海龍為原料，粉碎后過篩，待用。
(2)在粗吻海龍粗粉中加入4～12倍量的體積百分比為0～90％的乙醇-水溶液，勻漿、低溫浸泡，離心后取上清液，即為海龍蛋白粗提液。
(3)將蛋白粗提液于20～60℃減壓蒸發(fā)濃縮后，與HZ-801大孔樹脂接觸，充分吸附后用蒸餾水洗脫，收集蛋白組分，得到海龍蛋白分離液。
(4)將海龍蛋白分離液減壓蒸發(fā)濃縮，加入硫酸銨粉末使硫酸銨濃度達到20％-90％飽和度，充分攪拌后4℃靜置，離心，收集沉淀，將沉淀用少量Tris-HCl緩沖液溶解后透析、濃縮、冷凍干燥，即得到海龍粗蛋白。
(5)將海龍粗蛋白用pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液溶解后，與凝膠過濾介質(zhì)接觸，用pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液洗脫，收集分子量在10-100kDa的蛋白質(zhì)洗脫液，透析、濃縮、冷凍干燥后，經(jīng)體外抗腫瘤活性檢測，獲得海龍抗腫瘤粗蛋白，蛋白質(zhì)成分含量達95-100％。
(6)將海龍抗腫瘤粗蛋白用pH 8.4、20mM Tris-HCl緩沖液溶解，與離子交換介質(zhì)接觸，梯度NaCl緩沖液洗脫，得到數(shù)個不同濃度NaCl緩沖液的洗脫組分，第四個洗脫峰經(jīng)透析、濃縮、凍干后即為本發(fā)明所述的海龍抗腫瘤活性蛋白。
實施例1本發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白，外觀為白色粉末，經(jīng)Lowry法檢測蛋白質(zhì)含量為99.5％，經(jīng)苯酚-濃硫酸法檢測糖含量為0.5％。
對該蛋白進行SDS-PAGE，分離膠濃度為12％、濃縮膠濃度為5％，以分子量在14.4-116kDa的混合標準蛋白做對照，結(jié)果見圖1，其中Marker蛋白質(zhì)分子量標準；Sample本發(fā)明中的海龍抗腫瘤活性蛋白。由圖1可見本發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白在SDS-PAGE中顯示單一條帶，分子量為55kDa。
對該蛋白進行抗腫瘤活性測試，經(jīng)MTT法檢測，當藥物濃度為100μg/ml時，對Lovo(人結(jié)腸癌細胞株)、A549(人肺癌細胞株)、Hela(人宮頸癌細胞株)、CCRF-CEM(人白血病細胞株)的抑制率分別為55.8％、69.8％、62.8％和52.7％。
該蛋白10μg/ml與甲胺蝶呤或順鉑聯(lián)合使用，對人結(jié)腸癌細胞株Lovo進行抗腫瘤活性體外測試，經(jīng)MTT法檢測當甲胺蝶呤濃度為2.5μg/ml時，細胞生長抑制率增加40.3％，當順鉑濃度為0.025μg/ml時，細胞生長抑制率增加70.4％。
實施例2本發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白，外觀為白色粉末，經(jīng)Lowry法檢測蛋白質(zhì)含量為100％，經(jīng)苯酚-濃硫酸法檢測糖含量為0％；SDS-PAGE顯示分子量為55kDa的單一條帶。
對該蛋白采用動物移植性腫瘤實驗法考察其體內(nèi)活性荷S180肉瘤的ICR小鼠(42±2日齡、體重18-22g、雌性)10只，自接種腫瘤后第一天開始以20mg/Kg·天的劑量連續(xù)七天腹腔注射給藥；陽性對照為靜脈注射5-氟尿嘧啶的荷瘤小鼠10只(75mg/kg，于腫瘤接種后1、4天給藥兩次)；陰性對照為不給藥的荷瘤小鼠10只。在第10天稱小鼠體重后，剖取各小鼠的腫瘤并稱重，同時測量其各項免疫指標。
從表1中可以看出，該蛋白對荷S180肉瘤小鼠的腫瘤抑制率為42.88％。雖然陽性對照組的腫瘤抑制率達到了88.5％，但在實驗期間有3只小鼠死亡，存活小鼠的平均體重僅為19.48g，解剖時發(fā)現(xiàn)部分小鼠膽發(fā)黑，腸暗紅色，說明5-氟尿嘧啶有比較強的毒性；而給藥該蛋白組小鼠無死亡，平均體重為33.91g，說明本發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白具有低毒的特性。
與正常小鼠相比給藥該蛋白組小鼠的肝、脾和胸腺重量分別增加了21.2％、385％和51.2％；白細胞和血小板分別增加了624％和62.7％；淋巴細胞、單核細胞和中性細胞分別增加了275％、521％和856％。這些變化表明，本發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白還能顯著提高荷瘤小鼠的免疫力。
表1海龍抗腫瘤活性蛋白對荷S180肉瘤小鼠的療效

實施例3本發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白，外觀為白色粉末，經(jīng)Lowry法檢測蛋白質(zhì)含量為99％，經(jīng)苯酚-濃硫酸法檢測糖含量為1％；SDS-PAGE顯示為分子量55kDa的單一條帶。
對該蛋白采用動物移植性腫瘤實驗法考察其體內(nèi)活性，實驗方法同實施例2。當給藥劑量為30mg/Kg·天時，對荷S180肉瘤小鼠的腫瘤抑制率為51.14％。
權(quán)利要求
1.一種海龍抗腫瘤活性蛋白，其特征在于，以粗吻海龍為原料提取的分子量為55kDa的活性蛋白，其中，蛋白質(zhì)含量在99-100％之間，糖含量在0-1％之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海龍抗腫瘤活性蛋白，其特征是，其外觀為白色粉末，SDS-PAGE顯示是單一條帶。
全文摘要
一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的海龍抗腫瘤活性蛋白，以粗吻海龍為原料提取的分子量為55kDa的活性蛋白，其中，蛋白質(zhì)含量在99－100％之間，糖含量在0－1％之間，其外觀為白色粉末，SDS－PAGE顯示是單一條帶。本發(fā)明所提供的海龍抗腫瘤活性蛋白，具有抗腫瘤活性，同時有低毒、增強免疫的特點。本發(fā)明單獨或與其它藥物聯(lián)合使用均有抗腫瘤作用，主要用于各種癌癥的治療和輔助治療，如肺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、白血病等，尤其對A－549、Bel－7402、Hela、Lovo、P－388細胞株有較強殺傷作用；同時還具有增強免疫的作用。
文檔編號A61P35/00GK1793174SQ20051011223
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者李曉波, 張朝暉, 秦孫星, 王威, 王夢月 申請人:上海交通大學