專利名稱：人的堿性fgf突變蛋白質(zhì)的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于制備一種成人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(下面簡寫成hbFGF)的突變蛋白質(zhì)的技術(shù)，其中hbFGF的至少一種組分氨基酸被另一種氨基酸所取代，這種突變蛋白質(zhì)可用作傷口愈合促進(jìn)劑。
堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)是一種多肽的激素，它具有大約17，000的分子量，且主要由腦下垂體分泌。bFGF最初是作為一種對成纖維細(xì)胞(如BALB/c3T3細(xì)胞)有很強(qiáng)的生長促進(jìn)作用的因子而被分離出〔D.Gospodarowicz，Nature 249，123(1974)〕。人們已知FGF對幾乎所有的來源于中胚層細(xì)胞都有生長促進(jìn)作用〔D.Gospodarowicz et al.，Nature Cancer Insitute Monograph 48，109(1978)〕。尤其是bFGF生成血管的作用，連同其細(xì)胞生長促進(jìn)作用都提出有將其用作創(chuàng)傷的治療醫(yī)藥和用作血栓形成、動脈硬化等疾病的預(yù)防和治療醫(yī)藥的可能性。
對hbFGF編碼的基因已由Abraham等人〔The EMBO Journal 5，2523～2528(1986)〕和Kurokawa等人〔FEBS Letters 213，189-194(1987)〕克隆化，并在動物細(xì)胞中表達(dá)〔The Journal of Biological Chemistry 263，16471-16478(1988)〕以及大腸桿菌中表達(dá)〔The Journal of Biological Chemistry 263，16297-16302(1988)〕。然而，該物質(zhì)生產(chǎn)并不充足，且最終的樣品太不穩(wěn)定以至于不能用作醫(yī)藥。為解決不穩(wěn)定性的各種研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對于hbFGF分子的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代的這類化合物具有高的穩(wěn)定性且表現(xiàn)出相同的生物活性(Biochemical and Biophsical Research Communication 151，701～708(1988)〕。
進(jìn)而，又已研究了一種制備一種突變蛋白質(zhì)的方法，其中hbFGF的至少一種組分氨基酸通過遺傳工程技術(shù)被另一種氨基酸所取代(見歐洲專利公開No.281，822)。
當(dāng)采用大腸桿菌制備重組蛋白質(zhì)時，經(jīng)常形成水不溶性內(nèi)包體以累積蛋白質(zhì)。當(dāng)所需物質(zhì)從這類內(nèi)包體中分離出并純化時，該內(nèi)包體通常被所加入的蛋白質(zhì)變性劑溶解。然而對于hbFGF突變蛋白質(zhì)，如此溶解的這種蛋白質(zhì)是失活的，目前還沒有研究出使其再活化的技術(shù)。
如果使用遺傳工程技術(shù)，這種突變蛋白質(zhì)可以大量累積并處于活化狀態(tài)，進(jìn)而可高產(chǎn)率地分離并提純，則hbFGF突變蛋白質(zhì)可以用作醫(yī)藥。因而，一個關(guān)鍵問題就是建立一種高產(chǎn)率制備這種突變蛋白質(zhì)的方法。
通常，當(dāng)采用遺傳工程技術(shù)制備大量基因產(chǎn)物時，則選擇寄主載體體系和啟動子是重要的，這種不同的選擇取決于各自基因。各種對于hbFGF突變蛋白質(zhì)的有效表達(dá)體系的研究結(jié)果已揭示出采用T7啟動子的一種大腸桿菌基因表達(dá)體系〔F.M.Studier et al.，Journal of Molecular Biology 189，113-130(1986)〕是表達(dá)hbFGF突變蛋白質(zhì)基因極好體系。T7啟動子和hbFGF突變蛋白質(zhì)基因的組合是新穎的。這種T7啟動子被認(rèn)為是一種強(qiáng)啟動子。然而在某些情況下，這種累積的蛋白質(zhì)(如人體內(nèi)白細(xì)胞素-2、促乳素)形成內(nèi)包體，并且其大多數(shù)都是以失活態(tài)累積的。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)內(nèi)白細(xì)胞素的例子，Paris，N.等人已發(fā)現(xiàn)促乳素例子〔Paris，N.et al，Biotechnology and Applied Biochemistry，12，436-449(1990)〕。
本發(fā)明者對于積累大量的、處于活性狀態(tài)的hbFGF蛋白質(zhì)進(jìn)行了深入研究，目前已發(fā)現(xiàn)加入低濃度的異丙基硫代吡喃型半乳糖苷是有效的。此外，本發(fā)明者進(jìn)而還建立一種有效地分離和純化hbFGF蛋白質(zhì)的方法，這樣完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供(1)含有對一種突變蛋白質(zhì)編碼的核苷酸序列的載體，在這種突變蛋白質(zhì)中，成人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(hbFGF)的至少一種組分氨基酸被另一種氨基酸所取代，而T7啟動子在其上游端;
(2)一種由上述(1)中所述載體轉(zhuǎn)化來的轉(zhuǎn)化體;
(3)上述(2)中所述的轉(zhuǎn)化體，其中寄主是具有一個處于lac啟動子下游端的T7RNA聚合酶基因;
(4)一種制備突變蛋白質(zhì)的方法，該突變蛋白質(zhì)中成熟hbFGF的至少一種組分氨基酸被另一種氨基酸所取代，這種方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述(2)中所述的轉(zhuǎn)化體;
(5)上述(4)中所述的方法，其中，大約3～500μM(毫摩爾)的異丙基硫代吡喃型半乳糖苷(下面簡寫為IPTG)在上述(3)所述轉(zhuǎn)化體的對數(shù)生長期內(nèi)加入到培養(yǎng)基中，接著進(jìn)行培養(yǎng);以及(6)上述(5)中所述的方法，其中含有突變蛋白質(zhì)產(chǎn)物的溶液使用色譜法進(jìn)行純化，并采用交聯(lián)多糖硫酸鹽、具有磺酸基團(tuán)作為交換基團(tuán)的合成聚合物和/或用于凝膠過濾的合成聚合物作為載體。
根據(jù)本發(fā)明，取代型的成熟hbFGF突變蛋白質(zhì)可以大量制備，因而本發(fā)明可用于工業(yè)化生產(chǎn)這種突變蛋白質(zhì)。


圖1示出了實(shí)施例1中使用的rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23的DNA核苷酸序列和核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列;
圖2是實(shí)施例1中得到的質(zhì)粒pTB960的結(jié)構(gòu)示意圖;
圖3示出了實(shí)施例5中獲得的純化試樣的SDS-pAGE圖和標(biāo)記;以及圖4至圖6給出了由實(shí)施例5中獲得的純化試樣的高性能液相色譜圖;
圖7至圖9是由實(shí)施例8獲得的質(zhì)粒pHP901，pME901和pCM901的結(jié)構(gòu)示意圖。
本發(fā)明的成熟的hbFGF是一種由146種氨基酸構(gòu)成的肽，在圖1中，將緊接于N-末端甲硫氨酸的氨基酸脯氨酸作為第一號，而將C-末端的絲氨酸作為第146號。
于本發(fā)明中給出的hbFGF突變蛋白質(zhì)的例子包括這類蛋白質(zhì)，即成熟hbFGF的至少一組分氨基酸被另一種氨基酸所取代，如歐洲專利公開說明書No.281，822和Biochemical and Biophysical Research Communication 151，701-708(1988)〕中所述。
至于此種突變蛋白質(zhì)(其中hbFGF的至少一種氨基酸被另一種氨基酸所取代)在取代前hbFGF的組分氨基酸的數(shù)目，它可以是任何數(shù)量，只要不喪失FGF的特性(如血管形成特性、細(xì)胞生長刺激活性和細(xì)胞分化活性)。
在取代前此組分氨基酸的例子包括半胱氨酸和與半胱氨酸不同的氨基酸。特別指出的是半胱氨酸是較佳的。除半胱基酸以外其他氨基酸在取代前作為組分氨基酸的包括天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸和纈氨酸。
當(dāng)取代前組分氨基酸是半胱氨酸時，中性氨基酸作為取代氨基酸是較佳的。中性氨基酸的具體例子包括甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。尤其絲氨酸和蘇氨酸是較佳的。
當(dāng)取代前組分氨基酸是除半胱氨酸以外的一種氨基酸時，選擇在親水性、疏水性和電荷不同于取代前此組分氨基酸的其他氨基酸作為取代氨基酸。特別是，取代前氨基酸是天冬氨酸時，取代氨基酸包括天冬酰胺、蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和精氨酸，而天冬酰胺和精氨酸是較佳的。
當(dāng)取代前氨基酸是精氨酸時，取代氨基酸包括谷氨酰胺、蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸。谷氨酰胺是特別優(yōu)選的。
當(dāng)取代前組分氨基酸是甘氨酸時，取代氨基酸包括蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸和精氨酸。蘇氨酸是特別優(yōu)選的。
當(dāng)取代前組分氨基酸是絲氨酸時，取代氨基酸包括甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和天冬氨酸，而甲硫氨酸是較佳的。
當(dāng)取代前組分氨基酸是纈氨酸時，取代氨基酸包括絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸和天冬氨酸，而絲氨酸是優(yōu)選的。
在取代前對作為原始的組分氨基酸來說，天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸和纈氨酸是優(yōu)選的。
對作為取代氨基酸來說，天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和亮氨酸是優(yōu)選的。
最佳的被取代的突變蛋白質(zhì)包括這樣一種突變蛋白質(zhì)，即其中的組分氨基酸半胱氨酸被絲氨酸取代。
在上述的取代反應(yīng)中，可以同時進(jìn)行至少兩種組分氨基酸的取代。較佳的是取代二至三種組分氨基酸。
在本發(fā)明中的hbFGF突變蛋白質(zhì)的較佳實(shí)施例包括成熟的hbFGF突變蛋白質(zhì)的至少一種半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基所取代而得到的突變蛋白質(zhì)。
作為突變蛋白質(zhì)，重組的hbFGF突變蛋白質(zhì)CS23(下文也簡寫為rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23)是特別優(yōu)選的，其中成熟的hbFGF的處于69和87位置的半胱氨酸殘基分別被絲氨酸殘基所取代。上述hbFGF的氨基酸位置已經(jīng)序化，其序化是將氨基酸序列中緊鄰于N-未端甲硫氨酸的氨基酸脯氨酸作為第一號，如圖1所示。
為制備這種突變蛋白質(zhì)，采用了定位點(diǎn)誘變。這種技術(shù)已廣為人知并由R.F.Lather和J.P.Lecoq論述在Gentic Engineering，P13-50，Academic Press(1983)中。定向于低核苷酸誘變由M.Smith和S.Gillam論述在Gentic EngineeringPrinciples and Methods，Vol 3，P1-32，Plenum Prese(1981)中。
制備編碼此突變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，例如可用下述步驟制備(a)將含有hbFGF結(jié)構(gòu)基因單鏈的一種單鏈DNA同一種致誘變的低核苷酸引物進(jìn)行雜交(上述引物互補(bǔ)于這樣一個區(qū)中，即該區(qū)包括半胱氨酸被這種單鏈取代的密碼子，或包括一種在某些情況下與這種密碼子配對的反義三聯(lián)體，已經(jīng)證明，這種情況不能應(yīng)用于不同于除上述密碼子的其他氨基酸的密碼子，或不同于在某些情況下的反義三聯(lián)體)，(b)用DNA聚合酶延伸該引物，形成一種突變異源雙鏈核酸分子，及(c)復(fù)制這種突變異源雙鏈核酸分子。
然后，將用于轉(zhuǎn)移經(jīng)誘變處理的基因的噬菌體DNA進(jìn)行分離并引入到一種質(zhì)粒中。
本發(fā)明所用的T7啟動子可采用在T7DNA上發(fā)現(xiàn)的17種啟動子的任何一種〔J.L.Oakley et al.，Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.74，4266-4270(1977);M.D.Rosa，Cell 16，815-825(1979);N.Panayotatos et al.，Nature 280，35(1979);J.J.Dunn et al.，J.Mol.Biol.166，477-535(1983)〕，而φ10啟動子〔A.H.Rosenberg et al.，Gene 56，125-135(1987)〕是優(yōu)選使用的。
作為本發(fā)明所用的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，任何終止區(qū)都可采用，只要它在大腸桿菌體系中起作用，而Tφ終止區(qū)(F.W.Studier et al.，J.Mol.Biol.189，113-130(1986)〕是優(yōu)選使用的。
用于本發(fā)明的T7RNA聚合酶包括T7基因1〔F.W.Studier et al.，J.Mol.Biol.189，113-130(1986)〕。
用于形成本發(fā)明所采用的載體的載體例子包括pBR322，pUC8，pUC9，pMB9，pRC7，pACYC177和pKN410。
用于本發(fā)明中的載體是通過將T7啟動子和T7終止區(qū)摻合入上述載體中而形成的。這類載體包括pET-1，pET-2，pET-3，pET-4和pET5〔A.H.Roseberg，Gene 56，125～135(1987)〕，而pET-3C(同前)是優(yōu)選的。
作為用于本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的寄主，任何已摻入T7RNA聚合酶基因(T7基因1)〔F.W.Studier et al.，J.Mol Biol.189，113-130(1986)〕的大腸桿菌菌株都可使用，例如MM294，DH-1，C600和BL21。菌株MM294和BL21是優(yōu)選使用的，其中包含T7基因1的λ噬菌體已被溶源化。該T7RNA聚合酶基因也可作為一種具有與表達(dá)載體不同源的質(zhì)粒來寄存。在這種情況下，對T7基因1的啟動子是采用lac啟動子，它的表達(dá)是用異丙基-1-硫代-β-D-吡喃型半乳糖苷(IPIG)誘導(dǎo)的。
用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可通過使用本領(lǐng)域中已知的方法，用對T7啟動子表達(dá)有基因轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的質(zhì)粒將已摻合了上述T7基因1(RNA聚合酶基因)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化而獲得，這些方法如描述在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，2110(1972)和Gene 17，107(1982)中的。在這些情況下，所用的寄主可先用具有T7溶菌酶基團(tuán)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，這樣得到的轉(zhuǎn)化體同時具有兩種不同的質(zhì)粒。
當(dāng)此轉(zhuǎn)化體被培養(yǎng)時，液態(tài)培養(yǎng)基是特別適用于作為培養(yǎng)用介質(zhì)。碳源、氮源、無機(jī)化合物和其它轉(zhuǎn)化體生長必需的物質(zhì)也含于其中。碳源包括，例如葡萄糖、糊精、溶解淀粉和蔗糖。氮源包括無機(jī)或有機(jī)物質(zhì)，例如銨鹽、硝酸鹽、谷物浸漬液、胨、酪蛋白、酪蛋白氨基酸、肉浸計(jì)、大豆粗粉和土豆提取液。無機(jī)化合物的例子包括氯化鈣、磷酸氫二鈉和氯化鎂、酵母提取液、維生素、生長促進(jìn)因子和類似物進(jìn)而也加入其中。
培養(yǎng)基的PH值希望是6至8。
作為用于培養(yǎng)E.coli轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，較優(yōu)選的是，如M9培養(yǎng)基(Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics 431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972)，另外加了葡萄糖和酪蛋白氨基酸。鐵離子也可加入到此培養(yǎng)基中。鐵離子是那些在溶液中可離解成鐵離子的物質(zhì)或著是可以鐵離子形式使用的物質(zhì)。這類物質(zhì)包括鐵鹽，較佳是二價或三價鐵無機(jī)鹽，例如氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵或硫酸鐵、磷酸鐵和硝酸鐵。鐵離子的加入量為約10-6至10-4摩爾，較佳的加入量是5×10-6至5×10-5摩爾。培養(yǎng)過程通常在15°至43℃進(jìn)行約3至72小時，較佳是約12至48小時，如必要進(jìn)行通氣或攪拌。
對于基因表達(dá)，比較好的是在培養(yǎng)過程中加入IPTG。由此，連接于lac啟動子下游端的T7基因1(RNA聚合酶基因)被表達(dá)，而由此制備的T7噬菌體RNA聚合酶1識別出T7啟動子。依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，為表達(dá)lac啟動子，IPTG加入量為0.1至20毫摩爾，較佳是1至2毫摩爾〔達(dá)到1毫摩爾IPTGLφbner-Olesen等人，Cell，57 881-889(1989);2毫摩爾的IPTGErnst H.等人，Gene，68，345-355(1988);20毫摩爾的IPTGLuck，D.N.等人DNA，5，21-28(1986)〕。然而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過加入這樣量的IPTG在誘導(dǎo)表達(dá)中累積的蛋白質(zhì)形成內(nèi)含體，其有時得到失活的蛋白質(zhì)累積。關(guān)于以溶解狀態(tài)累積蛋白質(zhì)的方法的各種研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過程中，加入約3至500μM的IPTG可首先達(dá)到目的，較佳的是加入約3至300μM，更佳的是6至200μM，而最佳的是約6至80μM。當(dāng)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)如槽培養(yǎng)時，IPTG的加入量以約10至50μM為佳，較佳是10至200μM，更好是10至100μM，而最佳是10至80μM。當(dāng)進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)時如瓶培養(yǎng)時，IPTG的較佳的加入量是3至100μM，更佳的是6至8μM。IPTG首先加入是在開始培養(yǎng)后的1至24小時內(nèi)，較佳是3至12小時內(nèi)，而IPTG最好是在對數(shù)生長期內(nèi)加入。此后IPTG按需要以間歇式或連續(xù)式加入。含有IPTG的培養(yǎng)基是在溫度約20°至40℃，較佳是約20至30℃下培養(yǎng)。作為異丙基硫代吡喃型半乳糖苷的替代物，在某些場合下可使用，如丙基硫代吡喃型半乳糖苷，甲基硫代吡喃型半乳糖苷、丁基硫代吡喃型半乳糖苷和環(huán)己基硫代吡喃型半乳糖苷。
在本發(fā)明中的hbFGF突變蛋白質(zhì)可從上述培養(yǎng)基中分離和純化，例如，可利用下面方法。
當(dāng)本發(fā)明的hbFGF突變蛋白質(zhì)從培養(yǎng)細(xì)胞中提取時，這些細(xì)胞采用本領(lǐng)域已知的方法例如離心法在培養(yǎng)后收集。然后將收集到的細(xì)胞通過玻璃球、French擠壓超聲波處理、溶菌酶處理和/或凍結(jié)-解凍進(jìn)行破裂。用玻璃球破裂是尤其優(yōu)選的。
人們對純化依據(jù)本發(fā)明由上述上清液獲得的hbFGF突變蛋白質(zhì)的各種方法進(jìn)行了研究。結(jié)果是高產(chǎn)率地獲得了高純度的試樣，采用的方法是下面幾種方法的結(jié)合即使用一種交聯(lián)多糖硫酸鹽為載體的親合色譜法，載體是有一個磺酸基團(tuán)為交換基團(tuán)的合成聚合物的離子交換色譜法，使用凝膠過濾的合成聚合物為載體的色譜法，將這種方法彼此相結(jié)合應(yīng)用至少一次。
使用在本發(fā)明中的交聯(lián)多糖硫酸鹽包括交聯(lián)纖維素硫酸鹽、交聯(lián)瓊脂糖硫酸鹽和交聯(lián)葡聚糖硫酸鹽。
上述纖維素是由β-1，4鏈聯(lián)接的葡萄糖組成的多糖，其分子量較佳約50，000至2，000，000。它的具體實(shí)例包括Avicel(微晶纖維素，Asahi Chemical Industry，Japan)和Cellulofine(Chisso Corporation，Japan)。
上述的瓊脂糖是一種以瓊脂為主要組分的多糖，具有D-半乳糖基-(β1→4)-3，6-脫水-L-半乳糖基-(α1→3)的重復(fù)結(jié)構(gòu)。它的分子量較佳為10，000至5，000，000，它的具體實(shí)例包括瓊脂糖28(Sepharose 2B)，Sepharose 4B和Sepharose 6B(Pharmacia，Sweden)。
上述的葡聚糖是一種右旋葡萄糖聚合物，其主要有α(1→6)鏈，例如通過將一種微生物如Leuconostoc mesenteroides對蔗糖作用而形成。它的平均分子量較佳約為1，000至40，000，000。
使用于本發(fā)明中的交聯(lián)多糖硫酸鹽的制備是通過將交聯(lián)多糖，如上述葡聚糖、瓊脂糖和纖維素同已知交聯(lián)劑如表氯醇和2，3-二溴丙醇依照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行處理而得到。
這些交聯(lián)多糖是商業(yè)化的，可從Pharmacia(瑞典)購得，商品名為Sephadex G-10，Sephadex G-15，Sephadex G-25，Sephadex G-50和Sephadex G-100(交聯(lián)葡聚糖)，以及商品名為Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B和Sepharose CL-6B(交聯(lián)瓊脂糖)。交聯(lián)纖維素也可從Chisso Corporation(Japan)購買，商品名為Cellulofine(交聯(lián)纖維素)。所想要的交聯(lián)多糖硫酸鹽可通過將下面已知的硫酸化試劑，如氯代磺酸和硫酸酐酯同這些交聯(lián)多糖進(jìn)行反應(yīng)而合成得到。
這些交聯(lián)纖維素硫酸鹽的實(shí)例包括由Seikagaku Kogyo(Japan)投放市場的產(chǎn)品，商品名為Sulfated Cellulofine(交聯(lián)纖維素硫酸鹽)。
交聯(lián)葡聚糖硫酸鹽的實(shí)例包括硫酸鹽化的Sephadex。
交聯(lián)瓊脂糖硫酸鹽的實(shí)例包括硫酸鹽化的Sepharose。
用于本發(fā)明的交聯(lián)多糖硫酸鹽可以是相應(yīng)鹽的形式。其鹽的例子包括鈉鹽、鉀鹽、銨鹽和三甲基銨鹽。鈉鹽是特別優(yōu)選的。
用于本發(fā)明的交聯(lián)多糖硫酸鹽是不溶解于水的，因而最好是通過水化作用以其膠質(zhì)態(tài)來使用。
采用本發(fā)明中的交聯(lián)多糖硫酸鹽提純hbFGF蛋白質(zhì)的方法包括下述的親和色譜法。
含有hbFGF突變蛋白質(zhì)的水培養(yǎng)基是含有hbFGF突變蛋白質(zhì)的溶液。此水培養(yǎng)基包括水和培養(yǎng)基，主要由水組成，較佳的是用緩沖溶液，如磷酸鹽緩沖劑、硝酸鹽緩沖劑和Tris-鹽酸緩沖劑，調(diào)節(jié)PH值范圍，以防止該hbFGF突變蛋白質(zhì)失去活性。
接著將含有hbFGF突變蛋白質(zhì)的溶液重新調(diào)整到PH值范圍大約5.0至9.0內(nèi)，然后根據(jù)需要用蒸餾水稀釋，以使其電導(dǎo)率約為15mυ或更低。將由此得到的含有hbFGF的突變蛋白質(zhì)溶液與交聯(lián)多糖硫酸鹽膠體相接觸。為此目的，批量法和柱層析法都可使用。然而由于柱層析法操作簡便而更為適宜。在柱層析法中，此交聯(lián)多糖硫酸鹽凝膠被填充到柱中，隨后用一種適宜的緩沖溶液，例如含有0.4M NaCl的50mM的硝酸鹽緩沖液(PH7.0)完全地洗滌該柱，以使其平衡化。所需用的凝膠的量取決于填充的含hbFGF蛋白質(zhì)溶液的性質(zhì)，而每毫克的hbFGF突變蛋白質(zhì)約為1至50毫升的范圍是優(yōu)選的。
然后將含有hbFGF突變蛋白質(zhì)的上述溶液填充入柱內(nèi)。填充速度選擇空速(SV)范圍約0.1至5.0。在填充后，將柱充分洗滌，用常規(guī)方法提高緩沖溶液的離子強(qiáng)度，以洗脫和回收hbFGF突變蛋白質(zhì)。為提高離子強(qiáng)度，諸如NaCl鹽類可加入其中，或者使用高濃度的緩沖溶液，這樣電導(dǎo)率提高到至少約15mυ，較佳的是至少30mυ。對于洗脫過程，分批和濃度梯度洗脫方法均可使用。當(dāng)采用濃度梯度洗脫方法時，例如NaCl的濃度逐漸由約OM提高到2.0M，這樣進(jìn)行洗脫和回收。結(jié)果高純化的hbFGF突變蛋白質(zhì)以高產(chǎn)率被制得。
可用于本發(fā)明的具有磺酸基作為交換基團(tuán)的合成聚合物的例子包括那些磺酸基團(tuán)是直接或非直接引入到親水性乙烯基聚合物、苯乙烯-二乙烯基苯聚合物、丙烯酰胺聚合物和類似物的聚合物。從回收和操作觀點(diǎn)來看，磺酸基被引入到親水性乙烯基聚合物的SP(磺丙基)-Toyopearl(Tosoh，Japan)是特別優(yōu)選使用的。
當(dāng)進(jìn)行色譜化時，將部分純化的含有hbFGF突變蛋白質(zhì)溶液調(diào)整到鹽的濃度約為50mM或更低，例如，在以磷酸鹽緩沖劑的情形中，將其吸附在上述的樹脂上，PH范圍為5至7。對吸附步驟而言，分批和柱層析體系都可使用，但從操作觀點(diǎn)來看，柱層析體系是優(yōu)選使用的。采用提高鹽濃度的方法從樹脂上進(jìn)行洗脫。對洗脫步驟，分批和濃度梯度法都可使用。當(dāng)使用分批方法時，例如，一種通過將NaCl加入到上述磷酸鹽緩沖液中形成濃度約為50mM至1M的緩沖溶液可被使用。硝酸鹽緩沖液可代替磷酸鹽緩沖液而被采用。洗脫過程是在溫度約為1至25℃，較佳約為1至10℃，最好是在約4℃下進(jìn)行。
本發(fā)明所用的用于凝膠過濾的合成聚合物的實(shí)例包括親水性乙烯基聚合物和丙烯酰胺聚合物。從膠體的耐久性和操作觀點(diǎn)來看，Toyopearl HW(Tosoh，Japan)，親水性乙烯聚合物是優(yōu)選使用的。
當(dāng)對含有hbFGF突變蛋白質(zhì)的已部分純化的溶液例如在Toyopearl HW-50F色譜柱上進(jìn)行處理時，諸如磷酸鹽緩沖液和硝酸鹽緩沖液這類緩沖液都可用作展開溶劑。然而，比較有利的是使用50mM的硝酸鹽緩沖液(PH7.0)。處理過程是在約1至25℃，較佳是在約1至10℃，最佳是在約4℃下進(jìn)行。
除上述方法以外的其他方法也可用作純化步驟之一。在這類方法中，舉例來說，天然產(chǎn)品如纖維素、瓊脂糖和葡聚糖以及無機(jī)材料如玻璃球也可被用作離子交換色譜法中的載體。
作為凝膠過濾的載體，也可類似地使用主要由天然產(chǎn)品，(如纖維素、瓊脂糖和葡聚糖)組成的凝膠，以及基于無機(jī)材料(如玻璃球)的凝膠。
這樣獲得的試樣也可進(jìn)行透析并冷凍干燥而形成干態(tài)粉末。進(jìn)而，可將血清清蛋白加入試樣中，作為載體貯存它們，由此試樣避免被吸附在容器上。
在提純或貯存過程中，與痕跡量的還原劑共存便于抑制試樣被氧化。這種還原劑包括β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇和谷胱甘肽。
依據(jù)本發(fā)明，制得了本質(zhì)上無熱原和內(nèi)毒素的基本純的hbFGF突變蛋白質(zhì)。依據(jù)本發(fā)明制得的基本純的hbFGF突變蛋白質(zhì)包括含有本發(fā)明hbFGF突變蛋白質(zhì)的產(chǎn)品，其以蛋白質(zhì)含量計(jì)量，占95%(W/W)，較佳的是占98%(W/W)或更多。
由本發(fā)明的上述方法制得的hbFGF突變蛋白質(zhì)具有成纖維細(xì)胞生長促進(jìn)活性、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長促進(jìn)活性和生成血管的活性，且具有高穩(wěn)定性和低毒性。因而，它們可用作燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)后組織和類似傷口的愈合促進(jìn)劑，或根據(jù)其生成血管活性，用作治療血栓形成、動脈硬化和類似疾病的醫(yī)藥。它們還可用作促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)的試劑。特別指出的是至少一種組分半胱氨酸殘基被一種絲氨酸殘基所取代的這種突變蛋白質(zhì)是優(yōu)選的，這是因?yàn)槠涓叻€(wěn)定性。
當(dāng)本發(fā)明的hbFGF突變蛋白質(zhì)用作藥用制劑時，它們可通過腸胃外給藥或口服給藥于溫血動物(例如人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔子、狗和貓)，可以粉末形式，或與適于藥用的載體、賦形劑和稀釋液一起用作藥用組合物，例如以注射液、片劑、膠囊、溶液或軟膏形式。
注射液可用傳統(tǒng)的方法制備，例如使用生理鹽水或含有葡萄糖或其他輔劑的形成藥液。其藥用組合物，如片劑或膠囊也可根據(jù)常規(guī)方法制備。
當(dāng)本發(fā)明的hbFGF突變蛋白質(zhì)用作上述藥用制劑時，它們給藥于上述溫血動物的適宜劑量為每天約1ng/kg體重到100μg/kg體重，要考慮到給藥的途徑和病癥本身等等。
進(jìn)而，當(dāng)本發(fā)明的hbFGF突變蛋白質(zhì)被用作加速細(xì)胞培養(yǎng)的試劑時，最好是將其加入到培養(yǎng)基中，加入量為每升培養(yǎng)基約0.01至10μg，較佳加入量為每升培養(yǎng)基約為0.1至10μg。
當(dāng)本說明書及附圖中的堿、氨基酸用縮寫表示時，則所用縮寫是IUPAC-IUB Commission采納的生化詞匯或在本領(lǐng)域中常用的縮寫，如采用下列縮寫。當(dāng)這類氨基酸的旋光異構(gòu)體存在時，除另有說明外，則所表示的是左旋型(L型)。
DNA脫氧核糖核酸cDNA互補(bǔ)脫氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶RNA核糖核酸
dATP脫氧腺苷三磷酸dTTP脫氧胸苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸ATP腺苷三磷酸Tdr胸苷EDTA乙二胺四乙酸SDS十二烷基磺酸鈉Gly苷氨酸Ala丙氨酸Val纈氨酸Leu亮氨酸Ile異亮氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Cys半胱氨酸Met蛋氨酸Glu谷氨酸Asp精氨酸Lys賴氨酸Arg精氨酸His組氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸
Trp色氨酸Pro脯氨酸Asn天冬酰胺Gln谷氨酰胺參見圖1，就hbFGF-組分氨基酸的序效而言，該氨基酸序列的N-末端的Met是排列為第1號。而在本說明書中，緊挨Met后的Pro是被編成第1號。
用于下述實(shí)施例1中的載有質(zhì)粒pTB762的轉(zhuǎn)化體E.Coli.MM294/PTB762，于實(shí)施例1中制得的轉(zhuǎn)化體E.Coli MM294(DE3)/PTB960及于實(shí)施例8中制得的轉(zhuǎn)化體E.Coli MM294(DE3)/PCM901已委托日本的InStitute for Fermentation，Osaka(IFO)，及日本的Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry(FRI)保藏。它們的入藏登記號及存放日期列于表1。在FRI保藏的E.Coli MM294/PTB762開始是以FERM P號碼標(biāo)記的入藏登記號。所說的寄存物被轉(zhuǎn)為按Budapest Treaty的寄存物，而該轉(zhuǎn)化體已在FRI以FERM BP號標(biāo)識的入藏登記號存放。
表1轉(zhuǎn)化體 IFO FRIE.Coli MM294 IFO14613 FERM P-9409PTB762 (1987.5.27) (1987.6.11)FERM BP-1645E.Coli MM294 IFO14979 FERM BP-2690(DE3)/PTB960 (1989.12.12) (1989.12.16)E.Coli MM294 IFO15104 FERM BP-3168(DE3)/PCM901 (1990.10.26) (1990.11.17)此后本發(fā)明將以下列實(shí)施例詳述。當(dāng)然應(yīng)理解的是這些實(shí)施例的用意不是用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1制備rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23的重組體含有為rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23編碼的基因質(zhì)粒PTB 762經(jīng)用EcoRI及PstI處理，切去了為rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23編碼的DNA片斷，而在此突變蛋白質(zhì)中四個處于hbFGF中的半胱氨酸殘基的69位和87位置上的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基所取代〔Senoo等人，Biochemical and Biophysical Research Communicatton 151，701-708(1988)，歐洲專利公開281，822〕。然后用EcoRI和PstI將質(zhì)粒PTB1004(歐洲專利公開336，383)完全消化，在此后該片斷被T4DNA連接酶接在此所得到的最大片斷上，則構(gòu)成質(zhì)粒PTB921。然后質(zhì)粒PTB921用限制性內(nèi)切酶EcoRI裂開，使綠豆核酸酶與該產(chǎn)物反應(yīng)則使其末端變?yōu)槠烬R端，接著用限制性內(nèi)切酶Bg1II分裂，則得到含有為此rhbFGF突變蛋白質(zhì)編碼基因的DNA片斷。另外，載有對T7噬菌體〔F.W.Studier等人，Journal of Molecular Biology 189 113-130(1986)的一種φ10啟動子用限制性內(nèi)切酶裂開，然后該產(chǎn)物用綠豆核酸酶處理則將其末端變成平齊末端，接著再進(jìn)行與限制性內(nèi)切酶BamHI的反應(yīng)。用T4連接酶將含有rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23的DNA片斷連接到所得到的DAN片斷上，結(jié)果獲得表達(dá)質(zhì)粒PTB960(圖2)。
E.Coli MM294與λ噬菌體DE3溶源化以制備E.Coli菌株MM294(DE3)，在該噬菌體中插入了該噬菌體的一種RNA聚合酶基因〔F.W.Studier等人，Journal of Molecular Biology 189，113-130(1986)。通過表達(dá)質(zhì)粒PTB960使此E.Coli菌株轉(zhuǎn)化，由此獲得帶有示于圖1的為rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23編碼的基因重組體E.Coli MM294(DE3)/PTB960(IFO14979，F(xiàn)ERM BP-2690)。
實(shí)施例2將一菌杯量的重組體E.Coli MM294(DE3)/PTB960(IFO14979，F(xiàn)ERM BP-2690)接種于30ml的含50mg/l的氨芐青霉素鈉的LB培養(yǎng)基(10克/升的細(xì)菌胰胨、5克/升的細(xì)菌酵母提取液及5克/升的NaCl)中，然后于37℃下?lián)u動培養(yǎng)一整夜。將1.5ml的此培養(yǎng)液移到30ml的M-9培養(yǎng)基中(16.8克/升的Na2HPO4·12H2O、3克/升的KH2PO4、1克/升的NH4Cl、0.5克/升的NaCl及0.246克/升的MgSO4·7H2O)、該培養(yǎng)液中補(bǔ)加15克/升的葡萄糖、15克/升的酪蛋白氨基酸、1毫克/升的鹽酸硫胺素及50毫克/升的氨芐青霉素鈉，然后在37℃下?lián)u動培養(yǎng)。當(dāng)該培養(yǎng)物生長到100-120Klett單位的濁度時，加入IPTG以得到多種濃度，然后將此培養(yǎng)繼續(xù)進(jìn)行四小時，經(jīng)離心分離收集細(xì)胞并在-20℃下存放。
制備兩份相同的樣品。向一樣品中加7M的鹽酸胍，然后使細(xì)胞充分散開，接著靜置1小時。后經(jīng)離心分離得到上清液(bFGF突變蛋白質(zhì)的總量)。向另一樣品中加50微克/毫升的溶菌酶溶液(10%的蔗糖、10mM的EDTA、100mM的NaCl、1mM的APMSF及10mM的TriS-HCl，PH＝7.6)，然后將此混合物于4℃下靜置1小時。再用超聲波破碎法(Kubota Insonater 200M)使這些細(xì)胞破碎，接著經(jīng)離心分離得到一種上清液(有可溶性的hbFGF突變蛋白質(zhì))。對這兩種經(jīng)提取的溶液稀釋，用一種ELISA方法確定rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23的量，其結(jié)果示于表2。
表2IPTG加入量 rhFGF突變蛋白質(zhì) 可溶性rhbFGF突變(μm) CS23的累積量 蛋白質(zhì)CS23的(mg/l) 形成率(%)400 35 13100 41 1275 62 2550 73 2825 81 326.3 96 603.2 15 801.6 ＜5 -如上所示，在小規(guī)模培養(yǎng)如曲頸瓶中培養(yǎng)時，可加入少量IPTG范圍達(dá)到本發(fā)明的效果。也就是說，大約加入1mM IPTG則得到
ac啟動子。當(dāng)以100μM或更大的量加入IPTG時，產(chǎn)率低且大部份所需產(chǎn)物以不溶態(tài)累積，與此相對照，依據(jù)本發(fā)明，IPTG以3μM～100μM，特別是以6μM至80μM的范圍的量加入時，結(jié)果就得到了完全出乎意料的結(jié)果，即在產(chǎn)率及以可溶性蛋白質(zhì)累積比例方面得到顯著地提高。
實(shí)施例3將含15g/l葡萄糖、15g/l酪蛋白氨基酸、及5mg/l鹽酸硫胺素的M-9培養(yǎng)基(PH＝6.8)以2.5升的量置于一個5升容積的發(fā)酵罐中，然后進(jìn)行消毒。再將125ml的菌株培養(yǎng)液(按實(shí)施例2中所述方式制備的)接種于該培養(yǎng)基，接著將PH調(diào)至6.8，在37℃下，以2.5升/分的流量通氣，以1000轉(zhuǎn)/分的攪拌速度下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)在此培養(yǎng)期間(開始培養(yǎng)后3小時)內(nèi)濁度達(dá)到120Klett單位時，加入IPTG使其量達(dá)10μM。開始培養(yǎng)8小時后，再加葡萄糖及酪蛋白氨基酸以使其含量分別為10g/l，培養(yǎng)繼續(xù)進(jìn)行總共長15小時。結(jié)果rhbFGF突變蛋白質(zhì)以可溶態(tài)累積量達(dá)440mg/l。反之，在同樣條件下加400μM IPTG，僅產(chǎn)生17.5mg/l的rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23。
實(shí)施例4將用實(shí)施例2中所述方式得到的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到一個5升容積的發(fā)酵罐中，此罐中裝有與實(shí)施例3相同的培養(yǎng)基，然后在30℃，PH＝6.8，通氣流量為2.5升/分，以1000轉(zhuǎn)/分的速度攪拌條件下開始培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)開始7小時后，濁度達(dá)約700個Klett單位時，加入42μM的IPTG。開始培養(yǎng)8.5小時后，在PH＝6.8下加入20g/l的葡萄糖及20g/l酪蛋白氨基酸。由此培養(yǎng)進(jìn)行36小時。在該培養(yǎng)液中積累了860mg/l的可溶態(tài)的rhbFGF突變蛋白CS23。
實(shí)施例5將含有15g/l的葡萄糖、15g/l的酪蛋白氨基酸、及5mg/l的鹽酸硫胺素的M-9培養(yǎng)基(PH6.8，2.5升)置于一個5升的發(fā)酵罐中并消毒。然后將鐵離子以表3所示的濃度在經(jīng)過消毒后加入該罐中。對所得的培養(yǎng)基接種一份125ml的以實(shí)施例2中所述方式制備的菌株培養(yǎng)液，接著將PH調(diào)至6.8，在30℃、以2.5l/分的流量通氣，1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速攪拌的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物生長至大約300個Klett濁度單位時(大約在開始培養(yǎng)后5.5～6小時)，加入IPTG以使其含量達(dá)40μM，并在與此同時，將培養(yǎng)溫度降至25℃，接著再培養(yǎng)23.5小時。開始培養(yǎng)7～7.5小時后，各自以15g/l的比例加葡萄糖和酪蛋白氨基酸，并在培養(yǎng)過程中將PH值保持在6.8。結(jié)果示于表3。
表3鐵離子加入量 rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23產(chǎn)率0 1.002×10-6M 1.429×10-6M 2.603.6×10-5M 2.061×10-4M 1.23(注此鐵離子加入量表示的是后加入該培養(yǎng)基中的鐵離子量。該產(chǎn)率表示一種重量比，當(dāng)所加入鐵離子量為0時，取該比值為1)實(shí)施例6對含有50mg/l的氨芐青霉素鈉的1升LB培養(yǎng)基用1ml重組體E.Coli MM294(DE3)/PTB960(IFO14979，F(xiàn)ERM BP-2690)的主細(xì)胞進(jìn)行接種，再于30℃搖動培養(yǎng)8小時。將其全部量轉(zhuǎn)至到一個50升容積的盛有20升的LB培養(yǎng)基(含50mg/l的氨芐青霉素鈉)的培養(yǎng)罐中，再于30℃、1.0kg/cm2表壓的內(nèi)壓下，以10
/分的流量通氣，以300轉(zhuǎn)/分的攪拌速度下培養(yǎng)7小時。然后將所得的培養(yǎng)溶液18升移至360升的發(fā)酵培養(yǎng)基中(含15g/l的葡萄糖、15g/l的酪蛋白氨基酸、5mg/l的維生素B1及5mg/l的FeSO4·7H2O的M-9培養(yǎng)基)，再于30℃，在1.0kg/cm2G的內(nèi)壓下，以240升/分的流量通氣、攪拌速度為250轉(zhuǎn)/分條件下開始培養(yǎng)。當(dāng)該培養(yǎng)液達(dá)到約1000個Klett單位時，以相當(dāng)于100μM的量加入IPTG，然后將培養(yǎng)溫度降至25℃。與此同時，將含18kg葡萄糖、5.4kg的酪蛋白氨基酸的消毒液50升以大約2升/時的速率加入其中，然后繼續(xù)培養(yǎng)36小時。結(jié)果累積得到1.2g/l的可溶態(tài)的rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23。將這樣培養(yǎng)成的產(chǎn)物用沙氏離心機(jī)分離收集到濕細(xì)胞，于-80℃將其冰凍存放。
實(shí)施例7純化rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23將1kg實(shí)施例6中于-80℃冰凍存放的細(xì)胞(E.Coli MM294(DE3)/PTB960)懸浮于4升的含25mM磷酸鹽緩沖液(PH＝6.0)、0.1mM的對-脒基苯基甲磺酰氟鹽酸化物(APMSF)和2mM的二硫蘇糖醇(DTT)的緩沖液中。用5升容量的Dynomill型號KD-5儀器(Willybachfen，Switzerland)，采用4升玻璃珠，在冰冷卻下將該細(xì)胞破碎5個周期。用大約5升的該緩沖液洗此玻璃珠，再將洗液用提取液收集。將所得的大約10升此溶液以10，000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心分離(Model 21，Beckman.U.S.A.)長達(dá)60分鐘，結(jié)果得到一種上清液。將所獲得的上清液倒入Sulfated Cellulofine(Seikagaku Kogyo，Japan)柱中(內(nèi)徑25.2cm×50cm)。吸附后用25升25mM的含0.5M NaCl的磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗滌此柱。然后用30升含1M NaCl的25mM的磷酸鹽緩沖液(PH＝7.0)完成這洗脫過程。用一臺超濾器(Pellicon Casset System，Millipore，U.S.A.)濃縮該洗脫物直至在280nm處的吸光度顯示出3～4。將得到的濃縮溶液對大約60升的25mM的磷酸鹽緩沖液(PH6.0)進(jìn)行滲析一整夜。用一臺離心機(jī)(Beckman.U.S.A.)以4，200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速分離此滲析物30分鐘，則得到一種上清液。將此上清液倒入柱(內(nèi)徑17.0cm×33.0cm，SP-Toyopearl 650M，由Tosoh，日本制造)中。用7升含200mM NaCl的25mM的磷酸鹽緩沖液(PH6.0)洗此柱，再用10升，25mM的含500mM NaCl的磷酸緩沖液(PH6.0)進(jìn)行洗脫。將該洗脫物倒入Sulfated Cellulofine(Seikagaku Kogyo)柱(15.0cm內(nèi)徑×50.0cm)，使用高性能液相色譜儀(Gilson，F(xiàn)rance)。通過在20升50mM的檸檬酸鹽緩沖液(PH7.0)和30升50mM的含2M NaCl的檸檬酸鹽緩沖液(PH7.0)間的線性梯度完成此洗脫。收集主餾份并用10mM的檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0)稀釋至電導(dǎo)率為mmho或更小。將此被稀釋的溶液倒入一種SP-Toyopeal 650M(Tosoh，Japan)的柱(內(nèi)徑14.0cm×39.0cm)中。用10升含0.5M NaCl的25mM的檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0)洗此柱，再用10升25mM的含0.5M NaCl的檸檬酸鹽緩沖液(PH＝6.0)進(jìn)行洗脫過程。將此洗脫物倒入Toyopearl HW-50F(Tosoh，Japan)的柱(14.0cm內(nèi)徑×90.0cm)中，再用50mM的檸檬酸(PH7.0)展開。收集主餾分，并通過一臺Millipak 20濾器(Millipore，U.S.A.)消毒，則得到一種純化的rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23存貯液。產(chǎn)量是17.0克(百分產(chǎn)率為7%)。N-末端氨基酸序列分析、C-末端氨基酸分析及氨基酸組成分析分別示于表4-6中。
表4 N-末端氨基酸序列分析環(huán)號 氨基酸殘基(Pmol) 由核苷酸序列導(dǎo)出rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23 的氨基酸(750Poml)1 Pro(530) Pro2 Ala(553) Ala3 Leu(488) Leu4 Pro(433) Pro5 Glu(228) Glu6 Asp(269) Asp7 Gly(370) Gly8 Gly(470) Gly9 Ser(8) Ser10 Gly(328) Gly11 Ala(283) Ala12 Phe(341) Phe13 Pro(181) Pro14 Pro(338) Pro15 Gly(279) Gly16 His(69) His17 Phe(146) Phe18 Lys(264) Lys19 Asp(104) Asp20 Pro(125) Pro
＊用一臺Model 477 A蛋白質(zhì)序列分析儀(應(yīng)用生物系統(tǒng))進(jìn)行分析。
表5 C-末端氨基酸分析C-末端氨基酸 產(chǎn)率(%)Ser 41.0＊ 肼解法＊＊ 用一臺6330型氨基酸分析儀(Beckman)分析。
表6 氨基酸組成分析氨基酸 rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23 理論值A(chǔ)sp/Asn 11.9 12Thr 4.8 5Ser 10.7 12Glu/Gln 12.3 12Pro 9.0 9Gly 14.9 15Ala 9.0 9Cys - 2Val 6.4 7Met 2.1 2Ile 3.8 4Leu 13.3 13Tyr 5.9 7Phe 8.0 8His 3.1 3Lys 14.2 14Arg 10.6 11Trp1)1.1 1- 未鑒定＊ 鹽酸水解法＊＊ 用6330型氨基酸分析儀(Beckman)
1)Edelhoch法進(jìn)而圖3示出了在還原條件(100mM DTT，50℃，15分鐘)下所得的SDS-PAGE的結(jié)果。參見圖3，(1)和(2)分別代表該標(biāo)記和rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23。
圖4示出了用肝素-5PW(Tosoh，Japan)為載體的柱(內(nèi)徑7.5mm×7.5cm)的高性能液相色譜法分析的結(jié)果，其操作條件如下洗脫液A溶液〔50mM磷酸鹽緩沖液(PH7)〕B溶液〔含2M NaCl的50mM的磷酸鹽緩沖液(PH7)〕流速0.8ml/分檢測波長280nm。
圖5示出了以O(shè)DP-50(Asahi Chemical Industry，Japan)作載體的柱(內(nèi)徑4.6mm×150cm)的高性能液相色譜法的分析結(jié)果，分析條件如下洗脫液A溶液(0.1%的三氟乙酸)B溶液(含0.1%三氟乙酸的80%的乙腈)流速1.0ml/分檢測波長280nm圖6示出用G2000SW(Tosoh，Japan)作載體的柱(7.5mm內(nèi)徑×7.5cm)的高性能液相色譜法的分析結(jié)果，分析條件如下展開液;0.1M的磷酸鹽緩沖液(PH＝7)+0.1M的硫酸鈉流速0.5ml/分檢測波長280nm生物活性是用這樣一種方法鑒定的，即對胎牛犢心內(nèi)皮細(xì)胞的生長促進(jìn)活性的測定量作為該生物活性的指標(biāo)。結(jié)果給出了與此樣品活性相當(dāng)?shù)囊环N活性。
實(shí)施例8制備具有一種四環(huán)素抗性標(biāo)記的rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23的重組體含有為rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23編碼的基因質(zhì)粒PTB 762被AvaI和PstI完全消化，結(jié)果得到含有大部分rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23的大約有0.45K堿基對的DNA片斷，在此rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23中的存在于hbFGF的69位和87位上的四個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基所取代〔Senoo等人，Biochemical and Biophysical Research Communicalion 151，701-708(1988)，歐洲專利公開NO.281，822〕。用T4DNA連接酶將合成DNA(
)接在所得的片斷上，然后將此生成物用AvaI和PstI消化則得到一片斷A，在其中，一個PstI卵裂位點(diǎn)被修飾成BglII卵裂位點(diǎn)。此后，質(zhì)粒PTB955〔已缺失hbFGF的C-末端的為rhbFGF突變蛋白質(zhì)C128編碼的一種基因〔Seno等人，European Journal of Biochemistry，188，239-245，(1990)〕插入其中〕被SalI及BamHI完全消化而得到一種大約4.1K堿基對的片斷B。PTB955被AvaI和SalI完全消化，結(jié)果得到一個約有390個堿基對的片斷C。
用T4DNA連接酶將這三個片斷A、B和C連接則得到一種含氨芐青霉素抗性標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒PHP901(圖7)。
用EcoRI和BglII將PHP901完全消化就得到一個約1.1K堿基對的片斷，其含對rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23編碼的一種基因、一個T7啟動子和一個T7終止區(qū)。用T4DNA連接酶將該片斷接到用EcoRI和BamHI完全消化的pUC18上結(jié)果獲得質(zhì)粒pME901(圖8)。
用EcoRI和HindIII將pME901完全消化則獲得一個含有一個為rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23編碼的基因，一個T7啟動子和一個T7終止區(qū)的約0.77K堿基對的片斷。用T4DNA聚合酶孵化該片斷以將其末端改變?yōu)槠烬R末端。用T4DNA連接酶將該片斷接到經(jīng)ScaI消化的pBR322上則獲得含四環(huán)素標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒pCM901(圖9)。
用噬菌體DE3使E.Coli μM294溶源化以制備E.Coli菌株MM294(DE3)，在噬菌體DE3中插入了該T7噬菌體的RNA聚合酶基因〔F.W.Studier等人，Journal of Molecular Biology，189，113-130(1986)〕。通過用表達(dá)質(zhì)粒PCM901使這種E.Coli菌株轉(zhuǎn)化，由此得到帶有該rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23編碼的基因的重組體E.Coli MM294(DE3)/PCM901(IFO15104，F(xiàn)ERM BP-3168)。
實(shí)施例9用1ml重組體E.Coli MM294(DE3)/PCM901(IFO15104，F(xiàn)ERM BP-3168)的主細(xì)胞對1升的含5mg/l四環(huán)素鹽酸化物的LB-培養(yǎng)基進(jìn)行接種，然后于30℃搖動培養(yǎng)8小時。將其全部量移至盛于一50升容積的培養(yǎng)罐中的20升的LB培養(yǎng)基中(含5mg/l的四環(huán)素鹽酸化物)，然后在30℃，1.0kg/cm2表壓的內(nèi)壓下伴隨通氣(流量10升/分)及轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分的攪拌速度下進(jìn)行培養(yǎng)直至Klett單位為700。然后將所得的培養(yǎng)液全部移至360升的發(fā)酵培養(yǎng)基中(含15g/l的葡萄糖、15g/l的酪蛋白氨基酸、16.8g/l的Na2HPO4·12H2O、3g/l的KH2PO4、1g/l的NH4Cl、0.5g/l的NaCl、0.5g/l的MgSO4·7H2O、5mg/l的鹽酸硫胺素、2.5mg/l的FeSO4·7H2O及0.2g/l的防沫劑的M-9培養(yǎng)基)，然后在28℃、1.0kg/cm2表壓的內(nèi)壓下，以240l/分的流量通氣、250轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速攪拌的條件下開始培養(yǎng)。當(dāng)該培養(yǎng)液的濁度達(dá)約450Klett單位時，向其中加入10mg/l(42μM)的IPTG。由于余量糖濃度為1%，所以加入一種含葡萄糖(60g/l)和酪蛋白水解產(chǎn)物(15g/l)混合物的溶液，然后繼續(xù)培養(yǎng)40小時。結(jié)果累積出可溶態(tài)的1.6g/l的rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23。將這樣獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物用沙氏離心機(jī)收集濕細(xì)胞，再將該細(xì)胞于-80℃下冰凍存放。
用與實(shí)施例7相似的方式處理1kg這種所得的細(xì)胞，則得到純化的rhbFGF突變蛋白質(zhì)CS23原始溶液(產(chǎn)量25.0g)。該溶液的質(zhì)量在生物活性及物理和化學(xué)測定方面均與自實(shí)施例7中的樣品相當(dāng)。
權(quán)利要求
1.一種含有對一種突變蛋白質(zhì)編碼的核苷酸序列的載體，在該蛋白質(zhì)中至少一種成人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(hbFGF)的組分氨基酸是被另一種氨基酸所取代，且T7啟動子位于其上游端。
2.權(quán)利要求1的載體，在其中至少一種組分氨基酸是至少一種半胱氨酸的殘基，而另一種氨基酸是絲氨酸的殘基。
3.權(quán)利要求1的載體，在其中該突變蛋白質(zhì)是一種在成熟的hbFGF組分氨基酸中處于69-和87-位上的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基所代替的一種突變蛋白質(zhì)。
4.一種被權(quán)利要求1中的載體所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化體，在其中寄主是處在lac啟動子下游端的具有T7聚合酶基因的大腸桿菌(Escherichia Coli)。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化體，它具有E.Coli MM294(DE3)/PCM960的特性。
7.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化體，它具有E.Coli MM294(DE3)/PCM901的特性。
8.制備成熟的hbFGF的至少一種組分氨基酸是被另一種氨基酸所取代的突變蛋白質(zhì)的方法，它包括在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，在其中按權(quán)利要求5中的轉(zhuǎn)化體的對數(shù)生長期向該培養(yǎng)基添加約3～500μM的異丙基硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)，接著進(jìn)行培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，在其中使用3～300μM的IPTG。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，在其中使用6～200μM的IPTG。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，在其中使用6～80μM的IPTG。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，在其中含有突變蛋白質(zhì)產(chǎn)物的溶液用色譜法提純，采用一種交聯(lián)多糖硫酸鹽、一種具有一個磺酸基作為交換基的合成聚合物和/或一種用于凝膠過濾的合成聚合物作為載體。
全文摘要
于此公開的是(1)一種含對一種突變蛋白質(zhì)編碼的核苷酸序列的載體，在該突變蛋白質(zhì)中成人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(hbFGF)中的至少一種組分氨基酸被另一種氨基酸所取代，而T7啟動子處于其上游端；(2)一種被(1)的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體；(3)制備突變蛋白質(zhì)的方法，(4)(3)的方法，其中約3～500μm的異丙基硫代吡喃型半乳糖苷(IPTC)按轉(zhuǎn)化體的對數(shù)生長期加于培養(yǎng)基中，(5)(4)的方法，進(jìn)一步包括純化過程。
文檔編號C07K14/50GK1055009SQ9011011
公開日1991年10月2日 申請日期1990年12月19日 優(yōu)先權(quán)日1989年12月19日
發(fā)明者北野一昭, 栗山正人, 西村紀(jì), 五十嵐貢一 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社