專利名稱:一種用于治療股骨頭壞死的復合制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種用于治療股骨頭壞死的復合制劑。
背景技術(shù):
股骨頭缺血性壞死是臨床多發(fā)病和常見病,致殘率高。它可引起股骨頭塌陷、變形,最終導致髖關(guān)節(jié)功能障礙,本病為一不可逆過程。股骨頭壞死的根本原因是血供障礙,并且病程的發(fā)展會造成進一步的血供障礙,引發(fā)股骨頭壞死的加重,是一個惡性循環(huán)的發(fā)病過程,在股骨頭壞死中,血管損傷、炎癥導致的血管栓塞和骨內(nèi)壓升高是造成上述惡性循環(huán)的重要原因,這是股骨頭壞死治療中的難點。
股骨頭壞死的治療方法有手術(shù)治療和非手術(shù)治療,手術(shù)治療主要是人工關(guān)節(jié)置換術(shù),該方法只適合老年人,不適合從事重體力勞動的年輕人。非手術(shù)治療主要是采取血管生成及擴血管的藥物改善血供,但是,由于股骨頭骨內(nèi)壓高,單純應用血管生成因子很難誘導新血管生成。征對股骨頭壞死的病理特征,本發(fā)明研制一種復合制劑,采用抗炎因子使壞死股骨頭消炎減壓,同時,應用促進血管生成的細胞因子誘導新的血管生成,變股骨頭壞死惡性循環(huán)為良性循環(huán),達到治療股骨頭壞死的目的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效治療股骨頭壞死的復合制劑,。
本發(fā)明的目的可通過以下的技術(shù)措施來實現(xiàn)由具有促血管生成的細胞因子脂質(zhì)體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質(zhì)體緩釋劑復合而成。
本發(fā)明具有促血管生成的細胞因子脂質(zhì)體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質(zhì)體緩釋劑復合的重量份比為5~8∶8~12。
本發(fā)明具有促血管生成的細胞因子脂質(zhì)體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質(zhì)體緩釋劑重量份比為7∶10。
本發(fā)明所述具有促血管生成的細胞因子脂質(zhì)體緩釋劑中細胞因子的含量為100~200μg/ml,其中脂質(zhì)體由膽固醇與卵磷脂組成,膽固醇與卵磷酯的比值為1∶4。
本發(fā)明所述具有抗炎作用的細胞因子受體脂質(zhì)體緩釋劑中的細胞因子含量為100~200μg/ml,其中脂質(zhì)體由膽固醇與卵磷脂組成,膽固醇與卵磷酯的比值為1∶4。
本發(fā)明具有促血管生成的細胞因子為血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、或血小板樣生長因子(PDGF)。
本發(fā)明具有抗炎作用的細胞因子為腫瘤壞死因子(TNFRII-FC)、白細胞介素10(IL-10)或轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)。
由于細胞因子在體內(nèi)的半衰期短,采用脂質(zhì)體緩釋技術(shù),制備基因重組VEGF121及基因重組TNFRII-FC脂質(zhì)體,用于股骨頭壞死及骨創(chuàng)傷修復的治療,取得明顯的療效。
采用新西蘭兔,耳緣靜脈注射馬血清,臀肌注射醋酸潑尼松龍,制造激素性股骨頭壞死動物模型,模型建立后,動物隨機分為2組A組VEGF/TNFRII脂質(zhì)體治療組,B組未治療對照組。骨穿刺針行經(jīng)皮注射藥物至股骨頭。A組每只兔子左側(cè)股骨頭內(nèi)分別注入VEGF/TNFRII脂質(zhì)體,B組以同樣方法經(jīng)骨穿針注射同等量生理鹽水作為對照組。于治療后4周后,采用影像學方法觀察股骨頭結(jié)構(gòu)變化,病理組織學觀察骨組織、骨髓組織變化、骨組織內(nèi)血管的變化。
普通X線檢查顯示VEGF/TNFRII治療組左側(cè)股骨頭形態(tài)較右側(cè)有顯著改善,左側(cè)股骨頭關(guān)節(jié)面基本完整,無明顯缺損區(qū)域(見圖1)。
CT檢查顯示VEGF/TNFRII組左側(cè)關(guān)節(jié)面較右側(cè)清晰,骨密度較均一(見圖2)。
墨汁灌注血管造影結(jié)果顯示VEGF/TNFRII組可見血管網(wǎng)形成,潮線下、細小血管清淅可見。骺下血管分布及血管網(wǎng)的形成基本正常(見圖3)。未治療組墨汁灌注血管造影顯示股骨頭血管顯著減少,灌注不全面,血管出現(xiàn)明顯栓塞。(見圖4)HE染色結(jié)果顯示VEGF/TNFRII治療組軟骨細胞增生明顯,骨小梁邊有骨母細胞出現(xiàn),骨髓腔造血組織增生,空骨陷窩減少,栓塞的血管旁邊出現(xiàn)新生的血管,血管內(nèi)皮細胞增生(見圖5,6)。未治療對照組股骨頭壞死模型組HE染色顯示骨膜不完整,軟骨部分脫落,骨小梁稀疏變細,結(jié)構(gòu)紊亂,有碎片出現(xiàn),骨小梁骨細胞陷窩空疏,骨細胞核固縮;部分血管栓塞;骨髓腔內(nèi)造血組織明顯減少,脂肪細胞體積增大,有的融合成泡狀(見圖7,8)。
上述的動物實驗結(jié)果顯示VEGF/TNFRII脂質(zhì)體經(jīng)直接穿刺介入治療股骨頭壞死,股骨頭的空缺骨陷窩數(shù)明顯減少,骨髓腔內(nèi)脂肪細胞數(shù)量減少、體積明顯縮小,軟骨下區(qū)血管數(shù)目增多,血管內(nèi)脂肪栓子消失。VEGF/TNFRII的治療效果明顯。
圖1治療組普通X線檢查圖片,顯示股骨頭關(guān)節(jié)面趨于完整缺損區(qū)基本消失;圖2治療組CT檢查圖片,顯示左側(cè)股骨頭關(guān)節(jié)面較右側(cè)完整,骨質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰;圖3治療組墨汁灌注血管造影圖片(×10),顯示股骨頭血管墨汁染色顯示血管增生,部分血管有再通;圖4未治療組墨汁灌注血管造影圖片(×10),顯示股骨頭血管墨汁染色顯示血管閉塞,血管稀少,股骨頭淺層血管幾乎消失;圖5治療組HE染色結(jié)果圖片(HE×200),顯示骨小梁中骨細胞數(shù)目增多,小梁周邊骨母細胞增生,骨髓腔中造血組織明顯增生;圖6治療組HE染色結(jié)果圖片(HE×400),顯示骨小梁內(nèi)見骨細胞增生,小梁周邊出現(xiàn)較多的骨母細胞,空骨陷窩減少,骨小管及骨髓腔內(nèi)血管增生,其中栓塞的血管旁邊出現(xiàn)新生的血管。
圖7未治療組HE染色結(jié)果圖片(HE×200),顯示骨小梁中出現(xiàn)新生骨細胞,骨髓腔中造血組織增生,但是數(shù)量明顯少于A組。
圖8未治療組HE染色結(jié)果圖片(HE×400),顯示血管出現(xiàn)栓塞,空骨陷窩較多。
具體實施例方式
上述血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)脂質(zhì)體緩釋劑按以下步驟制備(1)VEGF121基因克隆、表達(VEGF121基因序列參見GenBank AF214570)從HL60細胞中提取總RNA,設計上下游引物,RT-PCR擴增VEGF121基因,克隆到pET-24a表達載體中,將pET-24a/VEGF121重組子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,通過表達篩選,得到VEGF121工程菌,通過細菌培養(yǎng),IPTG誘導表達,得到重組VEGF121。
(2)重組VEGF121的復性與純化將高效表達的菌體用TE緩沖液懸浮,4℃預冷后采用細胞勻漿機使其混合均勻。采用高壓均質(zhì)機高壓破菌,離心,得到包涵體,包涵體用洗滌液洗滌,再用7mol/L鹽酸胍溶解,溶解液透析于10mmol/L HCl中,加入固體尿素至其濃度為8mol/L,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度至0.2mg/mL,用5倍體積的復性液等容超濾,復性后蛋白質(zhì)上弱陰離子交換(DEAE-Sepharose fast flow)柱,NaCl濃度線性梯度洗脫,收集目的蛋白洗脫峰,透析去鹽、濃縮,上Sephacryl S-100凝膠過濾色譜,收集目的蛋白洗脫峰。
(3)VEGF121脂質(zhì)體的制備用二次乳化法制備VEGF121脂質(zhì)體,具體操作如下取35mg VEGF121蛋白,濃縮至30ml,按1∶4取膽固醇200mg,卵磷脂800mg,用100ml二氯四甲烷溶解,將水相和有機相混合乳化,于旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速80r/min)上減壓蒸發(fā)至圓底燒瓶內(nèi),乳化液變成凝膠狀黏稠液體時,再加入100ml PBS溶液繼續(xù)減壓蒸發(fā),使緩沖液100ml中總脂質(zhì)體含量1%,除去有機溶劑,將制備的混懸液再超聲30min,即得試驗用的VEGF脂質(zhì)體緩釋劑,取上述制備的液體加入甘露醇5g,10mg人血清白蛋白,分裝于青霉素瓶中冷凍干燥。
上述腫瘤壞死因子(TNFRII-FC)受體脂質(zhì)體緩釋劑按以下制備采用上海復旦張江生物有限公司購買的TNFRII-FC蛋白質(zhì)純品,用二次乳化法制備TNFRII-FC脂質(zhì)體,具體操作如下取35mg TNFRII-FC蛋白(凍干粉),按1∶4取膽固醇200mg,卵磷脂800mg,用100ml二氯四甲烷溶解,將水相和有機相混合乳化,于旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速80r/min)上減壓蒸發(fā)至圓底燒瓶內(nèi),乳化液變成凝膠狀黏稠液體時,再加入100ml PBS溶液繼續(xù)減壓蒸發(fā),使緩沖液100ml中總脂質(zhì)體含量1%,除去有機溶劑,將制備的混懸液再超聲30min,即得試驗用的VEGF脂質(zhì)體緩釋劑,取上述制備的液體加入甘露醇5g,10mg人血清白蛋白,分裝于青霉素瓶中冷凍干燥。
根據(jù)實驗動物的大小,取上述制得的血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)脂質(zhì)體緩釋劑和腫瘤壞死因子受體(TNFRII-FC)脂質(zhì)體緩釋劑,或取兩種脂質(zhì)體凍干粉,VEGF121與TNFRII-FC以重量份7∶10的比例溶于生理鹽水,用于注射。也可取上述兩種緩釋劑以重量份5∶8或8∶12的比例溶于生理鹽水,用于注射。
上述血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)也可用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、或血小板樣生長因子(PDGF)替代,同樣能起到治療效果。
上述腫瘤壞死因子(TNFRII-FC)也可用白細胞介素10(IL-10)或轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)替代,同樣能起到治療效果。
權(quán)利要求
1.一種用于治療股骨頭壞死的復合制劑,其特征在于由具有促血管生成的細胞因子脂質(zhì)體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質(zhì)體緩釋劑復合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑,其特征在于具有促血管生成的細胞因子脂質(zhì)體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質(zhì)體緩釋劑復合的重量份比為5~8∶8~12。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑,其特征在于具有促血管生成的細胞因子脂質(zhì)體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質(zhì)體緩釋劑重量份比為7∶10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑,其特征在于所述具有促血管生成的細胞因子脂質(zhì)體緩釋劑中細胞因子的含量為100~200μg/ml,其中脂質(zhì)體由膽固醇與卵磷脂組成,膽固醇與卵磷酯的比值為1∶4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的用于治療股骨頭壞死的藥物,其特征在于所述具有抗炎作用的細胞因子受體脂質(zhì)體緩釋劑中的細胞因子含量為100~200μg/ml,其中脂質(zhì)體由膽固醇與卵磷脂組成,膽固醇與卵磷酯的比值為1∶4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑,其特征在于具有促血管生成的細胞因子為血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、或血小板樣生長因子(PDGF)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或5所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑,其特征在于具有抗炎作用的細胞因子為腫瘤壞死因子(TNFR-FC)、白細胞介素10(IL-10)或轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療股骨頭壞死的復合制劑,由具有促進血管生成作用的血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)脂質(zhì)體緩釋劑和具有抗炎作用的腫瘤壞死因子受體(TNFR-FC)脂質(zhì)體緩釋劑復合而成,其中VEGF121脂質(zhì)體緩釋劑與TNFR-FC脂質(zhì)體緩釋劑復合的重量份比為5~8∶8~12。本發(fā)明VEGF/TNFR脂質(zhì)體緩釋劑經(jīng)直接穿刺介入治療激素誘導的兔股骨頭壞死,股骨頭的空缺骨陷窩數(shù)明顯減少,骨髓腔內(nèi)脂肪細胞數(shù)量減少、體積明顯縮小,軟骨下區(qū)血管數(shù)目增多,血管內(nèi)脂肪栓子消失;顯示VEGF/TNFR的治療效果明顯。
文檔編號A61K9/127GK1824298SQ20051012073
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者王小寧, 胡志明, 馬驪 申請人:南方醫(yī)科大學