專利名稱：野生型細(xì)胞因子的突變蛋白作為免疫原的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特定野生型細(xì)胞因子的突變蛋白作為免疫原的用途，該突變蛋白還是該野生型細(xì)胞因子的受體拮抗物，該免疫原誘導(dǎo)抗該野生型細(xì)胞因子的抗體產(chǎn)生，該抗體能夠中和由于所述野生型細(xì)胞因子的超量產(chǎn)生所致疾病中該細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。
例如，眾所周知，人白介素6(hIL-6)是一種184個氨基酸的多肽，屬于螺旋細(xì)胞因子類。白介素6是一種由多種細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子。它可以作為各種類型細(xì)胞的分化和生長因子，例如，免疫細(xì)統(tǒng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、造血干細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和神經(jīng)元。不過，hIL-6的超量產(chǎn)生可導(dǎo)致多種疾病，如慢性自免疫病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和癌性惡病質(zhì)。
為了預(yù)防和治療目的，本發(fā)明的這一具體方面總體上需要克服野生型細(xì)胞因子的超量產(chǎn)生，特別是hIL-6的超量產(chǎn)生。
本發(fā)明的用途可以滿足上述需要，同時提供其它優(yōu)點(diǎn)，通過以下說明可以了解這一點(diǎn)。
本發(fā)明的一個主題是一種野生型細(xì)胞因子的突變體用于制備用來治療或預(yù)防由于這種特定野生野細(xì)胞因子的超量產(chǎn)生所致的疾病的藥用化合物的用途。
本發(fā)明的另一個主題是用于治療由于野生型細(xì)胞因子的超量產(chǎn)生所致的疾病的藥用化合物，或用于預(yù)防所述疾病的含有該野生型細(xì)胞因子的至少一種突變體作為活性成分的疫苗。
可以用已知方法配制本發(fā)明的藥用化合物，例如，該方法需要有一種可以藥用的載體。所述載體和配制方法的例子可見于Remington′sPharmaceutical Sciences。為了生產(chǎn)一種適于有效施用的可以藥用的化合物，該化合物中必須含有有效量的本發(fā)明活性成分。給患者施用適于其疾病、體重、性別和年齡的用量的本發(fā)明藥用化合物。其它因素包括施用方法?？梢远喾N方式施用本發(fā)明的藥用化合物，例如，皮下、局部、口服和肌內(nèi)注射。
含有一種野生型細(xì)胞因子的至少一種突變蛋白作為活性成分的本發(fā)明藥用化合物可以多種形式以治療劑量在常見施用載體中施用。
例如，可以片劑、膠囊、丸劑、粉劑、顆粒、酏劑、軟膏、溶液、懸液、糖漿和乳液之類的劑型按劑量口服，或注射使用。本發(fā)明的化合物同樣可以靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、皮下施用、有或沒有包含體的局部施用、或肌內(nèi)注射。對于藥學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，以上所有劑型都是公知的。在任何情況下都必須使用有效但非毒性量的本發(fā)明活性成分。
該活性成分的日用劑量可以在0.01-1000mg/成人/日的大范圍內(nèi)變動。本發(fā)明有效量的活性成分通常以大約0.001-大約100mg/公斤體重/日的劑量提供。
根據(jù)本發(fā)明，由一種特定野生型細(xì)胞因子組成的活性成分通?？梢耘c適當(dāng)選擇的合適稀釋劑、賦形劑或藥用載體(通常是指通用名詞“載體”)混合的混合物形式施用，以便顧及理想的施用形式。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本發(fā)明疫苗的制備是已知的。通常，所述疫苗被制成可注射形式，或是溶液或是懸浮液。該制劑可以乳化或?qū)⑺龌钚猿煞职谥|(zhì)體中。該活性免疫成分通常與和該活性成分相容的藥用賦形劑混合。例如，合適的賦形劑有水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其組合形式。另外，如果必要，該疫苗可以含有少量的添加物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑，pH緩沖劑，和/或佐劑，以提高該疫苗的效力。
本發(fā)明的疫苗最好以腸胃外形式施用，例如，以肌內(nèi)或皮下注射形式施用。適用于其它施用方法的其它制劑包括栓劑和口服制劑。該化合物含有10-95％的活性成分，優(yōu)選為25-79％。
至此，已對本發(fā)明做過大致說明。通過以下例子可給出更詳細(xì)的說明，指明與本發(fā)明有關(guān)的特定場合，以便更好地理解本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)和可能的用途。


圖1a和1b表示用野生型hIL-6對正常小鼠和NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖2a和2b表示用其被簡稱為Sant1的突變型(含有突變Tyr31Asp、Gly35Phe、Ser118Arg、Val121Asp、Gln175Ile、Ser176Arg、Gln183Ala，且為hIL-6的拮抗物)對正常小鼠和NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖3表示為了證實(shí)在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗Sant1的抗體是否也能夠識別野生型IL-6所做實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖4表示為了證實(shí)在用野生型白介素6突變體Sant1免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的抗體是否能夠中和野生型人白介素6的生物學(xué)活性所做實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖5a和5b表示例7中所做實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖6a和6b表示例11中所做實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
例1用hIL-6和Sant1對具有hIL-6免疫耐受性的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫。
在大鼠神經(jīng)特異性烯醇化酶基因啟動子的控制下，在NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組中已整合了人白介素6的cDNA。
通過用重組人IL-6對上述NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠(每組5只小鼠)進(jìn)行免疫證實(shí)了上述耐受性理論；將同窩幼仔中無轉(zhuǎn)基因的同胞用作對照。同樣用一種被稱為Sant1的IL-6的突變體(對于人體細(xì)胞它不再具有殘余生物學(xué)活性，并可作為一種h-IL6受體拮抗物)對一組5只NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫，所述突變體具有以下7個突變Tyr31Asp、Gly35Phe、Ser118Arg、Val121Asp、Gln175Ile、Ser176Arg、Gln183Ala。在這種情況下，同樣是把同窩幼仔中無轉(zhuǎn)基因的5個同胞用作對照。免疫方法如下在零時刻，依次從每只動物(轉(zhuǎn)基因的和非轉(zhuǎn)基因的)體內(nèi)采集血樣(免疫前樣品)，然后通過腹膜內(nèi)(IP)注射100μg含有完全弗氏佐劑(CFA)的抗原(根據(jù)小鼠組，為野生型hIL-6或Sant1)對每只動物進(jìn)行免疫。在首次免疫10天后采集血樣(樣品1)。首次免疫20天后進(jìn)行第二次免疫(首次加強(qiáng))，再次使用含有不完全弗氏佐劑(IFA)的100μg抗原，10天以后(從首次免疫起30天后)第二次采集血樣(樣品2)。最后，在首次免疫40天后，再次用含有IFA的100μg抗原進(jìn)行第3次免疫，10天后(從首次免疫起50天后)第三次采集血樣(樣品3)。用已有方法從每種血樣中制備相應(yīng)的血清。
此時，用“EL1SA”法(酶聯(lián)免疫吸附測定)檢測獲自第二和第三樣品的血清中是否存在針對用于免疫的抗原的抗體。為此，以非共價形式將免疫用的同一種抗原結(jié)合在專門為此類實(shí)驗(yàn)所生產(chǎn)的培養(yǎng)板(ELISA板)上的孔的底部?？乖墓潭ɑ饔檬峭ㄟ^在室溫下在每一個待涂敷的孔中培養(yǎng)100μl以10μl/ml的濃度溶于1×PBS的抗原溶液14小時而實(shí)現(xiàn)的(這種操作被稱為“涂敷”)?？乖潭ɑ?，用蛋白涂敷孔中的塑性物質(zhì)，在室溫下在每個孔中培養(yǎng)由1×PBS配制的0.8％BSA(牛血清白蛋白)溶液4小時(這一操作被稱為“封閉”)。在除去“封閉”溶液之后，將100μl經(jīng)適當(dāng)稀釋的每種血清在每一個孔中在室溫下單獨(dú)培養(yǎng)90分鐘在此期間，血清中如果有針對固定在孔底的抗原的任何抗體，這些抗體將結(jié)合抗原本身，并最終被結(jié)合在孔的底部。在經(jīng)過90分鐘的培養(yǎng)期之后，從孔中除去血清，并在適當(dāng)洗滌之后將100μl由1×PBS配成的含有抗小鼠抗體的兔抗體的0.8％BSA加至每一個孔中，并在室溫下繼續(xù)培養(yǎng)50分鐘。在此期間，如果小鼠抗體已識別并結(jié)合在固定于孔底部的抗原上，這些小鼠抗體將由兔抗體識別并結(jié)合，從而再把兔抗體固定在孔的底部。另外，由DAKO公司生產(chǎn)并出售的抗小鼠抗體的兔抗體(在上述實(shí)驗(yàn)中，以1∶100的比例稀釋于PBS/BSA中使用)，被共價連接于一種酶即辣根過氧化物酶上。在經(jīng)過50分鐘培養(yǎng)之后，除去含有兔抗體的溶液，并適當(dāng)清洗孔。此時，向每個孔中加入100μl含有辣根過氧化物酶底物(TMB3，-3′，-5，-5′-四甲基聯(lián)苯胺二氯化物)溶液。該酶將所述底物轉(zhuǎn)化成一種可吸收450nm的可見光的產(chǎn)物；因此，由通過ELISA讀數(shù)儀在450nm下在每一個孔中測得的分光光度測定值可計算出轉(zhuǎn)化量。如果該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的得當(dāng)，其測得的吸收值(即光吸收量)與酶的量成比例，酶的量又與兔抗體量成比例，兔抗體又與抗最初存在于血清中的抗原的小鼠抗體量成比例。因此，吸收值可用于估算抗存在于血清中的抗原的小鼠抗體的量。如果抗所述抗原的小鼠抗體是上述反應(yīng)鏈的制約因素的話，情況即是如此。因此，為了得到適當(dāng)條件，建議對每一種待檢測的血清進(jìn)行一系列的稀釋(從1∶33到1∶8100)，因此，對于每一種血清來說，都有一些稀釋度，其中，針對免疫所用抗原的小鼠抗體量高到足以進(jìn)行精確測定，但尚未高到使該系統(tǒng)飽和。
野生型IL-6(wtIL-6)對典型的正常小鼠和典型的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖1a和圖1b中。如圖1a所示，正常小鼠產(chǎn)生了大量的抗-wtIL-6抗體，該量大到即使將血清稀釋到1∶8100仍可以檢測到信號的程度。反之，如圖1b所示，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了很少量的抗體事實(shí)上，當(dāng)以1∶300的比例稀釋來自第二樣品的血清和以1∶2700的比例稀釋來自第三樣品的血清時，該信號就中止了。為了對所有動物進(jìn)行可比較的客觀測定，通常將能產(chǎn)生比同一動物的免疫前血清的最高讀數(shù)高0.5O.D450的讀數(shù)的血清稀釋度稱為“效價”。圖1a和1b表示如何分別計算正常小鼠和NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的第二和第三樣品的效價。
圖2a和2b表示用一種IL-6的突變形式Sant1分別對典型的正常小鼠和典型的NSE-hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在這種情況下，兩種小鼠均產(chǎn)生大量的抗-Sant1抗體。事實(shí)上，即使將血清稀釋到1∶8100仍可檢測到較強(qiáng)信號。圖2a和2b表示如何計算正常小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的第二和第三樣品的效價。
表1對該實(shí)驗(yàn)中接種的所有小鼠的第二和第三樣品的效價數(shù)據(jù)(以上述方法計算)進(jìn)行了歸納。
表1Sant1的免疫原性小鼠組 血清效價第二樣品 第三樣品WT/wtIL-616245 51501711003900181250260019430 160020210 1800平均 674 3010NSE/wtIL-61180 921290 2151324 15514135 1351527 54平均 71 130wt小鼠效價/NSE 小鼠效價之比9.5 23WT/Sant16 150 2707 1450死亡8 290036009 130027001033003800平均 18202600NSE/Sant11 4000 40002 21.5 493 1750 ＞100004 1750 11505 2000 1800平均1900 3400wt小鼠效價/NSE 小鼠效價之比1 0.76可以看出，對于用wtIL-6抗原接種的小鼠來說，除了每只動物之間的差別外，平均而言，非轉(zhuǎn)基因小鼠對wtIL-6產(chǎn)生的抗體反應(yīng)比NSE/IL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的強(qiáng)10-20倍，這可以作為轉(zhuǎn)基因小鼠已出現(xiàn)人hIL-6免疫耐受性的證據(jù)。
相反，可以看出，對于用抗原Sant1接種的小鼠來說，同樣是除了每只動物之間的差別外，平均而言，非轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的抗體反應(yīng)與NSE/hIL-6小鼠的相同。這表明，引入hIL-6時形成Sant1的7個突變也使得突變體Sant1完全成為免疫系統(tǒng)的外源蛋白，否則該系統(tǒng)對hIL-6具有耐受性。
例2在用Sant1免疫的NSE/hIL-6血清中產(chǎn)生的抗體不僅能夠識別Sant1，而且能夠識別野生型hIL-6該實(shí)驗(yàn)是為了驗(yàn)證由小鼠產(chǎn)生的抗Sant1的抗體是否不僅能夠識別Sant1本身，而且能夠識別wthIL-6。通過一個ELISA試驗(yàn)再次驗(yàn)證了這一假設(shè)。在證實(shí)了用Sant1免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的抗體能夠識別并結(jié)合固定在ELISA板孔底部的突變體Sant1之后，在第二個實(shí)驗(yàn)中，以非共價形式將wtIL-6結(jié)合在ELISA板孔的底部。在孔中的塑性物質(zhì)被BSA飽和之后，將由Sant1免疫的小鼠的血清稀釋液加入孔中，以證實(shí)是否存在能識別wtIL-6的抗體。例如，圖3表示了NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖所示，對Sant1和wtIL-6的抗體反應(yīng)極其相似。換句話說，在第三樣品的血清中能檢測到結(jié)合于固定在孔底部的wtIL-6的抗體的存在，即使將血清以1∶8100的比例稀釋仍能測出抗體的存在。應(yīng)當(dāng)指出，當(dāng)直接用wtIL-6對NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫時，對wtIL-6本身的抗體反應(yīng)較弱事實(shí)上，在稀釋至1∶8100的血清中不能檢測到抗-wtIL-6抗體(圖1)。其它NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出與本例中小鼠相似的反應(yīng)。
例3在用Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠中所產(chǎn)生的抗體也能夠中和wthIL-6的生物學(xué)活性其目的是驗(yàn)證在用Sant1免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的、能識別wtIL-6的抗體是否也能中和wtIL-6自身的生物學(xué)活性。
所述wtIL-6的生物學(xué)活性是指在人Hep3B肝癌細(xì)胞中刺激經(jīng)由C-反應(yīng)蛋白基因啟動子的轉(zhuǎn)錄的能力。用現(xiàn)有方法測定轉(zhuǎn)錄刺激的效果(Gregory，B.，Savino，R.和Ciliberto，G.，J.ImmunologicalMethods，170，47-56，1994)。在有獲自兩種NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠#4和#5(均用Sant1免疫)的第三樣品中得到的血清連續(xù)稀釋液的條件下，用4ng/ml wtIL-6刺激人Hep3B肝癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。可以看出，兩種血清在稀釋到1∶100時，幾乎能完全抑制4ng/ml的wthIL-6對人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性。
此時，驗(yàn)證對wthIL-6的交叉抗體反應(yīng)的出現(xiàn)是否能夠改變在用Sant1免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中測得的wthIL-6含量。通過現(xiàn)有技術(shù)的“夾心”ELISA測定法測hIL-6含量，使用由“R&DSystems”公司生產(chǎn)的市售試劑盒，完全按照生產(chǎn)商的說明書操作。對用Sant1免疫的4只轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行測定，在其免疫前樣品及第三樣品中均測出hIL-6的含量。結(jié)果歸納在表2中。如表2所示，用Sant1免疫，除了能導(dǎo)致識別Sant1本身和wtIL-6的強(qiáng)抗體反應(yīng)的出現(xiàn)之外，還會造成用R&D Systems生產(chǎn)的ELISA“夾心”試劑盒測得的NSE/hIL-6小鼠血清中的hIL-6含量平均下降500倍以上。
表2-在NSE/hIL-6小鼠血清中可檢測到的hIL-6含量的下降血清中hIL-6含量小鼠號 免疫前血清第三樣品1 26ng/ml 0.02ng/ml2 39ng/ml 0.01ng/ml3 28ng/ml 0.10ng/ml4 35ng/ml 0.10ng/ml平均 32ng/ml 0.057ng/ml例4在由Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠中產(chǎn)生的抗體也能夠在體內(nèi)中和野生型hIL-6的生物學(xué)活性眾所周知，IL-6可誘發(fā)肝臟產(chǎn)生一系列的蛋白(稱為“急相蛋白”)。在急性反應(yīng)期間，血清淀粉樣蛋白A(Serum AmyloidA，下文稱之為SAA)表現(xiàn)出劇烈而迅速的提高。
其目的是驗(yàn)證在由Sant1免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的抗體(能夠與wt IL-6交叉反應(yīng))是否也能夠在體內(nèi)中和wt hIL-6的生物學(xué)活性，以在注射hIL-6后對小鼠SAA(mSAA)提高的抑制為指標(biāo)進(jìn)行測定。為此，從未免疫的(對照)NSE/hIL-6小鼠、從用wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠以及從Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠體內(nèi)采集血樣(下文中稱之為注射前樣品)。在所述動物從放血中恢復(fù)之后，對其腹膜內(nèi)注射10μgwt hIL-6。注射9小時后，從兩組動物中采集第二血樣(下文中稱之為“注射后樣品”)。按照現(xiàn)有技術(shù)方法通過“夾心”ELISA測定測注射前樣品與注射后樣品中的mSAA的含量，采用由“Biosource International”公司生產(chǎn)的市售試劑盒，并完全按照生產(chǎn)商的說明書操作。結(jié)果如表3所示?？梢钥闯觯嗣恐粍游镏g的差別外，平均而言，在注射10μghIL-6的未免疫的小鼠中測出其血清SAA含量明顯提高，而在注射相同量的hIL-6的由Sant1免疫的小鼠中未見其血清SAA含量提高。因此，用Sant1免疫，除了導(dǎo)致出現(xiàn)能識別Sant1本身和wt hIL-6的強(qiáng)抗體反應(yīng)之外，所述抗體反應(yīng)能在體外中和wt hIL-6對人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性，在體內(nèi)抑制由于注射hIL-6所引起的mSAA含量的提高，換句話說，還能在體內(nèi)中和hIL-6的生物學(xué)活性。應(yīng)當(dāng)指出，用wt hIL-6免疫可誘導(dǎo)少量抗hIL-6抗體的產(chǎn)生(見例1)，但它不能抑制因注射hIL-6引起的體內(nèi)mSAA含量的提高，因?yàn)橛靡吧蚳IL-6免疫的小鼠表現(xiàn)出與未免疫對照小鼠相當(dāng)?shù)难錝AA含量提高。
表3-在注射hIL-6之后在Sant1-免疫小鼠和對照NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠血清中可測出的mSAA含量的提高。
血清中mSAA含量 mSAA含量倍增小鼠組 小鼠號 注射前樣品 注射后樣品 單只小鼠 組平均1 68μg/ml-24μg/ml0.35Sant1 3 23μg/ml14μg/ml 0.61免疫 2883μg/ml93μg/ml 1.12 1.133662μg/ml105μg/ml1.73795μg/ml177μg/ml1.875 112μg/ml 718μg/ml6.48 41μg/ml694μg/ml16.9對照 14140μg/ml 613μg/ml4.4 9.01未免疫的 2147μg/ml479μg/ml10.132251μg/ml412μg/ml8.15153μg/ml433μg/ml8.151172μg/ml784μg/ml10.3wthIL-6 1254μg/ml380μg/ml6.98.9免疫的1328μg/ml310μg/ml11.11516μg/ml117μg/ml7.2例5
用由不同佐劑，氫氧化鋁配制的hIL-6和Sant1對NSEhIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疲眾所周知，當(dāng)用不同的佐劑進(jìn)行配制時，不同的抗原的表現(xiàn)也不同(Gupta，R.K.和Siber，G.R.，Vaccine，13，1263-1276，1995)。披露于例1中的用于免疫實(shí)驗(yàn)的完全(或不完全)弗氏佐劑因?yàn)槠涓弊饔枚荒苡糜谌梭w，這些副作用大多為注射部位的局部反應(yīng)，如肉芽腫和胞囊形成(Gupta，R.K.和Siber，G.R.，Vaccine，13，1263-1276，1995)。其目的是驗(yàn)證采用供人體免疫用的常用佐劑是否能在NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生具有抗Sant1且抗wt hIL-6的高效價抗體的類似免疫反應(yīng)。為此，選擇氫氧化鋁，因?yàn)樗悄壳俺Ｓ糜谌梭w的佐劑，具有良好的安全記錄(Gupta，R.K.和Siber，G.R.，Vaccine，13，1263-1276，1995)。
每次通過腹膜內(nèi)注射100μg抗原(或?yàn)镾ant1或?yàn)閣t hIL-6)對8-10只NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠組(加上10只作為對照的同窩仔中的非轉(zhuǎn)基因同胞)進(jìn)行免疫，所述抗原用氫氧化鋁配制，濃度為1mg/ml，總體積為100μl(100μg氫氧化鋁)，采用與例1相同的免疫方法。然后檢測第二血樣(在第二次注射或第一次加強(qiáng)后采集)和第三血樣(在第三次注射或第二次加強(qiáng)后采集)中是否存在抗用于免疫的抗原的抗體，檢測方法用例1中的“ELISA”方法。
為了對所述動物進(jìn)行可比較的客觀測定，通常將產(chǎn)生比同一動物的免疫前血清的最高讀數(shù)高0.5O.D.450的血清稀釋度稱為“效價”。如圖1a、1b、2a和2b所示，測定用wt hIL-6和Sant1免疫的正常和轉(zhuǎn)基因小鼠的效價。結(jié)果如表4所示。
一般，在該免疫實(shí)驗(yàn)中獲得的抗所用抗原的抗體量(效價)高于在例1所述免疫實(shí)驗(yàn)中獲得的抗體量；實(shí)際上，作為現(xiàn)有技術(shù)的一部分，鋁佐劑是選擇的用于誘導(dǎo)血清抗體的佐劑(Gupta，R.K.和Siber，G.R.，Vaccine，13，1263-1276，1995)。更具體地講，就用wt hIL-6抗原免疫的小鼠而言，同樣可以看出(除了動物個體之間的差異外)，平均來說，非轉(zhuǎn)基因小鼠所產(chǎn)生的對wt hIL-6的抗體反應(yīng)比在NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的抗體反應(yīng)強(qiáng)12-18倍，這就是轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了對人IL-6的免疫耐受性的證據(jù)，即使注射以氫氧化鋁為佐劑配制的所述抗原時也是如此。相反，對于用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的小鼠來說，可以看出，在這種情況下平均而言，非轉(zhuǎn)基因小鼠所產(chǎn)生的抗體反應(yīng)與在NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的抗體反應(yīng)相同，這與例1所述的免疫實(shí)驗(yàn)相同，表明以上7個突變(在引入hIL-6時產(chǎn)生Sant1)已使該突變體完全成為外源蛋白，即使用氫氧化鋁配制時也是如此。
表4.用氫氧化鋁配制的Sant1和wt hIL-6經(jīng)腹膜內(nèi)注射免疫NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型對照小鼠后的免疫原性血清效價小鼠組 小鼠號第二樣品 第三樣品通過腹 302196011848膜內(nèi)注 326070 15790射用氫 347460 46000氧化鋁 461414519600配制的 496240 18600wthIL-6 541270 6960免疫 56218 320的非轉(zhuǎn) 585470 5260基因 632138 2373小鼠 651200 3810組平均 6617 13056通過腹 35450 530膜內(nèi)注 512200 1630射用氫 53169 100氧化鋁 60160 630配制的 7555 217wthIL-6 8581 1440免疫的87 110176NSE/ 90 64 390hIL-6 93 1900 1700小鼠 99 194555組平均 538737通過腹20 7270 28185膜內(nèi)注21 7580 30200射用氫26 3555 54330氧化鋁27 2185 10960配制的28 9060 35700Sant1 29 7910 34515免疫的33 7380 43980非轉(zhuǎn) 34 1160 10550基因 36 5785 19880小鼠 43 5035 23155組平均 5692 29145通過腹22 4520 33105膜內(nèi)注35 3516 28690射用氫38 9990 44680氧化鋁44 3580 14430配制的46 1480 9940Sant1免 59 9780 20525疲的NSE/ 61 2360 63970hIL-6小鼠 79 2250 26330組平均 4400 30210
例6用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠血清中所產(chǎn)生的抗體不僅能識別Sant1，而且能識別wt hIL-6該例是為了驗(yàn)證在用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的NSE小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗Sant1抗體是否能夠與wt hIL-6發(fā)生交叉反應(yīng)。用與例2所述相同方法，通過“ELISA”再次證實(shí)了這一點(diǎn)。用上述方法以及如圖1a、1b、2a和2b所示計算抗體效價，所得數(shù)據(jù)如表5所示。
表5.用由氫氧化鋁配制的Sant1通過腹膜內(nèi)注射免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的血清對wt hIL-6的交叉反應(yīng)性。
第二樣品血清效價 第三樣品血清效價小鼠組 小鼠號wthIL-6 Sant1 wthIL-6 Sant1通過腹膜222525 4520 3118033105內(nèi)注射用351925 3516 1186028690氫氧化鋁387065 9990 4385044680配制的 443580 3580 1058514430Sant1 461480 1480 8675 9940免疫的NSE 599990 9780 2036020525/hIL-6 612800 2360 5200063970小鼠791980 2250 1489026330組平均3630 4400 2280028750同樣，當(dāng)把氫氧化鋁用作免疫佐劑時，抗Sant1和wt hIL-6的抗體效價相似。同樣，應(yīng)當(dāng)指出的是，當(dāng)用wt hIL-6對NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫時，針對wt hIL-6本身的抗體反應(yīng)很低例如，在用wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠組的第三血樣中，抗wt hIL-6的平均效價為737(見例5)，與之形成對比的是，用Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠組的抗wt hIL-6的平均效價為22800(高出13倍)。
例7在用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體還能中和wt hIL-6的生物學(xué)活性該例的目的是檢驗(yàn)在用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體是否除了能識別wt hIL-6之外，還能中和wt hIL-6本身的生物學(xué)活性。
所述wt hIL-6的生物學(xué)活性是指在人Hep3B肝癌細(xì)胞中刺激經(jīng)由C-反應(yīng)基因啟動子的轉(zhuǎn)錄作用的能力。用現(xiàn)有技術(shù)方法測定轉(zhuǎn)錄刺激的效果(Gregory，B.，Savino，R.和Ciliberto，G.，J.ImmunologicalMethods，170，47-56，1994)。用4ng/ml的wt hIL-6刺激人Hep3B肝癌細(xì)胞，并將其刺激度定為100％，或是在有獲自用Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠的第三血樣的血清的連續(xù)稀釋液的條件下用4ng/ml wt hIL-6刺激；在后一種情況下，其轉(zhuǎn)錄刺激度以僅用4ng/mlwt hIL-6培養(yǎng)的細(xì)胞所獲得刺激度的百分比表示。結(jié)果如圖5a和5b所示。可以看出，所有小鼠的血清在稀釋到1∶400時，幾乎能完全抑制4ng/ml的wt hIL-6對人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性。因此，對于用氫氧化鋁免疫的動物來說，中和外源添加的hIL-6對人肝癌細(xì)胞的生物活性的能力高于用CFA免疫的動物的(見例3，并比較圖5a和圖4)。當(dāng)用wt hIL-6免疫NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠時，所得到的極小量的抗hIL-6抗體不足以抑制wt hIL-6對人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性(見圖5b)。
在這種情況下，同樣要驗(yàn)證對wt hIL-6的交叉反應(yīng)的免疫反應(yīng)的出現(xiàn)是否會改變在用Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中測得的wt hIL-6含量。用例3所述方法，測定兩組小鼠的免疫前樣品和第三樣品中的hIL-6含量。結(jié)果歸納于表6中。可以看出，用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫，除了導(dǎo)致能識別Sant1本身和野生型hIL-6的強(qiáng)抗體反應(yīng)的出現(xiàn)之外，還會導(dǎo)致NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠血清中可檢測的hIL-6含量平均下降約1,400倍。用由相同佐劑配制的wt hIL-6本身來免疫，僅會導(dǎo)致血清中可檢測的hIL-6含量的有限的降低(與1400倍相比，其降低僅為3倍)。
表6.在用由氫氧化鋁配制的Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠血清中可檢測的hIL-6含量的降低血清中hIL-6含量(pg/ml)小鼠組 小鼠號 免疫前樣品 第三樣品通過腹 35 27505pg/ml 3522pg/ml膜內(nèi)注 51 24950pg/ml 2662pg/ml射用氫 53 25817pg/ml 4566pg/ml氧化鋁 60 23283pg/ml 9810pg/ml配制的 75 26373pg/ml 8186pg/mlwt hIL-685 23000pg/ml 8959pg/ml免疫的 87 25527pg/ml 9172pg/mlNSE/90 25590pg/ml 20041pg/mlhIL-6 93 23275pg/ml 5834pg/ml小鼠99 30830pg/ml 6582pg/ml組平均 25585pg/ml 7933pg/ml通過腹膜22 27300pg/ml*9pg/ml內(nèi)注射用35 31778pg/ml*9pg/ml氫氧化鋁38 25223pg/ml*9pg/ml配制的 44 29385pg/ml 41pg/mlSant1免 46 20600pg/ml*9pg/ml疫的NSE/59 22820pg/ml 45pg/mlhIL-6 61 23125pg/ml*9pg/ml小鼠79 24510pg/ml*9pg/ml組平均 25593pg/ml 18pg/ml星號(*)表示測試靈敏度的下限。
例8在用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠中產(chǎn)生的抗體能夠中和wt hIL-6在體內(nèi)的生物學(xué)活性該例的目的是驗(yàn)證在用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠中產(chǎn)生的抗體除了能識別wtIL-6之外，還能中和wthIL-6在體內(nèi)的生物學(xué)活性，如例4所述，通過測定因注射hIL-6所引起的鼠SAA(mSAA)血清含量的提高可以說明問題。該實(shí)驗(yàn)是按例4所述方法在未免疫的(對照)NSE/hIL-6小鼠和用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠上進(jìn)行的。結(jié)果歸納在表7中。可以看出，除了動物個體之間的差別外，平均而言，在注射10μg hIL-6的未免疫小鼠中同樣測出血清SAA含量增加了5～6倍。在用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的小鼠中，注射同樣量的hIL-6未見SAA含量增加。
表7.在注射hIL-6之后，在Sant1免疫的和對照的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中可測的mSAA含量的提高。
血清中mSAA含量mSAA含量倍增數(shù)小鼠組 小鼠號 注射前樣品 注射后樣品 單個小鼠 組平均226.1μg/ml 7.1μg/ml1.14354.4μg/ml 5.5μg/ml1.24387.4μg/ml 9.9μg/ml1.34Sant1 444.6μg/ml 6.5μg/ml1.4 1.19免疫小鼠 465.2μg/ml 6.9μg/ml1.33596.7μg/ml 7.5μg/ml1.13618.6μg/ml 10.2μg/ml 1.19798.8μg/ml 6.8μg/ml0.771585μg/ml265μg/ml3.11699μg/ml366μg/ml3.719296μg/ml 2997μg/ml 10.12041μg/ml146μg/ml3.6 5.41
未免疫21bis45μg/ml 276μg/ml 6.1的對照5541μg/ml 303μg/ml 7.45675μg/ml 291μg/ml 3.9因此，用Sant1免疫，除可導(dǎo)致能識別Sant1本身和wt hIL-6并能中和wt hIL-6在體外對人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性的強(qiáng)抗體發(fā)應(yīng)的出現(xiàn)外，還能抑制體內(nèi)因注射hIL-6所致的mSAA含量的提高，換句話說，還能在體內(nèi)中和hIL-6的生物學(xué)活性。
例9通過真皮內(nèi)施用途徑用由氫氧化鋁配制的hIL-6和Sant1對NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫上述例5、6、7和8表明，除了可以在否則對wt hIL-6有耐受性的動物體內(nèi)獲得對hIL-6本身的一種強(qiáng)的抗體反應(yīng)外，用由適于人體使用的佐劑(氫氧化鋁)配制的突變形式的hIL-6(Sant1)還能中和hIL-6的體外和體內(nèi)生物活性。不過，在例5所述的免疫實(shí)驗(yàn)中，通過腹膜內(nèi)注射注入抗原，這種方法不常用于人體免疫。其目的是驗(yàn)證用人體免疫用的施用方法是否能在NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)產(chǎn)生具有抗Sant1且抗wt hIL-6的高效價抗體的類似免疫反應(yīng)。
通過真皮內(nèi)方式(I.D.)對8-9只NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的組(加上10只作為對照的同窩生非轉(zhuǎn)基因同胞)進(jìn)行免疫，這種小鼠施用方式與用于人體的皮下(S.C.)施用方式相當(dāng)，這種方法在現(xiàn)有技術(shù)中目前被用于施用幾種疫苗。同樣，用與例1相同的免疫方法，每次用100μg抗原(Sant1或wt hIL-6)進(jìn)行注射，所述抗原用氫氧化鋁配制，濃度為1mg/ml，總體積為100μl(100μg氫氧化鋁)。再通過與例1中所述相同的“ELISA”方法檢驗(yàn)抗用于免疫的抗原的抗體在第二血樣(在第二次注射或第一次加強(qiáng)后采得)和第三血樣(在第三次注射或第二次加強(qiáng)后采得)中的存在。
為了對所有動物進(jìn)行可比較的客觀測定，通常將能產(chǎn)生比相同動物的免疫前血清的最高讀數(shù)高0.5O.D.450的讀數(shù)的血清稀釋度稱為效價。該效價是用如圖1a、1b、2a和2b所示方法對用wt hIL-6和Sant1免疫的正常和轉(zhuǎn)基因小鼠測得的。結(jié)果如表8所示。
同樣，對于用wt hIL-6抗原免疫的小鼠來說，可以看出(除了個體間的差別之外)，平均而言，非轉(zhuǎn)基因小鼠所產(chǎn)生的抗wt hIL-6的抗體反應(yīng)比在NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的反應(yīng)強(qiáng)40-50倍，這就是轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了對人IL-6的免疫耐受性的證據(jù)，當(dāng)該抗原以在氫氧化鋁中配制的形式通過真皮內(nèi)注射方式施用時也是如此。相反，對于用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的小鼠來說，在此情況下同樣可以看出，平均而言在非轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體反應(yīng)與在NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的反應(yīng)相同，與例1和5所述免疫實(shí)驗(yàn)相似，表明所述7個取代(在引入hIL-6時產(chǎn)生Sant1)已使該突變型完全成為外源蛋白，在用氫氧化鋁配制并通過真皮內(nèi)注射施用時也是如此。
表8.通過真皮內(nèi)注射(I.D.)用氫氧化鋁配制的Sant1和wt hIL-6在NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型對照小鼠上產(chǎn)生的免疫原性血清效價小鼠組 小鼠號 第二樣品第三樣品通過真 31 62204250皮內(nèi)注 45 888 1270射用氫 48 52 1150氧化鋁 50 10607640配制的 55 40504560wt hIL-657 43379260免疫的 61 40659020非轉(zhuǎn)64 13690 20000基因66 54607500小鼠65 680 700組平均 40506535
通過真皮47240 195內(nèi)注射用525125氫氧化鋁6230120配制的 8139160wt hIL-68697200免疫的NSE 9177100/hIL-6 96306 210小鼠2 25100組平均108 139通過真 25890 4610皮內(nèi)注 30540 3670射用氫 314370 13960氧化鋁 321770 10690配制的 377860 13235Sant1 398400 26680免疫的 407360 49774非轉(zhuǎn)456510 4770基因501000 16280小鼠53470 3100組平均3920 14680通過真 414640 5735皮內(nèi)注 422145 7640射用氫 471150 4490氧化鋁 481600 8700配制的 492110 6740Sant1 518980 20250
免疫的 5211400 23380NSE/hIL5620309880-6小鼠 65429014080組平均 426011210例10在用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠的血清里所產(chǎn)生的抗體不僅能識別Sant1，而且能識別wt hIL-6。
該例是要驗(yàn)證在通過真皮內(nèi)注射的施用方法用由氫氧化鋁配制的Sant1免疫的NSE小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體是否能夠與wt hIL-6發(fā)生交叉反應(yīng)。通過例2中所述“ELISA”方法再次證實(shí)了這一點(diǎn)。抗體效價按上述方法，和圖1a、1b、2a和2b所示進(jìn)行計算，所得數(shù)據(jù)見表9。
表9.用由氫氧化鋁配制的Sant1通過真皮內(nèi)注射免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的血清對wt hIL-6的交叉反應(yīng)性。
第二樣品血清效價第三樣品血清效價小鼠組小鼠號wt hLI-6 Sant1 wt hIL-6 Sant1通過真41960 4640 5800 5735皮內(nèi)注422720 2145 7820 7640射用氫47665 1150 2190 4490氧化鋁481010 1600 7075 8700配制的492660 2110 5060 6740Sant1免 516660 8980 17970 20250疫的NSE/ 5213380 11400 20740 23380hIL-6 562360 2030 7240 9880小鼠 654290 4290 10700 14080組平均 3856 4260 9400 11210
同樣，此時當(dāng)用氫氧化鋁作為佐劑通過真皮內(nèi)注射進(jìn)行免疫時，抗Sant1和wt hIL-6的抗體效價極為相似。此外，應(yīng)當(dāng)指出，當(dāng)用wt hIL-6對NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫時，對wt hIL-6本身的抗體反應(yīng)要低得多例如，在用wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠組內(nèi)第三血樣中抗wt hIL-6的平均效價為139(見例9)，與之對應(yīng)的是，在用Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠組內(nèi)抗wt hIL-6的平均效價為9400(比前者高70倍)。
例11在用由氫氧化鋁配制的Sant1通過真皮內(nèi)注射免疫的NSE/hII-6小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體也能夠中和wt hIL-6的生物學(xué)活性。
該例的目的是要驗(yàn)證在用由氫氧化鋁配制的Sant1通過真皮內(nèi)注射免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)所產(chǎn)生的這些抗體是否也能夠中和wt hIL-6本身的生物學(xué)活性。
同理，所述wt hIL-6的生物學(xué)活性是指刺激經(jīng)由C-反應(yīng)基因啟動子在人Hepa3B肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的能力。轉(zhuǎn)錄刺激的效果是按現(xiàn)有技術(shù)方法測定的(Gregory，B.，Savino，R.和Ciliberto，G.，J.ImmnologicalMethods，170，47-56，1994)。與例7所述情形一樣，用4ng/ml wt hIL-6刺激人Hep3B肝癌細(xì)胞，并將該刺激強(qiáng)度定為100％，或在獲自由Sant1和wt hIL-6通過真皮內(nèi)免疫的NSE/hIL-6小鼠的第三血樣的血清連續(xù)稀釋液的條件下用4ng/ml wt hIL-6進(jìn)行刺激；在后一種情況下，轉(zhuǎn)錄刺激度以僅用4ng/ml wt hIL-6培養(yǎng)的細(xì)胞所獲得的刺激的百分比形式表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6a和6b所示?？梢钥闯?，稀釋至1∶400的所有小鼠血清可抑制4ng/ml wt hIL-6對人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性的80％以上。同樣，應(yīng)當(dāng)指出的是，當(dāng)用wt hIL-6對NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫時，所得到的極少量的抗hIL-6抗體不足以抑制wt hIL-6對人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性(見圖6b)。
在這種情況下，同樣要驗(yàn)證這種抗wt hIL-6的交叉反應(yīng)免疫反應(yīng)的出現(xiàn)是否能夠改變在用Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠血清中測得的wt hIL-6的含量。用例3所述方法在兩組小鼠的免疫前樣品和第三樣品中測hIL-6的含量。結(jié)果歸納在表10中?？梢钥闯?，用由氫氧化鋁配制的Sant1通過真皮內(nèi)注射免疫的結(jié)果是，除了導(dǎo)致能識別Sant1本身和wt hIL-6的強(qiáng)抗體反應(yīng)的出現(xiàn)之外，還會使NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠血清中可檢測的hIL-6含量平均降低約350倍。相反，用由相同佐劑配制的wt hIL-6本身進(jìn)行免疫，僅能使血清中可測的hIL-6的含量發(fā)生有限的降低(僅降低2.4倍)。
表10.通過真皮內(nèi)注射用氫氧化鋁配制的Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠血清中可檢測的hIL-6含量的降低。
血清中IL-6含量(pg/ml)小鼠組 小鼠號 免疫前樣品第三樣品通過真皮47 23790pg/ml5684pg/ml內(nèi)注射用52 25450pg/ml3110pg/ml氫氧化鋁62 26190pg/ml4490pg/ml配制的wt81 24690pg/ml25930pg/mlhIL-6 86 22890pg/ml8600pg/ml免疫的 91 16600pg/ml6884pg/mlNSE/hIL 96 16760pg/ml5800pg/ml-6小鼠 2 22970pg/ml14670pg/ml組平均 22418pg/ml9396pg/ml通過真 41 21640pg/ml*9pg/ml皮內(nèi)注 42 19040pg/ml*9pg/ml射用氫 47 22940pg/ml173pg/ml氧化鋁 48 23990pg/ml*9pg/ml配制的 49 21640pg/ml79pg/mlSant1 51 25680pg/ml21pg/ml免疫的 52 24410pg/ml17pg/mlNSE/hIL 56 26540pg/ml204pg/ml
-6小鼠6520410pg/ml78pg/ml組平均 22920pg/ml66pg/ml星號(*)表示測試靈敏度的下限。
例12在用由氫氧化鋁配制的Sant1通過真皮內(nèi)注射免疫的NSE/hIL-6小鼠體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體也能在體內(nèi)中和wt hIL-6的生物學(xué)活性。
該例的目的是要驗(yàn)證在用由氫氧化鋁配制的Sant1通過真皮內(nèi)注射免疫的NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體是否也能在體內(nèi)中和wt hIL-6的生物學(xué)活性之一，如例4所示，該活性通常是指由注射hIL-6而在小鼠體內(nèi)引起的mSAA含量的提高。本實(shí)驗(yàn)是用例4所述方法用由氫氧化鋁配制的Sant1通過真皮內(nèi)注射免疫的NSE/hIL-6小鼠進(jìn)行的。將所取得的數(shù)據(jù)與例4(表3)和例8(表7)所述實(shí)驗(yàn)的對照未免疫小鼠的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果歸納在表11中?？梢钥闯?，除了動物個體之間的差別外，平均而言，通過注射hIL-6可使未免疫小鼠的SAA含量提高7倍，通過真皮內(nèi)注射用氫氧化鋁配制的Sant1免疫的小鼠則不能。
表11.在注射hIL-6之后在Sant1免疫的和對照NSE/hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中可檢測的mSAA含量的提高。
血清中mSAA含量mSAA含量倍增數(shù)小鼠組小鼠號 注射前樣品 注射后樣品 單個小鼠 組平均41 49μg/ml20μg/ml0.4642 10μg/ml9μg/ml 0.947 64μg/ml56μg/ml0.87Sant1 48 31μg/ml18μg/ml0.74免疫小鼠 49 8μg/ml 18μg/ml2.2 1.2251 23μg/ml23μg/ml1.052 23μg/ml40μg/ml1.756 39μg/ml41μg/ml1.05
6531μg/ml66μg/ml 2.1對照 5 112μg/ml 718μg/ml 6.4未免疫小鼠 8 41μg/ml694μg/ml 16.914140μg/ml 613μg/ml 4.41585μg/ml265μg/ml 3.11699μg/ml366μg/ml 3.719296μg/ml 2997μg/ml10.12041μg/ml146μg/ml 3.6 7.072147μg/ml479μg/ml 10.1321bis45μg/ml 276μg/ml 6.12251μg/ml412μg/ml 8.15153μg/ml433μg/ml 8.155541μg/ml303μg/ml 7.45675μg/ml291μg/ml 3.9因此，通過適用于人體的施用方法和佐劑用Sant1進(jìn)行的免疫，除了可導(dǎo)致能識別Sant1本身和wt hIL-6并能在體外中和wt hIL-6對人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性的強(qiáng)抗體反應(yīng)的出現(xiàn)之外，還能抑制因注射hIL-6引起的體內(nèi)mSAA含量提高，換句話說，還能在體內(nèi)中和hIL-6的生物學(xué)活性。
權(quán)利要求
1.一種野生型細(xì)胞因子的突變蛋白作為制備治療或預(yù)防因該特定野生型細(xì)胞因子的超量產(chǎn)生所致的疾病的藥用組合物的免疫原的用途，該突變蛋白還是所述細(xì)胞因子的受體拮抗物。
2.如權(quán)利要求1的野生型細(xì)胞因子的突變蛋白的用途，其中，所述野生型細(xì)胞因子是人白介素6。
3.權(quán)利要求2所述人白介素6的突變蛋白用于治療或預(yù)防因所述野生型細(xì)胞因子的超量產(chǎn)生所致的疾病的用途，所述疾病如慢性自身免疫病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和癌性惡病質(zhì)。
4.用于治療或預(yù)防因一種野生型細(xì)胞因子的超量產(chǎn)生所致的疾病的藥用化合物，其特征在于它含有至少一種藥理學(xué)有效量的所述野生型細(xì)胞因子的突變蛋白作為活性成分。
5.如權(quán)利要求4的藥用制劑，其含有根據(jù)需要的施用形式經(jīng)適當(dāng)選擇并定量的稀釋劑、賦形劑或藥用載體。
6.如權(quán)利要求4的用于對一種野生型細(xì)胞因子進(jìn)行免疫的疫苗，該細(xì)胞因子的超量產(chǎn)生會導(dǎo)致疾病，該疫苗含有所述細(xì)胞因子的至少一種突變蛋白作為活性成分，其以藥理學(xué)有效量含于稀釋劑、賦形劑或可以藥用的載體中。
7.如權(quán)利要求6的疫苗，用于對人白介素6進(jìn)行免疫，白介素6的超量產(chǎn)生會導(dǎo)致諸如慢性自身免疫病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和癌性惡病質(zhì)的疾病。
8.如權(quán)利要求7的疫苗，其含有稱為Sant1的、人白介素6(hIL-6)的突變蛋白作為活性成分，所述突變蛋白含有突變Tyr31Asp、Gly35Phe、Ser118Arg、Val121Asp、Gln175Ile、Ser176Arg、Gln183Ala。
9.如權(quán)利要求8的疫苗，其含有用氫氧化鋁配制的1mg/ml的突變蛋白Sant1作為活性成分，以每次0.1～100μg突變蛋白的量皮下注射3次。
10.如權(quán)利要求7的疫苗，其含有任何形式的hIL-6作為活性成分，該形式的hIL-6含有能使其成為hIL-6受體拮抗物的氨基酸取代。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防由一種特定的野生型細(xì)胞因子超量產(chǎn)生所導(dǎo)致的疾病的藥用化合物,其特征是其含有所述野生型細(xì)胞因子的至少一種突變體作為活性成分。從其最大范圍上講,本發(fā)明在于一種特定野生型細(xì)胞因子的突變蛋白作為免疫原的應(yīng)用,該突變蛋白還是所述細(xì)胞因子的受體拮抗物,該免疫原誘導(dǎo)抗這種野生型細(xì)胞因子的抗體的產(chǎn)生,并可以在因這種細(xì)胞因子超量產(chǎn)生所致的疾病中中和該細(xì)胞因子。圖4表示在用人白介素6進(jìn)行免疫的NSE/hIL－6轉(zhuǎn)基因小鼠中所產(chǎn)生的抗體能夠識別野生型白介素6,并能夠中和其生物學(xué)活性。
文檔編號A61P43/00GK1198098SQ96197295
公開日1998年11月4日 申請日期1996年8月22日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月1日
發(fā)明者G·希里伯托, R·薩維諾, R·科泰斯 申請人:布·安格萊荻公司分子生物學(xué)研究所