改進(jìn)的白介素-2突變蛋白的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>醫(yī)藥醫(yī)療技術(shù)的改進(jìn);醫(yī)療器械制造及應(yīng)用技術(shù)

專利名稱：改進(jìn)的白介素-2突變蛋白的制作方法
專利說(shuō)明改進(jìn)的白介素-2突變蛋白發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有提高的治療效果的人白介素-2(IL-2)突變蛋白。也提供制備這種新分子和藥物制劑用于治療癌癥和刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的方法。

背景技術(shù)：
白介素-2(IL-2)是自然殺傷細(xì)胞(NK)和T-細(xì)胞增殖與功能的強(qiáng)效激活劑(Morgan等，Sience 1931007-11，1976)。已證明這種自然產(chǎn)生的細(xì)胞因子單獨(dú)或與淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(LAK)或腫瘤滲出淋巴細(xì)胞(TIL)聯(lián)合時(shí)具有抵抗各種惡性疾病的抗腫瘤活性(見(jiàn)例如，Rosenberg等，N.Engl.J.Med.316889-97，1987；Rosenberg，Ann.Surg.208121-35，1988；Topalian等，J.Clin.Oncol.6839-53，1988；Rosenberg等，N.Engl.J.Med.3191676-80，1988；Weber等，J.Clin.Oncol.1033-40，1992)。然而為了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)獲得正面治療結(jié)果而采用的高劑量IL-2常常引起嚴(yán)重的副作用，包括發(fā)熱、寒戰(zhàn)、低血壓和毛細(xì)血管滲漏(血管滲漏綜合征或VLS)及神經(jīng)學(xué)變化(見(jiàn)例如，Duggan等，J.Immunotherapy 12115-22，1992；Gisselbrecht等，Blood 832081-85，1994；Sznol和Parkinson，Blood 832020-22，1994)。
雖然IL-2誘導(dǎo)的毒性和VSL的精確機(jī)理尚不清楚，但積累的資料提示IL-2誘導(dǎo)的殺傷(NK)細(xì)胞觸發(fā)了劑量限制性毒性(DLT)，結(jié)果過(guò)度產(chǎn)生了促炎癥細(xì)胞因子，包括IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-β和IL-6。這些細(xì)胞因子激活了單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和誘導(dǎo)了一氧化氮的產(chǎn)生，導(dǎo)致隨后的內(nèi)皮細(xì)胞損傷(Dubinett等，CellImmunol 157170-80，1994；Samlowski等，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.18166-78，1995)。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致其他人根據(jù)假說(shuō)T細(xì)胞選擇性表達(dá)了高親和力的IL-2受體(IL-2R)而開發(fā)了對(duì)T細(xì)胞而非NK細(xì)胞有優(yōu)先選擇性的IL-2突變蛋白(見(jiàn)例如，BAY50-4798，成熟的人IL-2的N88R IL-2突變蛋白，公開于國(guó)際專利WO 99/60128和Shanafelt等，Nat.Biotechnol.181197-202，2000)。
多種NK功能，如自然殺傷(NK)、LAK、和依賴于抗體的細(xì)胞毒(ADCC)的溶細(xì)胞殺傷、及細(xì)胞因子的產(chǎn)生和增殖有賴于激活不同NK胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的特異性中間產(chǎn)物。重要的是，有證據(jù)表明對(duì)IL-2-IL-2R相互作用的選擇性調(diào)節(jié)可影響下游NK-和T-細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)器功能，如增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和溶細(xì)胞殺傷(Sauve等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.884636-40，1991；Heaton等，Cancer Res.532597-2602，1993；Eckenberg等，J.Exp.Med.191529-40，2000)。
Proleukin

IL-2(含有重組的人IL-2突變蛋白阿地白介素；Chiron Corporation，Emeryville，California)已經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和腎癌。并正研究用于其它臨床適應(yīng)癥，包括非何杰金淋巴瘤、HIV和乳腺癌。然而，由于IL-2的相關(guān)毒副作用，需要毒性減低的IL-2突變蛋白以使該白介素具有更好的治療應(yīng)用。具有低毒性和/或增強(qiáng)的IL-2介導(dǎo)的NK細(xì)胞或T細(xì)胞效應(yīng)器功能的IL-2突變蛋白將會(huì)有更廣泛的用途，特別適合于癌癥治療和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)。
發(fā)明概述本發(fā)明是關(guān)于預(yù)計(jì)毒性降低和功能提高的人白介素-2(IL-2)突變蛋白。與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突變蛋白相比，這種突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的促炎癥細(xì)胞因子，同時(shí)保持或增強(qiáng)了NK細(xì)胞的增殖，保持了NK細(xì)胞介導(dǎo)的NK、LAK和ADCC溶細(xì)胞功能及保持了T細(xì)胞增殖功能。本發(fā)明提供編碼人IL-2突變蛋白的分離的核酸分子和分離的含有這些突變的多肽。也闡述了這些改進(jìn)的人IL-2突變蛋白治療癌癥和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)的臨床用途。
在一方面，本發(fā)明提供的分離的核酸分子含有編碼人IL-2突變蛋白的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，該核酸分子編碼含有選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344氨基酸序列的人IL-2突變蛋白。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括編碼的IL-2突變蛋白的分離的核酸分子含有選自SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341和343的核苷酸序列。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括的分離的核酸分子含有編碼人IL-2突變蛋白的核苷酸序列，其中該突變蛋白的氨基酸序列包含選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344序列的殘基2-133。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含含有選自SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341和343序列的核苷酸4-399的核苷酸序列。
在某些實(shí)施方式中，本文所述的核酸分子還可包含取代，其中SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343的核苷酸373-375被編碼丙氨酸的三聯(lián)密碼子取代。
在某些實(shí)施方式中，本文所述核酸分子還可包含取代，其中SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343的核苷酸373-375被編碼半胱氨酸的三聯(lián)子取代。
在某些實(shí)施方式中，本文所述的的核酸分子經(jīng)修飾而優(yōu)化了表達(dá)。這些核酸包含的核苷酸序列中，為了在感興趣宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼該突變蛋白的一個(gè)或多個(gè)密碼子已經(jīng)過(guò)優(yōu)化。含有優(yōu)化密碼子的示范性核酸包括但不限于含有選自以下核苷酸序列的核酸SEQ ID NO345、SEQ ID NO345的核苷酸4-399、SEQ ID NO346和SEQID NO346的核苷酸4-399。
本發(fā)明還包括用于在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明的一種或多種核酸。在這類表達(dá)載體中，所述核酸操作性連接有與在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)相容的調(diào)控元件。許多表達(dá)調(diào)控元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于以下轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、聚腺苷酸序列、優(yōu)化起動(dòng)翻譯的序列、翻譯終止序列。示范性的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子包括但不限于衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿病毒40的啟動(dòng)子。
在另一方面，本發(fā)明提供的細(xì)胞含有本發(fā)明的表達(dá)載體，其中的核酸序列(如編碼人IL-2突變蛋白)操作性連接于與在所選細(xì)胞中表達(dá)相容的調(diào)控元件。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。示范性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞。可用于實(shí)施本發(fā)明的其它細(xì)胞、細(xì)胞類型、組織類型等包括但不限于獲自以下的細(xì)胞昆蟲(如粉蚊夜娥(Trichoplusia ni)(Tn5)和Sf9)、細(xì)菌、酵母菌、植物、抗原提呈細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B-細(xì)胞、T-細(xì)胞、干細(xì)胞和它們的祖細(xì)胞)、原代細(xì)胞、永生細(xì)胞、腫瘤衍生細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明供本發(fā)明的含有用于重組產(chǎn)生人IL-2突變蛋白的表達(dá)載體的組合物和宿主細(xì)胞。這種組合物可含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
在還有一方面，本發(fā)明提供含人IL-2突變蛋白的分離的多肽。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的含有選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344氨基酸序列的多肽。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的含有選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344氨基酸序列的氨基酸殘基2-133的多肽。
在某些實(shí)施方式中，上述多肽還含有取代。其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
在某些實(shí)施方式中，上述多肽還含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位半胱氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
在某些實(shí)施方式中，該分離的多肽含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列，在SEQ IDNO4的125位絲氨酸取代了半胱氨酸，SEQ ID NO4中至少有一處其它的氨基酸取代，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，此突變蛋白1)保持了或增強(qiáng)了自然殺傷(NK)細(xì)胞的增殖，和2)誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子水平降低。示范性的取代包括但不限于T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、I24L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V。在某些實(shí)施方式中，該多肽還包含SEQ ID NO4位置1的丙氨酸缺失。
可用NK-92生物試驗(yàn)檢測(cè)自然殺傷(NK)細(xì)胞增殖的提高和NK細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子水平的降低?？稍谙嗟仍囼?yàn)條件下，將上述多肽對(duì)NK細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子的作用與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的作用作比較。在某些實(shí)施方式中，可在相等的試驗(yàn)條件下，用NK-92生物試驗(yàn)來(lái)證明，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的相比，上述多肽誘導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子TNF-α水平降低。
在某些實(shí)施方式中，在相等試驗(yàn)條件下，用NK3.3細(xì)胞毒生物試驗(yàn)來(lái)證明，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的相比，上述多肽保持或增強(qiáng)了人NK細(xì)胞介導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞毒性、淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞毒性、或ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
在某些實(shí)施方式中，在相等試驗(yàn)條件下，與用類似量的脫丙氨酰1 C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的相比，上述多肽保持或增強(qiáng)了NK3.3細(xì)胞系中磷酸化AKT的誘導(dǎo)。
在某些實(shí)施方式中，在相等試驗(yàn)條件下，該突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的高150％。
在某些實(shí)施方式中，該突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的高170％。
在某些實(shí)施方式中，該突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖約為脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的200-210％在某些實(shí)施方式中，在相等試驗(yàn)條件下，該突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖高于類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所誘導(dǎo)的至少10％。
在某些實(shí)施方式中，該突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖高于脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所誘導(dǎo)的至少15％。
在某些實(shí)施方式中，在相等試驗(yàn)條件下，該突變蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子低于類似量脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所誘導(dǎo)的100％。
在某些實(shí)施方式中，該突變蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子低于脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所誘導(dǎo)的70％。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括的分離的多肽含有人IL-2突變蛋白，其中該突變蛋白含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列，在SEQ ID NO4的125位半胱氨酸取代了絲氨酸，SEQ ID NO4中至少有一處其它的氨基酸取代，在相等試驗(yàn)條件下，該突變蛋白IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞與IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α之比率，比類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突變蛋白觀察到的至少高1.5倍?？捎肗K-92生物試驗(yàn)測(cè)定0.1nM突變蛋白的NK細(xì)胞增殖和1.0nM突變蛋白的TNF-α產(chǎn)量。在某些實(shí)施方式中，上述比率比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的至少高2.5倍。在某些實(shí)施方式中，此比率比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的至少高3.0倍。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，其中如用體內(nèi)溫度芯片測(cè)量體溫、測(cè)量血管滲漏或測(cè)量患者的最大耐受劑量所確定，當(dāng)給予患者時(shí)該突變蛋白顯示了改進(jìn)的耐受性。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了含有人IL-2突變蛋白的分離的多肽，其中與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的相比所述突變蛋白有較高的最大耐受劑量，所述最大耐受劑量可用B16F10黑色素瘤動(dòng)物模型測(cè)定。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了含有人IL-2突變蛋白的分離的多肽，在相等治療條件下，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治療相比所述突變蛋白顯示了相當(dāng)或提高的抗腫瘤活性，所述抗腫瘤活性可用B16F10黑色素瘤動(dòng)物模型評(píng)價(jià)。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了含有人IL-2突變蛋白的分離的多肽，在相等治療條件下，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治療相比所述突變蛋白顯示了相當(dāng)或提高的抗腫瘤活性和降低的副作用，所述抗腫瘤活性可用高等級(jí)非何杰金淋巴瘤Namalwa動(dòng)物模型或低等級(jí)非何杰金淋巴瘤Daudi動(dòng)物模型評(píng)價(jià)。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了含有人IL-2突變蛋白的分離的多肽，在相等試驗(yàn)條件下，其中所述突變蛋白當(dāng)與利妥昔抗體同時(shí)給藥時(shí)相比用脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2處理顯示可比或提高的抗腫瘤活性和降低的副作用，其中所述抗腫瘤活性用高度非何杰金淋巴瘤Namalwa動(dòng)物模型或低等級(jí)非何杰金淋巴瘤Daudi動(dòng)物模型評(píng)價(jià)。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，其中與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比所述突變蛋白顯示出提高的免疫效應(yīng)細(xì)胞活化作用?；罨拿庖呒?xì)胞可包括，但不限于，T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和噬中性粒細(xì)胞。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，其中與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比所述突變蛋白顯示出提高的抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)介導(dǎo)的溶細(xì)胞殺傷活性。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，其中與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比所述突變蛋白在血管滲漏綜合征動(dòng)物模型中造成的血管滲漏減少。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，其中與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比所述突變蛋白在動(dòng)物模型中造成較少的體溫變化，所述動(dòng)物體溫可用溫度芯片監(jiān)測(cè)。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括的分離的多肽含有人IL-2突變蛋白的氨基酸序列，其中該突變蛋白含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列，SEQ ID NO4的125位絲氨酸取代了半胱氨酸，和至少有一處其它的氨基酸取代，SEQ ID NO4中其它殘基取代的位置選自16、36、40、42、61、65、67、72、91、94、95和107位。在某些實(shí)施方式中，該多肽在SEQ ID NO4中還含有1位丙氨酸缺失。
在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生人白介素-2(IL-2)突變蛋白的方法，該方法包括用含有上述核酸分子之一的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；在能表達(dá)該核酸分子成為多肽的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和分離該多肽。在某些實(shí)施方式中，在相似的試驗(yàn)條件下，與類似量的選自脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的參比IL-2突變蛋白相比，該人白介素-2(IL-2)突變蛋白能保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖，還能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子，其中用NK-92生物試驗(yàn)來(lái)測(cè)定NK細(xì)胞的增殖和產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子。
在另一方面，本發(fā)明提供含有治療有效量的一種或多種上述多肽的組合物，該組合物含有人IL-2突變蛋白。此組合物還可含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
在另一方面，本發(fā)明提供刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物治療有效量的人IL-2突變蛋白，在相等試驗(yàn)條件下，與類似量的選自脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的參比IL-2突變蛋白相比，所述突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生低水平的促炎癥細(xì)胞因子和保持或增強(qiáng)了NK細(xì)胞的增殖，其中采用NK-92生物試驗(yàn)測(cè)定NK細(xì)胞的增殖和產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子。在某些實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物是人。
在某些實(shí)施方式中，用于刺激免疫系統(tǒng)的人IL-2突變蛋白含有選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344的氨基酸序列。
在某些實(shí)施方式中，用于剌激免疫系統(tǒng)的人IL-2突變蛋白含有的氨基酸序列包含選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344氨基酸序列的殘基2-133。
在某些實(shí)施方式中，用于剌激免疫系統(tǒng)的人IL-2突變蛋白還含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
在某些實(shí)施方式中，用于剌激免疫系統(tǒng)的人IL-2突變蛋白還含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位半胱氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
在另一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物治療有效量的人IL-2突變蛋白，在相似試驗(yàn)條件下，與類似濃度的選自脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的參比IL-2突變蛋白相比，該突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的促炎癥細(xì)胞因子和保持或增強(qiáng)了NK細(xì)胞增殖，其中采用NK-92生物試驗(yàn)來(lái)測(cè)定所述NK細(xì)胞的增殖和所述促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在某些實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物是人。
在某些實(shí)施方式中，用于治療癌癥的人IL-2突變蛋白含有選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344的氨基酸序列。
在某些實(shí)施方式中，用于治療癌癥的人IL-2突變蛋白含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的2-133殘基的氨基酸序列。
在某些實(shí)施方式中，用于治療癌癥的人IL-2突變蛋白還含有取代，其中在SEQ IDNO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
在某些實(shí)施方式中，用于治療癌癥的人IL-2突變蛋白還含有取代，其中在SEQ IDNO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位半胱氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
在另一方面，本發(fā)明提供在給予IL-2作為治療方案的病人中降低白介素-2(IL-2)誘導(dǎo)的毒性癥狀的方法。該治療方法包括給予作為IL-2突變蛋白的IL-2。
在某些實(shí)施方式中，用于治療的IL-2突變蛋白含有選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344的氨基酸序列。
在某些實(shí)施方式中，用于治療的IL-2突變蛋白含有選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344氨基酸序列的2-133殘基。
在某些實(shí)施方式中，用于治療的IL-2突變蛋白還含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
在某些實(shí)施方式中，用于治療的IL-2突變蛋白還含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位半胱氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
附圖簡(jiǎn)述

圖1概括說(shuō)明了用IL-2突變蛋白刺激分離自正常供體的人PBMC的增殖/促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生聯(lián)合試驗(yàn)方法。
圖2顯示了在人PBMC中F42E IL-2突變蛋白介導(dǎo)的增殖和TNF-α的產(chǎn)生。
圖3顯示了在人PBMC中L94Y IL-2突變蛋白介導(dǎo)的增殖和TNF-α的產(chǎn)生。
圖4顯示了在人PBMC中E95D IL-2突變蛋白介導(dǎo)的增殖和TNF-α的產(chǎn)生。
圖5顯示了在人PBMC中E95G IL-2突變蛋白介導(dǎo)的增殖和TNF-α的產(chǎn)生。
圖6顯示了在人PBMC中Y107R IL-2突變蛋白介導(dǎo)的增殖和TNF-α的產(chǎn)生。
圖7顯示IL-2激活的分離自正常供體的人PBMC保持了人NK-介導(dǎo)的LAK和ADCC活性。
圖8顯示的直方圖比較了每周三次給予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型

RL-2以及IL-2突變蛋白E95D和Y107R后的效果，見(jiàn)實(shí)施例11所述。
圖9比較了每周三次給予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型的

RL-2或者IL-2突變蛋白E95D和Y107R治療的小鼠的平均體重，如實(shí)施例11所述。
圖10顯示的直方圖比較了按照“Sleijfer”方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)給予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型

RL-2以及IL-2突變蛋白E95D和Y107R后的效果，如實(shí)施例11所述。
圖11比較了按照“Sleijfer”方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)給予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型

RL-2或者IL-2突變蛋白E95D和Y107R治療的小鼠的平均體重，如實(shí)施例11所述。
圖12顯示的直方圖比較了按照“Sleijfer”方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)給予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型

RL-2以及IL-2突變蛋白F42E和Y107R后的效果，按實(shí)施例11中所述進(jìn)行的重復(fù)研究。
圖13比較了按照“Sleijfer”方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)給予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型

RL-2或者IL-2突變蛋白F42E和Y107R治療的小鼠的平均體重，按實(shí)施例11所述進(jìn)行的重復(fù)研究。
圖14比較了每周三次給予經(jīng)照射的Balb/c裸鼠侵入性人非何杰金淋巴瘤模型(Namalwa)

和

后的效果，如實(shí)施例12所述。圖14顯示了平均腫瘤體積(mm3)與時(shí)間(治療后天數(shù))作的圖。
圖15比較了每周三次給予經(jīng)照射的Balb/c裸鼠侵入性人非何杰金淋巴瘤模型(Namalwa)

和Y107R IL-2突變蛋白后的效果，如實(shí)施例12所述。圖15顯示了平均腫瘤體積(mm3)與時(shí)間(治療后天數(shù))作的圖。
圖16比較了每周三次給予經(jīng)照射的Balb/c裸鼠侵入性人非何杰金淋巴瘤模型(Namalwa)的

和E95D IL-2突變蛋白后的效果，如實(shí)施例12所述。圖16顯示了平均腫瘤體積(mm3)與時(shí)間(治療后天數(shù))的繪圖。
圖17比較了每周三次給予經(jīng)照射的Balb/c裸鼠低等級(jí)Daudi人B細(xì)胞非何杰金淋巴瘤模型

和Y107R IL-2突變蛋白單一制劑治療后的效果，如實(shí)施例12所述。圖17顯示了平均腫瘤體積(mm3)與時(shí)間(治療后天數(shù))作的圖，并總結(jié)了統(tǒng)計(jì)結(jié)果％腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI)，部分反應(yīng)/完全反應(yīng)(PR/CR)，P值，％體重(BW)變化，以及臨床觀察。
圖18比較了每周三次與利妥昔單抗聯(lián)合給予經(jīng)照射的Balb/c裸鼠低等級(jí)Daudi人B細(xì)胞非何杰金淋巴瘤模型

和Y107R IL-2突變蛋白后的效果，如實(shí)施例12所述。圖18顯示了平均腫瘤體積(mm3)與時(shí)間(治療后天數(shù))作的圖，并總結(jié)了統(tǒng)計(jì)結(jié)果％腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI)，部分反應(yīng)/完全反應(yīng)(PR/CR)，P值，％體重(BW)變化，以及臨床觀察。
圖19比較了每周三次與利妥昔單抗聯(lián)合給予經(jīng)照射的Balb/c裸鼠低等級(jí)Daudi人B細(xì)胞非何杰金淋巴瘤模型

或Y107R IL-2突變蛋白治療的小鼠的條件性存活和抑制腫瘤生長(zhǎng)的水平，如實(shí)施例12所述。圖19顯示了條件性存活(％)和腫瘤生長(zhǎng)延遲時(shí)間(腫瘤發(fā)展到1000mm3的天數(shù))作的圖以及總結(jié)完全反應(yīng)(CR)標(biāo)準(zhǔn)的表格。
圖20比較了在存在或不存在利妥昔單抗時(shí)每周三次給予經(jīng)照射的Balb/c裸鼠低等級(jí)Daudi人B細(xì)胞非何杰金淋巴瘤模型

或Y107RIL-2突變蛋白治療的小鼠的平均體重，如實(shí)施例12所述。
圖21的直方圖比較了在示例性C57B1/6小鼠IL-2誘導(dǎo)的急性血管滲漏綜合征模型中評(píng)價(jià)的

以及IL-2突變蛋白E95D和Y107R的藥物耐受性。由于按實(shí)施例13中所述測(cè)定IL-2治療所造成的血管滲漏增加導(dǎo)致小鼠肺中125I-白蛋白的保留。
圖22顯示的圖說(shuō)明了小鼠中心體溫對(duì)IL-2治療的反應(yīng)。按照“Sleijfer”方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)給予皮下植入溫度芯片以監(jiān)測(cè)給予IL-2后溫度變化的C57BL/6小鼠

和

監(jiān)測(cè)給藥后9個(gè)小時(shí)的溫度，給予10種劑量，為期2周。最一致的是，溫度顯著變化發(fā)生在治療第5天給藥后4小時(shí)。
圖23顯示的圖比較了用

或者IL-2突變蛋白L94Y、F42E或E95G治療的C57BL/6小鼠的中心體溫。如實(shí)施例14所述，用皮下植入的溫度芯片監(jiān)測(cè)給藥后9個(gè)小時(shí)的溫度，給予10種劑量，為期2周，見(jiàn)實(shí)施例14中所述。圖24顯示直方圖比較了第5天給予

或者IL-2突變蛋白E95D、L94Y、Y107R或F42E后4小時(shí)C57BL/6小鼠的中心體溫。按照“Sleijfer”方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)給予皮下植入溫度芯片的C57BL/6小鼠IL-2，如實(shí)施例14所述。
圖25顯示了用

或者IL-2突變蛋白E95D、L94Y、Y107R或F42E治療的C57BL/6小鼠體溫降低和TNF-α血漿水平間的相關(guān)性。直方圖顯示比較了第5天按照“Sleijfer”方案給予IL-2后4小時(shí)的體溫變化和血漿TNF-α水平，如實(shí)施例14所述。溫度變化與TNF-α濃度作的圖表面溫度降低與TNF-α血漿水平升高呈線性相關(guān)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及人白介素-2(IL-2)突變蛋白，由于其毒性降低和/或NK或T細(xì)胞效應(yīng)器功能提高而具有改進(jìn)的治療效果。上述人IL-2突變蛋白及其生物活性變體與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的參比IL-2突變蛋白相比，誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子降低同時(shí)保持或增強(qiáng)了自然殺傷(NK)細(xì)胞的增殖?！按傺装Y細(xì)胞因子”指能刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子。這種細(xì)胞因子包括但不限于IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-β和IL-6。
術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”指由于氨基酸缺失、取代或二者而含有與天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)氨基酸序列不同的突變氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的人IL-2突變蛋白與成熟的人IL-2序列不同處在于，在成熟的人IL-2序列125位絲氨酸殘基取代了半胱氨酸殘基(即C125S)，和還含有至少一處其它的氨基酸取代，并且相對(duì)于成熟的人IL-2序列還含有一處或多處氨基酸缺失，如在成熟的人IL-2蛋白1位N-末端丙氨酸(Ala)的缺失。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白保留了成熟的人IL-2序列125位的半胱氨酸殘基，但至少有一處其它的氨基酸取代，并且相對(duì)于成熟的人IL-2序列還含有一處或多處氨基酸缺失，如在成熟的人IL-2蛋白1位N-末端丙氨酸(Ala)的缺失。這些人IL-2突變蛋白可以是糖基化的或非糖基化的，取決于產(chǎn)生它們的宿主表達(dá)系統(tǒng)。上述具體的取代所產(chǎn)生的人IL-2突變體保留所需活性，即用上述NK-92細(xì)胞試驗(yàn)，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子降低同時(shí)保持或增強(qiáng)了NK細(xì)胞的增殖。鑒定人IL-2序列中導(dǎo)致產(chǎn)生毒性降低和/或NK細(xì)胞增殖增強(qiáng)的IL-2變體的位置和這些位置的相關(guān)取代，在本領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)，通過(guò)改變?nèi)薎L-2序列內(nèi)的其它殘基可獲得本文所述的也保留了這些所需活性的人IL-2突變蛋白變體。本文所述的這些人IL-2突變蛋白變體也屬于本發(fā)明，還包括以下定義的。
人IL-2先翻譯成SEQ ID NO2所示的前體多肽，其由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列編碼。該前體多肽包含SEQ ID NO2的殘基1-20為信號(hào)序列。術(shù)語(yǔ)“成熟的人IL-2”指SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO3所示核苷酸序列編碼。術(shù)語(yǔ)“C125S人IL-2突變蛋白”或“C125S人IL-2”指成熟的人IL-2突變蛋白，其保留了成熟的人IL-2的1位N-末端丙氨酸殘基和成熟的人IL-2序列125位為絲氨酸取代了半胱氨酸。C125S人IL-2突變蛋白具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列，其由SEQ ID NO5所示核苷酸序列編碼。術(shù)語(yǔ)“脫丙氨酰-1C125S人IL-2”和“脫丙氨酰-1絲氨酸-125人IL-2”指成熟的人IL-2突變蛋白，其在成熟的人IL-2序列125位為絲氨酸取代了半胱氨酸和缺失成熟的人IL-2序列1位(即SEQ ID NO4的1位)的N-末端絲氨酸。脫丙氨酰-1C125S人IL-2具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO7所示核苷酸序列編碼。大腸桿菌重組產(chǎn)生的的脫丙氨酰-1C125S人IL-2突變蛋白稱為“阿地白介素”，可從市場(chǎng)上購(gòu)買到的制劑商品名為Proleukin

IL-2(Chiron Coporation，Emeryville，California)。對(duì)于本發(fā)明的目的，脫丙氨酰-1C125S人IL-2和C125S人IL-2突變蛋白，是作為人IL-2突變蛋白參比來(lái)測(cè)定本發(fā)明的人IL-2突變蛋白顯示的理想活性。因此在類似的試驗(yàn)條件下，測(cè)定相對(duì)于同等量脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突蛋白或C125S人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子量，本發(fā)明合適的人IL-2突變蛋白的所需活性降低了IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子，特別是產(chǎn)生的TNF-α。與此相似，在類似的試驗(yàn)條件下，測(cè)定相對(duì)于同等量脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖的量，本發(fā)明合適的人IL-2突變蛋白的所需活性保持或提高了IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖。
提供的所述分離核酸所編碼的人IL-2突變蛋白的及其生物活性變體含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和至少一處其它的氨基酸取代，當(dāng)與二種參比IL-2突變蛋白相比時(shí)，它能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的促炎癥細(xì)胞因子同時(shí)保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖。也提供分離的本發(fā)明核酸分子編碼的多肽。
本發(fā)明的人IL-2突變蛋白包含SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344所示的突變蛋白，也稱為“雙數(shù)SEQ ID NO10-344序列”。本發(fā)明也提供編碼這些突變蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341和343分別所示的編碼序列。這些編碼序列本文也稱為“單數(shù)SEQ ID NO9-343序列”。這些上述氨基酸序列的突變蛋白包含C125S人IL-2氨基酸序列和一處下表1所示的其它取代。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白缺失了這些氨基酸序列1位的原始丙氨酸殘基，而包含脫丙氨酰-1，C125S人IL-2氨基酸序列和至少一處下表1所示的其它取代。這些突變蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示序列的殘基2-133。本發(fā)明也提供編碼這些突變蛋白的核苷酸序列，例如所述編碼序列為SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示序列的核苷酸4-399。
也提供本文所述本發(fā)明的人IL-2突變蛋白的生物學(xué)活性變體，包括其具有所需人IL-2突變蛋白功能的片段和截短形式。例如，可用本領(lǐng)域熟知的和本文上述的重組DNA技術(shù)，通過(guò)去除全長(zhǎng)人IL-2突變蛋白氨基酸序列中的氨基酸殘基而產(chǎn)生上述人IL-2突變蛋白的片段或截短形式。本發(fā)明的人IL-2突變蛋白的合適變體具有類似于該新型人IL-2突變蛋白本身所顯示的生物學(xué)活性，即用本文所述的生物試驗(yàn)與參比的IL-2分子，即脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比時(shí)，它們具有該新型人IL-2突變蛋白的低毒性(即低的或降低的促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生)以及能保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖。認(rèn)為本文鑒定的某給定的新型人IL-2突變蛋白的變體與本發(fā)明新型人IL-2突變蛋白觀察到的相比，可具有水平絕對(duì)不同的特定生物學(xué)活性，只要當(dāng)與參比的人IL-2突變蛋白相比時(shí)，它保留了所需的毒性減低等生物學(xué)活性，即誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生低水平的促炎癥細(xì)胞因子，和/或能增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖。
表1本發(fā)明的人IL-2突變蛋白例子，其含有C125S人IL-2(SEQ ID NO6)或脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)的氨基酸序列，和至少一處選自下表的其它取代。
本發(fā)明的組合物還包含用于重組產(chǎn)生本發(fā)明人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體的載體和宿主細(xì)胞。此外，也提供含有治療有效量的本文所述人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體及藥學(xué)上可接受運(yùn)載體的藥物組合物。
本發(fā)明包括與參比IL-2突變蛋白相比，能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平促炎癥產(chǎn)物和保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖的人IL-2突變蛋白的生產(chǎn)方法。這些方法包括用含有編碼本發(fā)明新型人IL-2突變蛋白或編碼其生物學(xué)活性變體的核酸分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，在允許所編碼多肽表達(dá)的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，和分離多肽產(chǎn)物。
也提供刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)或治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括給予動(dòng)物治療有效量的本發(fā)明人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體，其中用本文以下所述的生物試驗(yàn)測(cè)定，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，該IL-2突變蛋白或其變體誘導(dǎo)的NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平促炎癥細(xì)胞因子和能保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖。
對(duì)給予IL-2作為治療方案的病人，本發(fā)明也提供降低白介素2(IL-2)所導(dǎo)誘導(dǎo)的毒性癥狀的方法。該方法包括給予本發(fā)明的IL-2突變蛋白，即用本文以下所述的生物試驗(yàn)測(cè)定，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，該IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平促炎癥細(xì)胞因子和能保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖。術(shù)語(yǔ)“核酸分子”本文包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(如mRNA)，和用核苷酸同類物產(chǎn)生的DNA或RNA同類物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選雙鏈DNA。本發(fā)明包括分離的或基本上純化的核酸或蛋白質(zhì)組合物?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子或蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分應(yīng)基本上沒(méi)有該核酸分子或蛋白質(zhì)天然存在的環(huán)境中通常與其相伴或相互作用的組分。因此當(dāng)用重組方法產(chǎn)生時(shí)，分離的或純化的核酸分子或蛋白質(zhì)基本上沒(méi)有其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基成分，或當(dāng)用化學(xué)合成法產(chǎn)生時(shí)基本上沒(méi)有化學(xué)前體物或其它化學(xué)物質(zhì)?！胺蛛x的”核酸宜不含產(chǎn)生該核酸生物體基因組DNA中天然側(cè)接該核酸的序列(即位于該核酸5’和3’末端的序列)(優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在各種實(shí)施方式中，分離的核酸分子所含有的產(chǎn)生此核酸的細(xì)胞基因組DNA中天然側(cè)接此核酸的少于約5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。基本上無(wú)細(xì)胞物質(zhì)的蛋白質(zhì)包含的污染蛋白應(yīng)不到蛋白制品干重的大約30％、20％、10％、5％或1％。當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體通過(guò)重組產(chǎn)生時(shí)，其中培養(yǎng)基的化學(xué)前體成分或非蛋白質(zhì)感興趣化學(xué)成分宜低于約30％、20％、10％、5％或1％(干重)。
新型人IL-2突變蛋白的生物學(xué)活性與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白相比，或與C125S人IL-2突變蛋白相比，本發(fā)明的新型人IL-2突變蛋白具有提高的治療指數(shù)。前兩種突變蛋白在本文中稱為“參比IL-2突變蛋白”，因?yàn)樵谟妙愃频牡鞍诐舛群拖嗟仍囼?yàn)條件分類本發(fā)明的突變蛋白進(jìn)行給定的比較中，本發(fā)明的新型突變蛋白在生物學(xué)性能上比得上這兩種先前已特征鑒定過(guò)的突變蛋白。本發(fā)明突變蛋白治療指數(shù)的提高反映在與這兩種參比IL-2突變蛋白之一的毒性及NK和/或T細(xì)胞效應(yīng)器功能相比時(shí)，其毒性改善(即該突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的促炎癥細(xì)胞因子)及NK和/或T細(xì)胞效應(yīng)器功能提高而毒性不提高，或這些突變蛋白的毒性改善及NK和/或T細(xì)胞效應(yīng)器功能均提高。
利用以下三種功能終點(diǎn)來(lái)選擇治療指數(shù)提高的突變蛋白(1)與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125人IL-2相比，能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生降低促炎癥細(xì)胞因子的水平；(2)與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，能保持或增強(qiáng)IL-2誘導(dǎo)的NK和T細(xì)胞增殖但不提高NK細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子；和(3)與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，能保持或改善(即增強(qiáng))NK-介導(dǎo)的溶細(xì)胞殺傷。NK-介導(dǎo)的溶細(xì)胞殺傷包括NK介導(dǎo)的、淋巴因子活化殺傷細(xì)胞(LAK)-介導(dǎo)的、和抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)-介導(dǎo)的溶細(xì)胞殺傷。
上述新型人IL-2突變蛋白顯示的最大治療指數(shù)改進(jìn)屬于預(yù)計(jì)臨床療效改善的三種功能類型。應(yīng)注意所有這些突變蛋白都顯示能保持或增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖和NK介導(dǎo)的溶細(xì)胞活性。該突變蛋白的第一類功能特征在于，與參比IL-2突變蛋白，即脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，優(yōu)選的突變蛋白能使IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞降低促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)保持IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖。該突變蛋白的第二類功能是增強(qiáng)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比二參比IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的更強(qiáng)，但沒(méi)有二參比IL-2突變蛋白所誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生所致的不良作用。該突變蛋白的第三類功能包括該突變蛋白具有“雙功能”，即與這兩種參比IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的活性水平相比，能使IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生降低，同時(shí)增強(qiáng)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖。
測(cè)定新鮮分離NK細(xì)胞的IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖和促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。見(jiàn)例如，Perussia，Methods 9370，1996和Baume等，Eur.J.Immunol.221-6，1992。據(jù)先前報(bào)導(dǎo)NK-92細(xì)胞系具有NK細(xì)胞的表型和功能特性，包括存在IL-2時(shí)的增殖(Gong等，Leukemia平共處8652，1994)，然而在存在IL-2時(shí)極少或不產(chǎn)生TNF-α(Nagashima等，Blood 913850，1998)。已開發(fā)的篩選人NK和T細(xì)胞功能活性的IL-2生物試驗(yàn)在本文以下實(shí)施例章節(jié)中描述。雖然可采用其它試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)NK細(xì)胞增殖和促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生、及T細(xì)胞效應(yīng)功能，但優(yōu)選用本文所述的IL-2生物試驗(yàn)來(lái)篩選感興趣的IL-2突變蛋白以確定它們是否保留了本文所述突變蛋白的所需特征。特別感興趣的是它們能否降低NK細(xì)胞誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生。因此，在一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖和TNF-α因子產(chǎn)生可用本文以下描述的人NK-92細(xì)胞系(ATCC CRL-2407，CMCC ID#11925)的IL-2生物試驗(yàn)來(lái)測(cè)定。對(duì)于NK-92細(xì)胞系的描述見(jiàn)Gong等，Leukemia 8(4)652-658，1994。為了本發(fā)明的目的，此試驗(yàn)稱為“NK-92生物試驗(yàn)”。
“降低”或“減少”促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生指與參比的IL-2突變蛋白，即脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突變蛋白相比，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子的水平降低，特別是NK細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α降低。雖然在可比試驗(yàn)條件下，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白可使NK細(xì)胞產(chǎn)生最低水平的TNF-α比類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的至少低20％，但本發(fā)明突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的最高水平取決于該突變蛋白所屬的功能類型。
因此，例如在某些實(shí)施方式中，通常應(yīng)選擇能最大增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)而對(duì)IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α無(wú)不良作用(即突變蛋白的第二類功能)的突變蛋白。在這些實(shí)施方式中，當(dāng)測(cè)定用人NK-92細(xì)胞系(ATCC CRL-2407，CMCC ID#11925)(即用上述NK-92生物試驗(yàn))和0.1nM或100pM(即0.1nM)濃度的各種人IL-2突變蛋白產(chǎn)生的TNF-α?xí)r，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平與參比IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的相類似(即±10％)，或優(yōu)選低于參比IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的90％。在本發(fā)明其它實(shí)施方式中，在可比的試驗(yàn)條件下，當(dāng)測(cè)定用人NK-92細(xì)胞系(即用上述NK-92生物試驗(yàn))和0.1nM濃度的各種人IL-2突變蛋白所產(chǎn)生的TNF-α?xí)r，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α水平低于類似量脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所誘導(dǎo)的90％、優(yōu)選低于85％，甚至更優(yōu)選低于80％。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)測(cè)定用人NK-92細(xì)胞系(即用上述NK-92生物試驗(yàn))和0.1nM濃度的各種人IL-2突變蛋白所產(chǎn)生的TNF-α?xí)r，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的至少低20％至60％。與參比IL-2突變蛋白相比，能保持或增強(qiáng)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖的這種突變蛋白屬于第一類功能的IL-2突變蛋白。
“保持”指在可比試驗(yàn)條件下，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的所需生物學(xué)活性水平為類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所觀察到活性水平的至少70％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少85％和高至100％(等價(jià))。因此，當(dāng)所需活性是誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖時(shí)，當(dāng)在可比試驗(yàn)條件下用同樣的生物試驗(yàn)(即上述NK-92生物試驗(yàn)和類似量的這些IL-2突變蛋白)測(cè)定NK細(xì)胞增殖時(shí)，本發(fā)明的IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖水平為類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的增殖活性的至少70％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少85％、90％、95％更高包括100％(±5％)。
“增強(qiáng)”或“提高”或“改進(jìn)”指在可比試驗(yàn)條件下，人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的所需生物學(xué)活性水平比類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所觀察到的更高。因此，當(dāng)所需的生物學(xué)活性是誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖時(shí)采用同樣的NK細(xì)胞增殖試驗(yàn)(如上述NK-92生物試驗(yàn))，本發(fā)明合適的IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖水平，為類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的NK細(xì)胞增殖活性的至少105％、110％、115％，更優(yōu)選至少120％，甚至更優(yōu)選至少125％，最優(yōu)選至少130％、140％或150％。
測(cè)定NK細(xì)胞增殖的試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的(見(jiàn)例如，Baume等，Eur.J.Immuno.221-6，1992；Gong等，Leukemia 8(4)652-658，1994和上述NK-92生物試驗(yàn))。優(yōu)選采用NK-92細(xì)胞來(lái)檢測(cè)IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子，特別是TNF-α的產(chǎn)生和NK細(xì)胞的增殖(即上述NK-92生物試驗(yàn))。NK細(xì)胞增殖試驗(yàn)所用人IL-2突變蛋白的合適濃度包括約0.005nM(5pM)-1.0nM(1000pM)，包括0.005nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM和0.005nM-1.0nM之間的其它數(shù)值。在本文下述的優(yōu)選實(shí)施方式中，采用NK-92細(xì)胞和約0.1nM-1.0nM濃度的人IL-2突變蛋白進(jìn)行NK細(xì)胞增殖試驗(yàn)。
由于本發(fā)明的人IL-2突變蛋白能降低對(duì)促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的誘導(dǎo)，和保持或增強(qiáng)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖，它們的IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖，與IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的比率，優(yōu)于脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的，每種突變蛋白的這些活性測(cè)定采用同等的蛋白濃度和生物試驗(yàn)條件。當(dāng)所測(cè)定的促炎癥細(xì)胞因子是TNF-α?xí)r，在類似的生物試驗(yàn)條件和蛋白濃度下，合適的本發(fā)明人IL-2突變蛋白在0.1nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖，與在1.0nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的比率，至少是用脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所獲得的1.5倍，更優(yōu)選是用參比IL-2突變蛋白獲得的至少1.75倍、2.0倍、2.25倍、甚至更優(yōu)選至少2.75倍、3.0倍、3.25倍。在某些實(shí)施方式中，在類似的生物試驗(yàn)條件和蛋白濃度下，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白在0.1nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖，與在1.0nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的比率，至少是用脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所獲得的3.5倍，3.75倍、4.0倍、4.5倍、或甚至5.0倍。
在類似的生物試驗(yàn)條件和蛋白濃度下，相對(duì)于用脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所觀察到，發(fā)明的突變蛋白也能提高(即增加)NK細(xì)胞的存活。NK細(xì)胞的存活可用本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)，包括本文所述試驗(yàn)來(lái)測(cè)定。例如，在存在感興趣IL-2突變蛋白時(shí)NK細(xì)胞的存活可通過(guò)檢測(cè)IL-2突變蛋白能否阻斷糖皮質(zhì)類固醇的程序性細(xì)胞死亡和誘導(dǎo)NK細(xì)胞表達(dá)BCL-2來(lái)測(cè)定(見(jiàn)例如Armant等，Immunology85331，1995)。
本發(fā)明提供監(jiān)測(cè)IL-2對(duì)NK細(xì)胞存活影響的試驗(yàn)。在一實(shí)施方式中，用pAKTELISA檢測(cè)突變蛋白在NK3.3細(xì)胞(CMCC ID#12022，見(jiàn)Kornbluth，J.Immunol.129(6)2831-37，1982)中能否誘導(dǎo)細(xì)胞存活信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，來(lái)測(cè)定感興趣的人IL-2突變蛋白存在時(shí)NK細(xì)胞的存活。以此方式，利用感興趣的IL-2突變蛋白上調(diào)NK細(xì)胞中的AKT磷酸化作為NK細(xì)胞存活的指標(biāo)。
本發(fā)明方法中采用的IL-2突變蛋白將激活和/或擴(kuò)增自然殺傷(NK)細(xì)胞而介導(dǎo)淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(LAK)活性和抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)。靜止(未活化的)NK細(xì)胞可介導(dǎo)對(duì)某些稱為“NK-細(xì)胞敏感性靶標(biāo)”的靶細(xì)胞(如人紅白血病K562細(xì)胞系)的自發(fā)性或天然細(xì)胞毒。被IL-2激活后NK細(xì)胞獲得了LAK活性。例如，可檢測(cè)IL-2激活的NK細(xì)胞能否殺傷各種腫瘤細(xì)胞和其它“NK-不敏感”靶細(xì)胞，如Daudi B-細(xì)胞淋巴瘤系(其通常能抵抗靜止(即未激活的)NK細(xì)胞的溶解作用)，來(lái)測(cè)定這種LAK活性。類似地，在存在最適濃度的有關(guān)腫瘤細(xì)胞特異性抗體時(shí)，可通過(guò)檢測(cè)IL-2活化細(xì)胞能否溶解“LAK敏感/NK-不敏感的”靶細(xì)胞，如Daudi B-細(xì)胞淋巴瘤系，或靜止(即未活化的)NK細(xì)胞不易溶解的其它靶細(xì)胞來(lái)測(cè)定ADCC活性。產(chǎn)生和測(cè)定NK/LAK細(xì)胞和ADCC細(xì)胞毒活性的方法是本領(lǐng)域已知的。見(jiàn)例如《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法人類免疫研究》(Current Protocols in ImmunologyImmunologic Studies in Humans)，增刊17，第7.7，7.18和7.27單元(John Wiley & Son，Inc.1996)。在一實(shí)施方式中，采用具有外周血NK細(xì)胞表型和功能特征的NK3.3的細(xì)胞系來(lái)檢測(cè)本發(fā)明IL-2突變蛋白的ADCC活性。對(duì)于本發(fā)明的目的，此試驗(yàn)稱為“NK3.3細(xì)胞毒生物試驗(yàn)”。
在類似的生物試驗(yàn)條件和蛋白濃度下，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所觀察到的相比，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白也能保持或增強(qiáng)IL-2誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。在一實(shí)施方式中，利用人T細(xì)胞系Kit225(CMCC ID#11234；Hori等，Blood 70(4)1069-72，1987)與本文下述試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞增殖。
如上所述，本文鑒定的候選先導(dǎo)人IL-2突變蛋白(即具有最佳改進(jìn)的治療指數(shù)的那些新型突變蛋白)屬于三種功能類型。第一種功能類型包括在類似的生物試驗(yàn)條件和蛋白濃度1.0nM測(cè)定所有突變蛋白時(shí)，誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α水平較低、約為脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的60％或更低，并且與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比保持或增強(qiáng)了NK細(xì)胞增殖的那些突變蛋白。這些突變蛋白可進(jìn)一步分成二亞類(1)當(dāng)在類似的生物試驗(yàn)條件和約1.0nM蛋白濃度檢測(cè)這些突變蛋白時(shí)，與參比的人IL-2突變蛋白相比，能增強(qiáng)(即大于100％)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖，但在約0.1nM或更低濃度時(shí)與參比的人IL-2突變蛋白觀察到的相比，NK細(xì)胞增殖活性降低(即低于100％)的那些人IL-2突變蛋白；和(2)在類似的條件和蛋白濃度約1.0-0.05(即約50pM)下檢測(cè)這些突變蛋白時(shí)，與參比的人IL-2突變蛋白觀察到的相比，能提高(即大于100％)或保持(即至少約70-100％)IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖的那些人IL-2突變蛋白。在一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖和TNF-α產(chǎn)生用NK-92細(xì)胞(即用NK-92細(xì)胞生物試驗(yàn))檢測(cè)，其中NK細(xì)胞增殖用商品化購(gòu)得的MTT染料還原試劑盒(CellTiter 96

非放射性細(xì)胞增殖試驗(yàn)試劑盒，購(gòu)自Promega Corp Madison，Wisconsin)檢測(cè)，根據(jù)比色讀數(shù)計(jì)算出刺激指數(shù)；用商品化購(gòu)得的TNF-αELISA試劑盒(BioSource CytoscreenTM人TNF-αELISA試劑盒；Camarillo，California)定量TNF-α。屬于第一種功能類型的人IL-2突變蛋白，包括含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自F42E、V91D和L72N的至少一種其它取代的那些突變蛋白，其中的殘基位置(即42、91或72)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即相對(duì)于SEQ ID NO4)。除C125S取代外，人IL-2突變蛋白包含F(xiàn)42E或V91D取代，可包含或不包含人IL-2的1位N-末端丙氨酸，屬于突變蛋白第一種功能類型的亞類(1)。見(jiàn)下面的實(shí)施例8和表13。除C125S取代外，人IL-2突變蛋白包含L72N取代，可包含或不包含人IL-2的1位N-末端丙氨酸，屬于突變蛋白第一種功能類型的亞類(2)。見(jiàn)下面的實(shí)施例8和表14。
第二種功能類型的人IL-2突變蛋白包括能強(qiáng)烈增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖但對(duì)IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α無(wú)不良作用的那些突變蛋白。屬于此功能類型的突變蛋白要符合三個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)(1)在選自0.005nM(即5pM)、0.02nM(即20pM)、0.05nM(即50pM)、0.1nM(即或100pM)或1.0nM(即1000pM)的一種或多種濃度時(shí)人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖的水平大于脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所誘導(dǎo)的約200％；(2)當(dāng)在選自0.005nM(即5pM)、0.02nM(即20pM)、0.05nM(即50pM)、0.1nM(即或100pM)或1.0nM(即1000pM)的至少二種濃度檢測(cè)時(shí)人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖的水平大于脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所誘導(dǎo)的約150％；(3)當(dāng)在1.0nM(即1000pM)或0.1nM(即100pM)濃度突變蛋白檢測(cè)產(chǎn)生的TNF-α?xí)r，IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平與參比IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的相似(即±10％)，優(yōu)選低于90％。在一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖采用NK-92細(xì)胞(即用上述NK-92細(xì)胞生物試驗(yàn))檢測(cè)，其中IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α用ELISA檢測(cè)，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用上述MTT試驗(yàn)檢測(cè)。屬于該第二種功能類型的人IL-2突變蛋白包括含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自L36D和L40D的至少一種其它取代的那些突變蛋白，其中的殘基位置(即36或40)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4)。見(jiàn)以下實(shí)施例8和表15。
第三種功能類型的人IL-2突變蛋白包括具有“雙功能”的那些突變蛋白，與參比的IL-2突變蛋白相比，它們能誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖增強(qiáng)和降低NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。屬于該第三種功能類型的突變蛋制品應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)(1)當(dāng)用選自0.005nM(即5pM)、0.02nM(即20pM)、0.05nM(即50pM)、0.1nM(即或00pM)或1.0nM(即1000pM)的任何一種濃度突變蛋白檢測(cè)時(shí)，誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖水平是脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的至少約150％；(2)當(dāng)用約1.0nM濃度突變蛋白檢測(cè)時(shí)，誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平低于脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的約75％。在一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖采用NK-92細(xì)胞(即用上述NK-92細(xì)胞生物試驗(yàn))檢測(cè)，其中IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α用ELISA檢測(cè)，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用上述MTT試驗(yàn)檢測(cè)。屬于該第三種功能類型的人IL-2突變蛋白包括含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自L19D、F42R和E61R的至少一種其它取代的那些突變蛋白，其中的殘基位置(即19、42或61)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4)。見(jiàn)以下實(shí)施例8和表16。
本發(fā)明還提供符合其它選擇標(biāo)準(zhǔn)，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比具有改進(jìn)的治療指數(shù)的人IL-2突變蛋白。因此，例如，在另一實(shí)施方式中，當(dāng)突變蛋白濃度為1.0nM測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平低約100％，優(yōu)選低約95％或90％，更優(yōu)選低約85％，并且，當(dāng)突變蛋白濃度為1.0nM測(cè)定時(shí)，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖高約130％。一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用NK-92細(xì)胞(即采用這里所述的NK-92生物試驗(yàn))測(cè)定，其中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生采用ELISA測(cè)定，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖通過(guò)上文所述的MTT試驗(yàn)測(cè)定。具有這些功能標(biāo)準(zhǔn)的人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自H16D、L19D、L36D、L36P、L40D、L40G、P65L、P65Y、E67A、L72N、L80K、L94Y、E95D、E95G、Y107H和Y107R的至少一個(gè)其它取代，其中的殘基位置(即16、19、36、40、65、67、72、80、94、95和107)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQID NO4)。符合這些功能標(biāo)準(zhǔn)的突變蛋白在0.1nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖與1.0nM突變蛋白IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的比率，比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的至少高1.25倍，優(yōu)選高至少1.5倍、1.75倍或2.0倍，至多高約2.5-2.75倍。也見(jiàn)下面的實(shí)施例2和表3，其中列出了脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突變蛋白中其它合適的取代。
在另一實(shí)施方式中，當(dāng)突變蛋白濃度為1.0nM測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平低約100％，并且，當(dāng)突變蛋白濃度為0.1nM測(cè)定時(shí)，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖高約150％。一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用NK-92細(xì)胞(即采用這里所述的NK-92生物試驗(yàn))測(cè)定，其中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生采用ELISA測(cè)定，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖通過(guò)上文所述的MTT試驗(yàn)測(cè)定。具有這些功能標(biāo)準(zhǔn)的人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自L36G、L36H、L40G和P65F的至少一個(gè)其它取代，其中的殘基位置(即36、40和65)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4)。符合這些功能標(biāo)準(zhǔn)的突變蛋白在0.1nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖與在1.0nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的比率，比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的高至少1.5倍，優(yōu)選至少高2.0倍，和高達(dá)2.5倍。見(jiàn)下面的實(shí)施例2和表4。
當(dāng)以1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的其它人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平高，高約100％，并且，當(dāng)以1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖高約150％。一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用NK-92細(xì)胞(即采用這里所述的NK-92生物試驗(yàn))測(cè)定，其中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生采用ELISA測(cè)定，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖通過(guò)上文所述的MTT試驗(yàn)測(cè)定。具有這些功能標(biāo)準(zhǔn)的人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自L36R、K64G、K64L、P65E、P65G、P65T和P65V的至少一個(gè)其它取代，其中的殘基位置(即36、64和65)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4)。符合這些功能標(biāo)準(zhǔn)的突變蛋白在0.1nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖與1.0nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的比率，比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的至少高1.5倍，優(yōu)選至少高1.75倍，和高達(dá)2.0-2.5倍。見(jiàn)下面的實(shí)施例2和表4。
在其它實(shí)施方式中，當(dāng)以1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平低約90％，優(yōu)選低約80％，并且，當(dāng)以0.1nM和1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖是脫丙氨酰-1，C125S人IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖的至少95％，優(yōu)選至少105％，更優(yōu)選至少120％到約200％，或者，在0.1nM時(shí)，與C125S人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖相比，可保持(即至少70％，優(yōu)選至少75％、80％或85％，更優(yōu)選至少90％，至多約100％)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖。一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用NK-92細(xì)胞(即采用這里所述的NK-92生物試驗(yàn))測(cè)定，其中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生采用ELISA測(cè)定，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖通過(guò)上文所述的MTT試驗(yàn)測(cè)定。具有這些功能標(biāo)準(zhǔn)的人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自H16D、L19D、L36D、L36P、F42E、F42R、E61R、P65L、P65Y、E67A、L72N、L80V、R81K、N88D、V91D、L94Y、E95D、E95G、Y107H和Y107R的至少一個(gè)其它取代，其中的殘基位置(即16、19、36、42、61、65、67、72、80、81、88、91、94、95或107)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4)。屬于此類的其它合適的突變蛋白示于下面的表5。符合這些功能標(biāo)準(zhǔn)的突變蛋白在0.1nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖與1.0nM突變蛋白時(shí)IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的比率，比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的至少高1.25倍，優(yōu)選至少高1.5倍、1.75倍、2.0倍，和高達(dá)2.5-2.75倍。見(jiàn)下面的實(shí)施例3和表5。
在另一實(shí)施方式中，當(dāng)以1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平低約80％，優(yōu)選低約70％，并且，當(dāng)以1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖是脫丙氨酰-1，C125S人IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖的至少80％，優(yōu)選至少90％、95％、100％或105％，更優(yōu)選至少110％到約150％。一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用NK-92細(xì)胞(即采用這里所述的NK-92生物試驗(yàn))測(cè)定，其中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生采用ELISA測(cè)定，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖通過(guò)上文所述的MTT試驗(yàn)測(cè)定。具有這些功能標(biāo)準(zhǔn)的人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80Y、R81E、R81L、R81N、R81P、R81T、N88H和Q126I的至少一個(gè)其它取代或者選自E61M、E62T、E62Y、L80G、L80N、L80R、L80W、D84R、N88T、E95M、Y107L、Y107Q和Y107T的至少一個(gè)其它取代，其中的殘基位置(即61、62、78、79、80、81、84、88、95或107)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4)。見(jiàn)下面的實(shí)施例3和表6和7。
再在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的IL-2突變蛋白符合以下功能標(biāo)準(zhǔn)(1)當(dāng)以1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平低約100％，優(yōu)選低約95％、90％或85％，更優(yōu)選低約80％或低約75％；(2)當(dāng)以0.1nM和1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比保持(約100％)或提高了(約105％，至約120％)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖；和(3)NK-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性比C125S人IL-2突變蛋白觀察到的高約140％，至約160％，比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2觀察到的高約115％，至約130％。一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用NK-92細(xì)胞(即采用這里所述的NK-92生物試驗(yàn))測(cè)定，其中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生采用ELISA測(cè)定，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖通過(guò)上文所述的MTT試驗(yàn)測(cè)定；而NK-介導(dǎo)的對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒活性例如在這里所述的NK3.3細(xì)胞毒生物試驗(yàn)中用NK3.3細(xì)胞系測(cè)定。具有這些功能標(biāo)準(zhǔn)的人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自P34R、P34T、L36A、L36D、L36P、R38P、F42A和L80R的至少一個(gè)其它取代，其中的殘基位置(即34、36、38、42或80)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO4)。見(jiàn)下面的實(shí)施例4和表8。
在另一實(shí)施方式中，選擇能夠誘導(dǎo)較低水平促炎癥細(xì)胞因子的預(yù)計(jì)其毒性有所改進(jìn)以及增強(qiáng)的NK細(xì)胞增殖活性和增強(qiáng)的LAK介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性本發(fā)明的IL-2突變蛋白。這些突變蛋白符合以下功能標(biāo)準(zhǔn)(1)當(dāng)以1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α的水平比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α的水平低約100％，優(yōu)選低約95％、90％、85％或80％；(2)當(dāng)以0.1nM和1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比保持(約100％)或提高(約105％，至約140％)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖；和(3)LAK-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒活性高約105％，優(yōu)選高約110％、115％或120％，至約140％。一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用NK-92細(xì)胞(即采用這里所述的NK-92生物試驗(yàn))確定，其中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生采用ELISA測(cè)定，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖通過(guò)上文所述的MTT試驗(yàn)測(cè)定；而LAK-介導(dǎo)的對(duì)Daudi細(xì)胞的細(xì)胞毒活性用NK3.3細(xì)胞系和這里所述的NK3.3細(xì)胞毒生物試驗(yàn)測(cè)定。具有這些功能標(biāo)準(zhǔn)的人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自L36P、L36R、F42A、L80R和V91Q的至少一個(gè)其它取代，其中的殘基位置(即36、42、80或91)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4)。見(jiàn)下面的實(shí)施例5和表9。
在其它實(shí)施方式中，選擇具有改進(jìn)的毒性、增強(qiáng)的NK細(xì)胞增殖活性和增強(qiáng)的ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性的本發(fā)明的IL-2突變蛋白。這些突變蛋白符合以下功能標(biāo)準(zhǔn)(1)當(dāng)以1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α的水平比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α的水平低約100％，優(yōu)選低約95％、90％、85％或80％；(2)當(dāng)以0.1nM和1.0nM的濃度測(cè)定時(shí)，與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比維持(至少90％)或提高(約105％，至多約115％)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖；和(3)ADCC-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒活性高約105％，優(yōu)選約110％或115％，至約120％。一實(shí)施方式中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖用NK-92細(xì)胞(即采用這里所述的NK-92生物試驗(yàn))確定，其中，IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生采用ELISA測(cè)定，IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖通過(guò)上文所述的MTT試驗(yàn)測(cè)定；而ADCC介導(dǎo)的對(duì)Daudi細(xì)胞的細(xì)胞毒活性在抗體如

(利妥昔單抗；IDEC-C2B8；IDEC PhannaceuticalsCorp.，San Diego，California)存在時(shí)用NK3.3細(xì)胞系和這里所述的NK3.3細(xì)胞毒生物試驗(yàn)測(cè)定。具有這些功能標(biāo)準(zhǔn)的人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自D20E或E67A的至少一個(gè)其它取代，其中的殘基位置(即20或67)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4)。見(jiàn)下面的實(shí)施例6和表10。
在另一實(shí)施方式中，如通過(guò)采用NK3.3細(xì)胞的pAKT ELISA試驗(yàn)所測(cè)定的，相對(duì)參比IL-2突變蛋白觀察到的，IL-2突變蛋白能維持或增強(qiáng)NK細(xì)胞存活。具有這些功能標(biāo)準(zhǔn)的人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和選自L40D、L40G、L80K、R81K、L94Y和E95D的至少一個(gè)其它取代，其中的殘基位置(即40、80、81、94或95)對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4)。見(jiàn)下面的實(shí)施例7和表11，其中顯示了符合這些功能標(biāo)準(zhǔn)的其它合適的突變蛋白。
新型人IL-2突變蛋白的生物學(xué)活性變體本發(fā)明也提供上述新型人IL-2突變蛋白的生物學(xué)性能比參比IL-2分子性能提高的變體，即用本文所述生物試驗(yàn)，當(dāng)與參比的IL-2分子，即脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，能誘導(dǎo)NK細(xì)胞降低或減少促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，和能保持可或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性變體。如前所述，認(rèn)為與本發(fā)明的新型人IL-2突變蛋白觀察到的相比，本文鑒定的給定的新型人IL-2突變蛋白可具有絕對(duì)不同的特定生物活性，只要與參比人IL-2突變蛋白相比具有所需特性，即誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的毒性降低，和/或能增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖。
“變體”指基本上相似的序列。上述新型人IL-2突變蛋白可以是天然產(chǎn)生的(如IL-2基因座的等位基因變體)或重組產(chǎn)生的(如突變蛋白)核酸或氨基酸序列。多肽變體可以是上述新型人IL-2突變蛋白的片段，或它們與該新型人IL-2突變蛋白不同之處在于具有一處或多處其它的氨基酸取代或缺失或氨基酸插入，只要變體多肽保留了上述新型人IL-2突變蛋白中存在的感興趣特定氨基酸取代。因此，合適的多肽變體包括對(duì)應(yīng)于成熟的人IL-2序列(即SEQ ID NO4)125位含有C125S取代的那些多肽，本文鑒定了可使本發(fā)明的新型人IL-2突變蛋白治療指數(shù)改進(jìn)的第二處氨基酸取代(即上表1所示的取代，優(yōu)選下表12所示的取代)，和一處或多處其它的氨基酸取代或缺失或氨基酸插入。因此例如，如表1所示，當(dāng)新型人IL-2突變蛋白含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和至少一處選自表1所示基團(tuán)的其它取代，這些新型人IL-2突變蛋白的合適生物學(xué)活性變體也含有C125S取代以及表1所示那些突變代表的其它取代，但與各種新型人IL-2突變蛋白不同之處在于有一處或多處其它的取代、插入或缺失，只要當(dāng)與參比的IL-2分子相比，該變體多肽具有比參比IL-2分子(即參比的IL-2突變蛋白C125S人IL-2或脫丙氨酰-1，C125S人IL-2)毒性低、促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生減少、和/或NK細(xì)胞增殖增強(qiáng)的所需特性。
當(dāng)如下文所述測(cè)定序列相同性百分比時(shí)，這種變體的氨基酸序列與各新型人IL-2突變蛋白，例如SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的人IL-2突變蛋白的氨基酸序列至少有70％相同，通常至少75％、80％、85％、90％相同，優(yōu)選至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。在其它實(shí)施方式中，當(dāng)如下文所述測(cè)定序列相同性百分比時(shí)，該生物學(xué)活性變體的氨基酸序列與SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的殘基2-133所示氨基酸序列至少有70％相同，通常至少75％、80％、85％、90％相同，優(yōu)選至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白生物學(xué)活性變體含有其它天然氨基酸如丙氨酸的C125S取代，這不影響所需的人IL-2突變蛋白的功能特性。因此例如，這種變體在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白生物學(xué)活性變體含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的殘基2-133，和在這些序列的125位丙氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
發(fā)明的其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白生物學(xué)活性變體含有SEQ IDNO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的氨基酸序列，和這些序列的125位半胱氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白生物學(xué)活性變體含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的殘基2-133，和這些序列的125位半胱氨酸殘基取代了絲氨酸殘基。
核酸“變體”指編碼本發(fā)明的新型人IL-2突變蛋白的多聚核苷酸，但由于基因密碼子的簡(jiǎn)并性其核苷酸序列不同于上述新型突變蛋白的序列。天然氨基酸的密碼子是本領(lǐng)域熟知的，包括特定宿主生物用于表達(dá)重組蛋白最常用的那些密碼子。編碼上述IL-2突變蛋白的核苷酸序列包括本文附屬序列表中所示的那些序列，及由于基因密碼子簡(jiǎn)并性而不同于上述序列的核苷酸序列。
因此例如，當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有丙氨酸殘基(即A)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有T7A、K9A、Q11A、E15A、K32A、L36A、F42A、L66A、E67A、V91A或L94A取代時(shí)，編碼取代的丙氨酸殘基的核苷酸序列可選自丙氨酸的四種通用三聯(lián)密碼子，即GCA、GCC、GCG和GCT。類似地，當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有天冬氨酸(即D)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有T7D、K9D、H16D、L19D、K35D、L36D、R38D、L40D、K64D、P65D、N88D、V91D或E95D取代時(shí)，編碼取代的天冬氨酸殘基的核苷酸序列可選自天冬氨酸的兩種通用三聯(lián)密碼子，即GAC和GAT。當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有精氨酸(即R)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有T7R、K9R、Q11R、P34R、L36R、F42R、E61R、K64R、P65R、L80R、D84R或Y107R取代時(shí)，編碼取代的精氨酸殘基的核苷酸序列可選自精氨酸的四種通用三聯(lián)密碼子，即CGT、CGC、CGA和CGG。當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有亮氨酸(即L)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有K8L、I24L、K35L、K64L、P65L、R81L或Y107L取代時(shí)，編碼取代的亮氨酸殘基的核苷酸序列可選自亮氨酸的六種通用三聯(lián)密碼子，即TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG。
當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有絲氨酸(即S)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有K9S、P34S、L36S、R38S、L40S、P65S、F78S、H79S、T102S或T123S取代時(shí)，編碼取代的絲氨酸殘基的核苷酸序列可選自絲氨酸的兩種通用三聯(lián)密碼子，即AGT和AGC。類似地，當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有纈氨酸(即V)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有K9V、P34V、F42V、P65V、H79V、L80V、L94V、T102V或Q126V取代時(shí)，編碼取代的纈氨酸殘基的核苷酸序列可選自纈氨酸的四種通用三聯(lián)密碼子，即GTT、GTC、GTA和GTG。當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有賴氨酸(即K)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有T10K、L36K、F44K、E61K、P65K、L80K、R81K、E106K或Y107K取代時(shí)，編碼取代的賴氨酸殘基的核苷酸序列可選自賴氨酸的兩種通用三聯(lián)密碼子，即AAA和AAG。類似地，當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有天冬酰胺(即N)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有T10N、K35N、L36N、L38N、L40N、P65N、L72N、H79N、L80N、R81N或V91N取代時(shí)，編碼取代的天冬酰胺殘基的核苷酸序列可選自天冬酰胺的兩種通用三聯(lián)密碼子，即GAT和GAC。
當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有蘇氨酸(即T)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有Q11T、P34T、K35T、F42T、E62T、P65T、L72T、L80T、R81T、S87T、N88T、L94T或Y107T取代時(shí)，編碼取代的蘇氨酸殘基的核苷酸序列可選自蘇氨酸的四種通用三聯(lián)密碼子，即ACT、ACC和ACA、ACG。類似地，當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有谷氨酸(即E)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有H16E、L19E、D20E、N33E、P34E、L36E、T41E、F42E、K64E、P65E、L80E、R81E或V91E取代時(shí)，編碼取代的谷氨酸殘基的核苷酸序列可選自谷氨酸的兩種通用三聯(lián)密碼子，即GAA和GAG。當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有異亮氨酸(即I)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有K35I、L36I、M46I、P65I、L94I或Q126I取代時(shí)，編碼取代的異亮氨酸殘基的核苷酸序列可選自異亮氨酸的三種通用三聯(lián)密碼子，即ATT、ATC和ATA。類似地，當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有脯氨酸(即P)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有K35P、L36P、R38P、H79P或R81P取代時(shí)，編碼取代的脯氨酸殘基的核苷酸序列可選自脯氨酸的四種通用三聯(lián)密碼子，即CCT、CCC、CCA和CCG。
當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有谷氨酰胺(即Q)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有K35Q、K64Q、P65Q、H79Q、V91Q、Y107Q或N119Q取代時(shí)，編碼取代的谷氨酰胺殘基的核苷酸序列可選自谷氨酰胺的兩種通用三聯(lián)密碼子，即CAA和CAG。類似地，當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有苯丙氨酸(即F)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有L36F、P65F、L66F、H79F、L80F或V91F取代時(shí)，編碼取代的苯丙氨酸殘基的核苷酸序列可選自苯丙氨酸的兩種通用三聯(lián)密碼子，即TTT和TTC。當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有甘氨酸(即G)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有L36G、R38G、L40G、T41G、K64G、P65G、L72G、L80G、V91G、E95G、M104G或E116G取代，編碼取代的甘氨酸殘基的核苷酸序列可選自甘氨酸的四種通用三聯(lián)密碼子，即GGT、GGC、GGA和GGG。類似地，當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有組氨酸(即H)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有L36H、K43H、P65H、N88H或Y107H取代時(shí)，編碼取代的組氨酸殘基的核苷酸序列可選自組氨酸的兩種通用是四聯(lián)密碼子，即CAT和CAC。
當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有酪氨酸(即Y)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有L36Y、E62Y、P65Y、L80Y或L94Y取代時(shí)，編碼取代的酪氨酸殘基的核苷酸序列可選自酪氨酸的兩種通用三聯(lián)密碼子，即TAT和TAC。類似地，當(dāng)本發(fā)明的IL-2突變蛋白含有半胱氨酸(即C)取代時(shí)，例如在C125S或脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白中含有T123C取代時(shí)，編碼取代的半胱氨酸殘基的核苷酸序列可選自半胱氨酸的兩種通用三聯(lián)密碼子，即TGT和TGC。
雖然上述核酸變體名單已描述了可用來(lái)編碼本文所鑒定的特定殘基取代的通用密碼子，但應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明包括編碼本文所述人IL-2突變蛋白的由于基因密碼子簡(jiǎn)并性而致的所有核酸變體。
天然的人IL-2的自然產(chǎn)生的等位基因變體可用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)，加入突變時(shí)可用作指南將其加入到本文所人IL-2突變蛋白中而不影響這些新型人IL-2突變蛋白所需的治療指數(shù)。變體核苷酸序列也包括衍生自合成的核苷酸的突變蛋白，例如，如下所述，通過(guò)定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的編碼上述新型人IL-2的突變蛋白。
通常，當(dāng)如下文所述測(cè)定序列相同性百分比時(shí)，本發(fā)明的核苷酸序列變體與它們各自的新型人IL-2突變蛋白的核苷酸序列，例如SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示的新型人IL-2突變蛋白編碼序列至少有70％相同，通常至少75％、80％、85％、90％相同，優(yōu)選至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。在其它實(shí)施方式中，當(dāng)如下文所述測(cè)定序列相同性百分比時(shí)，本發(fā)明的核苷酸序列變體與SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示的編碼序列的核苷酸4-399有至少70％，通常有至少75％、80％、85％、90％序列相同，優(yōu)選至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同。
術(shù)語(yǔ)“基因”和“重組基因”本文用于指含有編碼本發(fā)明IL-2突變蛋白開放讀框的核酸分子。短語(yǔ)“等位基因變體”指位于IL-2基因座的核苷酸序列或指該核苷酸序列編碼的多肽。這種天然等位基因變體通?？蓪?dǎo)致IL-2基因的核苷酸序列發(fā)生1-5％變異。任何和所有的核苷酸變體和所產(chǎn)生的IL-2序列的氨基酸多態(tài)性或變體是天然等位基因變異所至，不會(huì)改變本發(fā)明新型人IL-2突變蛋白的功能活性，包括按本發(fā)明突變產(chǎn)生的序列，所有這些產(chǎn)生的序列均屬于本發(fā)明的范圍。
例如，可在編碼新型IL-2突變蛋白的克隆DNA序列中制造突變來(lái)制備上述新型人IL-2突變蛋白的氨基酸序列變體，只要這些突變不改變表1鑒定的其它取代。誘變和改變核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域熟知的，見(jiàn)例如，Walker和Gaasta編，(1983)《分子生物學(xué)技術(shù)》Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，NewYork)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-92；Kunkel等，(1987)MethodsEnzymol.154267-82；Sambrook等(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)、美國(guó)專利4,873,192和本文引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響IL-2突變蛋白的所需生物學(xué)活性(即降低NK細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子、預(yù)計(jì)會(huì)減少毒性和保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖)的適當(dāng)氨基酸取代指南可在Dayhoff等，《多肽序列和結(jié)構(gòu)圖集》Atlas ofPolypeptide Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D C)的模型中找到。
當(dāng)設(shè)計(jì)上述人IL-2突變蛋白的生物學(xué)活性變體時(shí)，優(yōu)選保守性取代，如一個(gè)氨基酸用另一個(gè)具有相似性能的氨基酸取代?！氨Ｊ匦园被崛〈笔前被釟埢镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代。該領(lǐng)域已確定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸家族。這些家族包括含堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、無(wú)電荷極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。見(jiàn)例如，Bowie等，Science 2471306，1990。保守性取代的例子包括但不限于

和

對(duì)保守的半胱氨酸殘基，如氨基末端毗連的半胱氨酸殘基不宜進(jìn)行這種取代。
關(guān)于人IL-2蛋白中可通過(guò)取代、缺失或插入本文鑒定的所需取代而改變的區(qū)域是本領(lǐng)域知道的。見(jiàn)例如，Bazan，Science 257410-12，1992；McKay，Science 257412；Theze等，Immunol.Today 17481-86，1996；Buchli和Ciardelli，Biochem.Biophys307411-15，1993；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.857709-13，1988；Kunkel等，J.Immunol.1505731，1993；Eckenberg等，Cytokine 9488-98，1997。
在構(gòu)建本發(fā)明新型人IL-2突變蛋白變體時(shí)，將對(duì)編碼該變體的核苷酸序列進(jìn)行修飾，使變體多肽可繼續(xù)擁有所需活性。顯然，在編碼變體多肽的DNA中進(jìn)行的任何突變必須不將該序列置于讀框外、優(yōu)選不會(huì)產(chǎn)生可能導(dǎo)致二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。多肽變體可有少至1-15個(gè)氨基酸的不同，如6-10個(gè)、少至5個(gè)，少至4、3、2個(gè)，甚至1個(gè)氨基酸殘基不同。核苷酸序列變體可有少至1-30個(gè)核苷酸不同，如6-25個(gè)，少至5個(gè)，少至4、3、2個(gè)，甚至1個(gè)核苷酸不同。
本發(fā)明人IL-2突變蛋白的生物學(xué)活性變體包括這些突變蛋白的片段?！捌巍敝妇幋a核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分。就編碼序列而言，人IL-2突變蛋白核苷酸序列的片段可編碼保留了新型人IL-2突變蛋白所需生物學(xué)活性的突變蛋白片段。上述新型人IL-2突變蛋白的片段可以長(zhǎng)15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130個(gè)氨基酸或長(zhǎng)達(dá)該新型人IL-2多肽的全長(zhǎng)。編碼核苷酸序列的片段可以至少是45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、195、210、225、240、255、270、285、300、315、330、345、360、375、390個(gè)核苷酸，和長(zhǎng)達(dá)編碼該新型人IL-2突變蛋白的整個(gè)核苷酸序列。
可進(jìn)一步修飾上述人IL-2突變蛋白及其生物學(xué)活性變體，只要它們與C125S人IL-2突變蛋白或脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白相比具有所需特性，即毒性降低和/或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖。其它修飾包括但不限于磷酸化、非天然氨基酸同類物的取代等?？蓪?dǎo)致其體內(nèi)表達(dá)延長(zhǎng)，因此提高了IL-2突變蛋白藥物制劑效力的IL-2突變蛋白的修飾包括蛋白分子的糖基化或PEG化。天然是非糖基化的蛋白質(zhì)的糖基化常通過(guò)在分子中插入N-連接的糖基位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行?？捎眠@種方法來(lái)延長(zhǎng)蛋白質(zhì)如IL-2突變蛋白的半壽期。此外，可用此方法掩蓋免疫原性表位，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、減少凝聚和提高表達(dá)和純度產(chǎn)量。
一旦獲得上述人IL-2突變蛋白的變體，預(yù)計(jì)該人IL-2突變蛋白序列中的缺失、插入和取代不會(huì)使具體的人IL-2突變蛋白的特性產(chǎn)生根本改變。然而當(dāng)預(yù)先這樣做難以預(yù)計(jì)這種取代、缺失或插入的確切影響時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可用常規(guī)篩選試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)這種作用。即用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞增殖試驗(yàn)，包括上述試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞或T細(xì)胞增殖活性?？捎眉?xì)胞因子特異性ELISA，例如上述TNF-α特異性ELISA，來(lái)檢測(cè)IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子。NK細(xì)胞存活信號(hào)可用pAKT ELISA檢測(cè)(見(jiàn)例如，以下描述的試驗(yàn))。NK細(xì)胞介導(dǎo)的溶細(xì)胞活性(即細(xì)胞毒)可用本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)檢測(cè)(例如，本文所述的NK-介導(dǎo)的、LAK介導(dǎo)的、或ADCC介導(dǎo)的溶細(xì)胞活性)。
可將上述人IL-2突變蛋白及其生物學(xué)活性變體構(gòu)建成含有IL-2突變蛋白(或上述生物學(xué)活性變體)的融合或偶聯(lián)蛋白，其含IL-2突變蛋白融合于第二蛋白或共價(jià)偶聯(lián)于聚脯氨酸或水溶性聚合物以減少給藥次數(shù)或進(jìn)一步提高IL-2的耐受性能。例如，可用本領(lǐng)域已知方法將人IL-2突變蛋白(或其上述生物學(xué)活性變體)融合于人白蛋白或白蛋白片段(見(jiàn)例如WO 01/79258)?；蛘撸刹捎帽绢I(lǐng)域已知方法，將人IL-2突變蛋白(或其上述生物學(xué)活性變體)共價(jià)偶聯(lián)于聚脯氨酸或聚乙二醇均聚物和聚氧乙烯化的多元醇，其中所述均聚物一端可用烷基和多元醇不取代或取代。(見(jiàn)例如美國(guó)專利4,766,106；5,206,344和4,894,226)。
“序列相同性”指當(dāng)排列對(duì)比變體的核苷酸序列或氨基酸序列的特定連續(xù)區(qū)段，與參比序列的核苷酸序列或氨基酸序列時(shí)，變體序列和參比序列中所找到的相同核苷酸或氨基酸殘基。序列排列對(duì)比和測(cè)定序列之間相同性的方法是本本領(lǐng)域熟知的。見(jiàn)例如，Ausubel等編著，(1995)《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocol inMolecular Biology)，第9章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff，1978，見(jiàn)《多肽序列和結(jié)構(gòu)圖集5》增刊3(National BiomedicalResearch Foundation，Washington，D.C)。對(duì)于二條核苷酸序列的最佳排列對(duì)比，該變體核苷酸序列的連續(xù)區(qū)段與參比核苷酸序列相比時(shí)，可以加入一些核苷酸或缺失一些核苷酸。同樣，為了最佳排列對(duì)比二條氨基酸序列，將該變體氨基酸序列的毗連區(qū)段與參比氨基酸序列相比，可以加入一些氨基酸殘基或缺失一些氨基酸殘基。用于與參比核苷酸序列或參比氨基酸序列作比較的毗連區(qū)段應(yīng)含至少20個(gè)毗連核苷酸或氨基酸殘基，可以是30、40、50、100個(gè)或更多的核苷酸或氨基酸殘基。為提高序列相同性可在該變體核苷酸序列或氨基酸序列中加入空格，這可通過(guò)設(shè)置空格罰分來(lái)糾正。序列排列對(duì)比的方法是本領(lǐng)域熟知的。
可用數(shù)學(xué)算法來(lái)進(jìn)行二序列之間相同性百分比的測(cè)定。對(duì)于本發(fā)明的目的，采用Smith-Waterman的同源檢索算法測(cè)定氨基酸序列的序列相同性百分比，采用仿射6空格檢索，空格罰分12，空格延伸罰分2，BLOSUM矩陣62。Smith-Waterman的同源檢索算法在Smith-Waterman(1981)Adv.Appl.Math 2482-89中講解?；蛘?，用Smith-Waterman的同源檢索算法，采用空格罰分25，空格延伸罰分5，測(cè)定核苷酸序列的同源性百分比。因此，可用例如Time Logic的DeCyoher Hardware Accelerator進(jìn)行序列相同性的測(cè)定。
進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到當(dāng)考慮氨基酸相同性百分比時(shí)，某些氨基酸可能因保守性氨基酸取代(不會(huì)影響多核苷酸功能特性)而不同。此時(shí)，可考慮保守性取代的氨基酸類似性來(lái)校正序列相同性百分比。這種校正方法是本領(lǐng)域熟知的。見(jiàn)例如，Meyers等，ComputerApplic.Biol.Sci.411-17，1988。
重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞通常，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白用載體，優(yōu)選表達(dá)載體表達(dá)。可將用于在宿主細(xì)胞中自身復(fù)制的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而整合入宿主細(xì)胞基因組中(如非游離體哺乳動(dòng)物載體)。表達(dá)載體能指導(dǎo)與其操作性相連的編碼序列表達(dá)。通常重組DNA技術(shù)中用的表達(dá)載體為質(zhì)粒(載體)形式。然而，本發(fā)明包括其它類型的表達(dá)載體，如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物或載體含編碼本發(fā)明人IL-2突變蛋白的核酸分子，其形式適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸分子。感興趣的編碼序列可通過(guò)下述重組DNA技術(shù)，如Taniguchi等，Nature 302305-310，1983和Devos，Nucleic Acids Research 114307-4323或采用Wang等，Science 2241431-1433，1984所述的突變改變的IL-2來(lái)制備。認(rèn)識(shí)到單數(shù)SEQ ID NOS9-343所示編碼序列開始于成熟的人IL-2序列SEQID NO4第一個(gè)殘基的密碼子(即1位丙氨酸密碼子)，而不是甲硫氨酸密碼子，其通常是信使RNA中的翻譯起始密碼子ATG。這些公開的核苷酸序列也缺乏單數(shù)SEQ IDNOS9-343的399位核苷酸之后的翻譯終止密碼子。當(dāng)采用這些序列或含單數(shù)SEQID NOS9-343的4-399位核苷酸序列來(lái)表達(dá)本發(fā)明人IL-2突變蛋白時(shí)，應(yīng)知道含這些人IL-2突變蛋白編碼序列的表達(dá)構(gòu)建物還應(yīng)在上游和含人IL-2突變蛋白編碼序列的正確讀框內(nèi)包含一個(gè)翻譯起始密碼子，如ATG密碼子。翻譯起始密碼子可在人IL-2突變蛋白編碼序列起始密碼子的上游位置提供，所用的翻譯起始密碼子如ATG可能已存在于包含人IL-2突變蛋白編碼序列的序列中，或可由外源，如用于表達(dá)的質(zhì)粒提供，只要翻譯起始密碼子在含人IL-2突變蛋白編碼序列起始密碼子的正確讀框中位于人IL-2突變蛋白編碼序列的起始密碼子之前。類似地，上述人IL-2突變蛋白編碼序列之后為一個(gè)或多個(gè)翻譯終止密碼子，如TGA，使人IL-2突變蛋白產(chǎn)物末端為雙數(shù)SEQ ID NOS10-344所示序列的最后一個(gè)氨基酸。
該重組表達(dá)載體可含有根據(jù)用于表達(dá)的宿主細(xì)胞所選擇的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列操作性連接于被表達(dá)的核酸序列?！安僮餍韵噙B”指感興趣的核苷酸序列(即編碼本發(fā)明人IL-2突變蛋白的序列)連接于所述調(diào)節(jié)序列，其方式能使該核苷酸序列(如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)該載體被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中)表達(dá)。“調(diào)控序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(如聚腺苷酸信號(hào))。見(jiàn)例如，Goeddel(1990)，《基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法》(Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology)185(Academic Press，San Diego，California)。調(diào)控序列包括能在許多類型宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成性表達(dá)和只在某種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的那些序列(如組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道表達(dá)載體的設(shè)計(jì)取決于許多因素，如所選擇的待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、蛋白質(zhì)表達(dá)的所需水平等。可將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞中來(lái)產(chǎn)生上述人IL-2突變蛋白，或產(chǎn)生其生物學(xué)活性變體。
可將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物或載體設(shè)計(jì)成用于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)人IL-2突變蛋白或其變體。最常用含組成型或可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的載體在原核大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。在大腸桿菌中最大程度表達(dá)重組蛋白質(zhì)的方法可參見(jiàn)例如，Gottesman(1990)，《基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法》185(Academic Press，San Diego，CA)119-128頁(yè)和Wada等，Nucleic Acid Res 202111-18，1992。培養(yǎng)、收集、破裂或從細(xì)胞提取人IL-2突變蛋白或其變體的方法基本描述可見(jiàn)，例如美國(guó)專利4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,798；4,748,234和4,931,543。
重組人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體也可在真核細(xì)胞，如酵母菌或人細(xì)胞中制備。合適的真核宿主細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞(例子為可利用桿狀病毒載體在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，如sf9細(xì)胞，包括pAc系列(Smith等，Mol.Cell.Biol.32156-65，1983)和pVL系列(Lucklow和Summers，Virology 17031-39，1989)中表達(dá)蛋白質(zhì))；酵母細(xì)胞(釀酒酵母菌中表達(dá)載體的例子包括pYepSec1(Baldari等，EMBO J.6229-234，1987)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，Cell 30933-43，1982)，pJRY88(Schultz，Gene 54113-123，1987)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)，和pPicZ(Invitrogen Corporation，San Diego，CA))；或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括pCDM8(Seed，Nature 329840，1987)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J.6187-195，1987))。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國(guó)侖鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，常通過(guò)病毒調(diào)控元件提供表達(dá)載體的控制功能。例如，常用的啟動(dòng)子得自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和仙臺(tái)病毒40。真核和原核細(xì)胞的其它合適表達(dá)系統(tǒng)可參見(jiàn)Sambrook等(1989)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)的16和17章，見(jiàn)Goeddel(1990)，《基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法》185(AcademicPress，San Diego，California)。
可優(yōu)化在感興趣宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的人IL-2突變蛋白的編碼序列。對(duì)某給定細(xì)胞宿主，可參考在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因經(jīng)計(jì)算將該序列中的G-C含量調(diào)節(jié)至平均水平。密碼子優(yōu)化方法是本領(lǐng)域熟知的?？蓛?yōu)化個(gè)別密碼子，例如已進(jìn)行的密碼子殘基取代，如C125S取代、C125A取代、和/或表1所示的其它取代的密碼子?；蛘?，可優(yōu)化人IL-2突變蛋白編碼序列中的其它密碼子以提高宿主細(xì)胞表達(dá)，如已為在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)優(yōu)化了該序列中的1％、5％、10％、25％、50％、75％或高達(dá)100％密碼子。見(jiàn)例如，SEQ ID NO345和346公開的人IL-2突變蛋白序列。其中為在大腸桿菌中表達(dá)，已分別優(yōu)化了E61R和Y107R取代的密碼子。
術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”在本文中可互換使用。應(yīng)理解此術(shù)語(yǔ)不僅指具體的對(duì)象細(xì)胞而且指這些細(xì)胞的子代或可能的子代細(xì)胞。因?yàn)橥蛔兓颦h(huán)境影響其后代可能發(fā)生某些變化。這些子代實(shí)際上與親代細(xì)胞不相同，但這仍屬于此術(shù)語(yǔ)的范疇。
可用常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”本文用于指各種將外源核酸(如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的本領(lǐng)域已知技術(shù)，包括磷酸鈣-氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、顆粒槍或電穿孔。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的合適方法可見(jiàn)Sambrook等(1989)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)和其它標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。
在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于產(chǎn)生本發(fā)明IL-2突變蛋白和其生物學(xué)活性變體的原核和真核細(xì)胞一般可見(jiàn)Sambrook等(l989)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中的描述。
藥物組合物產(chǎn)生和純化人IL-2突變蛋白或其變體后，可將它們摻入到用于人和獸醫(yī)治療，如癌癥治療或預(yù)防、免疫治療和傳染病治療或預(yù)防的藥物組合物中。因此，可將人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體配制成藥物組合物用于各種治療。作為組合物，人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體用該領(lǐng)域已知方法經(jīng)胃腸道外給予對(duì)象。所述對(duì)象包括哺乳動(dòng)物如；靈長(zhǎng)動(dòng)物、人、狗、牛、馬等。這些藥物組合物可含有能提高本發(fā)明人IL-2突變蛋白藥效或提高所需質(zhì)量的其它化合物。該藥物組合物通過(guò)所選途徑給藥時(shí)必須安全，它們必須滅菌、保留生物活性、它們必須能穩(wěn)定地溶解人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體。取決于制備工藝，本發(fā)明的IL-2突變蛋白藥物組合物可以液體形式，在大氣環(huán)境、冷藏、或冷凍、或干燥制劑形式，如凍干粉末保存，給藥前可重建為液體溶液、懸浮液或乳液，再以各種方法之一，包括口服或胃腸道外給藥途徑給予。
這種藥物組合物通常含有至少一種人IL-2突變蛋白、其生物學(xué)活性變體、或其組合，和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。配制用于給藥的本發(fā)明人IL-2突變蛋白的方法是該領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。見(jiàn)例如，Gennaro(編)(1995)《雷明頓藥物科學(xué)與實(shí)踐》(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)(第19版，Mack PublishingCompany，Easton，PA)。
語(yǔ)句“藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體”本文用于指包括與給藥相容的任何和所有的溶劑、分散劑、包衣劑、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等?？捎糜谒帉W(xué)活性物質(zhì)的這種媒介和制劑是該領(lǐng)域熟知的。除了迄今已知與該活性化合物不相容的任何常規(guī)媒介和制劑外，這類介質(zhì)均可用于本發(fā)明的人IL-2突變蛋白藥物制劑中。也可在該組合物中加入添加的活性化合物。
可將含有本發(fā)明人IL-2突變蛋白的IL-2突變蛋白藥物組合物配制成與其給藥途徑相容。根據(jù)所需結(jié)果給藥途徑可以不同。可用藥團(tuán)劑型、連續(xù)輸注或恒量輸注(短時(shí)，如1-6小時(shí)輸注)給予人IL-2突變蛋白藥物組合物。可經(jīng)口服、鼻內(nèi)、胃腸道外包括靜脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)等，皮內(nèi)、透皮(局部)、透粘膜和直腸給藥，或肺吸入給予人IL-2突變蛋白藥物組合物。
胃腸道外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可包含以下成分滅菌稀釋液如注射用水、鹽水、非揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如芐醇或甲基對(duì)羥基苯甲酸酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸鈉；螯合劑如EDTA；表面活性劑如聚山梨酯80；SDS；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和調(diào)節(jié)張力的制劑如氯化鈉或葡聚糖?？捎盟峄驂A，如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。胃腸道外制品可封裝在玻璃或塑料制的安瓿、一次性針筒或多劑小瓶中。
適合注射用的藥物組合物包括滅菌水溶液(水溶性)或分散液，和可即刻制備成滅菌可注射溶液或懸浮液的滅菌粉末。制備過(guò)程中應(yīng)盡量減少蛋白質(zhì)凝聚物的形成，靜脈內(nèi)給藥的合適運(yùn)載體包括生理鹽水、抑菌水、Cemophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物必須滅菌，應(yīng)是易裝在注射器中的液體。應(yīng)在操作和貯存條件下穩(wěn)定，必須防腐以防止微生物，如細(xì)菌和霉菌的污染作用。運(yùn)載體可以是溶劑或分散劑，包括例如，水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如，可采用包衣劑如卵磷酯，通過(guò)維持所需的顆粒大小(分散液時(shí)采用表面活性劑)來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？捎酶鞣N抗菌劑和抗真菌劑，如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來(lái)預(yù)防微生物的作用。許多情況下此組合物中宜包含等滲劑，如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。可在此組合物中包含能延遲吸收的制劑，如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長(zhǎng)吸收。
如需要，可在合適的溶劑中摻入所需量的一種活性化合物或與上述成分的組合，然后過(guò)濾除菌，來(lái)制備無(wú)菌注射溶液。通常在含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需上述其它成分的無(wú)菌運(yùn)載體中加入活性化合物來(lái)制備分散液。就制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，產(chǎn)生活性成分的粉末加上先已無(wú)菌過(guò)濾溶液的其它所需成分。
口服組合物通常包含惰性稀釋劑或可食用運(yùn)載體。它們可封裝在明膠膠囊中或壓成片劑。為口服給藥，可通過(guò)已知方法，將藥物制成腸溶形式避免被胃內(nèi)消化或進(jìn)一步包衣或混合以在消化道特定部位釋放。對(duì)于口服治療給藥，可在活性化合物中加入賦形劑和采用片劑、錠劑或膠囊。也可用液體運(yùn)載體制備口服組合物，用作漱口水。其中化合物隨液體運(yùn)載體口服吸入、咳出或吞入?？砂ㄋ帉W(xué)上相容的粘合劑，和/或輔佐物質(zhì)作為組合物的一部分。藥片、藥丸、膠囊、錠劑等可含有以下成分或性質(zhì)相似的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃原膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬酯酸鎂或氫化植物油(Sterote)；潤(rùn)滑劑如膠質(zhì)二氧化硅；增甜劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙子香精。
也可通過(guò)透粘膜或透皮方式全身給藥。為了透粘膜或透皮給藥、可在制劑中采用適合透過(guò)屏障的滲透劑。這種滲透劑通常是本領(lǐng)域知道的，包括例如，透粘膜給藥的洗滌劑、膽酸鹽和羧鏈孢酸衍生物。
在一實(shí)施方式中，用能保護(hù)該化合物抵抗被機(jī)體快速消除的運(yùn)載體來(lái)制備該活性化合物，如控釋制劑，包括植入和微膠囊包裹的運(yùn)送系統(tǒng)。可采用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法是該領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。也可從Alza Corporation和NovaPharmaceutical，Inc.購(gòu)買到這些物質(zhì)。也可采用脂質(zhì)體懸浮液(包括用抗病毒抗原的單克降抗體靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)作為藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。這些可按該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如美國(guó)專利4,522,811中所述來(lái)制備。
特別優(yōu)選配制易于給藥和劑量均一的口服或胃腸道外單位劑型的組合物。單位劑型本文用于指物理上分開的適合治療對(duì)象的不連續(xù)劑量；各單位含有與所需藥物運(yùn)載體會(huì)混合的預(yù)定量經(jīng)計(jì)算能產(chǎn)生所需治療效果的活性化合物。說(shuō)明書說(shuō)明了本發(fā)明的單位劑型直接取決于該活性化合物的獨(dú)特性能和可達(dá)到的特定治療效果，和本專業(yè)對(duì)這種活性化合物治療個(gè)體的固有限制。
本發(fā)明的人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體，可用本領(lǐng)域已知的人IL-2配制方法配制。當(dāng)前方法中采用的合適制劑可見(jiàn)各種專利和出版物，例如美國(guó)專利4,604，377中所述，它們顯示的優(yōu)選IL-2制劑含有治療量的IL-2，但基本上沒(méi)有非IL-2蛋白和內(nèi)毒素，生理學(xué)上可接受水溶性運(yùn)載體和溶解IL-2的足夠量表面活性劑，如十二烷基磺酸鈉?？砂衅渌煞钟?，例如糖。美國(guó)專利4,766,106顯示了含有聚乙二醇(PEG)修飾的IL-2制劑。歐洲專利申請(qǐng)出版物No.268,110顯示含有選自聚乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(Tween-80)、聚乙二醇單硬酯酸酯和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物(Triton X405)等各種非離子表面活性劑的IL-2制劑。美國(guó)專利4,992,271公開了含人血清白蛋白的IL-2制劑。美國(guó)專利5,078,997公開了含人血清白蛋白和氨基酸的IL-2制劑。美國(guó)專利6,525,102公開了含氨基酸基質(zhì)作為該多肽主要穩(wěn)定劑的IL-2制劑，和酸性和/或其鹽形式以將溶液緩沖在可接受的pH范圍來(lái)穩(wěn)定該多肽。待批美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/408,648公開了適合肺輸送的IL-2制劑。
治療用途含有獲自這些人IL-2突變蛋白的本發(fā)明人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體的藥物制劑可用于刺激免疫系統(tǒng)，治療癌癥，如目前用天然IL-2或Proleukin

IL-2治療的癌癥。本發(fā)明的人IL-2突變蛋白和其合適的生物學(xué)活性變體優(yōu)點(diǎn)是能降低促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，預(yù)計(jì)毒性較低，同時(shí)能保持或增強(qiáng)所需的功能活性，如NK細(xì)胞增殖、存活、NK-細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(NK、LAK和ADCC)和T細(xì)胞增殖。
由于預(yù)計(jì)毒性較低，在那些需要高劑量IL-2的臨床病癥中，可給予與天然IL-2或

IL-2相似或更高劑量的本發(fā)明人IL-2突變蛋白和其生物學(xué)活性變體而最大程度降低的毒性作用。因此，本發(fā)明為IL-2給藥作為治療方案對(duì)象提供了減少白介素-2(IL-2)誘導(dǎo)的毒性癥狀的方法，該方法包括給予上述IL-2突變蛋白作為IL-2。而且，本發(fā)明的人IL-2突變蛋白和其合適的生物學(xué)活性變體具有治療效果更好的其它優(yōu)點(diǎn)，因此較低劑量的這些人IL-2突變蛋白可提供比天然IL-2或Proleukin

IL-2更好的治療效果。
給予對(duì)象藥學(xué)上有效量的本發(fā)明IL-2突變蛋白藥物組合物?！八帉W(xué)上有效量”指可用于治療、預(yù)防或診斷某疾病或病癥的量。“對(duì)象”指哺乳動(dòng)物，如靈長(zhǎng)動(dòng)物、人、狗、貓、牛、馬、豬、綿羊等。用本發(fā)明藥物制劑治療的對(duì)象優(yōu)選人。
為治療目的給藥時(shí)，給藥可以是預(yù)防性或治療性給藥。當(dāng)預(yù)防性提供時(shí)，在出現(xiàn)癥狀前提供藥物。預(yù)防性給藥的作用是預(yù)防或減輕后續(xù)癥狀。當(dāng)治療性提供時(shí)，在癥狀發(fā)作時(shí)(或短時(shí)后)提供藥物。治療性給予藥物作用是減輕現(xiàn)有癥狀。
因此例如，含有本發(fā)明人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體的有效量藥物組合物的制劑可用于治療、預(yù)防和診斷許多對(duì)IL-2治療有臨床反應(yīng)的疾病?？膳渲票景l(fā)明人IL-2突變蛋白和其生物學(xué)活性變體用于治療與天然序列的IL-2或Proleukin

IL-2所治療的相同疾病。因此，含有本發(fā)明人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體的制劑可用于診斷、預(yù)防和治療(局部或全身)細(xì)菌、病毒、寄生蟲、原蟲和霉菌感染；增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用；刺激淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞活性；介導(dǎo)淋巴細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)；促進(jìn)同種異體抗原反應(yīng)；促進(jìn)放療后、化療后或與其它抗癌藥物聯(lián)合治療后，或骨髓或自身干細(xì)胞移植后(功相結(jié)合)癌癥病人的免疫重建；促進(jìn)獲得性免疫缺陷狀態(tài)的免疫功能恢復(fù)；重建老人和老齡動(dòng)物的正常免疫功能；開發(fā)診斷試驗(yàn)如利用酶擴(kuò)增、放射標(biāo)記、放射顯象和本領(lǐng)域已知的監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)時(shí)IL-2水平的其它方法；促進(jìn)用于治療和診斷目的的T細(xì)胞體外生長(zhǎng)；阻斷淋巴因子的受體位點(diǎn)；和各種其它治療性、診斷性和研究應(yīng)用。已調(diào)查了人IL-2或其變體如人IL-2突變蛋白的各種治療和診斷應(yīng)用，見(jiàn)Rosenberg等，N.Engl.J.Med.316889-97，1987；Rosemberg，Ann.Surg.208121-135，1988；Topalian，J.Clin.Oncol.6839-53，1988；Rosenberg等，N.Engl.J.Med.3191676-80，1988；W eber等，J.Clin.Oncol.1033-40，1992；Grimm等，Cell.Immunol.70(2)248-59，1982；Mazumder，Cancer J.Sci.Am.3(增刊1)S37-42，1997；Mazumder和Rosenberg，J.Exp.Med.159(2)495-507，1984；和Mazumder等，Cancer Immunol.Immuther.15(1)1-10，1983。含有本發(fā)明人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體的制劑可用作單一的治療活性藥物，或可與其它免疫學(xué)相關(guān)細(xì)胞或其它治療藥物聯(lián)用。相關(guān)細(xì)胞的例子有B或T細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞等，可用于與IL-2或其變體聯(lián)用的示范性治療藥物是各種干擾素，特別是γ-干擾素、B-細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-1和抗體，包括但不限于抗HER2抗體，如

(Trastuzumab；Genentech，Inc.，South San Francisco，California)或抗-CD20抗體，如

(利妥昔單抗；IDEC-C2B8；Biogen IDEC Pharmaceutical Corp.，San Diego California)。
給予人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體的劑量范圍可在0.1-15mIU/m2之間。IL-2免疫治療與抗癌癥單克降抗體聯(lián)用的治療有效量和具體治療方案是本領(lǐng)域知道的。參見(jiàn)，例如，題為“非何杰金氏淋巴瘤的治療方法(Methods of Therapy forNon-Hodgkin’s Lymphoma)”的待批美國(guó)專利申請(qǐng)第2003-0185796號(hào)和題為“過(guò)度表達(dá)HER2受體蛋白為特征的癌癥IL-2/抗-HER2抗體聯(lián)合治療(CombinationIL-2/Anti-HER2 Antibody Therapy for Cancers Characterized by Overexpression of theHER2 Receptor Protein)”的待批美國(guó)專利20030235556，和題為“慢性淋巴細(xì)胞白血病的治療方法”的待批美國(guó)專利申請(qǐng)No.60/491,371，2003年7月31日提交的代理人備忘錄No.59516-278。對(duì)于疾病如腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，可給予人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體300,000-800,000IU/kg/8小時(shí)作高劑量靜脈藥團(tuán)注射。見(jiàn)上述美國(guó)專利申請(qǐng)中B-細(xì)胞淋巴瘤、HER2+癌癥、乳腺癌和CLL的IL-2免疫治療推薦劑量。
采用IL-2免疫療法來(lái)治療HIV感染也是本領(lǐng)域知道的。見(jiàn)例如，美國(guó)專利No.6,579,521中此臨床疾病推薦的劑量和治療方案。
因此，本發(fā)明提供治療對(duì)象的癌癥或調(diào)節(jié)對(duì)象免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予本發(fā)明治療有效量的IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體。“治療有效量”指足以誘導(dǎo)所需生物學(xué)結(jié)果但不誘導(dǎo)不可接受毒性作用的劑量水平。給予的量根據(jù)該藥物組合物中人IL-2突變蛋白或其生物學(xué)活性變體的濃度、需要的活性、被治療哺乳動(dòng)物的疾病狀況、劑型、給藥方法、給藥頻率和病人因素如年齡、性別和疾病嚴(yán)重性而不同。認(rèn)為可提供廣泛范圍濃度的治療有效量，如需要可給予對(duì)象多次治療有效量來(lái)減輕和/或緩解癥狀、體癥或所述疾病的病因，或進(jìn)行生物系統(tǒng)的其它所需改變。通常，本發(fā)明的IL-2突變蛋白藥物組合物含有人IL-2突變蛋白或其變體的濃度范圍高于

IL-2所用的范圍。由于劑量比

IL-2高，應(yīng)密切監(jiān)視對(duì)象以確定有無(wú)毒性副作用出現(xiàn)。這類臨床實(shí)驗(yàn)分析是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如已用于確定

IL-2免疫調(diào)節(jié)和癌癥治療當(dāng)前所用的劑量。
監(jiān)測(cè)人IL-2突變蛋白功能活性的生物試驗(yàn) 本發(fā)明也提供監(jiān)測(cè)IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖和產(chǎn)生TNF-α、IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒、IL-2誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖、和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞存活的新型生物試驗(yàn)方法。已開發(fā)了這些試驗(yàn)方法來(lái)篩選候選IL-2突變蛋白的所需功能特性，如減少促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生(特別是TNF-α和/或TNF-γ)改善耐受性、和促進(jìn)NK細(xì)胞介導(dǎo)的功能，如反映于該突變蛋白能保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞增殖、保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(NK、LAK和ADCC)及保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞的存活。
這些試驗(yàn)先前在本文中也稱為“NK-92生物試驗(yàn)”，用于監(jiān)測(cè)IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖。此生物試驗(yàn)采用人NK-92細(xì)胞系(ATCCCRL-2407，CMCC ID#11925)。NK-92細(xì)胞系最初由Gong等，leukemia 8(4)652-58，1994報(bào)導(dǎo)，顯示具有活化NK細(xì)胞的表型和功能特性。NK-92的增殖是IL-2依賴的，如果在缺乏IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)細(xì)胞將死亡。該細(xì)胞系在接觸IL-2后48-72小時(shí)之內(nèi)也產(chǎn)生可檢測(cè)水平的TNF-α。
按照本發(fā)明的方法，可用此NK-92細(xì)胞生物試驗(yàn)篩檢IL-2突變蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α和誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖的相對(duì)能力。在此方法中，將NK-92細(xì)胞培養(yǎng)在由α-MEM、12％熱滅活胎牛血清(FBS)、8％熱滅活馬血清、0.02mM葉酸、0.2mM肌醇、2mM1-谷氨酰胺和0.1mMβ-巰基乙醇組成的完全培養(yǎng)基(NK-92培養(yǎng)基)中。以最低密度1-3 x 105細(xì)胞/毫升接種培養(yǎng)物，添加1000IU/ml的參比重組人IL-2突變蛋白(例如稱為脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或參比的C125S人IL-2突變蛋白)。準(zhǔn)備此試驗(yàn)，將細(xì)胞置于新鮮的NK-92培養(yǎng)基中至少48小時(shí)然后用于試驗(yàn)。試驗(yàn)前一天，洗滌NK-92細(xì)胞三次，置于NK-92培養(yǎng)基中24小時(shí)不加IL-2。離心細(xì)胞，懸浮在NK-92培養(yǎng)基中(無(wú)IL-2)，以4 x 104細(xì)胞/孔密度，將NK-92培養(yǎng)基稀釋的200微升含不同濃度參比IL-2突變蛋白，如脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2；或不同濃度的待篩選感興趣功能特性的候選IL-2突變蛋白，接種在96孔平底板中。37℃，5％CO2培養(yǎng)72小時(shí)后，取100微升等量培養(yǎng)上清液凍存，隨后用商品化購(gòu)得的TNF-αELISA試劑盒(例如BioSource CytoscreenTM人TNF-αELISA試劑盒；Camarillo，california)定量檢測(cè)TNF-α。對(duì)于培養(yǎng)中存活的細(xì)胞，用商品化購(gòu)得的MTT染料試劑盒(CellTiter96

非放射細(xì)胞增殖試驗(yàn)試劑盒(Promega Corp.，madison，Wisconsin)測(cè)定增殖，和根據(jù)比色讀數(shù)計(jì)算刺激指數(shù)。
上述第二種IL-2生物試驗(yàn)提供了篩選IL-2候選突變蛋白能否誘導(dǎo)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒方法。此生物試驗(yàn)稱為“NK-92細(xì)胞毒生物試驗(yàn)”，采用了人NK3.3細(xì)胞系。NK3.3細(xì)胞系顯示具有外周血NK細(xì)胞的表型和功能特性(Kornbluth，J Immunol129(6)2831-37，1982)，可通過(guò)Fc受體(CD16 FcγRIIIA)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒(ADCC)。以下實(shí)驗(yàn)章節(jié)的表2小結(jié)了用此種IL-2生物試驗(yàn)檢測(cè)NK3.3細(xì)胞的生物學(xué)活性。
按照本發(fā)明的方法，可用NK3.3細(xì)胞毒生物試驗(yàn)篩選具有細(xì)胞毒活性的候選IL-2突變蛋白。在此方法中，擴(kuò)增NK3.3細(xì)胞并維持在添加有15％熱滅活胎牛血清、25mMhepes\2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作為IL-2來(lái)源的RPMI-1640培養(yǎng)基中。準(zhǔn)備此試驗(yàn)，在無(wú)IL-2(“饑餓”)時(shí)培養(yǎng)NK3.3細(xì)胞24小時(shí)。此試驗(yàn)包括在U形底96-孔板中接種5 x 104個(gè)“饑餓的”NK3.3細(xì)胞，使其接觸不同濃度的參比IL-2突變蛋白，如脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白，或不同濃度的感興趣候選IL-2突變蛋白，總體積200微升。培養(yǎng)18小時(shí)后將IL-2激活的NK3.3效應(yīng)細(xì)胞與5 x 103個(gè)鈣黃綠素(calcein)AM-標(biāo)記的靶細(xì)胞(K562或Daudi)或抗體包被的鈣黃綠素AM-標(biāo)記的靶細(xì)胞(包被有最終濃度2μg/ml的利妥昔單抗的Daudi細(xì)胞)共培育，得到最終的效-靶比10:1。效應(yīng)-靶細(xì)胞共培育4小時(shí)后，簡(jiǎn)單離心96孔板；取100微升培養(yǎng)上清液置于黑色透明平底96孔板中用熒光計(jì)定量測(cè)定鈣黃綠素AM的釋放。測(cè)定的量表示為特異性溶解百分比，用以下公式計(jì)算％特異性溶解＝100×[(實(shí)驗(yàn)孔平均值-自發(fā)釋放平均值)/(最大釋放平均值-自發(fā)釋放平均值)]；測(cè)定含有標(biāo)記的靶細(xì)胞但無(wú)效應(yīng)細(xì)胞孔的自發(fā)釋放，和測(cè)定含有標(biāo)記的酸細(xì)胞和1％Triton X-100孔的最大釋放。
上述第三種IL-2生物試驗(yàn)提供了篩選IL-2候選突變蛋白誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖能力的方法。在此方法中，T-細(xì)胞增殖IL-2生物試驗(yàn)采用人T-細(xì)胞系Kit225(CMCC ID#11234)，其衍生自一慢性T-淋巴細(xì)胞白血病病人(Hori等，Blood 70(4)1069-72)。Kit225細(xì)胞能組成性表達(dá)IL-2受體復(fù)合物的α、β、γ亞單位。Kit225增殖是IL-2依賴的，如果培養(yǎng)中長(zhǎng)期缺乏IL-2細(xì)胞將死亡。
按照本發(fā)明，該試驗(yàn)包括在無(wú)IL-2時(shí)培養(yǎng)Kit225細(xì)胞24小時(shí)，然后接種入特定數(shù)目的細(xì)胞和不同濃度的參比IL-2突變蛋白，如脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白，或不同濃度的感興趣候選IL-2突變蛋白，培育48小時(shí)后，用標(biāo)準(zhǔn)的商品化購(gòu)得的MTT染料還原試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖，根據(jù)比色讀數(shù)計(jì)算刺激指數(shù)。
本發(fā)明的第四種生物試驗(yàn)提供了篩選IL-2候選突變蛋白促進(jìn)NK細(xì)胞存活能力的方法。在此方法中，篩選突變蛋白誘導(dǎo)NK細(xì)胞存活信號(hào)的能力。Proleukin

IL-2(即含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白的制劑)能誘導(dǎo)事先經(jīng)IL-2饑餓的NK3.3細(xì)胞中AKT的磷酸化，認(rèn)為這是“存活信號(hào)”。按照此生物試驗(yàn)，擴(kuò)增NK3.3細(xì)胞并維持在添加有15％熱滅活胎牛血清、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作為IL-2來(lái)源的RPMI-1640培養(yǎng)基中。準(zhǔn)備此試驗(yàn)，在無(wú)IL-2(“饑餓”)時(shí)培養(yǎng)NK3.3細(xì)胞24小時(shí)。作為細(xì)胞存活信號(hào)的指標(biāo)，通過(guò)加入2nM參比IL-2突變蛋白，如脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白，或2nM感興趣候選IL-2突變蛋白，剌激“饑餓的”NK3.3細(xì)胞(2 x 106)30分鐘。用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞二次。用50微升含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞抽提緩沖液溶解細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)行一輪凍熔。4℃，13000rpm離心提取物10分鐘。將1:10稀釋的澄清溶解液等份加入AKT[pS473]*免疫試驗(yàn)試劑盒(BioSource Internatioal)的孔中。按操作程序，用定量ELISA檢測(cè)磷酸化AKT的水平。
本發(fā)明也提供用人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)篩選IL-2突變蛋白功能特性的生物試驗(yàn)。這些試驗(yàn)之一是聯(lián)合的增殖/促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生生物試驗(yàn)。當(dāng)接觸IL-2時(shí)，人PBMC增殖和以劑量依賴方式分泌細(xì)胞因子。設(shè)計(jì)此種聯(lián)合試驗(yàn)來(lái)評(píng)估用參比IL-2突變蛋白(如脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白或C125S突變蛋白)，或感興趣的候選IL-2突變蛋白刺激72小時(shí)后增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生水平。用密度梯度離心分離法(如用ACDA Vacutainer CPT試管)分離一名或多名正常供體的PBMC。在96孔組織培養(yǎng)處理平板的完全RPMI培養(yǎng)基(RPMI，10％熱滅活人AB血清、25mM HEPES、2mM谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素/兩性霉素)中，與不同濃度(0.039nM-10nM)的IL-2，或作為陰性對(duì)照無(wú)IL-2，37℃，7％CO2，培養(yǎng)每孔200000個(gè)細(xì)胞。培育66小時(shí)后取等量細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍存，隨后檢測(cè)細(xì)胞因子。用1μCi3H-胸苷脈沖細(xì)胞6小時(shí)，然后收集細(xì)胞測(cè)定核苷酸摻入水平(如用Wallac Trilux microbeta平板讀數(shù)儀)，作為細(xì)胞增殖的衡量。可用商品購(gòu)得的ELISA試劑盒(如購(gòu)自BioSource International)按廠商指南檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α水平。對(duì)不同供體，如6、8或10位供體的完全小組反復(fù)進(jìn)行此試驗(yàn)，可提供“正常人群”對(duì)IL-2的代表性增殖和細(xì)胞因子應(yīng)答反應(yīng)的特征。然后可如表1所示分析數(shù)據(jù)，這將在以下實(shí)施例10中進(jìn)一步描述。
可利用第二種PBMC生物試驗(yàn)來(lái)篩選IL-2候選突變蛋白介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞毒的能力。此試驗(yàn)中，用密度梯度離心分離全血的人PBMC。在存在10nM IL-2對(duì)照或感興趣IL-2突變蛋白下刺激PBMC3天產(chǎn)生LAK活性，如本領(lǐng)域目前通常所實(shí)施的那樣(見(jiàn)例如，《人NK細(xì)胞的分離和LAK活性的產(chǎn)生》(Isolation of Human K Cells andGeneration of LAK activity)，選自《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current protocol inImmunology)；1996 John Wiley & Son，Inc.)。所得細(xì)胞群含有“效應(yīng)”細(xì)胞，可分類為NK或LAK，其可分別殺傷K562和Daudi腫瘤靶細(xì)胞。這些效應(yīng)細(xì)胞也能介導(dǎo)ADCC，因效應(yīng)細(xì)胞能識(shí)別結(jié)合于Daudi靶細(xì)胞的特異性抗體的Fc部分。一實(shí)施方式中，能結(jié)合Daudi靶細(xì)胞的抗體是

(利妥昔單抗)。
按照本發(fā)明的方法，將已用感興趣的候選IL-2突變蛋白激活的人PBMC(效應(yīng)細(xì)胞)與鈣黃綠素AM-標(biāo)記的靶細(xì)胞以不同的效靶比(E:T比例)共培養(yǎng)4小時(shí)。檢測(cè)培養(yǎng)上清液中相對(duì)于鈣黃綠素AM的細(xì)胞毒量。所測(cè)得的量根據(jù)自發(fā)釋放和最大釋放對(duì)照量，表示為各E:T比例時(shí)的特異性溶解百分比。該生物試驗(yàn)可檢測(cè)以下生物學(xué)活性自然/自發(fā)性細(xì)胞毒(NK)，其中靶細(xì)胞是K562細(xì)胞；淋巴因子活化的殺傷(LAK)，其中靶細(xì)胞是Daudi細(xì)胞；和抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)，其中靶細(xì)胞是抗體包被的Daudi細(xì)胞(如

包被的Daudi細(xì)胞)。
獲得熒光儀測(cè)得的數(shù)據(jù)，表示為相對(duì)熒光(強(qiáng)度)單位(rfu)。此生物試驗(yàn)的對(duì)照包括只有標(biāo)記的靶細(xì)胞(最小)和作為100％溶解衡量的標(biāo)記靶細(xì)胞與最終濃度1％Triton X-100(最大)。用以下公式計(jì)算衡量此試驗(yàn)有效性(如>30％試驗(yàn)無(wú)效)的最小與最大比值的百分率
一旦該試驗(yàn)證實(shí)有效，計(jì)算出一式三份樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，然后用以下公式從一式三份樣品的平均值計(jì)算出特異性溶解百分比
數(shù)據(jù)報(bào)告為特異性溶解百分比；此外，可用候選IL-2突變蛋白相對(duì)于IL-2參比對(duì)照(如脫丙氨酰-1，C125S突變蛋白或C125S突變蛋白)的比值來(lái)確定在供體的混合人PBMC群中細(xì)胞毒活性是否保持于IL-2參比對(duì)照的水平。
可利用上述試驗(yàn)來(lái)篩選IL-2候選突變蛋白庫(kù)中具有所需功能特性者，其中感興趣的功能活性包括以下一種或多種IL-2誘導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生(特別是TNF-α和/或INF-γ)、IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞增殖、IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(NK、LAK和ADCC)和IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞存活。
給予以下實(shí)施例是為了闡述而非限制。
實(shí)施例 IL-2的治療應(yīng)用受到與其給藥相關(guān)毒性的阻礙，包括發(fā)熱、寒戰(zhàn)、低血壓和血管滲漏綜合征。具有改進(jìn)的耐受性和IL-2介導(dǎo)的NK和T細(xì)胞效應(yīng)功能的IL-2突變蛋白允許給予相似的能更好耐受的治療劑量或較高劑量，因此提高了此蛋白更佳療效的潛力。本研究的整體策略是選擇新型人IL-2突變蛋白，利用一組全面的專門化產(chǎn)量適度的人NK-細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫試驗(yàn)篩選系統(tǒng)顯示其具有以下功能特性能降低促炎癥細(xì)胞因子(特別是TNF-α)的產(chǎn)生，因而改善了耐受性，和促進(jìn)NK細(xì)胞介導(dǎo)的功能，反映在該蛋白能保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞的增殖、保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(NK、LAK和ADCC)和保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞的存活。
為了鑒定具有所需治療特性的合適的IL-2突變蛋白，將候選的重組人IL-2突變蛋白的生物學(xué)活性與稱為參比IL-2突變蛋白的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(在以下實(shí)施例中用其縮寫“Pro”)和C125S人IL-2(在以下實(shí)施例中用其縮寫“Ala-Pro”)顯示的這些生物學(xué)活性相比較。阿地白介素是大腸桿菌產(chǎn)生的重組脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白，投放市場(chǎng)的制品商標(biāo)名為

IL-2(Chiron Corporation，Emeryville，California)。

IL-2是一種專門的凍干制劑，為該突變蛋白的非糖基化形式，用大腸桿菌生產(chǎn)，在下述生物試驗(yàn)中使用時(shí)以蒸餾水重建。
在某些實(shí)施方式中，使用了以商品名

IL-2(Chiron)銷售的阿地白介素的單體制劑，它是含有與

IL-2相同人IL-2突變蛋白(阿地白介素)的液體制劑，但制備前的最終純化步驟不同。參見(jiàn)美國(guó)專利No.4,931,543和美國(guó)專利No.6,525,102。用于最初篩選實(shí)驗(yàn)的C125S人IL-2是用AME哺乳動(dòng)物系統(tǒng)制造的，并用專利AME緩沖液配制。
下述的人IL-2突變蛋白在宿主哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞中表達(dá)。其中參比IL-2突變蛋白是C125S人IL-2，宿主細(xì)胞用含C125S突變的操作性連接有Pro-1啟動(dòng)子的天然人IL-2編碼序列的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化。在脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(即SEQ ID NO7)的編碼序列上融合了含人IL-2的真正IL-2信號(hào)序列和N-末端丙氨酸密碼子(即SEQID NO1的核苷酸1-63)的編碼序列。該蛋白質(zhì)在293T細(xì)胞哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)為GSHis-加尾蛋白，用NI-NTA珠純化。
實(shí)施例1 初步篩選人IL-2突變蛋白利用密碼子誘變技術(shù)平臺(tái)(Applied Molecular Evolution，Inc.，San Diego，California)構(gòu)建了含有C125人IL-2分子(本實(shí)施例稱為“Ala-Pro”)2508個(gè)所有可能的單個(gè)氨基酸突變的變體庫(kù)。商品購(gòu)得的

IL-2產(chǎn)品中所用的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白與Ala-Pro不同在于C125S人IL-2突變蛋白中保留了天然產(chǎn)生的人IL-2序列1位N-末端Ala殘基。在重組生產(chǎn)Ala-Pro突變蛋白時(shí)采用了AME哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)DirectAMETM和ExpressAMETM(Applied MolecularEvolution，Inc.，San Diego，California)。
初步篩選用人NK-92細(xì)胞系功能性免疫試驗(yàn)進(jìn)行，用人NK3.3細(xì)胞系測(cè)試了促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α)的產(chǎn)生、NK細(xì)胞增殖和NK溶細(xì)胞殺傷(NK、LAK和ADCC)及細(xì)胞存活(pAKT)。選擇的初步功能終點(diǎn)包括(1)與Ala-Pro IL-2(即C125S人IL-2突變蛋白)或

IL-2(即脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白)觀察到的相比，減少了NK-92細(xì)胞系的促炎癥TNF-α產(chǎn)生；(2)與這二種參比IL-2突變蛋白觀察到的相比，保持或增強(qiáng)了人NK-92細(xì)胞系的增殖；和(3)與這二種參比IL-2突變蛋白觀察到的相比，保持或增強(qiáng)了人NK3.3細(xì)胞系介導(dǎo)的NK、LAK和ADCC-介導(dǎo)的溶細(xì)胞殺傷。第二種功能終點(diǎn)是，在NK3.3細(xì)胞系中，與這種參比IL-2突變蛋白相比，保持或增強(qiáng)了對(duì)磷酸化AKT(pAKT)的誘導(dǎo)，和與Ala-Pro IL-2(即C125S人IL-2突變蛋白)或

IL-2(即脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白)觀察到的相比，保持或增強(qiáng)了人Kit225 T細(xì)胞系的T細(xì)胞增殖。
在人C125S IL-2分子所有2,508種可能的單個(gè)氨基酸突變蛋白變體中鑒定的168種進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)上面的表1)。用這種方法鑒定到三類非常需要求的具有改進(jìn)功能特征的IL-2突變蛋白。與脫丙氨酰-1，C125S(即

IL-2中存在的)或C125S(即Ala-Pro)人IL-2突變蛋白相比，所有選出的IL-2突變蛋白保持了NK溶細(xì)胞功能(NK/LAK/ADCC)。
預(yù)計(jì)第一類突變蛋白具有改進(jìn)的耐受性，通過(guò)與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白或C125S人IL-2突變蛋白觀察到的相比，其誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α減少可以證實(shí)。這類突變蛋白可分成兩種(1)在濃度為50pM-1000pM時(shí)誘導(dǎo)低TNF-α產(chǎn)生并維持NK細(xì)胞增殖，包括含有L72N取代的脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白；和(2)僅在高濃度(1nM)時(shí)誘導(dǎo)低TNF-α產(chǎn)生并維持增殖，包括含有V91D或F42E取代的脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白。見(jiàn)下面的實(shí)施例8和表13和14。
第二類突變蛋白包括那些與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白(即

IL-2中的)或C125S人IL-2突變蛋白(這里稱為Ala-Pro IL-2)觀察到的相比，具有增強(qiáng)NK細(xì)胞功能、尤其是NK細(xì)胞增殖的突變蛋白。鑒定屬于此功能類型的突變蛋白包括含有L36D和L40D取代的脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白。見(jiàn)下面的實(shí)施例8和表15。
第三類突變蛋白包括“雙功能”突變蛋白，更加與

IL-2中存在的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白或C125S人IL-2突變蛋白(文中稱為Ala-Pro IL-2)觀察到的相比，第三類突變蛋白誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生減少同時(shí)增強(qiáng)NK增殖，因此預(yù)計(jì)其具有改進(jìn)的耐受性。這些“雙功能”突變蛋白顯示出大于1.5的改進(jìn)的NK增殖TNF-α產(chǎn)生比例。鑒定屬于此功能類型的突變蛋白包括含有L19D、F42R或E61R取代的脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白。見(jiàn)下面的實(shí)施例8和表16。
下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述了將主要候選物鑒定分成這三種功能類別的篩選方法。篩選方法采用以下方案。
NK細(xì)胞的增殖/TNF-α產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞增殖和TNF-α產(chǎn)生的IL-2生物試驗(yàn)采用人NK-92細(xì)胞系(ATCC CRL-2407，CMCC ID#11925)。最初由Gong等，Leukemia 8(4)652-658，1994報(bào)導(dǎo)的NK-92細(xì)胞系顯示了活化NK細(xì)胞的表型和功能特性。NK-92的增殖是IL-2依賴的；如果在沒(méi)有IL-2時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)死亡。接觸IL-2后48-72小時(shí)內(nèi)，該細(xì)胞系也產(chǎn)生可檢測(cè)水平的TNF-α。
將NK-92細(xì)胞培養(yǎng)在含α-MEM、12％熱滅活胎牛血清(FBS)、8％熱滅活馬血清、0.02mM葉酸、0.2mM肌醇、2mM1-谷氨酰胺和0.1mMβ-巰基乙醇的完全培養(yǎng)基(NK-92培養(yǎng)基)中。以最低密度1-3 x 105細(xì)胞/毫升接種培養(yǎng)物，添加1000IU/ml的參比重組人IL-2突變蛋白(脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(即阿地白介素或

IL-2，Chiron Corporation，Emeryville，California)或C125S人IL-2突變蛋白(在上述AME哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中重組產(chǎn)生)。準(zhǔn)備此試驗(yàn)時(shí)，將細(xì)胞置于新鮮的NK-92培養(yǎng)基中至少48小時(shí)然后用于試驗(yàn)。試驗(yàn)前一天，洗滌NK-92細(xì)胞三次，置于NK-92培養(yǎng)基中24小時(shí)不加IL-2。離心細(xì)胞，懸浮在NK-92培養(yǎng)基中(無(wú)IL-2)，以4 x 104細(xì)胞/孔密度，用NK-92培養(yǎng)基稀釋的200微升含有作為參比IL-2分子的不同濃度脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白；或不同濃度的本發(fā)明IL-2突變蛋白，接種在96孔平底板中。37℃，5％CO2培養(yǎng)72小時(shí)后，取100微升等量培養(yǎng)上清液凍存，隨后用商品化購(gòu)得的TNF-αELISA試劑盒(BioSource CytoscreenTM人TNF-αELISA試劑盒；Camarillo，California)定量檢測(cè)TNF-α。對(duì)于培養(yǎng)中存活的細(xì)胞，用商品化購(gòu)得的MTT染料試劑盒(

非放射細(xì)胞增殖試驗(yàn)試劑盒(PromegaCorp.，Madison，Wisconsin)測(cè)定增殖，和根據(jù)比色讀數(shù)計(jì)算刺激指數(shù)。
NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒的IL-2生物試驗(yàn)采用人NK3.3細(xì)胞系。NK3.3細(xì)胞系顯示了外周血NK細(xì)胞的表型和功能特性(Kornbluth，J.Immunol.129(6)2831-2837，1982)，可通過(guò)Fc受體(CD16 FcγRIIIA)介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞毒(ADCC)作用。該細(xì)胞系獲自Jackie Kornbluth博士，限制許可在露易斯洲立大學(xué)中使用，保存于CMCC(ID12022)。
表2 用IL-2生物試驗(yàn)檢測(cè)Nk3.3細(xì)胞生物活性的小結(jié)
擴(kuò)增NK3.3細(xì)胞并維持在添加有15％熱滅活胎牛血清、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作為IL-2來(lái)源的RPMI-1640培養(yǎng)基中。準(zhǔn)備此試驗(yàn)，在無(wú)IL-2(“饑餓”)時(shí)培養(yǎng)NK3.3細(xì)胞24小時(shí)。此試驗(yàn)包括在U形底96-孔板中接種5 x 104個(gè)“饑餓的”NK3.3細(xì)胞，使其接觸作為參比IL-2分子的不同濃度的脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2，或不同濃度的本發(fā)明IL-2突變蛋白，總體積200微升。培養(yǎng)18小時(shí)后將IL-2激活的NK3.3細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞與5 x 103個(gè)鈣黃綠素AM-標(biāo)記的靶細(xì)胞(K562或Daudi)或抗體包被的鈣黃綠素AM-標(biāo)記的靶細(xì)胞(包被有最終濃度2μg/ml的利妥昔單抗的Daudi細(xì)胞)共培育，得到最終的效-靶比10:1。效應(yīng)-靶細(xì)胞共培育4小時(shí)后，簡(jiǎn)單離心96孔板；取100微升培養(yǎng)上清液置于黑色透明平底96孔板中用熒光計(jì)定量測(cè)定鈣黃綠素AM的釋放。測(cè)定的量表示為特異性溶解百分比，用以下公式計(jì)算％特異性溶解＝100×[(實(shí)驗(yàn)孔平均值-自發(fā)釋放平均值)/(最大釋放平均值-自發(fā)釋放平均值)]；測(cè)定含有標(biāo)記的靶細(xì)胞但無(wú)效應(yīng)細(xì)胞孔的自發(fā)釋放，和測(cè)定含有標(biāo)記的靶細(xì)胞和1％Triton X-100孔的最大釋放。
T細(xì)胞增殖 T細(xì)胞增殖的IL-2生物試驗(yàn)采用人T-細(xì)胞系Kit225(CMCC ID #11234)，其衍生自一慢性T-淋巴細(xì)胞白血病病人(Hori等，Blood70(4)1069-72，1987)。Kit225細(xì)胞能組成性表達(dá)IL-2受體復(fù)合物的α、β、γ亞單位。Kit225增殖是IL-2依賴的，如果培養(yǎng)中長(zhǎng)期缺乏IL-2細(xì)胞將死亡。該試驗(yàn)包括將Kit225細(xì)胞在無(wú)IL-2時(shí)培養(yǎng)24小時(shí)，然后接種入特定數(shù)目的細(xì)胞和不同濃度的作為參比IL-2分子的脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白，或不同濃度的本發(fā)明IL-2突變蛋白，培育48小時(shí)后，用標(biāo)準(zhǔn)的商品化購(gòu)得的MTT染料還原試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖，根據(jù)比色讀數(shù)計(jì)算出刺激指數(shù)。
NK細(xì)胞存活信號(hào) 篩選了人IL-2突變蛋白庫(kù)某亞組誘導(dǎo)NK細(xì)胞存活信號(hào)的能力。Proleukin

IL-2(即含有脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白的制劑)能誘導(dǎo)事先經(jīng)IL-2饑餓的NK3.3細(xì)胞中的AKT磷酸化，認(rèn)為這是“存活信號(hào)”。按照此生物試驗(yàn)，擴(kuò)增NK3.3細(xì)胞并維持在添加有15％熱滅活胎牛血清、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作為IL-2來(lái)源的RPMI-1640培養(yǎng)基中。準(zhǔn)備此試驗(yàn)，在無(wú)IL-2(“饑餓”)時(shí)培養(yǎng)NK3.3細(xì)胞24小時(shí)。作為細(xì)胞存活信號(hào)的指標(biāo)，通過(guò)加入2nM參比IL-2突變蛋白，如脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突變蛋白，或2nM感興趣的候選IL-2突變蛋白，刺激“饑餓的”NK3.3細(xì)胞(2 x 106)30分鐘。用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞二次。用50微升含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞抽提緩沖液溶解細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)行一輪凍熔。4℃，13000rpm離心提取物10分鐘。將1:10稀釋的澄清溶解液等份加入AKT[pS473]*免疫試驗(yàn)試劑盒(BioSource Internatioal)的孔中。按操作程序，用定量ELISA檢測(cè)磷酸化AKT的水平。
實(shí)施例2根據(jù)能否增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖來(lái)鑒定IL-2突變蛋白在鑒定的供進(jìn)一步篩選的168種突變蛋白(表1)中，總共有97種有益的突變顯示能使NK細(xì)胞增殖比0.1nM脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(即Proleukin

IL-2中存在的突變蛋白)高130％，同時(shí)不會(huì)增加TNF-α的產(chǎn)生(即比1nM脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白介導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生低100±8％)。這些突變蛋白列于表3。
表3.采用NK-92細(xì)胞增殖試驗(yàn)(CPA)作為主要選擇標(biāo)準(zhǔn)鑒定的IL-2突變蛋白。顯示了1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)的總TNF-α產(chǎn)生(pg/ml)和與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2觀察到的相比TNF-α產(chǎn)生百分比(％Pro)。CPA值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2觀察到的值的百分比(％Pro)。顯示在0.1nM蛋白質(zhì)時(shí)％NK細(xì)胞增殖與1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)的％TNF-α產(chǎn)生的比值(％CPA0.1TNF-α)。細(xì)胞毒試驗(yàn)的值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的值或?qū)125S人IL-2(Ala-Pro)觀察到的值的比值。

對(duì)定量<0.066ng/μl的IL-2突變蛋白制品進(jìn)行了第二次分析。該分析鑒定到4種額外的突變，所有突變都發(fā)生在關(guān)鍵位置36、40和65上，其中，突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比0.1nM脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白(即存在于Proleukin

IL-2中)介導(dǎo)的高150％，而在1nM時(shí)誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生是類似量脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白(即1nM)介導(dǎo)的≤100％。第二次分析還鑒定到7種其它突變，所有突變都發(fā)生在關(guān)鍵位置36、64和65上，在1nM時(shí)誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生略微增加(約為用類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2參比分子觀察到的101-109％)，同時(shí)在0.1nM時(shí)仍可誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白介導(dǎo)的高150％。TNF-α的產(chǎn)生見(jiàn)表4。
表4.采用NK-92細(xì)胞增殖試驗(yàn)(CPA)作為主要選擇標(biāo)準(zhǔn)鑒定到的其它IL-2突變蛋白。顯示在1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)的總TNF-α產(chǎn)生(pg/ml)和與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2觀察到相比的TNF-α產(chǎn)生百分比(％Pro)。CPA值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2觀察到的值的百分比(％Pro)。顯示在0.1nM蛋白質(zhì)時(shí)％NK細(xì)胞增殖與1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)％TNF-α產(chǎn)生的比值(％CPA0.1TNF-α)。細(xì)胞毒試驗(yàn)的值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的值或?qū)125S人IL-2(Ala-Pro)觀察到的值的比值。

實(shí)施例3根據(jù)能否降低的TNF-α產(chǎn)生來(lái)鑒定IL-2突變蛋白選擇在1nM時(shí)能使TNF-α產(chǎn)生比脫丙氨酰-1，C125S(即Proleukin

IL-2中存在的突變蛋白)或C125S人IL-2突變蛋白IL-2(指Ala-Pro IL-2)低87％，或在0.1nM和1nM時(shí)與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2相比能維持(至少96.4％)或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖，及在0.1nM時(shí)與C125S人IL-2突變蛋白相比能維持(至少79.2％)NK細(xì)胞增殖(數(shù)據(jù)未顯示)的突變蛋白。見(jiàn)表5。
表5.用以下選擇標(biāo)準(zhǔn)鑒定的IL-2突變蛋白1.0nM時(shí)TNF-α產(chǎn)生比用脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的<87％，且在兩種濃度(0.1和1.0nM)時(shí)與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的相比能維持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖。顯示了在1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)的總TNF-α產(chǎn)生(pg/ml)和與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)觀察到相比的TNF-α產(chǎn)生百分比。CPA值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2觀察到的值的百分比(％Pro)。顯示在0.1nM蛋白質(zhì)時(shí)％NK細(xì)胞增殖與1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)％TNF-α產(chǎn)生的比值(％CPA0.1TNF-α)。細(xì)胞毒試驗(yàn)的值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的值或?qū)125S人IL-2(Ala-Pro)觀察到的值的比值。

調(diào)整這些篩選標(biāo)準(zhǔn)以獲得那些符合以下標(biāo)準(zhǔn)的突變蛋白TNF-α產(chǎn)生比1nM脫丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2刺激的低81％，且在1nM時(shí)(即只在一種參比IL-2突變蛋白濃度時(shí))與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2相比能維持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖(至少95％)。用這些篩選標(biāo)準(zhǔn)鑒定的其它突變蛋白涉及位置20、78、79、80、81、88和126上殘基的變化。見(jiàn)表6。
表6.用以下選擇標(biāo)準(zhǔn)鑒定的IL-2突變蛋白TNF-α產(chǎn)生比用1.0nM脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的<81％，且在1.0nM時(shí)與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白(Pro)相比能維持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖。顯示在1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)的總TNF-α產(chǎn)生(pg/ml)和與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)觀察到相比的TNF-α產(chǎn)生百分比。CPA值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2觀察到的值的百分比(％Pro)。顯示在0.1nM蛋白質(zhì)時(shí)％NK細(xì)胞增殖與1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)％TNF-α產(chǎn)生的比值(％CPA0.1TNF-α)。細(xì)胞毒試驗(yàn)的值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的值或?qū)125S人IL-2(Ala-Pro)觀察到的值的比值。

對(duì)定量≤0.066ng/μl的IL-2突變蛋白制品進(jìn)行第二次分析。該分析鑒定到在1nM時(shí)顯示TNF-α產(chǎn)生比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白低96.2％，并在1nM濃度時(shí)維持參比IL-2分子誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖至少100％的其它IL-2突變蛋白。見(jiàn)表7。
表7.用以下選擇標(biāo)準(zhǔn)鑒定的IL-2突變蛋白TNF-α產(chǎn)生比用1.0nM脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的<96.2％，且在1.0nM時(shí)與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白(Pro)相比能維持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖。顯示在1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)的總TNF-α產(chǎn)生(pg/ml)和與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)觀察到相比的TNF-α產(chǎn)生的百分比。CPA值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2觀察到的值的百分比(％Pro)。顯示在0.1nM蛋白質(zhì)時(shí)％NK細(xì)胞增殖與1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)％TNF-α產(chǎn)生的比值(％CPA0.1TNF-α)。細(xì)胞毒試驗(yàn)的值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的值或?qū)125S人IL-2(Ala-Pro)觀察到的值的比值。

實(shí)施例4鑒定具有增強(qiáng)NK-介導(dǎo)細(xì)胞毒的IL-2突變蛋白選擇在0.1nM或1.0nM測(cè)定時(shí)對(duì)K562細(xì)胞的NK-介導(dǎo)的細(xì)胞毒超過(guò)C125S人IL-2突變蛋白(即Ala-Pro)至少140％、超過(guò)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白(即Proleukin

IL-2中存在的突變蛋白)至少115％，以及在1nM測(cè)定時(shí)誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生比這兩種參比IL-2突變蛋白低100％，并且在0.1nM或1nM測(cè)定時(shí)與這兩種參比IL-2突變蛋白相比能維持NK細(xì)胞增殖(至少100％)的突變蛋白。見(jiàn)表8。
表8.采用NK3.3細(xì)胞毒試驗(yàn)(K562靶)鑒定的IL-2突變蛋白天然細(xì)胞毒突變蛋白。顯示在1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)總TNF-α產(chǎn)生(pg/ml)和與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)觀察到相比的TNF-α產(chǎn)生百分比。CPA值表示為0.1nM或1nM時(shí)對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)觀察到的值的百分比。顯示了Pro(％CPATNF-α(Pro))和Ala-Pro(％CPATNF-α(Ala-Pro))在0.1nM蛋白質(zhì)時(shí)％NK細(xì)胞增殖與1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)％TNF-α產(chǎn)生的比值。細(xì)胞毒試驗(yàn)的值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的值或?qū)125S人IL-2(Ala-Pro)觀察到的值的比值。

實(shí)施例5鑒定LAK活性增強(qiáng)的IL-2突變蛋白然后根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)選擇突變蛋白NK細(xì)胞介導(dǎo)的LAK活性比C125S人IL-2突變蛋白(即Ala-Pro)增強(qiáng)120％，且與Proleukin

IL-2中存在的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白相比保持了(至少100％)NK細(xì)胞介導(dǎo)的LAK活性，并且在1nM時(shí)產(chǎn)生的TNF-α比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白和C125S人IL-2突變蛋白少100％，在0.1nM和1nM時(shí)與這些參比IL-2突變蛋白相比能保持NK細(xì)胞增殖(至少100％)。見(jiàn)表9。
表9.采用NK3.3細(xì)胞毒試驗(yàn)(Daudi靶細(xì)胞)鑒定的目標(biāo)IL-2突變蛋白的淋巴因子激活殺傷(LAK)活性。顯示了各突變蛋白的總TNF-α產(chǎn)生(pg/ml)和與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)觀察到相比的TNF-α產(chǎn)生百分比。CPA值表示為0.1nM或1nM時(shí)對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)觀察到的值的百分比。顯示了Pro(％CPATNF-α(Pro))和Ala-Pro(％CPATNF-α(Ala-Pro))在0.1nM蛋白質(zhì)時(shí)％NK細(xì)胞增殖與1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)的％TNF-α產(chǎn)生的比值。細(xì)胞毒試驗(yàn)的值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的值或?qū)125S人IL-2(Ala-Pro)觀察到的值的比值。

實(shí)施例6鑒定具ADCC活性增強(qiáng)的IL-2突變蛋白然后根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)選擇突變蛋白NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC活性比C125S人IL-2突變蛋白(Ala-Pro)增強(qiáng)至少115％，比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白(Pro)增強(qiáng)至少105％，在1nM時(shí)產(chǎn)生的TNF-α比參比IL-2突變蛋白少100％，在0.1nM時(shí)與這兩種參比IL-2突變蛋白相比能保持NK細(xì)胞增殖(至少100％)。見(jiàn)表10。
表10.采用NK3.3細(xì)胞毒試驗(yàn)(利妥昔單抗包被的Daudi靶細(xì)胞)鑒定的目標(biāo)IL-2突變蛋白抗體依賴性細(xì)胞毒(LAK)。顯示了總TNF-α產(chǎn)生(pg/ml)和與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)觀察到相比的TNF-α產(chǎn)生百分比。CPA值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)觀察到的值的百分比。顯示在0.1nM蛋白質(zhì)時(shí)％NK細(xì)胞增殖與1.0nM蛋白質(zhì)時(shí)％TNF-α產(chǎn)生的比值。細(xì)胞毒試驗(yàn)的值表示為對(duì)脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)觀察到的值或?qū)125S人IL-2(Ala-Pro)觀察到的值的比值。

實(shí)施例7選擇支持NK細(xì)胞存活增強(qiáng)的突變蛋白選擇與脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白相比能增強(qiáng)NK細(xì)胞存活的突變蛋白。見(jiàn)表11。
表11.采用NK3.3pAKT誘導(dǎo)試驗(yàn)鑒定的細(xì)胞存活陽(yáng)性目標(biāo)IL-2突變蛋白。

實(shí)施例8選擇具有最大增強(qiáng)治療能力(Therapeutic Profile)的人IL-2突變蛋白采用上述選擇標(biāo)準(zhǔn)鑒定到25種特別感興趣的人IL-2突變蛋白。這些突變蛋白示于表12。

根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)選擇突變蛋白后按以下選擇這些標(biāo)準(zhǔn)將突變蛋白進(jìn)一步分組 1)顯示TNF-α產(chǎn)生比C125S人IL-2突變蛋白觀察到的<80％并有以下特征的突變蛋白 a)在1nM時(shí)保持增殖能力，但相比參比IL-2突變蛋白，增殖活性在較低濃度時(shí)下降，包括還具有F42E或V91D突變的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白或C125S人IL-2突變蛋白(見(jiàn)表13)；或 b)在1nM時(shí)顯示TNF-α產(chǎn)生顯著降低，且在低至50pM時(shí)保持增殖活性，其包括還具有L72N突變的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白或C125S人IL-2突變蛋白(見(jiàn)表14)； 2)在一種或多種測(cè)試濃度(5pM、20pM、50pM、100pM和1000pM)時(shí)使NK-92增殖比C125S人IL-2突變蛋白>200％，但對(duì)TNF-α產(chǎn)生沒(méi)有不良影響(在濃度為100pM或1nM時(shí)的TNF-α產(chǎn)生比參比IL-2突變蛋白觀察到的<100％)的突變蛋白。此外，選擇標(biāo)準(zhǔn)包括，在至少2種濃度測(cè)試時(shí)增殖指數(shù)比參比IL-2突變蛋白，即C125S人IL-2(Ala-Pro)觀察到的高150％；該組突變蛋白包括還具有L36D或L40D突變的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白或C125S人IL-2突變蛋白(見(jiàn)表15)；和 3)顯示出增強(qiáng)的增殖活性和降低TNF-α產(chǎn)生的突變蛋白，其中，TNF-α產(chǎn)生是在1nM測(cè)試時(shí)C125S人IL-2突變蛋白觀察到的<75％，同時(shí)NK細(xì)胞增殖是任何一種濃度(5pM、20pM、50pM、100pM和1000pM)測(cè)試時(shí)C125S人IL-2突變蛋白觀察到的>150％；該組突變蛋白包括還具有L19D、F42R或E61R突變的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白或C125S人IL-2突變蛋白(見(jiàn)表16)。

實(shí)施例9人IL-2突變蛋白維持T細(xì)胞增殖作為選擇有益突變基礎(chǔ)的第二功能終點(diǎn)(secondary functional endpoint)是與用Ala-Pro IL-2(即C25S人IL-2突變蛋白)或

(即脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白)觀察到的相比能保持或改進(jìn)人KIT225 T細(xì)胞系的增殖。選擇上表1所示的168種突變蛋白亞組進(jìn)行這種功能終點(diǎn)測(cè)試。結(jié)果示于下表17。
表17.Kit225人T細(xì)胞系的增殖—MTT試驗(yàn)得到的與Y-Pro IL-2對(duì)照(酵母表達(dá)的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白)或Pro對(duì)照(阿地白介素，

)相比的OD比值。
*Y-Pro＝酵母系統(tǒng)表達(dá)的脫丙氨酰-1，C125S IL-2；該試驗(yàn)用的所有突變蛋白均為酵母載體所表達(dá) “保持”T細(xì)胞增殖定義為IL-2對(duì)照+/-20％實(shí)施例10能降低正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生同時(shí)保持或增強(qiáng)其增殖和細(xì)胞毒水平的優(yōu)選IL-2突變蛋白的鑒定從上述單個(gè)氨基酸取代序列中選出表18所示的25種IL-2突變蛋白進(jìn)行小規(guī)模表達(dá)/純化。測(cè)試了這些IL-2突變蛋白能否導(dǎo)致分離自幾位正常人供體的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)耐受性提高和保持活性的類似功能特性，與相關(guān)的IL-2對(duì)照(脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白(存在于Proleukin

IL-2中))和酵母菌表達(dá)的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2突變蛋白(在下述數(shù)據(jù)中稱為Y-Pro)作比較。具體說(shuō)，通過(guò)用感興趣的IL-2突變蛋白刺激衍生自一組正常人供體的PBMC，測(cè)定增殖和促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α)的產(chǎn)生，及能否通過(guò)自然/自發(fā)性細(xì)胞毒(NK)、淋巴因子活化的殺傷(LAK)，或抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)而殺傷腫瘤靶細(xì)胞。
表18.篩選在人PBMC中具有活性的含以下其它取代的C125S人IL-2(SEQ IDNO6)或脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)氨基酸序列的人IL-2突變蛋白。1 1通過(guò)與成熟的人IL-2(SEQ ID NO4)相關(guān)的氨基酸位置和該位置的氨基酸取代鑒定IL-2突變蛋白采用了以下主要功能終點(diǎn) 1)與相關(guān)的人IL-2突變蛋白對(duì)照相比，IL-2突變蛋白激活的人PBMC產(chǎn)生降低的促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α)； 2)與相關(guān)的人IL-2突變蛋白對(duì)照相比，能保持或增強(qiáng)IL-2誘導(dǎo)的人PBMC增殖，但不提高促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生； 3)與相關(guān)的人IL-2突變蛋白對(duì)照相比，能保持或增強(qiáng)體外用IL-2突變蛋白激活的人PBMC的NK、LAK和ADCC介導(dǎo)的溶細(xì)胞殺傷。
試驗(yàn)說(shuō)明聯(lián)合增殖/促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生試驗(yàn)的方法接觸IL-2后，人PBMC以劑量依賴方式增殖和分泌細(xì)胞因子。為最大程度提高數(shù)據(jù)輸出和效率，設(shè)計(jì)了聯(lián)合試驗(yàn)來(lái)評(píng)估用參比IL-2突變蛋白或感興趣人IL-2突變蛋白刺激72小時(shí)后的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生水平。試驗(yàn)設(shè)置包括用密度梯度離心分離法(ACDAVacutainer CPT試管)分離一名或多名正常供體的PBMC。在96孔組織培養(yǎng)處理平板的完全RPMI培養(yǎng)基(RPMI，10％熱滅活人AB血清、25mMHEPES、2mM谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素/兩性霉素)中，加入不同濃度(0.039nM-10nM)的IL-2，或作為陰性對(duì)照不加IL-2，37℃，7％CO2，培養(yǎng)每孔200000個(gè)細(xì)胞。培育66小時(shí)后取等量細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍存，隨后檢測(cè)細(xì)胞因子。用1μCi3H-胸苷脈沖細(xì)胞6小時(shí)，然后收集細(xì)胞測(cè)定核苷酸摻入水平(Wallac Trilux Microbeta平板讀數(shù)儀)，來(lái)衡量細(xì)胞增殖。用商品購(gòu)得的ELISA試劑盒(BioSource International)按廠商指南檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α水平。對(duì)一完整組6名不同供體反復(fù)進(jìn)行此試驗(yàn)，提供了“正常人群”對(duì)IL-2的代表性增殖和細(xì)胞因子應(yīng)答反應(yīng)的特征分析。
數(shù)據(jù)分析在不同的試驗(yàn)平板中一式二份接種PBMC樣品來(lái)評(píng)估(試驗(yàn))的可重復(fù)性。分析增殖數(shù)據(jù)通過(guò)減去本底增殖(PBMC+無(wú)IL-2)和計(jì)算一式二份樣品的平均值。從含PBMC的試驗(yàn)孔中取得細(xì)胞培養(yǎng)上清液，合并后得到細(xì)胞因子數(shù)據(jù)，為一式二份孔的細(xì)胞因子平均水平。根據(jù)ELISA試劑盒中裝的純化TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量TNF-α的水平，用pg/ml表示。進(jìn)一步匯編一組6名正常人供體的數(shù)據(jù)，概括在圖1所示的示意圖中。
細(xì)胞毒試驗(yàn)(NK/LAK/ADCC) 此試驗(yàn)中，用密度梯度離心分離全血的PBMC。如本領(lǐng)域目前通常進(jìn)行的那樣，(見(jiàn)例如，《人NK細(xì)胞的分離和LAK活性的產(chǎn)生》，選自《Current protocols inImminnology(新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南)》；1996 John Wiley & Son，Inc.)，在存在10nM IL-2對(duì)照或感興趣的IL-2突變蛋白時(shí)刺激PBMC了無(wú)產(chǎn)生LAK活性。所得細(xì)胞群含有“效應(yīng)”細(xì)胞，可分類為NK或LAK，其可分別殺傷K562和Daudi腫瘤靶細(xì)胞。這些效應(yīng)細(xì)胞也能介導(dǎo)ADCC，因效應(yīng)細(xì)胞能識(shí)別結(jié)合于Daudi靶細(xì)胞的特異性抗體(此例是

)的Fc部分。此試驗(yàn)包括以不同的效--靶比(ET比例)共培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞與鈣黃綠素AM-標(biāo)記的靶細(xì)胞4小時(shí)。檢測(cè)培養(yǎng)上清液中相對(duì)于鈣黃綠素AM的細(xì)胞毒活性量。所測(cè)得的量根據(jù)自發(fā)釋放和最大釋放對(duì)照量，表示為各ET比例時(shí)的特異性溶解百分比。小結(jié)此試驗(yàn)可檢測(cè)以下生物學(xué)活性數(shù)據(jù)分析獲得熒光儀測(cè)得的數(shù)據(jù)，表示為相對(duì)熒光(強(qiáng)度)單位(rfu)。對(duì)照包括只有標(biāo)記的靶細(xì)胞(最小)和作為100％溶解衡量的標(biāo)記靶細(xì)胞與最終濃度1％Triton X-100(最大)。用以下公式計(jì)算衡量此試驗(yàn)有效性(如>30％試驗(yàn)無(wú)效)的最小與最大比值的百分率
一旦證實(shí)該試驗(yàn)有效，計(jì)算出一式三份樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，然后用以下公式從一式三份樣品的平均值計(jì)算出特異性溶解百分比
數(shù)據(jù)報(bào)告為特異性溶解％；此外，可利用IL-2突變蛋白與相關(guān)IL-2對(duì)照的比值來(lái)確定與對(duì)照相比，是否保持了對(duì)混合的人PBMC群具有細(xì)胞毒活性。
結(jié)果鑒定到能降低正常人PBMC促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生同時(shí)保持或增強(qiáng)增殖和細(xì)胞毒水平的5個(gè)優(yōu)選IL-2突變蛋白。對(duì)于以下提供的數(shù)據(jù)，只與相關(guān)對(duì)照，即在同一酵母系統(tǒng)中表達(dá)式并純化的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2(稱為Y-Pro)一起測(cè)試了IL-2突變蛋白。在二次獨(dú)立的試驗(yàn)中，用聯(lián)合的增殖/促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生試驗(yàn)，先測(cè)試了IL-2突變蛋白的劑量反應(yīng)曲線(39pM-10nM)，各用三名正常供體的PBMC作一式二份測(cè)試。數(shù)據(jù)分析包括供體的個(gè)體概況、均值±標(biāo)準(zhǔn)差、與內(nèi)部對(duì)照IL-2的差異分析和細(xì)胞因子產(chǎn)量(pg/ml)按增殖(cpm)標(biāo)準(zhǔn)化，以得到每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子相對(duì)量。最后計(jì)算出與IL-2對(duì)照相比TNF-α產(chǎn)量減少的百分?jǐn)?shù)。如果10,000pM濃度時(shí)保持了增殖水平和TNF-α產(chǎn)量減少25％以上的IL-2突變蛋白確實(shí)是優(yōu)選的。表19小結(jié)了在脫丙酰-1，C125S人IL-2突變蛋白骨架中含有所示其它氨基酸取代的5種優(yōu)選IL-2突變蛋白觀察到的TNF-2產(chǎn)生減少的百分比。圖2-6分別顯示在人PBMC中，F(xiàn)42E、L94Y、E95D、E95G和Y107R突變蛋白介導(dǎo)的增殖和TNF-α產(chǎn)生。
表19.IL-2對(duì)照TNF-α產(chǎn)生減少的百分比1
1數(shù)值代表一組6名正常人供體PBMC的Y-Pro對(duì)照平均降低百分比。
細(xì)胞因子數(shù)據(jù)按增殖標(biāo)準(zhǔn)化一旦鑒定到5種優(yōu)選的IL-2突變蛋白，重要的是確定此IL-2突變蛋白激活的PBMC是否保留了通過(guò)NK、LAK和ADCC活性溶解腫瘤靶細(xì)胞的能力。如圖7所示，觀察到IL-2突變蛋白與相關(guān)IL-2對(duì)照之間在通過(guò)NK、LAK和ADCC活性溶解腫瘤靶細(xì)胞能力上未見(jiàn)差異。
實(shí)施例11用B16F10黑色素瘤模型評(píng)價(jià)IL-2突變蛋白的效果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 用IL-2敏感的B16F10黑色素瘤模型測(cè)試了Y107R、F42E和E95D IL-2突變蛋白。評(píng)價(jià)目標(biāo)的劑量反應(yīng)，確定最小有效劑量(MED)，并證明抑制肺轉(zhuǎn)移的效果。
研究的第一天給C57BL/6小鼠靜脈內(nèi)植入B16F10黑色素瘤細(xì)胞(50,0000細(xì)胞/小鼠)。小鼠為4-6周齡，根據(jù)體重將它們隨機(jī)分成10組。每組的平均體重相差20％之內(nèi)。在第2天開始治療，包括給予

形式的IL-2、RL-2(大腸桿菌產(chǎn)生的研究級(jí)IL-2)、

(IL-2的單體形式)，或者給予IL-2突變蛋白E95D或Y107R。
測(cè)試兩種不同的劑量方案1)根據(jù)Sleijfer等(J.Clin.Oncol.10(7)1119-1123，1992)所述方案的改進(jìn)“Sleijfer”方案，包括用皮下給予的IL-2治療2周，每天一次，每周5天(給藥5天/停藥2天/給藥5天，采用升高劑量(dose-up)設(shè)計(jì))，和2)每周給予IL-2三次的方案。根據(jù)測(cè)定的作為藥物耐受性指標(biāo)的肺轉(zhuǎn)移數(shù)(第18-21天，盲試)、臨床觀察和體重測(cè)量評(píng)價(jià)治療的功效和耐受性。
結(jié)果每周三次靜脈內(nèi)給予C57BL/6小鼠的鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型

RL-2、

以及IL-2突變蛋白E95D和Y107R(圖8和9)。IL-2測(cè)試藥劑的最小有效劑量(MED)(統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的劑量與藥物運(yùn)載體的比值)如下

(3.3mg/kg)、

(3.3mg/kg)、RL-2(3.3mg/kg)、E95D(5.7mg/kg)、Y107R(5.7mg/kg)。測(cè)試藥劑的ED50(相比藥物運(yùn)載體抑制50％轉(zhuǎn)移)分別為

2.4mg/kg、E95D 4.8mg/kg、Y107R 6.1mg/kg。相比IL-2基準(zhǔn)(

劑量為5.7mg/kg(每周三次)的Y107R和E95D能產(chǎn)生相同的轉(zhuǎn)移抑制。突變蛋白或

未達(dá)到最大耐受劑量(MTD)。所有測(cè)試藥劑劑量都可良好耐受，在研究期間小鼠顯示體重正常(圖9)。下表20總結(jié)了藥效結(jié)果。
表20.鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型每周三次給予

以及IL-2突變蛋白E95D和Y107R的效果。
*ANOVA/Student-Newmans-Keul檢驗(yàn) 然后采用“Sleijfer”劑量方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)測(cè)試IL-2藥劑。與運(yùn)載體治療或未治療的小鼠相比，E95D和Y107R在所有劑量(3.3、5.7和8.1mg/kg)都顯著減少了平均肺轉(zhuǎn)移數(shù)(p<0.001 ANOVA/Student-Newmans-Keul檢驗(yàn))，其效果與IL-2基準(zhǔn)(

)相當(dāng)(圖10和11)。3.3和8.1mg/kg的Y107R顯示分別為2/10和1/10只小鼠有完全反應(yīng)(CR)(表21)，CR被定義為小鼠肺部的腫瘤(包括顯微病損)完全消失。與運(yùn)載體治療或未治療的小鼠相比，5.7mg/kg的

和8.1mg/kg的RL-2以及3.3、5.7和8.1mg/kg的

顯著降低肺轉(zhuǎn)移(p<0.001ANOVA/Student-Newmans-Keul檢驗(yàn))。

E95D和Y107R的最小有效劑量為3.3mg/kg，計(jì)算出的E95D、Y107R和

的ED50為<3.3mg/kg。高至8.1mg/kg0的測(cè)試藥劑的所有劑量都耐受良好，小鼠顯示體重正常。未達(dá)到MTD(圖11)。下表21總結(jié)了藥效結(jié)果。
表21.按“Sleijfer”方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型給予

RL-2、

以及IL-2突變蛋白E95D和Y107R的效果 ANOVA/Student-Newmans-Keul檢驗(yàn) 在重復(fù)研究中，采用“Sleijfer”劑量方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)評(píng)價(jià)了

Y107R以及F42E在B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中的效果。與運(yùn)載體治療或未治療的小鼠相比，5.7mg/kg和10.5mg/kg的Y107R、F42E、L2-7001以及5.7mg/kg的

顯示了可顯著降低肺轉(zhuǎn)移數(shù)(p<0.05ANOVA/Student-Newmans-Keul檢驗(yàn))(圖12和13)。

F42E和Y107R的最小有效劑量為5.7mg/kg，計(jì)算出的ED50分別為F42E 6.47mg/kg、Y107R 6.33mg/kg、L2-70015.37mg/kg。類似劑量的測(cè)試藥劑(

F42E和Y107R)之間效果沒(méi)有差別，說(shuō)明IL-2突變蛋白具有與基準(zhǔn)(

和

)相同的活性。劑量為5.7mg/kg的

和10.5mg/kg的

顯示小鼠體重減輕，并分別鑒定為各藥劑的MTD劑量(圖13)。對(duì)所有測(cè)試劑量的突變蛋白Y107R和F42E都未觀察到體重減輕(即未達(dá)到IL-2突變蛋白的MTD)，說(shuō)明這些突變蛋白比IL-2基準(zhǔn)能被更好地耐受(圖13)。表22總結(jié)了藥效結(jié)果。
表22.在重復(fù)研究中按“Sleijfer”方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)鼠B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型給予Proleukin、RL-2、

以及IL-2突變蛋白E95D和Y107R的效果 ANOVA/Student-Newmans-Keul檢驗(yàn) 結(jié)論 1.IL-2突變蛋白E95D、Y107R和F42E在體內(nèi)保留抗腫瘤活性。
2.當(dāng)每周給予三次或按“Sleijfer”方案給藥時(shí)，IL-2突變蛋白E95D、Y107R和F42E在經(jīng)典的B16黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型中的效果與類似劑量的基準(zhǔn)(

或

相當(dāng)。
3.與IL-2基準(zhǔn)

或

相比，IL-2突變蛋白Y107R和F42E能被更好耐受、保留了IL-2活性、顯示了較高治療指數(shù)。
4.用IL-2突變蛋白Y107R和F42E能獲得較高的最大耐受劑量(MTD)，且在臨床方案中允許采用較高的劑量強(qiáng)度，因此具有提高的藥效。
實(shí)施例12突變蛋白在非何杰金淋巴瘤異種移植模型中的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 這些研究的目的是評(píng)價(jià)

(IL-2)、

E95D和Y107R作為單一藥劑或與單克隆抗體利妥昔單抗(

IDEC-C2B8；IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California)聯(lián)用在NK(或免疫效應(yīng)細(xì)胞)/ADCC-介導(dǎo)的效力模型中的活性(圖14-20)。在兩種不同的非何杰金淋巴瘤(NHL)模型，即對(duì)IL-2敏感的Namalwa(高等級(jí)NHL)模型和對(duì)IL-2顯示邊緣活性(marginal activity)但對(duì)利妥昔單抗有反應(yīng)的Daudi模型(低等級(jí)NHL，CD20+)中評(píng)價(jià)IL-2突變蛋白的效果。
結(jié)果接種Namalwa或Daudi細(xì)胞之前使無(wú)胸腺BALB/c裸鼠適應(yīng)1周。在經(jīng)過(guò)經(jīng)照射的幼齡裸鼠(3戈瑞，約3.2分鐘)右腹皮下植入Namalwa或Daudi細(xì)胞(5×106細(xì)胞/小鼠)和0.1mL50％基質(zhì)膠。當(dāng)平均腫瘤體積達(dá)到100-200mm3時(shí)開始治療。該日指定為研究的第1天。腫瘤體積和體重每周評(píng)價(jià)兩次。記錄臨床觀察。對(duì)腫瘤體積大于3000mm3的各小鼠或平均腫瘤體積大于2000mm3的一組小鼠實(shí)施安樂(lè)死。體重下降大于20％的小鼠也處死。根據(jù)腫瘤體積的測(cè)量、體重和臨床觀察確定終點(diǎn)。
在經(jīng)照射的Balb/c裸鼠內(nèi)的分期的侵入性人NHL模型(Namalwa)中評(píng)價(jià)每周三次給予

突變蛋白Y107R或E95D的效果(圖14-16)。

單一藥劑顯示出良好的劑量反應(yīng)效果，其計(jì)算出的ED50為2mg/kg(圖16)。與僅用運(yùn)載體治療相比，1mg/kg、每周3次(p＝0.038)和3mg/kg、每周3次(p＝0.009)的

的活性顯著不同。然而，用1mg/kg、每周3次

治療和用1mg/kg、每周3次

治療沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)(圖16？)。
IL-2突變蛋白Y107R和E95D在Namalwa腫瘤模型中顯示了劑量反應(yīng)效果(圖15和16)。用1和3mg/kg E95D每周治療三次與用運(yùn)載體治療顯著不同(p<0.001)，而在該模型中Y107R的最小有效劑量略高(3mg/kg)。在Namalwa模型中，以1mg/kgY107R和E95D每周治療三次與以1mg/kg基準(zhǔn)

和

)每周治療3次的活性相當(dāng)(p>0.05)。突變蛋白測(cè)試到3mg/kg，未達(dá)到MTD。
在Balb/c裸鼠的CD20+低等級(jí)人NHL Daudi異種移植物中評(píng)價(jià)了每周3次給予

或IL-2突變蛋白Y107R與利妥昔單抗聯(lián)合治療的效果(圖17-20)。這些試驗(yàn)的目的是評(píng)價(jià)體內(nèi)活化效應(yīng)細(xì)胞(NK、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、噬中性粒細(xì)胞)對(duì)于IL-2和治療性抗體(利妥昔單抗)聯(lián)合治療效果的作用。用3mg/kg的

或Y107R單一藥劑治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與運(yùn)載體治療沒(méi)有差別(p>0.05，ANOVA，第26天)(圖17)。然而，當(dāng)根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)延遲(即腫瘤發(fā)展到1000mm3的天數(shù))分析時(shí)，與運(yùn)載體治療相比觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05，Lon Rank檢驗(yàn))。與單一藥劑各自相比，采用

或

與利妥昔單抗聯(lián)合治療觀察到顯著增強(qiáng)了對(duì)腫瘤的療效(p>0.05，ANOVA，第26天)(圖18和19)。與Proleukin/L2-7001一樣，在B-細(xì)胞淋巴瘤的Daudi人異種移植模型中，當(dāng)與利妥昔單抗聯(lián)合給予時(shí)，Y107R突變蛋白誘導(dǎo)了類似的對(duì)腫瘤療效的增強(qiáng)。與

治療相比，Y107R和利妥昔單抗的聯(lián)合治療導(dǎo)致持續(xù)反應(yīng)數(shù)增加(5CR)及條件性存活改善(圖18和19)。IL-2突變蛋白單一藥劑以及與利妥昔單抗聯(lián)合的所有劑量都被良好耐受(圖20)。
結(jié)論 1.突變蛋白E95D和Y107R顯著抑制侵入性B-細(xì)胞NHL(NHL的Namalwa模型)的腫瘤生長(zhǎng)。
2.IL-2突變蛋白可能是對(duì)黑色素瘤、NHL等癌癥亞類有效的一種藥劑。
3.IL-2突變蛋白Y107R對(duì)低等級(jí)B細(xì)胞NHL Daudi模型具有邊緣活性，但與利妥昔單抗聯(lián)用時(shí)能夠激活免疫效應(yīng)細(xì)胞(即NK、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、噬中性粒細(xì)胞)從而有效介導(dǎo)ADCC 4.IL-2突變蛋白Y107R和利妥昔單抗聯(lián)合治療顯示療效好于單用IL-2或利妥昔單抗。
5.IL-2突變蛋白的活性可以與通過(guò)ADCC接到的效應(yīng)或類似的免疫效應(yīng)細(xì)胞機(jī)制起作用的其它抗體聯(lián)合應(yīng)用。
6.這些發(fā)現(xiàn)的含意可應(yīng)用于作用機(jī)制與IL-2(或突變蛋白)相似的其它細(xì)胞因子分子，來(lái)介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)可能用于其它療法或疾病適應(yīng)證。
實(shí)施例13評(píng)價(jià)在IL-2誘導(dǎo)的血管滲漏綜合征模型中的耐受性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 研究開始前使雌性C57BL/6小鼠適應(yīng)1周。小鼠為8-10周齡，根據(jù)體重將它們隨機(jī)分成5組。腹膜內(nèi)(i.p.)注射6mg/kg(約2,000,000IU)

或者IL-2突變蛋白E95D或Y107R，每天三次。重復(fù)注射10劑。第4天在給予

劑量4小時(shí)后注射用0.1ml含1％小鼠血清的PBS配制的125I-白蛋白(1μCi，PerkinElmer Life Sciences Inc.Boston，MA)。注射125I-白蛋白60分鐘后對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。收集肺并將其置入γ計(jì)數(shù)小瓶中。
結(jié)果采用高劑量IL-2或

(6mg/kg，i.p.，每天3次，10劑)治療導(dǎo)致保留于小鼠肺中的125I-白蛋白有統(tǒng)計(jì)學(xué)增加，這是由于血管滲漏增加而模擬了類似于人的血管滲漏綜合征(VLS)病理模型(圖21)。在此試驗(yàn)性VLS“急性”模型中，IL-2突變蛋白E95D和Y107R都引起了125I-白蛋白保留增加；然而，Y107R顯示VLS誘導(dǎo)程度比

治療降低了16％(圖21)。
實(shí)施例14用溫度芯片監(jiān)測(cè)體溫變化評(píng)價(jià)IL-2突變蛋白的耐受性介紹盡管IL-2誘導(dǎo)的毒性和VLS的確切機(jī)制還不清楚，但積累的數(shù)據(jù)提示，IL-2誘導(dǎo)的天然殺傷細(xì)胞(NK)引發(fā)了劑量限制性毒性，這是過(guò)度產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1β和IL-6等促炎癥細(xì)胞因子的結(jié)果，這些細(xì)胞因子能活化單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和誘導(dǎo)產(chǎn)生一氧化氮(NO)從而導(dǎo)致隨后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷(Dubinett等，1994，CellImmunol.157(1)170-180；和Samlowski等，1995，J.Immunother.Emphasis TumorImmunol.18(3)166-78)。
發(fā)熱和寒冷是IL-2治療期間常見(jiàn)的3級(jí)不良癥狀。發(fā)熱是對(duì)TNF-α誘生前列腺素E2的生理反應(yīng)，發(fā)熱導(dǎo)致血管收縮和顫抖，隨后導(dǎo)致中心溫度發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變。IL-2在體外不直接誘導(dǎo)前列腺素E2合成；因此IL-2本身歸類為一種非熱原性細(xì)胞因子。然而，IL-2在外源給藥后可誘導(dǎo)釋放熱原性細(xì)胞因子，尤其是TNF-α，這是發(fā)熱和IL-2治療期間急性反應(yīng)其它方面的主要原因(Mier等，1988，J.Clin.Immunol.8426)。已報(bào)道用IL-2治療的患者的TNF-α血漿水平可超過(guò)600ng/ml(Gemlo等(1988)Cancer Res.48(20)5864-5867)。
人類的劑量限制性毒性(例如，發(fā)熱/寒冷、VLS和低血壓)都與產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子和NO有關(guān)。因此，促炎癥細(xì)胞因子如TNF-α的產(chǎn)生與誘導(dǎo)生理體溫變化之間有直接關(guān)系，可監(jiān)測(cè)溫度變化作為IL-2免疫治療耐受性的預(yù)報(bào)。
為建立不良癥狀的模型，重要的是要將溫度變化與促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生之間的關(guān)系由人外推到小鼠。在這兩種物種中，促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β等)的產(chǎn)生是誘生下丘腦前列腺素E2所介導(dǎo)的體溫變化的原因。通常使用的試驗(yàn)動(dòng)物如小鼠當(dāng)急性接觸多種藥物時(shí)會(huì)出現(xiàn)體溫過(guò)低和代謝減退。推測(cè)這是一種為降低毒性攻擊致死性而固有的保護(hù)性反應(yīng)(Gordon和Yange(1997)Ann.N.Y.Acad.Sci.813835)。
盡管可以預(yù)測(cè)IL-2給藥后小鼠模型的中心體溫將升高，但實(shí)際上觀察到該模型的中心體溫降低。本領(lǐng)域已知炎癥的外源性介質(zhì)如LPS誘導(dǎo)TNF-α并使小鼠模型的中心體溫暫時(shí)降低(Kozak等(1997)Ann.NY Acad.Sci.813835)。在另一種模型中，體溫過(guò)低的預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)被證明是SEB腸休克小鼠類模型死亡率的有效指示(Vlach等(2000)Comp.Med.50160)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在C57BL/6小鼠皮下植入溫度芯片，用POCKET SCANNER系統(tǒng)(BioMedic DataSystems，Inc.Seaford，DE)來(lái)監(jiān)測(cè)體溫變化。

或者IL-2突變蛋白E95D、Y107R、L94Y或F42E采用“Slefer”劑量方案(給藥5天/停藥2天/給藥5天)皮下給藥。在IL-2給藥前后的給定時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)小鼠體溫，并與注射緩沖液對(duì)照(載體)的小鼠進(jìn)行比較。根據(jù)中心體溫、臨床觀察、體重和血漿促炎癥細(xì)胞因子(例如TNF-α)水平確定終點(diǎn)。
結(jié)果

或

給藥后(5.7mg/kg或8.1mg/kg，每天皮下注射給藥，持續(xù)5天)，第4和5天給藥后4小時(shí)觀察到溫度顯著降低。盡管溫度降低(不是人類中觀察到的升高)，但此作用可重現(xiàn)，且在運(yùn)載體治療動(dòng)物中未觀察到此作用。圖22顯示了延長(zhǎng)時(shí)間，包括10種劑量為期2周到給藥后9小時(shí)的溫度監(jiān)測(cè)。最一致的顯著變化發(fā)生在第5天給藥后4小時(shí)。此外，此小鼠模型中IL-2誘導(dǎo)的溫度變化與血漿TNF-α水平顯著相關(guān)。該模型可重現(xiàn)，表23總結(jié)了對(duì)IL-2治療反應(yīng)中體溫顯著降低的結(jié)果。
表23.給藥后4小時(shí)體溫變化小結(jié)。
第1周
第2周
1數(shù)值表示為平均體溫(℉)+/-SD，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(ANOVA+Studen-Newman-Keuls)，p>0.05表示不顯著 *以10.5mpk劑量給藥2周小組的動(dòng)物 2用于研究的BALB/c小鼠 3研究荷瘤動(dòng)物，以5.7mpk劑量所有小組的藥效研究 4由于嚴(yán)重低溫1只小鼠在最后一次注射后30分鐘死亡 5NS＝不顯著(P>0.05) 注意，

制劑在該小鼠模型中被較好耐受，這是因?yàn)轶w溫顯著下降與劑量等于或大于8.1mg/kg時(shí)觀察到的結(jié)果一致，此模型中

的最大耐受劑量為5.7mg/kg。這些觀察結(jié)果與給藥時(shí)間延長(zhǎng)(通常為每輪給藥2周)的其它荷瘤動(dòng)物臨床前模型一致。
兩種IL-2突變蛋白Y107R和F42E顯示出體溫變化減少與誘生的TNF-α降低顯著相關(guān)，預(yù)測(cè)其耐受性優(yōu)于

和

見(jiàn)圖23-25。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將記住上述的本發(fā)明的許多修改和其它實(shí)施方式，這些發(fā)明具有以上所述和附圖所提出優(yōu)點(diǎn)。因此應(yīng)理解本發(fā)明不限于上述的具體實(shí)施方式
，各種修改和其它實(shí)施方式也包括在本文所述實(shí)施方式的范圍內(nèi)。雖然本申請(qǐng)采用了一些專門術(shù)語(yǔ)，但它們只按通用的含義使用，而不是限制本發(fā)明的范圍。
序列表
<110>L.奧克曼(Lea Aukerman)
K.德尼斯—米澤(Kimberly Denis-Mize)
C.海斯(Car la Heise)
B.杰拉(Bahi ja Jal lal)
D.門尼澤斯(Daniel Menezes)
S.E.威爾森(Susan T.Wilson)
<120>改進(jìn)的白介素-2突變蛋白
<130>PP020354.0003
<140>60/550,868
<141>2004-03-05
<140>60/585,980
<141>2004-07-07
<140>60/646,095
<141>2005-01-21
<160>346
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
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<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>T102S，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>313
<210>314
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T102S，C125S人IL-2突變蛋白
<400>314
<210>315
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>T102V，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>315
<210>316
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T102V，C125S人IL-2突變蛋白
<400>316
<210>317
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>M104G，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>317
<210>318
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>M104G，C125S人IL-2突變蛋白
<400>318
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<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>E106K，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>319
<210>320
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>E106K，C125S人IL-2突變蛋白
<400>320
<210>321
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y107H，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>321
<210>322
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Y107H，C125S人IL-2突變蛋白
<400>322
<210>323
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y107K，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
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<210>324
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Y107K，C125S人IL-2突變蛋白
<400>324
<210>325
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y107L，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>325
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<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Y107L，C125S人IL-2突變蛋白
<400>326
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<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y107Q，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
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<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<400>328
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<221>CDS
<222>(1)...(399)
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<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Y107R，C125S人IL-2突變蛋白
<400>330
<210>331
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y107T，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>331
<210>332
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Y107T，C125S人IL-2突變蛋白
<400>332
<210>333
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>E116G，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>333
<210>334
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>E116G，C125S人IL-2突變蛋白
<400>334
<210>335
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>N119Q，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>335
<210>336
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N119Q，C125S人IL-2突變蛋白
<400>336
<210>337
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>T123C，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>337
<210>338
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T123C，C125S人IL-2突變蛋白
<400>338
<210>339
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>T123S，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>339
<210>340
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T123S，C125S人IL-2突變蛋白
<400>340
<210>341
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Q126I，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>341
<210>342
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Q126I，C125S人IL-2突變蛋白
<400>342
<210>343
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Q126V，C125S人IL-2突變蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>343
<210>344
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Q126V，C125S人IL-2突變蛋白
<400>344
<210>345
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C61R，C125S人IL-2突變蛋白，具有為大腸桿菌表達(dá)最優(yōu)化的E61R密碼子
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>345
<210>346
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y107R，C125S人IL-2突變蛋白，具有為大腸桿菌表達(dá)最優(yōu)化的Y107R密碼子
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>34權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其特征在于，該核酸分子含有選自以下的核苷酸序列
a)編碼人IL-2突變蛋白的核苷酸序列，所述突變蛋白含有選自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示的核苷酸序列；
c)編碼人IL-2突變蛋白的核苷酸序列，所述突變蛋白選自包含SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168，170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示序列的殘基2-133的氨基酸序列；
d)含有SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示序列核苷酸4-399的核苷酸序列；
e)a)、b)、c)或d)中任一項(xiàng)所述的核苷酸序列，其中所述序列包含SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343的核苷酸373-375被編碼丙氨酸的三聯(lián)密碼子取代；
f)a)、b)、c)或d)中任一項(xiàng)所述的核苷酸序列，其中所述序列包含SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343的核苷酸373-375被編碼半胱氨酸的三聯(lián)密碼子取代；和
g)a)、b)、c)、d)、e)或f)中任一項(xiàng)所述的核苷酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)編碼所述突變蛋白的密碼子在感興趣宿主細(xì)胞中的表達(dá)已被優(yōu)化。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其特征在于，g)所述的核苷酸序列選自SEQ ID NO345的序列、SEQ ID NO345的核苷酸4-399、SEQ ID NO346的序列、和SEQ ID NO346的核苷酸4-399。
3.一種含有如權(quán)利要求1所述核酸分子的表達(dá)載體。
4.一種含有如權(quán)利要求1所述核酸分子的宿主細(xì)胞。
5.一種分離的多肽，其特征在于，該多肽含有選自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的殘基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的丙氨酸殘基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的半胱氨酸殘基。
6.一種分離的多肽，其特征在于，該多肽含有人IL-2突變蛋白，其中所述突變蛋白含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO4的125位絲氨酸取代了半胱氨酸，和在SEQ ID NO4中至少有一處其它的氨基酸取代，其中所述突變蛋白在相等試驗(yàn)條件下，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，1)能保持或增強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞的增殖；2)能導(dǎo)致NK細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子的水平降低，其中所述NK細(xì)胞的增殖和所述NK細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子用NK-92生物試驗(yàn)檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白還含有SEQ IDNO4的1位丙氨酸缺失。
8.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，所述其它的取代選自T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、I24L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V。
9.如權(quán)利要求8所述的分離的多肽，其特征在于，所述取代是H16D、L19D、L19E、L36D、L36P、L40D、L40G、F42E、F42R、E61R、P65Y、L72N、L80K、R81K、N88D、V91D、V91N、L94Y、E95D、E95G、Y107H或Y107R。
10.如權(quán)利要求8所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白還含有SEQ IDNO4的1位的丙氨酸缺失。
11.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，所述促炎癥細(xì)胞因子是TNF-α。
12.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，在相等試驗(yàn)條件下，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的相比，所述突變蛋白提供了保持或增強(qiáng)的人NK細(xì)胞介導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞毒、淋巴因子活化殺傷(LAK)細(xì)胞毒、或ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，其中所述NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒用NK3.3細(xì)胞毒生物試驗(yàn)檢測(cè)。
13.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，在相等試驗(yàn)條件下，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的相比，所述突變蛋白能提供維持的或改進(jìn)的NK3.3細(xì)胞系磷酸化AKT的誘導(dǎo)。
14.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，在相等試驗(yàn)條件下，所述突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的高150％。
15.如權(quán)利要求14所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的高170％。
16.如權(quán)利要求15所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖為脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的約200％至約210％。
17.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，在相等試驗(yàn)條件下，所述突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的至少高10％。
18.如權(quán)利要求17所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的至少高15％。
19.如權(quán)利要求18所述的分離的多肽，其特征在于，在相等試驗(yàn)條件下，所述突變蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子低于類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的100％。
20.如權(quán)利要求19所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白誘導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生低于脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2誘導(dǎo)的70％。
21.一種分離的多肽，其特征在于，該多肽含有人IL-2突變蛋白，其中所述突變蛋白含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO4的125位絲氨酸取代了半胱氨酸，和在SEQ ID NO4中至少有一處其它的氨基酸取代，其中在相等試驗(yàn)條件下，所述突變蛋白的IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖與IL-2誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生的比率，比類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的至少高1.5倍，其中用NK-92生物試驗(yàn)檢測(cè)0.1nM突變蛋白的NK細(xì)胞增殖和1.0nM突變蛋白的TNF-α產(chǎn)生。
22.如權(quán)利要求21所述的分離的多肽，其特征在于，所述比率比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的至少高2.5倍。
23.如權(quán)利要求21所述的分離的多肽，其特征在于，所述比率比脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的至少高3.0倍。
24.如權(quán)利要求21所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白還含有SEQ IDNO4的1位的丙氨酸缺失。
25.一種分離的多肽，其特征在于，該多肽含有人IL-2突變蛋白的氨基酸序列，其中所述突變蛋白含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO4的125位絲氨酸取代了半胱氨酸，和SEQ ID NO4中選自16、36、40、42、61、65、67、72、91、94、95和107位置至少一處的其它氨基酸取代。
26.如權(quán)利要求25所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白還含有SEQ IDNO4的1位的丙氨酸缺失。
27.一種制造人白介素-2(IL-2)突變蛋白的方法，在相似的試驗(yàn)條件下，與類似量的選自脫丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的參比人IL-2突變蛋白相比，該突變蛋白能保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖也能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平促炎癥細(xì)胞因子，其中，采用NK-92生物試驗(yàn)檢測(cè)所述NK細(xì)胞的增殖和促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，所述方法包括
a)用含有權(quán)利要求1所述核酸分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；
b)在允許所述核酸分子表達(dá)成多肽的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和
c)分離所述多肽。
28.一種制造人白介素-2(IL-2)突變蛋白的方法，在相似的試驗(yàn)條件下，與類似量的選自脫丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的參比人IL-2突變蛋白相比，該突變蛋白能保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖也能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平促炎癥細(xì)胞因子，其中，采用NK-92生物試驗(yàn)檢測(cè)所述NK細(xì)胞的增殖和促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，所述方法包括
a)用含有編碼權(quán)利要求25所述多肽的核酸分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；
b)在允許所述核酸分子表達(dá)成多肽的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和
c)分離所述多肽。
29.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效量的權(quán)利要求2所述人IL-2突變蛋白和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
30.一種刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的方法，其特征在于，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的人IL-2突變蛋白，其中，在相等試驗(yàn)條件下，與類似量的選自脫丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的參比IL-2分子相比，所述突變蛋白能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的促炎癥細(xì)胞因子，和保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖，其中用NK-92生物試驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞增殖和所述促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述人IL-2突變蛋白含有選自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的殘基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的丙氨酸殘基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的半胱氨酸殘基。
33.一種治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，其特征在于，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的人IL-2突變蛋白，其中在相似的試驗(yàn)條件下，與類似量的選自脫丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的參比IL-2分子相比，所述突變蛋白能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的促炎癥細(xì)胞因子，和保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖，其中用NK-92生物試驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞增殖和所述促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述人IL-2突變蛋白含有選自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的殘基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的丙氨酸殘基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的半胱氨酸殘基。
36.一種減輕經(jīng)過(guò)IL-2給藥治療方案的對(duì)象中白介素-2(IL-2)誘導(dǎo)的毒性癥狀的方法，其特征在于，該方法包括給予IL-2突變蛋白作為所述IL-2，其中所述IL-2突變蛋白含有選自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的殘基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的丙氨酸殘基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的半胱氨酸殘基。
37.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白的最大耐受劑量高于脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2觀察到的，其中所述最大耐受劑量用B16F10黑色素瘤動(dòng)物模型測(cè)定。
38.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，在相等治療條件下，與用脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治療相比，所述突變蛋白顯示了相同或改進(jìn)的抗腫瘤活性和降低的副作用，其中所述抗腫瘤活性用B16F10黑色素瘤動(dòng)物模型評(píng)價(jià)。
39.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，在相等治療條件下，與用脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治療相比，所述突變蛋白顯示了相同或改進(jìn)的抗腫瘤活性和降低的副作用，其中所述抗腫瘤活性用高等級(jí)非何杰金淋巴瘤Namalwa動(dòng)物模型或低等級(jí)非何杰金淋巴瘤Daudi動(dòng)物模型評(píng)價(jià)。
40.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，在相等治療條件下，與用脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治療相比，當(dāng)所述突變蛋白與利妥昔單抗共同給予時(shí)顯示了相同或改進(jìn)的抗腫瘤活性和降低的副作用，其中所述抗腫瘤活性用高等級(jí)非何杰金淋巴瘤Namalwa動(dòng)物模型或低等級(jí)非何杰金淋巴瘤Daudi動(dòng)物模型評(píng)價(jià)。
41.如權(quán)利要求39或40所述的分離的多肽，其特征在于，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，所述突變蛋白顯示了增強(qiáng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞激活作用。
42.如權(quán)利要求41所述的分離的多肽，其特征在于，所述突變蛋白顯示了增強(qiáng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞激活作用，所述細(xì)胞選自T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和噬中性粒細(xì)胞。
43.如權(quán)利要求40所述的分離的多肽，其特征在于，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，所述突變蛋白顯示了增強(qiáng)的抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)-介導(dǎo)的溶細(xì)胞殺傷效力。
44.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，所述突變蛋白在血管滲漏綜合征動(dòng)物模型中引起的血管滲漏較少。
45.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，與類似量的脫丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，所述突變蛋白在動(dòng)物模型中引起的體溫變化較少，其中所述動(dòng)物的體溫用溫度芯片監(jiān)測(cè)。
46.如權(quán)利要求6所述的分離的多肽，其特征在于，如用體內(nèi)溫度芯片測(cè)量體溫、測(cè)量血管滲漏或測(cè)量所述對(duì)象的最大耐受劑量所確定的那樣，所述突變蛋白當(dāng)給予對(duì)象時(shí)具有改進(jìn)的耐受性。
47.人IL-2突變蛋白在刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)方法中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的人IL-2突變蛋白，其中在相等試驗(yàn)條件下，與類似量的選自脫丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的參比IL-2分子相比，所述突變蛋白能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的促炎癥細(xì)胞因子，和保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖，其中用NK-92生物試驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞增殖和所述促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
48.人IL-2突變蛋白在治療哺乳動(dòng)物癌癥方法中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的人IL-2突變蛋白，其中在相似的試驗(yàn)條件下，與類似量的選自脫丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的參比IL-2分子相比，所述突變蛋白能誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的促炎癥細(xì)胞因子，和保持或增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖，其中用NK-92生物試驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞增殖和所述促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
49.人IL-2突變蛋白在降低經(jīng)過(guò)IL-2給藥治療方案的對(duì)象中白介素-2(IL-2)誘導(dǎo)的毒性癥狀方法中的應(yīng)用，其特征在于，該方法包括給予所述IL-2突變蛋白作為所述IL-2，其中所述突變蛋白含有選自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的殘基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的丙氨酸殘基；和
d)有a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位絲氨酸殘基的半胱氨酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明提供了新型人白介素-2(IL-2)突變蛋白或其變體、其核酸分子和變體。也公開了制備這些突變蛋白的方法和刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)的方法。此外，本發(fā)明提供含有本發(fā)明核酸分子的重組表達(dá)載體和已導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。包括含有治療有效量的本發(fā)明人IL-2突變蛋白和藥學(xué)上可接受運(yùn)載體的藥物組合物。與天然的IL-2或ProleukinIL-2相比，該IL-2突變蛋白制品毒性較低，同時(shí)保持或提高了NK細(xì)胞介導(dǎo)的作用，可用于制備治療癌癥和刺激免疫系統(tǒng)的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P37/04GK101426916SQ200580014421
公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2005年3月4日優(yōu)先權(quán)日2004年3月5日
發(fā)明者K·德尼斯-米澤, C·海斯, D·門尼澤斯, S·E·威爾森申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷公司

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該技術(shù)已申請(qǐng)專利。僅供學(xué)習(xí)研究，如用于商業(yè)用途，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：K.德尼斯-米澤;C.海斯;D.門尼澤斯;S.E.威爾森
技術(shù)所有人：諾華疫苗和診斷公司
我是此專利的發(fā)明人

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