專利名稱：由rna依賴性dna聚合酶活化的藥物前體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作藥物前體的化合物領(lǐng)域，特別是在癌細(xì)胞和被逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的細(xì)胞中被以RNA分子為模板的DNA聚合酶例如人端粒酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活化的藥物前體。
背景技術(shù)：
目前，由于用于癌細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞的藥物的選擇性低使得癌癥和逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的病癥的治療效果受到嚴(yán)重限制。致瘤性轉(zhuǎn)化和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染兩者都不能以表型改變后易成為藥物的選擇性靶點(diǎn)的方式來轉(zhuǎn)化細(xì)胞。例如癌癥藥理學(xué)仍然是基于對(duì)個(gè)體的健康細(xì)胞也高度有害的細(xì)胞毒性藥物，而抗獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)藥物大部分由于其對(duì)未感染細(xì)胞的正常生理學(xué)的干擾而具有嚴(yán)重副作用。抗癌和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的選擇性的缺乏是其在體內(nèi)具有高毒性的原因。此外癌癥中那些不需要的次級(jí)效應(yīng)不能通過長(zhǎng)效飽和緩和來代償，特別是在長(zhǎng)期存活機(jī)會(huì)傾向于零的仍是不治之癥的晚期實(shí)體腫瘤中。因此需要具有既減小副作用又增強(qiáng)其功效和治療指數(shù)的更有選擇性的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒和抗癌藥物。
近年來進(jìn)行了許多嘗試將細(xì)胞毒性藥物做成“藥物前體”。從治療觀點(diǎn)來說，“藥物前體”是無活性的化合物，它能在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性藥物，即，由于其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了化學(xué)或酶轉(zhuǎn)化而成為有治療活性的化合物。
提供好的藥物前體的難點(diǎn)不僅僅在于尋找能在體內(nèi)活化的分子，還在于使此活化對(duì)靶細(xì)胞有高度選擇性。換言之，理想的候選抗癌或抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物前體在健康組織中保持穩(wěn)定和無活性而僅在到達(dá)感染或癌癥細(xì)胞后活化為藥物發(fā)揮殺死這些細(xì)胞的細(xì)胞毒素作用。
這就需要開發(fā)抗癌和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物前體。
發(fā)明概述現(xiàn)在本申請(qǐng)人已經(jīng)開發(fā)出了新的抗癌和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物前體，其活性細(xì)胞毒性化合物與RNA依賴性DNA聚合酶例如端粒酶或逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶水解的分子結(jié)合，通過水解釋放出細(xì)胞毒性化合物的細(xì)胞毒性片段或前體片段。
因此本發(fā)明的目的是提供藥物前體化合物，它包含一個(gè)能被RNA依賴性DNA聚合酶水解的部分，該部分共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞毒性化合物或細(xì)胞毒性化合物的體的殘基上，其中所述藥物前體化合物的水解產(chǎn)物是具有細(xì)胞毒性的，以及其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的另外目的是提供制備上述藥物前體化合物，藥學(xué)組合物的方法、所述藥學(xué)組合物包含至少一種上述定義的化合物，該化合物任選與一種或多種佐劑和/或其它活性成分聯(lián)用、以及上述化合物用于制備對(duì)實(shí)體腫瘤、癌前狀態(tài)和由逆轉(zhuǎn)錄病毒感染引起的疾病的治療有效的藥學(xué)組合物的用途。
本發(fā)明的另外目的是提供用于體外和體內(nèi)治療血液學(xué)腫瘤和治療來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的患者的血液及血液衍生物的藥物，包含至少一種如上述定義的藥物前體化合物；如上定義的藥物前體化合物用于體外治療血液學(xué)腫瘤和治療來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的患者的血液和血液衍生物的用途；體外或體內(nèi)治療血液學(xué)腫瘤和來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的患者的血液和血液衍生物的方法，包含用至少一種如上述定義的化合物接觸待治療的血液或血液衍生物的步驟；增強(qiáng)細(xì)胞毒性化合物效力和耐受性的方法，包含形成藥物前體，其中所述細(xì)胞毒性化合物結(jié)合于能被RNA依賴性DNA聚合酶水解的部分上；和治療實(shí)體腫瘤、癌前狀態(tài)和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染引起的疾病的治療方法，包含給需要此種治療的患者施用藥學(xué)有效量的至少一種如上述定義的化合物，任選與一種或多種佐劑和/或其它活性成分聯(lián)用。本發(fā)明化合物的特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下說明中詳細(xì)描述。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明“所述藥物前體化合物水解產(chǎn)物是具有細(xì)胞毒性的”的表述的意思是水解產(chǎn)物可以是細(xì)胞毒性片段類的或是可以通過細(xì)胞活動(dòng)在化學(xué)轉(zhuǎn)化后成為具有細(xì)胞毒性的片段。術(shù)語“片段”的意思是指藥物前體化合物通過水解所釋放的一部分。
端粒酶是將核苷酸加入端粒末端、染色體末端的RNA依賴性DNA聚合酶。由于其酶活性，它類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶；與上述其它酶的不同是端粒酶是核糖核蛋白，是結(jié)合在復(fù)合物中的RNA模板。
人的大多數(shù)體細(xì)胞不顯示端粒酶活性；因此端粒在連續(xù)的細(xì)胞分裂中逐漸縮短直到端粒達(dá)到最低臨界長(zhǎng)度標(biāo)志著細(xì)胞復(fù)制阻斷和進(jìn)入所謂衰老期。相反，在大多數(shù)癌細(xì)胞中端粒酶活性是可恢復(fù)的，因此端粒長(zhǎng)度保持不變并且轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠無限增生、允許癌克隆的擴(kuò)張且有利于轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。此領(lǐng)域的研究使抑制端粒酶活性的預(yù)計(jì)作為抗腫瘤藥物的化合物獲得發(fā)展。然而證明這些化合物的抗癌作用的嘗試表明即使當(dāng)這些化合物有效阻斷端粒酶活性的時(shí)候端粒縮短為臨界長(zhǎng)度需要的時(shí)間仍太長(zhǎng)而無法與癌演進(jìn)進(jìn)行有效地比較。
本申請(qǐng)人在反向透視中利用了作為癌細(xì)胞特征的端粒酶活性。不去試圖抑制它的活性，本申請(qǐng)人設(shè)計(jì)并制備了被端粒酶本身活化為細(xì)胞毒性化合物的藥物前體；在此情況下治療功效不是酶抑制的功能而是其活性的功能，僅在端粒酶存在的靶細(xì)胞內(nèi)特異性釋放細(xì)胞毒性化合物。
由于所有RNA依賴性DNA聚合酶具有共同的酶機(jī)制，因此相同的分子還能被逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶例如AIDS的病因HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶識(shí)別，并因此還對(duì)治療逆轉(zhuǎn)錄病毒感染引起的疾病例如AIDS有效。
根據(jù)本發(fā)明所述的藥物前體化合物例如含有二核苷多磷酸的類似物作為底物可被識(shí)別，并且被端粒酶或逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶催化水解，隨后釋放出細(xì)胞毒性分子。
本發(fā)明化合物的水解部分優(yōu)選包含作為RNA依賴性DNA聚合酶的底物的部分，它共價(jià)結(jié)合于包含選自磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯(tiophosphate)或硫代膦酸酯(tiophosphonate)彼此相同或不同的至少三個(gè)基團(tuán)的鏈上，可能被一個(gè)或多個(gè)其它細(xì)胞毒性化合物殘基取代，與第一個(gè)殘基相同或不同，或被一個(gè)或多個(gè)選自包括烷基，特別是低級(jí)烷基、芳基和芳基烷基的組的R基團(tuán)取代。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選化合物是具有通式(I)的化合物TS-Om-(PXX’)-(O-PYY’)n-O-(PZZ’)-Op-CT(I)其中TS是被RNA依賴性DNA聚合酶的催化位點(diǎn)識(shí)別的部分，CT是細(xì)胞毒性化合物或細(xì)胞毒性化合物前體的殘基，X、Y和Z從O和S中選擇，X’、Y’和Z’從O、CT’、O-CT’、R和OR中選擇，其中CT’是與CT相同或不同的細(xì)胞毒性化合物或細(xì)胞毒性化合物前體的殘基，R選自包括烷基，特別是低級(jí)烷基、芳基和芳基烷基的組，m＝0，1；n＝1，2；p＝0，1。
更優(yōu)選化合物是式(I)化合物，其中X＝X’＝Z＝Z’＝O，并且m＝1。
當(dāng)不另行說明時(shí)，如本發(fā)明中所用的術(shù)語“烷基”、“低級(jí)烷基”、“芳基”和“烷基芳基”應(yīng)當(dāng)如下理解術(shù)語“烷基”是指僅有單鍵的直鏈或支鏈烴鏈，優(yōu)選C1-C20鏈。根據(jù)本發(fā)明的烷基基團(tuán)的實(shí)例包括，但是不限于，甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基和叔戊基。
-術(shù)語“低級(jí)烷基”是指鏈中有1至7個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選1至4個(gè)碳原子。根據(jù)本發(fā)明的低級(jí)烷基基團(tuán)的實(shí)例包括，但是不限于，甲基、乙基、丙基、異丙基和正丁基。
-術(shù)語“芳基”是指包含一個(gè)或多個(gè)不飽和環(huán)的碳環(huán)或雜環(huán)基團(tuán)，每個(gè)環(huán)為5至8元環(huán)，優(yōu)選5或6元環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的芳基基團(tuán)的實(shí)例包括，但是不限于，苯基、吡啶基、甲苯基、萘基、antracenyl和phenantryl。
-術(shù)語“芳基烷基”是指具有如上定義的烷基取代基和芳基取代基的基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的烷基芳基的實(shí)例包括，但是不限于，乙基苯次甲基、異丁基苯次甲基、芐基、乙基芐基、丙基芐基、異丙基芐基、丁基芐基、異丁基芐基、環(huán)乙磺?；S基、stirenyl和聯(lián)苯基。
根據(jù)本發(fā)明，烷基、低級(jí)烷基、芳基和芳基烷基基團(tuán)可以被例如OH、NH2、鹵素基團(tuán)和具有至少一個(gè)雙鍵或三鍵的烴鏈例如C2-8烯基和C2-8炔基基團(tuán)取代。R基團(tuán)優(yōu)選從甲基和苯基中選擇，更優(yōu)選苯基。
本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)盡管有空間位阻，但是結(jié)合于可水解部分的取代基不能消除癌細(xì)胞培養(yǎng)基的提取物中的水解活性，從而使結(jié)合于端粒酶底物的分子被釋放出來。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，TS部分是核苷或其類似物的殘基，例如選自包括脫氧鳥苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、7-脫氮-2’-脫氧鳥苷、7-脫氮-2’-腺苷、6-硫-2’-脫氧鳥苷、2’，3’-雙脫氧鳥苷、2’，3’-雙脫氧肌苷、D-碳環(huán)-2’-脫氧鳥苷、疊氮胸苷、卡波佛、阿德福韋和替諾福韋的組。
RNA依賴性DNA聚合酶對(duì)藥物前體的活化產(chǎn)生于P-O鍵的水解，同時(shí)釋放出細(xì)胞毒性化合物或其前體。
能夠用于制備本發(fā)明藥物前體的細(xì)胞毒性化合物選自包括阿昔洛韋、噴昔洛韋、更昔洛韋、7-甲基-鳥苷、吉西他濱、氟脫氧尿苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、2-氯脫氧腺苷、碘苷、阿糖胞苷、曲西立濱、5-氮雜-2’-脫氧胞苷、2’3’-雙脫氫尿昔-2’3’-脫氧尿苷、5-羥基-2’-脫氧胞苷、3-脫氮尿苷、依諾他濱、2’，3’-雙脫氧胞苷、拉米夫定、恩曲他濱、(S)-1-(3-羥基-1-甲氧基丙基)胞嘧啶、(-)-2’-脫氧-3’-氧雜-4’-硫代胞苷、萊兩佛(racivir)、瑞沃賽特(reverset)、1-(1，3-二羥基-2-丙氧基-甲基)胞嘧啶、(2’S)-2’-脫氧-2’-C-甲基胞苷、1-(2-脫氧-2-亞甲基-β-D-赤型(erithro)-呋喃糖基(pentofuranosyl))胞嘧啶、1-(2-C-氰基-2-脫氧-1-β-D-阿拉伯糖-呋喃糖基)胞嘧啶、1-(3-C-乙炔基-β-D-核-呋喃糖基)胞嘧啶、β-L-二氧戊環(huán)-胞苷和(E)-2’-脫氧-2’-(氟亞甲基)胞苷的組。
上述優(yōu)選TS部分在代表相應(yīng)核苷或其類似物的下列化學(xué)式中于星號(hào)指示的位置結(jié)合于磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯或硫代膦酸酯基團(tuán)的鏈上 2’-脫氧鳥苷2’-脫氧腺苷 3’-脫氧胸苷 7-脫氮-2’-脫氧鳥苷 7-脫氮-2’-脫氧腺苷 6-硫代-2’-脫氧鳥苷 2’，3’-雙脫氧鳥苷 2’，3’-雙脫氧肌苷 D-碳環(huán)-2’-脫氧鳥苷
3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷 卡波佛 阿德福韋 替諾福韋如上列出的優(yōu)選CT或CT’殘基在代表相應(yīng)細(xì)胞毒性化合物的下列化學(xué)式中于星號(hào)指示的位置結(jié)合于磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯或硫代膦酸酯基團(tuán)的鏈上 阿昔洛韋 噴昔洛韋
更昔洛韋 7-甲基鳥苷 吉西他濱 氟脫氧尿苷氟尿苷 氟達(dá)拉濱2-氯脫氧腺苷 碘苷 阿糖胞苷 曲西立濱
5-氮雜-2’-脫氧胞苷 2’3’-雙脫氫尿苷-2’3’-脫氧尿苷 5-羥基-2’-脫氧胞苷 3-脫氮尿苷 依諾他濱 2’，3’-雙脫氧胞苷 拉米夫定 恩曲他濱 (S)-1-(3-羥基-1-甲氧基丙基)胞嘧啶 (-)-2’-脫氧-3’-氧雜-4’-硫代胞苷
瑞沃賽特 1-(1，3-二羥基-2-丙氧基-甲基)胞嘧啶 萊西佛 1-β-D-阿拉伯糖-呋喃糖基胞嘧啶 (2’S)-2’-脫氧-2’-C-甲基胞苷 1-(2-脫氧-2-亞甲基-β-D-赤型-呋喃糖基)胞嘧啶
1-(2-C-氰基-2-脫氧-1-β-D-阿拉伯糖-呋喃糖基)胞嘧啶 1-(3-C-乙炔基-β-D-核-呋喃糖基)胞嘧啶 (E)-2’-脫氧-2’-(氟亞甲基)胞苷
β-L-二氧戊環(huán)-胞苷游離形式或藥學(xué)可接受的鹽形式的本發(fā)明化合物可根據(jù)制備藥學(xué)組合物的常規(guī)方法制備藥學(xué)組合物，并且可以包含一種或多種藥學(xué)可接受的輔料和/或稀釋劑。
本發(fā)明藥學(xué)組合物可通過任何常規(guī)方法給藥，例如經(jīng)腸胃外、口服、局部、鼻等等，特別是通過腸胃外、靜脈注射、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。因此，根據(jù)本發(fā)明的化合物制劑包括特別是無菌水溶液和非水溶液、混懸液、乳劑和用時(shí)溶解于無菌介質(zhì)中的無菌固體組合物，并且它們還可包含藥學(xué)可接受的輔料和/或稀釋劑。
本發(fā)明藥學(xué)組合物可包含至少一種本發(fā)明化合物為活性成分，可與其它適當(dāng)選擇的佐劑和/或活性成分聯(lián)用，特別是抗代謝物，例如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、西他拉濱(citarabine)、5-氮雜胞苷、吉他西濱、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、磷酸氟達(dá)拉濱、噴司他丁和克拉屈濱。
本發(fā)明的藥物前體對(duì)治療實(shí)體腫瘤、癌前狀態(tài)和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染引起的疾病有效；此外，它們可用于體內(nèi)和體外治療血液學(xué)腫瘤和凈化來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的患者的血液和血液衍生物。
本發(fā)明藥物前體的給藥還可與一種或多種其它活性成分聯(lián)用，特別是例如那些上面提到的抗代謝物，包含于與本發(fā)明藥物前體相同的藥學(xué)組合物中或包含于另一與本發(fā)明藥學(xué)組合物在聯(lián)合化療設(shè)計(jì)中一起給藥的藥學(xué)組合物中。
上面描述的化合物可從細(xì)胞毒性化合物開始制備，在適當(dāng)條件下和用已知方法，使細(xì)胞毒性化合物共價(jià)結(jié)合于一個(gè)由至少三個(gè)磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯或硫代膦酸酯基團(tuán)組成的適合的鏈上，并且因此通過此鏈結(jié)合于被端粒酶或逆轉(zhuǎn)錄酶識(shí)別為底物的分子的一部分上，反之亦然。
制備本發(fā)明化合物的所有起始化合物是市場(chǎng)上可獲得的產(chǎn)品，或可通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從市場(chǎng)上可獲得的產(chǎn)品開始制備。
下列所報(bào)道的實(shí)施例不限制本發(fā)明的說明。
實(shí)施例1阿昔洛韋單磷酸酯(ACVMP)的制備ACVMP用摘自Yoshikawa等人Tetrahedron Lett.1967，50，5065的方法制備。1g阿昔洛韋(4.3mmol)和6ml磷酸三乙酯的混合物在O℃下逐漸加入到4ml磷酸三乙酯和860μl磷酰氯(8.6mmol)的混合物中?；旌衔镌?-4℃攪拌12小時(shí)。然后加入100ml乙醚沉淀出阿昔洛韋-5’-磷酰二氯。
過濾沉淀并且溶解于25ml用冰預(yù)冷的5％NaHCO3水溶液中。0℃攪拌1小時(shí)并室溫?cái)嚢?小時(shí)后，用1M NaOH調(diào)pH至7.0。再攪拌12小時(shí)后，混合物蒸發(fā)至干，溶解于最小體積的水中并上樣至DEAE-纖維素柱。用pH 7.5的三乙胺重碳酸鹽線性梯度(0.05-0.8M)洗脫柱子。對(duì)適當(dāng)?shù)南疵摷?jí)分進(jìn)行真空蒸發(fā)。加入乙醇并且再次蒸發(fā)除去三乙胺重碳酸鹽獲得為三乙胺鹽的ACVMP(1.28g，2.53mmol，收率＝59％)。
1H-NMR(D2O，pH 7.5，200MHz)δ(ppm)1.17-1.21(t，J＝7.3，18H)，3.06-3.17(q，J＝7.3，12H)，3.69-3.77(m，2H)，3.85-3.94(m，2H)，5.51(s，1H)，7.93(s，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 7.5，80MHz)δ(ppm)3.79(s)。
實(shí)施例2阿昔洛韋二磷酸酯(ACVDP)的制備ACVDP用摘自Hoard D.E.等人J.Am.Chem.Soc.1965，87，1785-1788的方法合成。此轉(zhuǎn)化需要的正磷酸三丁基胺如下制備。無水磷酸(5g，51mmol)和10ml CH2Cl2在無水條件下放入施蘭克試管(Schlenk tube)中。然后將三丁基胺(12.25ml，51mmol)在30分鐘內(nèi)滴入溶液。混合物攪拌1小時(shí)。將CH2Cl2蒸發(fā)并且反應(yīng)殘余物用3×10ml無水吡啶和2×10ml無水DMF重蒸。終產(chǎn)物以1M濃度溶解于無水DMF中，并且在4℃經(jīng)分子篩(4)保存。
ACVMP三乙胺鹽(1.0lg，2mmol)用Dowex 50W-X8(吡啶型樹脂)轉(zhuǎn)化為其吡啶鹽。用50％甲醇水溶液洗脫柱子。洗脫液在減壓下蒸發(fā)至干，然后加入10ml甲醇和1.44ml三丁基胺(6mmol)。攪拌30分鐘后，真空下濃縮溶液。通過反復(fù)加入和蒸發(fā)無水吡啶(3×10ml)、無水甲苯(2×10ml)和無水DMF(3×10ml)來干燥殘余物得到的ACVMP三丁基胺鹽溶解于15ml無水DMF中。
1，1’-羰基二咪唑(1.5g，12mmol)溶解于5ml DMF中。將此溶液加入到ACVMP溶液中。在分子篩上室溫?cái)嚢杌旌衔铩?2小時(shí)后，加入700μl無水甲醇(12mmol)和再過30分鐘后，將13ml含有1M正磷酸三丁基胺的DMF(13mmol)在攪拌下滴入。室溫12小時(shí)后，離心除去沉淀。上清液中加入75ml水并且獲得的溶液用3×50ml CHCl3萃取，使其減少體積(5ml)并上樣至DEAE-纖維素柱。用三乙胺重碳酸鹽的線性梯度(0.05-1M)洗脫柱子。對(duì)適當(dāng)?shù)南疵摷?jí)分進(jìn)行真空蒸發(fā)。殘余重碳酸鹽通過兩個(gè)連續(xù)的蒸發(fā)步驟從20ml甲醇中除去。蒸發(fā)至干獲得984mgACVDP三乙胺鹽(1.42mmol，收率＝70％)。
1H-NMR(D2O，pH 8.5，200MHz)δ(ppm)1.23-1.30(t，J＝7.3，27H)，3.14-3.25(q，J＝7.3，18H)，3.77-3.81(m，2H)，4.04-4.12(m，2H)，5.56(s，1H)，7.98(s，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 8.5，80MHz)δ(ppm)-6.35-6.62(d，J＝22.1)，-10.62-10.90(d，J＝22.1).
實(shí)施例3無環(huán)鳥苷基2’-脫氧-5’-鳥苷三磷酸酯(ACVTPdG)的制備dGMP和ACVDP的三丁基胺鹽通過首先用Dowex 50W-X8色譜柱將其鈉鹽或三乙胺鹽轉(zhuǎn)化為吡啶鹽來制備。
將水(5ml)和700mg dGMP(2mmol)的溶液上樣至Dowex 50W-X8(吡啶型)。用50％甲醇水溶液洗脫柱子。洗脫液減壓蒸發(fā)至干，然后加入500μl三丁基胺(2mmol)和10ml水。30分鐘后將混合物蒸發(fā)至干。獲得的殘余物用3×10ml無水吡啶和2×5ml無水DMF蒸發(fā)。
984mg ACVDP三乙胺鹽(1.42mmol)溶解于5ml水中上樣至Dowex 50W-X8柱并且用50％甲醇水溶液洗脫。真空下濃縮溶液，然后加入710μl三丁基胺(2.8mmol)和15ml水。攪拌30分鐘后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，殘余物通過反復(fù)加入和蒸發(fā)無水吡啶(3×10ml)和無水DMF(2×10ml)來干燥。
ACVDP的無水三丁基胺鹽，14ml DMF和910mg 1，1’-羰基二咪唑(7.1mmol)于施蘭克試管中在無水條件下混和。在分子篩上室溫?cái)嚢?2小時(shí)后，加入570μl甲醇(10mmol)，30分鐘后加入6ml含有dGMP的無水三丁基胺鹽的DMF。另外攪拌14小時(shí)后，將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，溶解于最小體積的水中并上樣至DEAE-纖維素柱。用三乙胺重碳酸鹽緩沖液(pH 7.5)線性梯度(0.05-1M)洗脫柱子。將含有ACVTP-dG的洗脫級(jí)分合并并且濃縮至干。殘余的重碳酸鹽通過兩個(gè)連續(xù)的蒸發(fā)從20ml甲醇中除去，并且殘余物質(zhì)用Dowex 50W-X8樹脂轉(zhuǎn)化為其鈉鹽，通過用1M NaOH四倍柱床體積洗滌轉(zhuǎn)化后者使其從其H+形式至其鈉鹽形式后，用水洗滌直至pH中性。獲得的產(chǎn)物真空下干燥為干燥黃色粉末(350mg，0.45mmol，收率＝32％)。
1H-NMR(D2O，pH 7.5，200MHz)δ(ppm)2.35-2.48(m，1H)，2.65-2.79(m，1H)，3.70-3.74(m，2H)，4.05-4.20(m，5H)，4.65-4.71(m，1H)，5.39(s，1H)，6.16-6.23(t，J＝6.59，1H)7.84(s，1H)，7.99(s，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 7.5，80MHz)δ(ppm)-11.13-11.37(d，J＝19.53)，-11.28-11.51(d，J＝19.53)，-22.90-23.36(t，J＝19.53)。
實(shí)施例4無環(huán)鳥苷基2’-脫氧-5’-腺苷三磷酸酯(ACVTPdA)的制備按照上面實(shí)施例3中描述的方法使用2’-脫氧腺苷-5’-單磷酸二鈉鹽(dAMP，165mg，0.5mmol)代替dGMP和ACVDP三丁基胺鹽(194mg，0.28mmol)來制備ACVTPdA，得到ACVTPdA鈉鹽為黃色粉末(82mg，0.11mmol，收率＝39％)。
1H-NMR(D2O，pH 7.5，200MHz)δ(ppm)2.42-2.53(m，1H)，2.62-2.75(m，1H)，3.61-3.65(m，2H)，3.97-4.19(m，5H)，4.64-4.71(m，1H)，5.29(s，1H)，6.31-6.38(t，J＝6.59，1H)7.70(s，1H)，8.05(s，1H)，8.34(s，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 7.5，80MHz)δ(ppm)-11.41-11.65(d，J＝19.53)，-11.59-11.83(d，J＝19.53)，-23.27-23.76(t，J＝19.53)。
實(shí)施例5無環(huán)鳥苷基5’-胸苷三磷酸酯(ACVTPT)的制備按照上面實(shí)施例3中描述的方法使用胸苷-5’-單磷酸二鈉鹽(TMP，183mg，0.5mmol)代替dGMP和ACVDP三丁基胺鹽(194mg，0.28mmol)來制備ACVTP-T，得到ACVTP-T鈉鹽為黃色粉末(100mg，0.13mmol，收率＝46％)。
1H-NMR(D2O，pH 7.5，200MHz)δ(ppm)1.95(s，3H)，2.31-2.40(m，1H)，3.83-3.89(m，2H)，4.12-4.29(m，5H)，4.61-4.68(m，1H)，5.59(s，1H)，6.31-6.38(t，J＝6.59，1H)，7.66(s，1H)，7.79(s，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 7.5，80MHz)δ(ppm)-11.30-11.64(d，J＝19.50)，-11.59-11.83(d，J＝19.50)，-23.32-23.80(t，J＝19.50)。
實(shí)施例63’-疊氮胸苷-5’-單磷酸酯的制備100mg 3’-疊氮胸苷(0.37mmol)和0.5ml磷酸三乙酯的混合物在0℃下逐漸加入到1ml磷酸三乙酯和100μl磷酰氯(1.0mmol)的混合物中。混合物在0-4℃攪拌下保持16小時(shí)。然后加入10ml用冰預(yù)冷的5％NaHCO3水溶液并于0℃攪拌1小時(shí)后，用1M NaOH調(diào)pH至7.0。繼續(xù)攪拌12小時(shí)后，混合物用3×10ml乙醚萃取來除去磷酸三乙酯。減少水溶液體積(1ml)并且上樣至DEAE-纖維素柱。用pH 7.5的三乙胺重碳酸鹽線性梯度(0.05-0.4M)洗脫柱子。對(duì)適當(dāng)?shù)南疵摷?jí)分進(jìn)行真空蒸發(fā)。加入甲醇并且再次蒸發(fā)以除去三乙胺重碳酸鹽獲得的3’-疊氮胸苷-5’-單磷酸三乙胺鹽為白色固體(90mg，0.15mmol，收率＝40％)。
1H-NMR(D2O，pH 7.5，200MHz)δ(ppm)1.23-1.30(t，J＝7.32，18H)，1.92(s，3H)，2.44-2.52(m，2H)，3.13-3.24(q，J＝7.32，12H)，3.96-4.00(m，2H)，4.12-4.20(m，1H)，4.46-4.54(m，1H)，6.22-6.29(t，J＝6.59，1H)，7.81(s，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 7.5，80MHz)δ(ppm)2.57(s)。
實(shí)施例72’，3’，-雙脫氧胞苷-5’-單磷酸酯的制備按照上面實(shí)施例6描述的合成3’-疊氮胸苷-5’-單磷酸酯的方法制備2’3’-雙脫氧胞苷-5’-單磷酸酯，使用2’3’-雙脫氧胞苷(ddC，100mg，0.47mmol)代替AZT，得到的2’3’-雙脫氧胞苷-5’-單磷酸酯為白色固體(ddCMP，145mg，0.28mmol，收率＝59％)。
1H-NMR(D2O，pH 7.5，200MHz)δ(ppm)1.23-1.30(t，J＝7.32，18H)，1.74-2.11(m，2H)，2.24-2.40(m，2H)，3.13-3.24(q，J＝7.32，12H)，3.85-3.90(m，1H)，4.02-4.11(m，1H)，4.18-4.30(m，1H)，5.88-5.92(m，1H)，6.04-6.08(d，J＝7.32，1H)，8.08-8.12(d，J＝7.32，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 7.5，80MHz)δ(ppm)1.30(s)。
實(shí)施例82’，3’-雙脫氧胞苷-5’-二磷酸酯的制備按照上面實(shí)施例3描述的方法用2’3’-雙脫氧胞苷-5’-單磷酸三乙胺鹽(105mg，0.2mmol)代替無環(huán)鳥苷單磷酸酯制備2’，3’-雙脫氧胞苷-5’-二磷酸酯(ddCDP)，得到的ddCDP為白色固體(100mg，0.14mmol，收率＝70％)。
1H-NMR(D2O，pH 7.5，200MHz)δ(ppm)1.23-1.30(t，J＝7.32，18H)，1.62-1.96(m，2H)，2.12-2.37(m，2H)，3.13-3.24(q，J＝7.32，12H)，3.75-3.80(m，1H)，3.92-4.02(m，1H)，4.11-4.21(m，1H)，5.85-5.88(m，2H)，7.81-7.85(d，J＝7.32，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 7.5，80MHz)δ(ppm)-4.51-6.47(br s)，-8.40-9.40(br s)。
實(shí)施例9無環(huán)鳥苷基-3’-疊氮胸苷-5’-三磷酸酯的制備按照上面實(shí)施例3描述的方法用3’-疊氮胸苷-5’-單磷酸三乙胺鹽(AZTMP，90mg，0.16mmol)代替dGMP和ACVDP三丁基胺鹽(80mg，0.12mmol)制備ACV-TP-AZT，得到的ACV-TP-AZT鈉鹽為黃色粉末(30mg，0.04mmol，收率＝33％)。
1H-NMR(D2O，pH 7.5，200MHz)δ(ppm)1.91(s，3H)，2.36-2.52(m，2H)，3.72-3.83(m，2H)，4.05-4.24(m，4H)，4.52-4.63(m，1H)，5.43(s，2H)，6.22-6.31(t，J＝7.32，1H)，7.75(s，1H)，7.88(s，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 7.5，80MHz)δ(ppm)-11.38-11.63(d，J＝18.30)，-11.77-12.01(d，J＝18.31)，-23.11-23.56(t，J＝18.31)。
實(shí)施例102’，3’-雙脫氧胞苷-2’-脫氧-5’-鳥苷三磷酸酯的制備按照上面實(shí)施例3描述的方法用2’，3’-雙脫氧胞苷-5’-二磷酸三乙胺鹽(ddCDP，100mg，0.14mmol)代替ACVDP三乙胺鹽和2’脫氧鳥苷-5’-單磷酸二鈉鹽(dGMP，98mg，0.28mmol)制備ddC-TP-dG，得到的ddC-TP-dG鈉鹽為黃色粉末(20mg，0.04mmol，收率＝28％)。
1H-NMR(D2O，pH 7.5，200MHz)δ(ppm)1.74-2.11(m，2H)，2.35-2.75(m，4H)，3.70-3.85(m，2H)，3.92-4.02(m，1H)，4.11-4.21(m，2H)，4.52-4.63(m，1H)，5.50(s，2H)，6.06-6.27(m，2H)，7.83-785(d，J＝7.30，1H)，7.95(s，1H)。
31P-NMR(D2O，pH 7.5，80MHz)δ(ppm)-11.13-11.36(d，J＝18.31，2P)，-22.52-22.99 (t，J＝18.31)。
權(quán)利要求
1.藥物前體化合物，所述的藥物前體化合物包含能被RNA依賴性DNA聚合酶水解的部分，所述部分共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞毒性化合物或細(xì)胞毒性化合物前體的殘基上，其中所述藥物前體化合物的水解產(chǎn)物是具有細(xì)胞毒性的，以及其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的能被RNA依賴性DNA聚合酶水解的部分包含能被RNA依賴性DNA聚合酶的催化位點(diǎn)識(shí)別的部分，所述部分共價(jià)結(jié)合于包含至少三個(gè)基團(tuán)的鏈上，所述的基團(tuán)彼此相同或不同并選自包括磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯和硫代膦酸酯和它們可能被取代基團(tuán)的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，具有通式(I)TS-Om-(PXX’)-(OPYY’)n-O-(PZZ’)-Op-CT(I)其中TS是能被RNA依賴性DNA聚合酶的催化位點(diǎn)識(shí)別的部分，CT是細(xì)胞毒性化合物或細(xì)胞毒性化合物前體的殘基，X、Y和Z從O和S中選擇，X’、Y’和Z’從O、CT’、O-CT’、R和OR中選擇，其中CT’是與CT相同或不同的細(xì)胞毒性化合物或細(xì)胞毒性化合物前體的殘基，并且R選自包括烷基、芳基和芳基烷基的組，優(yōu)選低級(jí)烷基，m＝0，1n＝1，2p＝0，1
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中X＝X’＝Z＝Z’＝O和m＝1.
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述化合物是二核苷多磷酸類似物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述RNA依賴性DNA聚合酶從端粒酶和逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶中選擇。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中所述TS部分是選自包括脫氧鳥苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、7-脫氮-2’-脫氧鳥苷、7-脫氮-2’腺苷、6-硫-2’-脫氧鳥苷、2’，3’-雙脫氧鳥苷、2’，3’-雙脫氧肌苷、D-碳環(huán)-2’脫氧鳥苷、疊氮胸苷、卡波佛、阿德福韋和替諾福韋的組的核苷或其類似物的殘基。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中所述CT殘基是選自包括阿昔洛韋、噴昔洛韋、更昔洛韋、7-甲基-鳥苷、吉西他濱、氟脫氧尿苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、2-氯脫氧腺苷、碘苷、阿糖胞苷、曲西立濱、5-氮雜-2’-脫氧胞苷、2’3’-雙脫氫尿苷-2’3’-脫氧尿苷、5-羥基-2’-脫氧胞苷、3-脫氮尿苷、依諾他濱、2’，3’-雙脫氧胞苷、拉米夫定、恩曲他濱、(S)-1-(3-羥基-1-甲氧基丙基)胞嘧啶、(-)-2’-脫氧-3’-氧雜-4’-硫胞苷、萊西佛、瑞沃賽特、1-(1，3-二羥基-2-丙氧基-甲基)胞嘧啶、(2’S)-2’-脫氧-2’-C-甲基胞苷、1-(2-脫氧-2-亞甲基-β-D-赤型-呋喃糖基)胞嘧啶、1-(2-C-氰基-2-脫氧-1-β-D-阿拉伯糖-呋喃糖基)胞嘧啶、1-(3-C-乙炔基-β-D-核-呋喃糖基)胞嘧啶、β-L-二氧戊環(huán)-胞苷和(E)-2’-脫氧-2’-(氟亞甲基)胞苷的組的細(xì)胞毒性化合物或細(xì)胞毒性化合物前體的殘基。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中R選自甲基和苯基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的化合物，其中R是苯基。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，選自包括無環(huán)鳥苷基3’-脫氧-5’-鳥苷三磷酸酯(ACVTPdG)、無環(huán)鳥苷基2’-脫氧-5’-腺苷三磷酸酯(ACVTPdA)、無環(huán)鳥苷基-5’-胸苷三磷酸酯(ACVTPT)、無環(huán)鳥苷基-3’-疊氮胸苷-5’-三磷酸酯(ACVTPAZT)，和2’，3’-雙脫氧胞苷-2’-脫氧-5’鳥苷三磷酸酯(ddCTPdG)的組。
12.制備如權(quán)利要求1-11定義的化合物的方法，其中細(xì)胞毒性化合物是在適合的條件下和用已知方法共價(jià)結(jié)合于一個(gè)包括至少三個(gè)基團(tuán)的合適的的鏈上，所述的基團(tuán)選自包括磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯或硫代膦酸酯的組，并且通過此鏈與能被端粒酶或逆轉(zhuǎn)錄酶識(shí)別為底物的部分結(jié)合，反之亦然。
13.藥學(xué)組合物，所述藥學(xué)組合物包含至少一個(gè)如權(quán)利要求1-11定義的化合物，所述的化合物任選與一種或多種佐劑和/或其它活性成分聯(lián)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥學(xué)組合物，還包含藥學(xué)可接受的輔料和/或稀釋劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥學(xué)組合物，其中所述其它活性成分是抗代謝物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥學(xué)組合物，其中所述抗代謝物選自包括甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、西他拉濱、5-氮雜胞苷、吉他西濱、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、磷酸氟達(dá)拉濱、噴司他丁和克拉屈濱的組。
17.如權(quán)利要求1-11定義的化合物在制備對(duì)實(shí)體腫瘤、癌前狀態(tài)和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染引起的疾病的治療有效的藥學(xué)組合物中的用途。
18.用于體外或體內(nèi)治療血液學(xué)腫瘤和治療來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的患者的血液和血液衍生物的藥物，包含至少一個(gè)如權(quán)利要求1-11定義的化合物。
19.如權(quán)利要求1-11定義的化合物在體外治療血液學(xué)腫瘤和治療來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的患者的血液和血液衍生物中的用途。
20.體外或體內(nèi)治療血液學(xué)腫瘤和治療來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的患者的血液和血液衍生物的方法，包含用至少一個(gè)如權(quán)利要求1定義的化合物接觸待治療的血液或血液衍生物的步驟。
21.增強(qiáng)細(xì)胞毒性化合物的效力和耐受性的方法，包含形成藥物前體，其中所述細(xì)胞毒性化合物結(jié)合于能被RNA依賴性DNA聚合酶水解的部分。
22.治療實(shí)體腫瘤、癌前狀態(tài)和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染引起的疾病的治療方法，包含給需要此治療的患者施用藥學(xué)有效量的至少一個(gè)如權(quán)利要求1-11定義的化合物，所述化合物任選與一種或多種佐劑和/或其它活性成分聯(lián)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述其它活性成分是抗代謝物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述抗代謝物選自包括甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、西他拉濱、5-氮雜胞苷、吉他西濱、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、磷酸氟達(dá)拉濱、噴司他丁和克拉屈濱的組。
全文摘要
本文公開的是能被RNA依賴性DNA聚合酶例如端粒酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活化的藥物前體，用于治療血液學(xué)腫瘤和來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的患者的血液和血液衍生物的用途，和其用于制備藥學(xué)組合物的用途以治療實(shí)體腫瘤、癌前狀態(tài)和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染引起的疾病。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101031308SQ200580026059
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2005年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月3日
發(fā)明者伊邁諾·貝爾蒂尼, 克勞迪奧·魯奇耐特, 阿爾桑德羅·夸沖, 馬西默·克來門特, 阿爾桑德羅·莫迪尼 申請(qǐng)人:意大利普羅泰拉有限公司