用于生產(chǎn)第一代乙醇的酵母菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及相對于第一代乙醇生產(chǎn)中所用的專用菌株具有改進性質(zhì)的酵母菌株。具體地，本發(fā)明的菌株具有增加的乙醇收率、較低的甘油產(chǎn)量和與標準菌株D1B相似或稍慢的乙醇生產(chǎn)動力學。本發(fā)明還涉及通過培養(yǎng)所述菌株獲得的酵母，以及所述酵母和/或所述菌株用于工業(yè)生產(chǎn)乙醇的用途。CNCM I-479020130725CNCM I-479120130725CNCM I-479220130725CNCM I-478220130626CNCM I-407220080904
【專利說明】
用于生產(chǎn)第一代乙醇的酵母菌株
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生產(chǎn)第一代乙醇的菌株、通過培養(yǎng)運些菌株獲得的酵母、W及用于從 所述酵母工業(yè)生產(chǎn)乙醇的方法。更具體地，本發(fā)明設(shè)及對乙醇耐受性強、比目前乙醇生產(chǎn)工 藝中所用的大多數(shù)有效菌株生產(chǎn)的甘油低、W及乙醇產(chǎn)量高的=個具體菌株。本發(fā)明的菌 株還具有快的乙醇生產(chǎn)動力學。
【背景技術(shù)】
[0002] 不可再生能源資源的減少和對溫室氣體排放增加越來越多的關(guān)注導致需要尋找 化石燃料(石油、煤、天然氣)替代物的能源資源。來自森林和/或農(nóng)業(yè)或食品加工產(chǎn)品和/或 副產(chǎn)品的植物生物質(zhì)構(gòu)成用于生產(chǎn)工業(yè)上感興趣的分子的大量碳源。用植物所含的可發(fā)酵 糖生產(chǎn)的乙醇用于具有燃燒發(fā)動機的車輛。因此，在北美和歐洲，生物乙醇的生產(chǎn)在過去幾 年已經(jīng)經(jīng)歷了快速發(fā)展。2008年，全球用植物生物質(zhì)生產(chǎn)了超過560億升乙醇。
[0003] 第一代生物乙醇通過發(fā)酵富含淀粉(玉米谷物、大麥、小麥、木馨、馬鈴馨塊莖等） 或薦糖(甘薦、甜菜、甜高梁等）的生物質(zhì)中所含的己糖(包含6個碳的糖）來生產(chǎn)，而"第二 代"生物乙醇通過轉(zhuǎn)化農(nóng)業(yè)廢棄物(例如谷物賴桿和玉米賴桿）、森林殘渣、木材、能源作物 (例如柳枝稷)或具有短或非常短的旋轉(zhuǎn)的矮樹林(例如楊樹)所含的纖維素和半纖維素來 生產(chǎn)。
[0004] 獲得第一代方法的富含糖的發(fā)酵介質(zhì)的方法相對簡單且好控制。在甜植物例如甘 薦、甜高梁或甜菜的情況下，將植物研磨或切成片，直接或在水中浸泡后獲得含糖汁液?？?W用獲得的粗汁液、用濃縮汁液或用多種濃縮汁液(例如提取初始所述的糖的一部分獲得 的糖漿)進行酒精發(fā)酵。在富含淀粉的植物部分例如玉米谷物的情況下，必須首先將淀粉水 解成葡萄糖，然后才能將酵母轉(zhuǎn)化成乙醇。標準的水解過程由W下組成:第一階段，期間通 過a-淀粉酶的作用將淀粉鏈轉(zhuǎn)化為較短的鏈，然后是"SSF"(同時糖化和發(fā)酵)發(fā)酵步驟，期 間通過添加葡萄糖巧酶來水解糊精，且期間酵母將葡萄糖發(fā)酵成乙醇。在發(fā)酵步驟之前，一 些方法(稱為冷方法)進行降低的淀粉水解或甚至沒有淀粉水解。在用木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn) 第二代乙醇的情況下，化學和酶促水解過程復雜得多并且費力，因為木質(zhì)纖維素材料由難 W解構(gòu)W從木質(zhì)素中釋放纖維素和半纖維素的剛性基質(zhì)組成。水解木質(zhì)纖維素材料產(chǎn)生包 含己糖和/或戊糖的水解物。無論使用何種生物質(zhì)或采用何種產(chǎn)品，最終產(chǎn)物是相同的，僅 生產(chǎn)過程不同。
[0005] 在歐洲，甜菜和谷物（小麥、大麥、玉米)是用于生產(chǎn)農(nóng)業(yè)來源的乙醇的主要資源。 甜植物（甜菜、甘薦）和淀粉類植物(谷物例如小麥或玉米）中所含的糖（葡萄糖、果糖或薦 糖)通過使用酵母的工業(yè)發(fā)酵工藝轉(zhuǎn)化成酒精。然后將酒精蒸饋并脫水W獲得生物乙醇。在 生產(chǎn)工藝中獲得的副產(chǎn)物(酒糟和漿料)意欲用于動物飼料。
[0006] 第一代乙醇生產(chǎn)者所用的酵母主要是能夠優(yōu)化生產(chǎn)工藝收益率的專用酵母。運些 酵母尤其是：Ethanol反e過孩（F既mentis@)、ThemK)Sacc? (Lalleimrid啜)、Angei SuperAlcohol? (Angci.?)和F細@(ABMauri@)。運些酵母的預期品質(zhì)是在代表工業(yè)條 件的溫度和抑范圍內(nèi)，它們快速生產(chǎn)高濃度乙醇和耗盡發(fā)酵培養(yǎng)基的糖的能力。在使用谷 物(尤其是玉米)產(chǎn)生具有高糖濃度的水解物的方法中尤其需要運些品質(zhì)。實際上，生產(chǎn)者 調(diào)節(jié)他們發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖含量使其盡可能高，同時確保將糖盡可能快且完全地轉(zhuǎn)化成乙 醇。就像生產(chǎn)者希望酵母將培養(yǎng)基中的所有糖轉(zhuǎn)化成乙醇，他們也希望消耗的糖轉(zhuǎn)化成乙 醇的總產(chǎn)量盡可能高，從而在發(fā)酵中產(chǎn)生最少的副產(chǎn)物例如甘油。
[0007]具有對乙醇顯示更好耐受性的酵母和具有產(chǎn)生更少甘油，同時確保在普通發(fā)酵條 件和發(fā)酵參數(shù)波動期間相等或更高的生產(chǎn)力(體積方面）的酵母將允許乙醇生產(chǎn)者通過提 高乙醇產(chǎn)量來增加他們工廠的收益率。因此，仍然需要用于生產(chǎn)第一代乙醇的新的改進的 酵母菌株。
[000引發(fā)明簡述
[0009] 本發(fā)明設(shè)及與第一代乙醇生產(chǎn)中通常使用的專用酵母菌株相比，具有改進性質(zhì)的 釀酒酵母（Saccharomyces cereviSiae)酵母菌株。
[0010] 因此，具體地，本發(fā)明的一個主題是在布達佩斯條約條件下，W保藏號1-4791于 2013年7月25 日保藏于CNCM(Collection 化tionale de Cultures de Micro-organismes [法國國家微生物培養(yǎng)物保藏中屯、]of the Institut Pasteur,25;rue du Docteur Roux, 75724Paris, Cedex 15)的釀酒酵母菌株53-137。
[0011] 本發(fā)明的另一個主題是在布達佩斯條約條件下，W保藏號1-4790于2013年7月25 日保藏于CNCM(Collection 化tionale de Cultures de Micro-organismes[法國國家微 生物培養(yǎng)物保藏中屯、]of the Institut Pasteur,2虹Ue du Docteur Roux,75724F*a;ris, Cedex 15)的釀酒酵母菌株53-005。
[0012] 本發(fā)明的另一個主題是在布達佩斯條約條件下，W保藏號1-4792于2013年7月25 日保藏于CNCM(Collection 化tionale de Cultures de Micro-organismes[法國國家微 生物培養(yǎng)物保藏中屯、]of the Institut Pasteur,2虹Ue du Docteur Roux,75724F*a;ris, Cedex 15)的釀酒酵母菌株53-214。
[OOU] 本發(fā)明還設(shè)及通過培養(yǎng)選自W保藏號1-4791于2013年7月25日保藏于CNCM的釀酒 酵母菌株、W保藏號1-4790于2013年7月25日保藏于CNCM的釀酒酵母菌株和W保藏號I-4792于2013年7月25日保藏于CNCM的釀酒酵母菌株的釀酒酵母菌株獲得的酵母。
[0014] 本發(fā)明的一個主題還是選自W保藏號1-4791于2013年7月25日保藏于CNCM的釀酒 酵母菌株、W保藏號1-4790于2013年7月25日保藏于CNCM的釀酒酵母菌株和W保藏號I-4792于2013年7月25日保藏于CNCM的釀酒酵母菌株的釀酒酵母菌株或通過培養(yǎng)運些菌株之 一獲得的酵母用于從生物質(zhì)生產(chǎn)第一代乙醇的用途。
[0015] 本發(fā)明的一個主題還是從生物質(zhì)生產(chǎn)第一代乙醇的方法，包含使用選自W保藏號 1-4791于2013年7月25日保藏于CNCM的釀酒酵母菌株、W保藏號1-4790于2013年7月25日保 藏于CNCM的釀酒酵母菌株和W保藏號1-4792于2013年7月25日保藏于CNCM的釀酒酵母菌株 的釀酒酵母菌株或通過培養(yǎng)運些菌株之一獲得的酵母的發(fā)酵步驟。
[0016] 在一些實施方案中，生物質(zhì)富含糖和/或淀粉，并且選自或尤其源自玉米、小麥、大 麥、黑麥、高梁、木馨、小黑麥、馬鈴馨、甘馨、甘薦、甜菜和甜高梁。
[0017] 在一些優(yōu)選的實施方案中，生物質(zhì)選自或源自玉米、小麥、大麥、木馨、甜菜和甘 薦。
[0018] 本發(fā)明的一個主題還是用乙醇生產(chǎn)過程獲得的發(fā)酵殘渣生產(chǎn)酒糟和補充有可溶 物質(zhì)的酒糟。
[0019] W下給出本發(fā)明一些優(yōu)選實施方案的更詳細的描述。
[0020] 發(fā)明詳述
[0021] 如上所述，本發(fā)明設(shè)及有助于第一代乙醇生產(chǎn)的=個釀酒酵母菌株。本發(fā)明的= 個菌株通過雜交和選擇程序的方式獲得。它們來自W保藏號1-4072于2008年9月4日保藏于 CNCM的釀酒酵母菌株(屬于
【申請人】的菌株)和W保藏號1-4782于2013年6月26日保藏于CNCM 的釀酒酵母克隆(也屬于
【申請人】)之間的雜交。
[0022] 1-4072酵母菌株是
【申請人】從21個評估菌株組中選擇的對乙醇具有最強耐受性的 困株。
[0023]
【申請人】選擇釀酒酵母克隆1-4782,因為對乙醇具有高耐受性（雖然比1-4072菌株 低），但甘油生產(chǎn)低于1-4072菌株。
[0024] 雜交選擇程序?qū)е卤景l(fā)明的=個菌株。運些菌株的每一個均構(gòu)成目前第一代乙醇 工藝生產(chǎn)中所用的最有效的專用菌株的替代物。實際上，本發(fā)明的=個菌株對乙醇的耐受 性比1-4072參考菌株高，同時由于甘油（發(fā)酵反應(yīng)的副產(chǎn)物)產(chǎn)量低，第一代乙醇的產(chǎn)量比 1-4072菌株高。無論發(fā)酵期間的溫度(32°C、35°C或38°〇、9化4.0、5.0或5.5)和無機氮的供 給（150-500ppm)，均觀察到運種良好的耐受性，使運些菌株特別適用于其中發(fā)酵參數(shù)波動 很常見的第一代乙醇的生產(chǎn)。并且，本發(fā)明的菌株具有乙醇生產(chǎn)動力學與1-4072參考菌株 相似或稍慢的優(yōu)勢。
[0025] 本發(fā)明還設(shè)及通過培養(yǎng)本發(fā)明的菌株之一獲得的酵母。培養(yǎng)酵母菌株的方法是本 領(lǐng)域已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何根據(jù)其性質(zhì)優(yōu)化各菌株的培養(yǎng)條件。
[00%]本發(fā)明的酵母菌株和通過培養(yǎng)運些菌株獲得的酵母用于從生物質(zhì)生產(chǎn)第一代乙 醇。本文的術(shù)語"生物質(zhì)"意欲是指轉(zhuǎn)化后能夠變成能源的植物來源的任何有機物質(zhì)。優(yōu)選 的，在本發(fā)明上下文中，生物質(zhì)來自農(nóng)業(yè)或食品加工產(chǎn)品和/或副產(chǎn)品。特別地，生物質(zhì)優(yōu)選 富含薦糖或淀粉，選自或源自例如玉米、小麥、大麥、黑麥、高梁、木馨、小黑麥、馬鈴馨、甘 馨、甘薦、甜菜和甜高梁。
[0027] 在一些優(yōu)選的實施方案中，生物質(zhì)選自或源自玉米、小麥、大麥、木馨、甜菜和甘 薦。
[0028] 用于從生物質(zhì)生產(chǎn)第一代乙醇的方法和在發(fā)酵步驟中使用酵母是本領(lǐng)域已知的。 最常見的工業(yè)方法使用物理、化學和生化處理，最終目的是允許糖的發(fā)酵并產(chǎn)生乙醇。存在 該方法的一些變體，并且是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的酵母菌株和通過培養(yǎng)運些菌株獲得的 酵母可W用于生產(chǎn)第一代乙醇的任何方法。
[0029] 本發(fā)明尤其適用于生產(chǎn)作為燃料的乙醇，但也適用于生產(chǎn)食品、化學劑、藥物和化 妝品工業(yè)的乙醇。
[0030] 除非另有定義，說明書中所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù) 人員通常理解的相同含義。而且，本文提及的所有出版物、專利申請、所有專利和任何其他 參考文獻通過引用的方式并入本文。
【附圖說明】
[0031] 圖1:根據(jù)實施例1在液化發(fā)酵培養(yǎng)基上進行的發(fā)酵試驗結(jié)束時的最終濃度。(A)乙 醇濃度和(B)甘油濃度。培養(yǎng)基A、B和C描述于表1。
[0032] 圖2:在各種發(fā)酵條件下1-4072菌株(A)和雜交體I-4790(B)、1-4791 (C)和1-4792 (D)的乙醇生產(chǎn)動力學。
【具體實施方式】
[0033] W下實施例描述本發(fā)明的一些實施方案。然而，應(yīng)當理解實施例和附圖僅W說明 性的方式呈現(xiàn)，而不W任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0034] 實施例1:選擇與1-4072菌株雜交的親本菌株
[0035] 在酒精發(fā)酵中測試一組21個菌株或克隆。測試在同時糖化和發(fā)酵(SSF)條件下進 行，其中糖相對于菌株轉(zhuǎn)化成乙醇的能力過量。首先，使用添加或不添加來自蒸饋殘渣的可 溶物質(zhì)的含有淀粉糊精的合成培養(yǎng)基。其次，使用按下表給出的比例的從玉米面粉、可溶物 質(zhì)部分、蒸饋殘渣和工藝水制備的發(fā)酵培養(yǎng)基。運些各種成分從根據(jù)第一代方法生產(chǎn)工業(yè) 乙醇的工廠獲得。將pH調(diào)節(jié)至5.6后，將基于玉米面粉的混合物用Liquozyme?SCDS (Novozymes)于85°C液化3小時。所用的Liquozyme?劑量是〇.8ml/kg所用面粉。接種前，將初 始抑調(diào)節(jié)至5.0或4.5;如下表所示加入各種濃度的尿素(相當于300、600和1000 ppm的氮）。 Wo.6ml/kg面粉的劑量加入Spyrizyme化日1 Ultra?(Novozymes)。將發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)為32 °C。在500ml =角瓶中，預先在豐富合成培養(yǎng)基中繁殖菌株(微曝氣繁殖）。
[0036] 要1
[0037]
[00；3 引
[0039] 在測試的各菌株中，保留W保藏號1-4072保藏于CNCM的菌株，因為其是在測試的 所有菌株中產(chǎn)生最多乙醇的菌株。在測試的各菌株中，保留1-4782菌株，因為其是產(chǎn)生大量 乙醇(盡管少于1-4072)，并且產(chǎn)生的甘油量比1-4072菌株少的菌株。
[0040] 有趣地注意到，與1-4072菌株的乙醇生產(chǎn)動力學相比，1-4782克隆的乙醇生產(chǎn)動 力學相當慢。圖IA和IB示出了試驗期間獲得的乙醇和甘油的最終濃度。
[0041] 因此，目的是通過雜交獲得至少一個對乙醇的耐受性比1-4072菌株高、甘油產(chǎn)量 比1-4072菌株低、且乙醇生產(chǎn)動力學至少與1-4072菌株相似的雜交體。
[0042] 實施例2:獲得新雜交體
[0043] -旦選擇親本菌株，進行通過雜交產(chǎn)生新菌株發(fā)展的各種技術(shù)步驟，包含：
[0044] -通過產(chǎn)抱然后萌發(fā)獲得兩個親本菌株的分離子，并表征它們的性別類型，
[0045] -建立雜交表后進行雜交，和
[0046] -分離并鑒定新雜交體。
[0047] 選擇1-4072菌株的精華分離子。制備1-4072菌株的分離子，并評估它們的乙醇產(chǎn) 量。然后，根據(jù)運些結(jié)果，選擇具有最佳酒精性能水平的8個V'性別類型的抱子和12個V 性別類型的抱子。
[0048] 進行雜交并獲得新菌株。為了獲得新菌株，在選擇的1-4072分離子和隨機選擇的 1-4782分離子之間進行若干系列的雜交。
[0049] 鑒定新雜交體。通過交配型PCR鑒定新雜交體。
[0050] 因此，在進行的雜交結(jié)束時，產(chǎn)生并驗證很多菌株。在雜交體中，如下所示，本申請 主題的1-4791、1-4790和1-4792尤其突出。
[0051 ] 實施例3:選擇新雜交體
[0052]為了能夠從292個新產(chǎn)生的菌株中選擇最佳雜交體，開發(fā)了四個水平的選擇。運些 選擇基于W下：監(jiān)測與1-4072對照相比，酒精發(fā)酵培養(yǎng)基用待研究的菌株接種后的質(zhì)量損 失，W及測量各種溫度(35°C和38°C)下發(fā)酵72小時后產(chǎn)生的乙醇濃度、剩余葡萄糖和甘油。 所用的發(fā)酵培養(yǎng)基是含有在測試菌株轉(zhuǎn)化乙醇的能力之上的高葡萄糖濃度的合成培養(yǎng)基。 選擇標準是比1-4072菌株更好的質(zhì)量損失動力學和/或比1-4072菌株降低的甘油產(chǎn)量。根 據(jù)化學計量方程：Imo 1葡萄糖一2mo 1 C〇2+2mo 1乙醇，質(zhì)量損失是通過酵母生產(chǎn)乙醇的間接 指示，運使得能夠整體上將產(chǎn)生和蒸發(fā)的C〇2形式的培養(yǎng)基質(zhì)量的質(zhì)量損失和產(chǎn)生的乙醇 質(zhì)量聯(lián)系起來。
[0化3] 最后，從292個菌株中選擇18個雜交體，包括I-4790J-4791和1-4792菌株。選擇運 些菌株因為它們具有W下特征：
[0化4]-雜交體1-4790:在35°C和38°C的溫度下，對于與1-4072菌株相等的乙醇產(chǎn)量，甘 油產(chǎn)量降低15-20%。然而，質(zhì)量損失動力學比1-4072菌株低；
[0化日]-雜交體1-4791:在35。(：和38。(：的溫度下，與1-4072菌株相比乙醇產(chǎn)量增加3.5%， 質(zhì)量損失動力學比1-4072菌株快，且甘油產(chǎn)量與1-4072菌株相等；
[0化6]-雜交體1-4792:在35。(：和38。(：的溫度下，乙醇產(chǎn)量與1-4072相等（在38。(：稍微提 高），質(zhì)量損失動力學與1-4072相等，且甘油產(chǎn)量比1-4072低7.5-8%。
[0057] 實施例4:雜交體在糖過量的培養(yǎng)基中從玉米面粉生產(chǎn)乙醇
[0058] 在基于玉米面粉和來自工業(yè)蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分的培養(yǎng)基中進行測試。在各 種發(fā)酵溫度下，用各種添加的氮，并在各種初始抑值下進行測試。研究的特征是:菌株對乙 醇的最大耐受性、甘油產(chǎn)量和乙醇生產(chǎn)動力學。
[0059] 測量隨時間的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量損失。一旦質(zhì)量損失達到穩(wěn)定，進行發(fā)酵培養(yǎng)基 的取樣并通過HPLC分析乙醇和甘油濃度。從測量的濃度和為了進行分析而取樣的時間點的 發(fā)酵液的質(zhì)量W及初始濃度和質(zhì)量值計算產(chǎn)生的乙醇和甘油的質(zhì)量。
[0060] 方案.用玉米面粉、來自蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分和工藝水制備發(fā)酵培養(yǎng)基。為了 盡可能像地模擬工業(yè)生產(chǎn)條件，從根據(jù)第一代方法生產(chǎn)工業(yè)乙醇的工廠獲得運些各種成 分。S種工業(yè)成分的比例是:玉米面粉(36%w/w)、來自蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分(35%w/w) 和工藝水(29%w/w)。將抑調(diào)節(jié)至5.6后，將混合物用Liquozyme?SCDS(Novozymes)于85°C液 化3小時。所用的Liquozyme?劑量是〇.8ml/kg所用面粉。接種前，將初始抑調(diào)節(jié)至5或4(根據(jù) 表），并加入各種濃度的尿素(相當于300、600和1000 ppm的氮）DW〇.6ml/kg面粉的劑量加入 Spyrizyme Fuel Ultra?(Novozymes)。在SOOmlS角瓶中，預先在豐富合成培養(yǎng)基中繁殖菌 株(微曝氣繁殖）。通過離屯、繁殖培養(yǎng)基并將離屯、沉淀重懸于水中來制備酵母膏。測定酵母 膏的固體含量，并用所述膏接種發(fā)酵培養(yǎng)基W具有〇.5g干酵母當量Ag培養(yǎng)基的接種水平。
[0061] 進行測試.下表表示進行的發(fā)酵測試和所用菌株的條件。
[0062] 表2.發(fā)酵測試條件
[0063]
[0064] A: 36 %玉米面粉、35 %來自蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分、29 %工藝水
[0065] B: 36 %玉米面粉、35 %來自蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分、29 %工藝水
[0066] N:氮的供給
[0067] 結(jié)果.所得結(jié)果如下表所示。
[006引表3-4.在測試1-9中產(chǎn)生的乙醇和甘油的最終濃度W及乙醇和甘油的質(zhì)量。
[0069]表3
[0072]
[0073] 運些結(jié)果清楚表明，雜交體對乙醇的耐受性比1-4072起始菌株好(相對于1-4072 菌株顯示2-3 %的優(yōu)勢），且它們產(chǎn)生的甘油比1-4072菌株少。1-4790、1-4791和1-4792菌株 的運種甘油低產(chǎn)量邏輯上應(yīng)當導致消耗的糖轉(zhuǎn)化成乙醇的更好收率。
[0074] 乙醇生產(chǎn)動力學.W舉例方式，圖2示出了測試10-13的質(zhì)量損失動力學。
[0075] 運些結(jié)果表明，在測試的所有菌株中，1-4072菌株具有最快的乙醇生產(chǎn)動力學。在 本發(fā)明的雜交體中，1-4791雜交體的乙醇生產(chǎn)動力學或多或少與1-4072菌株相似。另一方 面，1-4790雜交體在P冊顯示最慢的動力學，延遲高達10小時。
[0076] 實施例5:雜交體在糖濃度有限的培養(yǎng)基中從玉米面粉生產(chǎn)乙醇的測試
[0077] 轉(zhuǎn)化成乙醇的收率.為了加強之前的結(jié)果，用比實施例4的測試中所用的玉米面粉 濃度低的玉米面粉濃度進行一些測試，從而菌株完全可W消耗培養(yǎng)基中的可發(fā)酵糖。進行 的測試如下表5所示：
[0078] 表5.發(fā)酵條件
[0079]
[0080] C: 32°C : 33%玉米面粉、35%來自蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分、32%工藝水
[00川 D: 35°C : 30%玉米面粉、35%來自蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分、35%工藝水
[0082] 結(jié)果如下表6和7所示。
[0083] 表 6
[0084]
[
[
[
[0088] 所得結(jié)果證實了之前測試的觀察結(jié)果：雜交體I-4790、I-4791和1-4792產(chǎn)生比I-4072參考菌株明顯少的甘油和多的乙醇，尤其是在提供的氮(N)劑量降低時。
[0089] 結(jié)論.所得結(jié)果清楚表明：
[0090] -1-4791雜交體具有:與1-4072相同或相似的乙醇生產(chǎn)動力學、對乙醇更好的耐受 性(+2% )、更低的甘油產(chǎn)量(-5% )和更好的乙醇收率(+2% );
[0091] -1-4790雜交體具有：比1-4072對乙醇更好的耐受性(+3%)、更低的甘油產(chǎn)量(-10%)和更好的乙醇收率(+2%)，但乙醇生產(chǎn)動力學比1-4072慢；
[0092] -1-4792雜交體具有：除了在苛刻條件下（38°C/pH 4)，比1-4072對乙醇更好的耐 受性(+3%)、與1-4072相似的乙醇生產(chǎn)動力學、更低的甘油產(chǎn)量(-5%)和更好的乙醇收率 (+!%)〇
[0093] 實施例6:用選擇的=個雜交體生產(chǎn)酵母的測試
[0094] 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的補料-分批方案，在曝氣條件下，在中試規(guī)模繁殖選擇 的雜交體。根據(jù)常規(guī)技術(shù)干燥所得酵母。運些酵母生產(chǎn)測試在沒有注意到任何特別問題下 進行。
[00M]用產(chǎn)生的即溶干酵母進行乙醇生產(chǎn)測試，目的是驗證酵母生產(chǎn)過程不損害產(chǎn)生的 菌株的性能水平。
[0096] 方案.用玉米面粉、來自蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分和工藝水制備發(fā)酵培養(yǎng)基。從生 產(chǎn)工業(yè)乙醇的工廠獲得運些各種成分。S種工業(yè)成分的比例是：玉米面粉(36%w/w)、來自 蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分（35%w/w)和工藝水（29%w/w)。將pH調(diào)節(jié)至5.6后，將混合物用 Liquoz;yme?SCDS(Novoz;ymes)于85°C 液化3小時。所用的Liquozyme? 劑量是0.8ml/kg 所用 面粉。
[0097] 在用水稀釋的液化培養(yǎng)基(70%w/w、30%w/w)上繁殖從雜交體I-4790J-4791和 1-4792產(chǎn)生的干酵母W及商業(yè)酵母化hanol Red?。接種水平是0.5g干酵母Ag培養(yǎng)基，將pH 調(diào)節(jié)至5,繁殖溫度是32°C，加入尿素（SOOppm)和Spirizyme化日1叫tra?(〇.6ml/kg面粉）。 W10 %重量/重量的轉(zhuǎn)移將繁殖培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0098] 在表8所示的條件下進行發(fā)酵。
[0099] 表 8
[0100]
[0101] B: 36 %玉米面粉、35 %來自蒸饋殘渣的可溶物質(zhì)部分、29 %工藝水
[0102] 如表9所示，在進行的測試的精確度極限內(nèi)，所得結(jié)果證實已經(jīng)獲得的結(jié)果，并證 實生產(chǎn)并干燥I-4790、I-4791和1-4792菌株的可能性。
[0103] 結(jié)論.根據(jù)本發(fā)明獲得的結(jié)果能夠獲得當它們用于從源自植物生物質(zhì)的糖生產(chǎn)乙 醇時，具有在生產(chǎn)力和收率上顯著改進的性能水平的工業(yè)酵母。
[0104] 與市場上的參考產(chǎn)品化thanol Red?)相比；
[01化]-1-4790工業(yè)菌株能夠?qū)⒁掖忌a(chǎn)力提高+2%，由于產(chǎn)生的甘油量降低10%，乙 醇/糖收率提局；
[0106] -1-4791工業(yè)菌株能夠?qū)⒁掖忌a(chǎn)力提高+2%，由于產(chǎn)生的甘油量降低5%，乙醇/ 糖收率提局；
[0107] -1-4792工業(yè)菌株能夠?qū)⒁掖忌a(chǎn)力提高+1%，由于產(chǎn)生的甘油量降低5%，乙醇/ 糖收率提高.
[010引 表9
【主權(quán)項】
1. 釀酒酵母菌株，選自以保藏號1-4791于2013年7月25日保藏于CNCM的酵母菌株、以保 藏號1-4790于2013年7月25日保藏于CNCM的酵母菌株和以保藏號1-4792于2013年7月25日 保藏于CNCM的酵母菌株。2. 通過培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的酵母菌株獲得的釀酒酵母。3. 權(quán)利要求1所述的酵母菌株或權(quán)利要求2所述的酵母用于從生物質(zhì)生產(chǎn)第一代乙醇 的用途。4. 權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述生物質(zhì)富含糖和/或淀粉。5. 權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述生物質(zhì)包含或源自甘蔗、甜菜、甜高粱、玉 米、小麥、大麥、黑麥、高粱、小黑麥、馬鈴薯、甘薯和/或木薯。6. 用于從生物質(zhì)生產(chǎn)第一代乙醇的方法，包含使用權(quán)利要求1所述的酵母菌株或權(quán)利 要求2所述的酵母的發(fā)酵步驟。7. 權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述生物質(zhì)富含糖和/或淀粉。8. 權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述生物質(zhì)包含甘蔗、甜菜、甜高粱、玉米、小麥、 大麥、黑麥、高粱、小黑麥、馬鈴薯、甘薯和/或木薯。
【文檔編號】C12N1/18GK105874056SQ201480071617
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月30日
【發(fā)明人】J-M·巴沃澤, A-D·基普爾, A·特拜基
【申請人】樂斯福公司