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      循環(huán)癌細胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的檢測以及治療的制作方法

      文檔序號:1110395閱讀:279來源:國知局
      專利名稱:循環(huán)癌細胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的檢測以及治療的制作方法
      背景技術(shù)
      目前只有25%-30%的乳癌患者基于在其原發(fā)性腫瘤的活組織檢查中發(fā)現(xiàn)Her-2/neu(也叫做Her2/neu;HER2;c-erbB-2和erbB2)蛋白或基因的增加水平而接受赫賽汀(HERCEPTIN)治療。文獻數(shù)據(jù)指出,在原發(fā)性腫瘤活組織檢查中為Her2/neu陰性結(jié)果的相當多數(shù)量的婦女(測試的26個中的11個)繼續(xù)發(fā)展為其循環(huán)癌細胞上的Her2/neu陽性(Hayes DF等,Int J Oncol 211111-7;Meng S等,2004 Proc Natl Acad Sci USA1019393-98)。而且,相當多的患有乳癌的婦女不具有容易獲得的活組織檢查材料以用于測試Her-2-neu的狀況。在Hayes等和Meng等的論文中使用的方法繁瑣且耗時,需要一種快速的更加方便的檢驗,特別是可在醫(yī)生診所中實施的檢驗。Hayes等的方法需要流式細胞計數(shù)分析,Meng等的方法需要熒光原位雜交(FISH),其比本發(fā)明所提到的Her-2/neu蛋白的直接檢測(例如通過ECL)更加復雜和耗時。
      Her2/neu和赫賽汀治療在來自患乳癌婦女的大約25%的活組織檢查樣品中觀察到了Her2/neu癌基因的過量表達并且Her2/neu癌基因的過量表達與不良預后有關(guān)。群司珠單抗(Trastuzumab)(赫賽汀)是人源化的單克隆抗體,其抗Her2/neu受體的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)和抑制過量表達該受體的人乳癌細胞的增殖(見Esteve FJ 2004,The Oncologist 9(附刊3)第4-9頁,最近綜述)。乳癌細胞上Her-2/neu的蛋白質(zhì)表達可容易地達到每個細胞500,000個分子或更多的水平,如Her-2/neu過量表達的稱為SK-BR-3的人乳癌細胞系的情況。目前Her2/neu的檢驗依靠檢驗患者活組織檢查的組織切片的蛋白質(zhì)過量表達或基因擴增。在那些具有基因擴增或蛋白質(zhì)的至少2+免疫染色的婦女中,用單個試劑群司珠單抗或用與諸如紫杉醇等化學治療劑組合的群司珠單抗已經(jīng)證明有顯著應答。能靶向Her-2/neu的其它試劑正在開發(fā)中且具有與本發(fā)明的赫賽汀相似的適用性。這些試劑包括但不限于正由Genentech開發(fā)的OMNITARG(pertuzumab);正由GlaxoSmithKline開發(fā)的GW-572016(Xia等,2004,Oncogene 23646-653);正由Pfizer開發(fā)的CP-654577(Barbacci等,2003,Cancer Res 634450-4459);正由Wyeth開發(fā)的HKI-272(Rabindran等,2004,Cancer Res 2004,643958-65)。在其特異性中包括Her-2/neu的其它抗癌劑描述在Janmaat和Giaccone,2003(The Oncologist 8576-86)中。除了乳癌之外,Her-2/neu在包括卵巢癌等其它癌細胞中也是過量表達的。
      ECL電化學發(fā)光是一種使用設計成電化學刺激時發(fā)光的標記的過程(關(guān)于ECL的綜述見Yang等,1994,Biotechnology 12193-194;也可見Blackburn等,1991,Clin Chem 371534-1539)。這些標記與合適的裝置(如由BioVeris開發(fā)的)一起供檢測諸如蛋白質(zhì)、mRNA和DNA等各種生物分子的具有高度靈敏度的方法之用。Martin等(2003,美國專利號6,524,865)描述了基于ECL的酶免疫測定;然而沒有描述檢測血液中循環(huán)癌細胞上的蛋白質(zhì)如Her-2/neu的應用。
      ECL和整個真核細胞使用整個真核細胞的ECL方法已由Chinn等公開(美國專利6,300,143 B1)。然而Chinn等的方法是用于測量細胞表面抗體的結(jié)合親和力而不是測定細胞表面上受體分子的相對數(shù)量。且Chinn的方法起始于大量細胞(167,000細胞每ml)的純化細胞群,與首先從全血中發(fā)現(xiàn)的不純混合物中分離數(shù)量可以是很少(典型地為1至200細胞每ml;Hayes等,2002)的所選細胞群相反。
      Her-2/neu或相關(guān)分子的測定目前美國食品和藥品管理局(FDA)批準的篩選用赫賽汀(群司珠單抗)治療的患者的測定是(1)Her-2/neu蛋白過量表達的免疫組織化學法(DAKO的HERCEPTEST)和(2)用于Her-2/neu基因擴增的FISH(熒光原位雜交)測定(VYSIS的PATHVISION試劑盒)。這些檢驗已顯示了患者對于赫賽汀的應答和受益的預見性(Fornier M等,2002.HER2testing and correlation with efficacy of trastuzumab therapy.Oncology161340-58)。然而,這兩種測定都具有以下四個限制
      1)這些測定需要活組織檢查樣品組織。不是所有的患者都有這樣存檔的容易獲得的用于檢測的材料。在這種情況下,唯一的選擇是獲得腫瘤活組織檢查樣品。血液樣品的測定會更加方便、容易實施,且具有更快提供答案的潛力。
      2)非常普遍的是,首次診斷乳癌時采集的活組織檢查樣品在數(shù)年后當患者疾病復發(fā)時才使用。因此,使用測試舊組織材料的測定,能在作出關(guān)于是否用赫賽汀治療患者的臨床決定之前在可能為許多年的時間點上確定患者關(guān)于Her-2/neu的腫瘤狀況。文獻數(shù)據(jù)提出在原發(fā)性腫瘤活組織檢查中具有Her2/neu陰性結(jié)果的相當多數(shù)量的婦女(26個測試中的11個)繼續(xù)發(fā)展為其循環(huán)癌細胞上的Her2/neu陽性(Hayes DF等,Int JOncol 211111-7;Meng S等,2004 Proc Natl Acad Sci USA 1019393-98),因此是用赫賽汀治療的候選者。關(guān)于來自血液樣品的循環(huán)乳癌細胞的Her-2/neu狀況的測定,會提供其目前Her-2/neu狀況的更加實用且快速的測定。
      3)由于這些測定中評分的主觀性,地方實驗室與中央實驗室對于兩種類型的測定最近已顯示出顯著量的相異,在一些地方實驗室發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生高達25%的假陽性率(Fornier等,2002)。使用更加常見的免疫組織化學測定,相對于FISH估計有14%~17%的假陰性率(Seidman等,2001,J Clin Oncol 192587-95;Fornier等,2002)。使用免疫組織化學產(chǎn)生的14%~17%的假陰性率顯示了在美國每年有數(shù)千名這樣的婦女將補充為赫賽汀治療的候選者。
      4)最后,這些方法是緩慢的,需要(a)待從采集位置的存儲處重新獲得的組織塊,(b)待切割的切片,(c)大量的處理和其次很經(jīng)常性的,(d)耗時和受訓人員的主觀性評分。這些手工分析是不方便的,其一般用于通過免疫組織化學法顯示細胞染色的程度或用于顯示對樣品進行評分所需的陽性FISH位置的數(shù)量。對于治療醫(yī)生來說,希望提供更迅速反饋的更快測定。此外,F(xiàn)ISH是很昂貴的且不能普遍地獲得(Fornier等,2002)。
      Koski,1998(美國專利5,783,404)描述了乳癌細胞和乳癌組織中Her-2/neu蛋白的免疫組織化學測定,其使用能識別Her-2/neu蛋白特定部分的變性表位的單克隆抗體。然而這些測定是在純的乳癌細胞群或如在乳癌組織中很高百分比的乳癌細胞的環(huán)境中進行的。Koski沒有解決在復雜基質(zhì)中如血液中檢測少量的表達Her-2/neu的乳癌細胞的問題。
      Slamon等,1990(美國專利4,968,603)描述了擴增Her-2/neu基因的測定和在篩選患者中的用途。沒有提供檢測Her-2/neu蛋白的測定的實施例。而且,該專利沒有解決在復雜基質(zhì)中如血液中檢測少量的表達Her-2/neu的乳癌細胞的問題。用針對Her-2/neu蛋白的單克隆抗體如赫賽汀治療乳癌患者的鑒定患者的應用沒有指示。
      Carney等,1995(美國專利5,401,638)描述了人血清或血漿的免疫測定,以檢測由人neu基因產(chǎn)物胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)組成的全長Her-2/neu蛋白的截短形式構(gòu)成的neu相關(guān)蛋白p100。Carney的該項專利沒有解決特別是在復雜混合物如全血中的細胞相關(guān)的或全長的Her-2/neu蛋白的檢測。基于Carney的商業(yè)上的測定(來自ONCOGENE)具有的靈敏度(1.5ng截短的Her-2/neu每ml血清)太低,以至于不能用于檢測潛在少量的Her-2/neu蛋白(pg含量),該潛在少量的Her-2/neu蛋白能根據(jù)本發(fā)明得以檢測且是檢測所要求的。正如本發(fā)明中的測定對于細胞相關(guān)Her-2/neu是非常有利的,因為患者活組織檢查組織的免疫組織化學已經(jīng)證明了細胞相關(guān)表達對響應赫賽汀治療的預見力。Burstein等(2003,J ClinOncol 212889-2895)的最近報告顯示了針對截短的p100蛋白(HER2ECD)的血清測定的有限有效性。Burstein等報道“HER2 ECD的基線水平或治療引起的HER2 ECD減少均未預測出一個周期后針對群司珠單抗的臨床應答”。在用赫賽汀治療的乳癌患者的研究中,Cobleigh等(1999,J Clin Oncol 92639)達成了一個相似的結(jié)論,即在血清ECD水平和赫賽汀應答狀況之間沒有可證明的顯著關(guān)聯(lián)。
      Carney等,1997(美國專利5,604,107)描述了在細胞溶解物中檢測全長p185 Her-2/neu蛋白的免疫測定;然而基于Carney的商業(yè)上的ELISA測定具有的靈敏度的數(shù)量級太低,以至于不能用于檢測此處描述的申請所要求的少量Her-2/neu蛋白(pg含量)。如上所述,用于定量Her-2/neu蛋白的該測定的靈敏度被報道為每ml血清為1.5ng截短的Her-2/neu;推測在更加復雜的混合物如全血中將更差。而且,Carney等沒有解決使用全血的Her-2/neu測定。代替的是在血液的血漿成分而不是細胞相關(guān)成分中檢測稱為p100的截短的Her-2/neu的水平。上面討論了優(yōu)選如該發(fā)明中測量細胞相關(guān)全長蛋白質(zhì)的測定而不是測量截短的蛋白質(zhì)的血漿水平的測定的基本原理。Carney等也沒有指出使用整個細胞而是使用細胞溶解物。
      Hudziak等,1998(美國專利5,720,937)要求保護通過將哺乳動物體內(nèi)的細胞暴露于單克隆抗體以確定Her-2/neu蛋白的過量表達的體內(nèi)測定。然而,沒有描述體外測定腫瘤細胞的方法。
      血液中循環(huán)癌細胞的分離Terstappen等,2002(美國專利6,365,362)描述了使用具有針對上皮細胞粘附分子(EpCAM)的抗體的免疫磁珠從患者血液樣品中分離乳癌細胞。Terstappen的測定結(jié)合了免疫磁性富集與流式細胞計數(shù)分析和免疫細胞計數(shù)分析。然而,流式細胞計數(shù)和免疫細胞計數(shù)是不方便且耗時的技術(shù)。
      因此,在醫(yī)學實踐中需要一種快速且方便的測定,其靈敏度足以使用全血樣品來鑒定以下患有乳癌的婦女,她們具有在循環(huán)乳癌細胞上的Her-2/neu蛋白的過量表達,且因此有望受益于諸如群司珠單抗等Her-2/neu靶向治療。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明提供一種檢測血液樣品中循環(huán)癌細胞上的Her-2/neu蛋白的表達的方法,該方法包括從所述血液樣品中分離所述癌細胞,然后對分離的所述癌細胞實施能檢測癌細胞相關(guān)Her-2/neu的免疫測定,其中陽性免疫測定結(jié)果表明所述癌細胞上Her-2/neu的存在。本發(fā)明的測定具有以下限定的靈敏度a)每毫升血液樣品中能以0.1皮克~20皮克的Her-2/neu水平檢測癌細胞相關(guān)Her-2/neu;或b)能從以每毫升血液少于或等于100個SK-BR-3細胞的濃度摻入血液中時的SK-BR-3乳癌細胞檢測Her-2/neu。
      本發(fā)明提供一種鑒定有望受益于用靶向Her-2/neu的抗癌劑所進行的治療的癌癥患者的方法,該方法包括上述的檢測方法。當用于鑒定這樣的患者時,從患者中抽取含有癌細胞的血液樣品。本發(fā)明提供一種治療如此鑒定的癌癥患者的方法,該方法包括給患者施用Her-2/neu靶向抗癌劑。


      圖1通過ECL免疫測定檢測重組Her-2/neu(4pg/孔、16pg/孔和64pg/孔)。
      圖2從SK-BR-3人乳癌細胞提取物(每孔10、30和100個細胞溶解物材料)中檢測Her-2/neu。所用的細胞溶解試劑是Sigma Lysis Buffer。
      圖3從SK-BR-3人乳癌細胞提取物(每孔10、30和100個細胞溶解物材料)中檢測Her-2/neu。所用的細胞溶解試劑是Pierce Lysis Buffer。
      圖4比較SK-BR-3乳癌細胞(Her-2/neu過量表達的陽性對照)中與MDA-MB-468乳癌細胞(Her-2/neu過量表達呈陰性)的溶解物中Her-2/neu免疫測定檢測的ECL信號。對于每一個細胞系,使用來自10、30和100個細胞/孔的溶解物材料。
      圖5比較以0.9、3和10個細胞/孔的溶解物材料使用的來自SK-BR-3乳癌細胞(Her-2/neu過量表達的陽性對照)與以0.9、3、10和100個細胞/孔的溶解物材料使用的來自MDA-MB-468乳癌細胞(Her-2/neu過量表達呈陰性)的溶解物中Her-2/neu免疫測定檢測的ECL信號。
      圖6對于以1、3和10個SK-BR-3細胞/孔的溶解物材料使用的來自SK-BR-3乳癌細胞(Her-2/neu過量表達的陽性對照)的溶解物中Her-2/neu免疫測定檢測,未受到PBMC溶解物(100至10,000個細胞/孔)的干擾。
      具體實施例方式
      如這里使用的過渡性術(shù)語“包括”是開放式的。使用該術(shù)語的權(quán)利要求可以含有該權(quán)利要求中那些列舉要素之外的額外要素。因此,例如,該權(quán)利要求可理解為也包括沒有在此明確列舉的其它步驟的方法,只要列舉的要素或其等價要素是存在的。
      本發(fā)明提供靈敏的足以定量血液樣品中循環(huán)乳癌細胞上的Her-2/neu蛋白的水平的方法,并提供鑒定那些有望受益于使用赫賽汀或別的靶向Her-2/neu的試劑進行的治療的患乳癌婦女的方法。一種方便、高靈敏性且快速的通過檢驗血液樣品來鑒定將受益于赫賽汀治療的額外患者的方法,在乳癌治療領域中是一個重要的進步。如下所述,一種用于檢測循環(huán)乳癌細胞表面上Her-2/neu蛋白的快速且高度靈敏的免疫學測定如使用電化學發(fā)光(ECL)檢測是實施上述方法的優(yōu)選方法。
      本發(fā)明是基于用于從血液中分離循環(huán)癌細胞過程的高度特異性和某些基于免疫學的測定如ECL的高度靈敏性的組合。優(yōu)選的且有利的是,將免疫磁珠用于本發(fā)明的兩個方面,因而起到新的雙重功能的作用將免疫磁珠用于從血液中分離和純化循環(huán)癌細胞,然后將不同的珠或這些相同的珠用作實施ECL的支持相,從而允許磁體捕獲它們且將目標抗原與標記的抗體(例如釕標簽標記的抗體)集中在一起。
      在本發(fā)明的檢測方法的實施方案中,上述a)中的靈敏度水平為1皮克~20皮克、1皮克~10皮克或者1皮克~5皮克的Her-2/neu每毫升血液樣品。在本發(fā)明的檢測方法的另一個實施方案中,上述b)中的靈敏度水平為能從以每毫升血液少于或等于10個SK-BR-3細胞的濃度摻入血液中時的SK-BR-3乳癌細胞檢測Her-2/neu。在更進一步的實施方案中,上述b)中的靈敏度水平為能從以每毫升血液少于或等于3個SK-BR-3細胞,甚至每毫升血液少于或等于1個SK-BR-3細胞的濃度摻入血液中時的SK-BR-3乳癌細胞檢測Her-2/neu。
      從患有癌癥特別是乳癌的患者中獲取血液樣品(通常為約8ml~20ml)。詳細步驟包括以下1.除去紅細胞2.可選的陰性選擇以進一步去除正常白細胞。優(yōu)選的實施方案包括該步驟。
      3.陽性選擇循環(huán)癌細胞4.由循環(huán)癌細胞檢測和定量Her-2/neu蛋白1.除去紅細胞。
      可獲得多種除去紅細胞的方法,包括但不限于基于密度的分離(如將血液直接收集到BECTON DICKINSON BD Vacutainer CPT管中,隨后離心)和商業(yè)上的溶解緩沖液如PURESCRIPT RBC溶解緩沖液(GENTRA,Minneapolis)、FACS溶解溶液(BDIS)、IMMUNOLYSE(COULTER)、OPTILYSE B(IMMUNOTECH)和ACK溶解緩沖液(BIOSOURCE,Rockville,MD)。
      一個優(yōu)選的方法使用具有抗凝劑(EDTA或檸檬酸鹽)的BDVacutainer CPT管。這些管含有恰當離心(1,100×g 10分鐘,甩平桶型轉(zhuǎn)子(swing-out bucket rotor))后使得可除去紅細胞和嗜中性粒細胞的物質(zhì)。離心后,管底含有紅細胞(紅血球)和嗜中性粒細胞的細胞沉淀。在該細胞沉淀上面是凝膠層,在該凝膠層上面是腫瘤細胞、淋巴細胞和單核細胞(作為血漿底部的一個條帶)。然后可將腫瘤細胞、淋巴細胞和單核細胞容易地從凝膠層上面的頂部收集。該方法是優(yōu)選的,因為其不僅可以除去紅細胞而且還可以除去嗜中性粒細胞。
      2.陰性選擇以進一步去除正常白細胞。
      本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案使用陰性選擇步驟以分離腫瘤細胞。陰性選擇使得可進一步去除白細胞特別是淋巴細胞和單核細胞。該步驟包括使用對兩種白細胞抗原特別是共同的白細胞抗原CD45和對紅細胞抗原如血型糖蛋白A具有雙特異性的抗體。一種商業(yè)上可獲得的具有這樣雙特異性抗體的混合物可獲自STEMCELL TECHNOLOGIES(Rosettesep目錄第15127號和第15167號)。該混合物包括針對血型糖蛋白A和人的造血細胞上多種細胞表面抗原(CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b)的雙重特異性抗體。在血液采集之前,將一種或多種這些雙特異性抗體加入到BD Vacutainer CPT管中。在優(yōu)選的實施方案中,使用針對多于一個的白細胞相關(guān)CD分子的雙特異性抗體的混合物。當將血液導入CPT vacutainer管時,雙特異性抗體則形成免疫玫瑰花結(jié),每一個免疫玫瑰花結(jié)由白細胞加許多紅細胞組成。這些免疫玫瑰花結(jié)具有近似紅細胞的密度,且當離心后,發(fā)現(xiàn)在紅細胞沉淀中,因此進而從細胞沉淀和凝膠層上面發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞級分中除去白細胞。收集血漿中具有腫瘤細胞的級分以進一步處理。
      3.陽性選擇循環(huán)癌細胞。
      分離循環(huán)癌細胞的優(yōu)選方法使用免疫磁珠。分離循環(huán)癌細胞的其它方法包括過濾(Vona G等,2000,Am J Pathol.2000 15657-63)。在一個優(yōu)選的實施方案中,免疫磁珠具有針對癌細胞表面上選擇性發(fā)現(xiàn)的抗原(如上皮細胞粘附分子(EpCAM)、細胞角蛋白如細胞角蛋白-19)的抗體,特別是針對細胞角蛋白和其它表面標記的抗體混合物。也可使用具有針對Her2/neu的抗體的免疫磁珠。免疫磁珠可以具有各種大小(50微米~小于200nm),包括具有針對EpCAM(其為商業(yè)上可獲得的)或針對Her2/neu的抗體的DYNAL珠(>1.5微米~約50微米)。在一個優(yōu)選的實施方案中,使用納米顆粒珠,因為其使得可更快且更有效地將腫瘤細胞和珠結(jié)合。在本發(fā)明的一個實施方案中,將EasySepTM人EpCAM陽性選擇混合物和EasySepTM磁性納米顆粒(STEMCELL TECHNOLOGIES)加入到來自先前步驟的血漿中具有腫瘤細胞的級分中。然后用磁體從剩余物質(zhì)中分離腫瘤細胞,并用水溶液清洗腫瘤細胞。然后純化的腫瘤細胞可備下個步驟中檢測抗原之用。
      4.由循環(huán)癌細胞檢測和定量Her-2/neu蛋白。
      然后可以通過使用與檢測分子連接的針對Her-2/neu的單克隆抗體(mAb)如赫賽汀或mAb 191924(R&amp;D systems目錄號為MAB 1129)或多克隆抗體(例如山羊多克隆抗體R&amp;D systems目錄號為AF1129)來完成Her-2/neu的檢測。在電化學發(fā)光(ECL)的情況下,檢測分子是釕。在公共領域中有豐富的文獻提供了用于將釕連接于抗體(例如Lee等,AmJ Trop Med Hyg 2001,651-9),隨后在含有三丙胺的溶液中進行磁珠上抗原的ECL檢測的非常有用的方法。通過電勢的應用,激發(fā)釕標記而發(fā)光,使用ECL檢測儀器(如ORIGEN分析儀或可商購的儀器像來自BIOVERIS公司(Gaithersburg,MD)的M-Series384)檢測所述光。
      根據(jù)本發(fā)明使用的免疫測定可以是針對Her-2/neu的多克隆或單克隆抗體。優(yōu)選單克隆抗體是人源化的小鼠單克隆抗體,例如群司珠單抗。群司珠單抗對于本發(fā)明的免疫測定和治療方法是優(yōu)選的。
      為了檢測Her-2/neu,各種針對Her-2/neu的單克隆和多克隆抗體和包括針對胞外結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體可商購自如R&amp;D Systems(Minneapolis,MN Biosource(Camarillo,CA)和BD Biosciences,SanDiego,CA)等來源。兔多克隆抗體也可獲自LABVISION公司(Fremont.CA;如neu Ab-21)和獲自UPSTATE CELL SIGNALING SOLUTIONS(Lake Placid,NY;如目錄號06-562)。針對Her-2/neu胞外結(jié)構(gòu)域的山羊多克隆抗體可獲自R&amp;D systems(目錄號AF1129)。針對全長重組Her-2/neu的山羊多克隆抗體可獲自EXALPHA BIOLOGICS(Rosedale,MA;目錄號M100P)。預計這些針對全長Her-2/neu的多克隆抗體將能與Her-2/neu的胞外和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合而不是胞外結(jié)構(gòu)域特異性的??色@得的單克隆抗體針對胞外結(jié)構(gòu)域(例如R&amp;D Systems目錄號MAB1129)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(例如LABVISION neuAB-8),包括針對C-末端肽(例如LABVISION neuAB-15)。在Hudziak等(1997,美國專利5,677,171)中也公開了針對Her-2/neu的單克隆抗體。一個改進的實施方案使用赫賽汀,因與該抗體結(jié)合是最能夠預測作為患者的治療手段的赫賽汀的結(jié)合。另一個有利的實施方案使用兔多克隆抗體或結(jié)合于Her-2/neu蛋白上的許多表位的抗體混合物而使得具有更高的靈敏度。
      在本發(fā)明的一個實施方案中,免疫測定在完整的癌細胞上進行,并使用選擇性結(jié)合于Her-2/neu胞外結(jié)構(gòu)域的抗體。作為一種選擇,在免疫測定前可將分離的癌細胞溶解,并在細胞溶解物上進行免疫測定。在這種情況下,免疫測定可使用選擇性結(jié)合于Her-2/neu的胞外結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體。在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中,免疫測定使用一種或兩種選擇性結(jié)合于Her-2/neu胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體。
      本發(fā)明的免疫測定比任何先前開發(fā)的針對Her-2/neu的免疫測定更為迅速且具有明顯更高的靈敏度。本發(fā)明的免疫測定能檢測非癌癥人類志愿者中每ml血液加入的100個或更少SK-BR-3乳癌細胞的Her-2/neu表達。本發(fā)明的免疫測定能以每毫升血液樣品中20皮克或更少Her-2/neu的水平檢測癌細胞相關(guān)Her-2/neu。
      除了電化學發(fā)光之外,能產(chǎn)生本發(fā)明所需的高靈敏度的其它免疫測定包括,但不限于a)如Liu Y等,2003(J Food Protection 66512-7)描述的化學發(fā)光。
      b)如Yu H等,2000(Biosens Bioelectron 14829-40)描述的熒光發(fā)生化學發(fā)光(FCL)。
      c)熒光偏振免疫測定(見Howanitz JH,1988 Arch Pathol Lab Med112775-9)。
      d)時間分辨熒光免疫測定(Butcher H等,2003,J Immunol Methods272247-56;Soukka等,2001,Clin Chem 471269-78;Howanitz JH,1988Arch Pathol Lab Med 112775-9)。
      在一個優(yōu)選的實施方案中,估計了測定中使用的乳癌細胞的相對量。這使得可獲得每個細胞的總Her-2/neu蛋白的比率,并能與具有每個細胞高、中和低水平Her-2/neu蛋白的乳癌細胞的對照標準進行比較。這是優(yōu)選的實施方案,因其排除了其中有許多具有低水平Her-2/neu蛋白表達的循環(huán)乳癌細胞的假陽性情況,其可能給出模擬從少量具有高水平表達的乳癌細胞獲得的信號。在該實施方案中,可使用各種方法來估計相對細胞數(shù)量,所述方法包括流式細胞計數(shù)分析、總DNA或DNA相關(guān)抗原如溶解細胞的組蛋白(每個二倍體細胞有6pg DNA)的定量和濁度或吸光度測定。
      由于其靈敏度,用于鑒定有望受益于用靶向Her-2/neu的抗癌劑所進行的治療的患者的本發(fā)明方法,可有效地應用于先前通過Her-2/neu組織測試已測定(例如通過免疫組織化學或FISH分析)腫瘤活組織檢查組織為Her-2/neu表達陰性的患者。
      通過參考以下實施例將更好地理解本發(fā)明,該實施例舉例說明但不限制這里描述的本發(fā)明。
      實施例實施例1
      患有轉(zhuǎn)移性乳癌的患者來到診所,將血液樣品(8mL至40mL)直接抽取到BD Vacutainer CPT管中,所述BD Vacutainer CPT管含有諸如檸檬酸鹽等抗凝劑以及所加入的陰性選擇產(chǎn)物含有針對紅細胞抗原及針對白細胞表面抗原的雙特異性抗體的ROSETTESEP(來自STEMCELLTECHNOLOGIES)。將所述物質(zhì)在1500RCF(相對離心力)至1800RCF離心20分鐘。除去凝膠層上面的細胞層。加入EasySepTM人EpCAM陽性選擇混合物和EasySepTM磁性納米顆粒(StemCell Technologies),用磁場分離和清洗腫瘤細胞。將針對Her-2/neu的釕標記的多克隆抗體隨同三丙胺溶液一起加入到粘附于已結(jié)合到電極的磁珠的腫瘤細胞中。在本領域中描述了釕標記抗體的常規(guī)方法,如在Lee等,Am J Trop Med Hyg 2001,651-9中。施加電流并使用如商購的(BIOVERIS Corporation)ECL檢測裝置來檢測電化學發(fā)光(ECL)。在這些儀器中將光電倍增管(PMT)恰好置于工作電極之上以有效地捕獲光。在工作電極下面,將磁體放在捕獲用目標抗原包被的珠的適當位置。信號與發(fā)現(xiàn)的結(jié)合在循環(huán)腫瘤細胞表面上的Her-2/neu的量成比例。
      實施例2提供與實施例1中使用的相同的方法,不同之處在于使用針對Her-2/Neu的單克隆抗體而不是多克隆抗體進行檢測。
      實施例3提供與實施例1~2中使用的相同的方法,不同之處在于在加入連接于磁珠的針對Her-2/neu的抗體之前溶解所分離的乳癌細胞。溶解可用本領域中描述的許多細胞溶解試劑實現(xiàn),所述細胞溶解試劑例如但不限于Lysis Buffer A[1%NP-40、20mM Tris(pH 8.0)、137mM NaCl、10%甘油、2mM EDTA、1mM原釩酸鈉、10μg/mL抑肽酶、10Ug/mL亮肽素]和RIPA緩沖液(Papetti和Herman,2001,Am J Pathology 159165-178)。在該夾心式ECL(見Yang等,1994,for an illustration of a‘sandwich’immunoassay using ECL)中,使用兩套針對Her-2/neu的抗體一種抗體是生物素?;那艺掣接阪溈股锼氐鞍装坏拇胖椋诙N抗體是釕標記的。
      實施例4提供與實施例1~3使用的相同的方法,不同之處在于患者具有先前基于原發(fā)性腫瘤分析為Her-2/neu陰性的結(jié)果或者不具有容易獲得用于分析的腫瘤組織。
      實施例5提供實施例1~4中使用的方法,在分析中使用額外的定量乳癌細胞的相對數(shù)量的步驟。根據(jù)DNA含量(每二倍體核有6pg DNA)定量細胞的ELISA(www.gentra.com/calcularing.asp)已由Friis等描述了(2003;APMIS 111658-68),但缺少本發(fā)明所需的靈敏度。使用高度靈敏的免疫測定例如通過使用ECL和用于定量Her-2/neu的類似儀器,實現(xiàn)了檢測本發(fā)明所要求的少量細胞所需的更高靈敏度測定。
      為了通過ECL定量細胞,首先溶解細胞(例如用溶解緩沖液,例如但不限于上面詳述的Lysis Buffer A),然后加入兩種不同的針對雙鏈DNA的抗體(例如可獲自STATENS SERUM INSTITUT(哥本哈根,丹麥)的小鼠單克隆抗體HYB33-01;可獲自CHEMICON(Temecula,CA,USA)的小鼠單克隆抗體MAB3032;來自ALPHA DIAGNOSTICSINTERNATIONAL(San Antonio,TX,USA)的小鼠單克隆抗體(目錄號DNA11-M));一種已用釕進行標記(本領域描述了釕標記抗體的常規(guī)方法,如Lee等,Am J Trop Med Hyg 2001,651-9),另一種用生物素進行標記以粘附于鏈抗生物素蛋白包被的磁珠。用三丙胺溶液和借助使用磁場結(jié)合于電極的磁珠通過ECL實現(xiàn)抗原[該情況下dsDNA(雙鏈DNA)]的定量。施加電流并使用如商購的(BIOVERIS公司)的ECL檢測裝置檢測電化學發(fā)光(ECL)。在這些儀器中將光電倍增管(PMT)恰好置于工作電極之上以有效地捕獲光。信號與dsDNA的量成比例,因此與細胞數(shù)量成比例。然后這使得可獲得每細胞數(shù)量中Her-2/neu的比率。該比率而不是每ml血液中腫瘤細胞相關(guān)Her-2/neu的絕對數(shù)量,在本發(fā)明中對于測定患者針對赫賽汀治療的靈敏度是有利的。
      實施例6實施例1~5中顯示為Her-2/neu水平高于對照樣品的患者,被認為是具有對Her-2/neu呈陽性的腫瘤細胞,然后用包括針對Her2/neu的單克隆抗體如赫賽汀的療法治療。優(yōu)選的治療包括以90分鐘輸注施用4mg/kg的初始負荷劑量,每周以30分鐘輸注2mg/kg的維持劑量。
      實施例7在該實施例中,純化的重組Her-2/neu(胞外結(jié)構(gòu)域)用作一種標準以使用電化學發(fā)光檢測夾心式免疫測定的靈敏度。
      制備四種不同的PBS測定緩沖液·測定緩沖液1PBS(磷酸緩沖鹽水)中含0.5%吐溫-20和0.5%牛血清白蛋白(BSA)·測定緩沖液2PBS中含1.0%吐溫-20和0.5%BSA·測定緩沖液3PBS中含0.5%吐溫-20和1.0%BSA·測定緩沖液4PBS中含1.0%吐溫-20和1.0%BSAHer-2/neu標準(重組Her-2/neu胞外結(jié)構(gòu)域)獲自DakoCytomation(Carpinteria,CA 93013USA;Product EL541)。山羊抗人Her-2/neu多克隆抗體以生物素?;头巧锼仵;瘍煞N形式(目錄號分別為BAF1129和AF1129)獲自R&amp;D Systems,Inc.(Minneapolis,MN 55413USA),單克隆抗體MAB1129(R&amp;D Systems目錄號為191924)也是一樣。多克隆抗體AF1129和單克隆抗體MAB1129按如下進行釕標記(“TAG標記”)·在DMSO中制備1.5μg/μl釕標記(BV-TAG-NHS Ester,目錄號為110034;BioVeris公司,Gaithersburg,MD,USA)。
      ·對于500μl單克隆抗體(蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml),加入18.8μlBV-TAG-NHS,對于200μl多克隆抗體(蛋白質(zhì)濃度為0.5mg/ml),加入3.8μl BV-TAG-NHS。在每一種情況下,將溶液孵育一小時,并通過加入20μl 2M甘氨酸停止反應。
      ·每一反應混合物中未偶聯(lián)的BV-TAG-NHS Ester用PD-10凝膠過濾柱除去,所述凝膠過濾柱用PBS(包含0.08%疊氮化鈉)預先平衡,所述包含0.08%疊氮化鈉的PBS也用于洗脫。對于每一抗體,通過蛋白質(zhì)測定法測定每一級分中的蛋白質(zhì)濃度,具有高蛋白質(zhì)含量的級分用于隨后的實施例中。
      在本實施例和隨后的實施例中,釕標記的多克隆抗體AF1129和生物素酰化的多克隆抗體BAF1129此后稱為“TAG-pAb”和“Biotin-pAb”。本實施例中釕標記的單克隆抗體MAB1129此后稱為“TAG-mAb”。
      電化學發(fā)光測定按如下進行·按順序?qū)?5μl/孔的Her-2/neu標準,然后50μl/孔的TAG-Ab和Biotin-Ab混合物(例如各濃度為1μg/ml;稀釋到4種PBS測定緩沖液中)加入到96孔U型底聚丙烯板的孔中,并在室溫持續(xù)搖動孵育(例如2小時)。
      ·將25μl中的10μg磁性鏈抗生物素蛋白珠(例如Dynabeads M-280Streptavidin,目錄號為110028,BioVeris,Corporation,Gaithersburg,MD)加入到每個孔中,并持續(xù)搖動孵育(例如30分鐘)。
      ·將PBS測定緩沖液加入到每個孔中以使最終體積為每孔250μl。本測定中分析物(重組Her-2/neu胞外結(jié)構(gòu)域)的含量為每孔16pg至1600pg不等。也包括沒有分析物的對照孔。所有條件以至少雙份重復孔進行測試。然后使用M8M-SeriesAnalyzer(目錄號為310800,BioVeris,Corporation,Gaithersburg,MD)分析96孔板的電化學發(fā)光。
      結(jié)果顯示,使用具有TAG-pAb和Biotin-pAb的夾心式免疫測定,使用所有四種不同的測定緩沖液可檢測到所有測試的重組Her-2/neu胞外結(jié)構(gòu)域的水平(16pg/孔、160pg/孔和1600pg/孔),且高于基線(表1)。使用具有TAG-mAb和Biotin-pAb的夾心式免疫測定也可檢測到重組Her-2/neu胞外結(jié)構(gòu)域(表2)。
      表1.通過使用釕標記的多克隆(TAG-pAb)和生物素?;亩嗫寺】贵w(Biotin-pAb)的免疫測定進行重組Her-2/neu的電化學發(fā)光(ECL)檢測。

      *平均ECL信號高于來自沒有抗原的對照孔的平均信號。
      表2.通過使用釕標記的單克隆(TAG-mAb)和生物素酰化的多克隆抗體(Biotin-pAb)的免疫測定進行重組Her-2/neu的電化學發(fā)光(ECL)檢測。

      *平均ECL信號高于來自沒有抗原的對照孔的平均信號。
      **信號不高于來自沒有抗原的對照孔的平均信號。
      實施例8使用如實施例7中所使用的方法,不同之處在于·在本實施例整個過程中使用的PBS測定緩沖液是PBS測定緩沖液1。
      ·僅使用的釕標記的抗體是Tag-pAb。加入的Tag-pAb的濃度是在50μl中的2μg/ml而不是1μg/ml。
      ·重組Her-2/neu(胞外結(jié)構(gòu)域)的量為4pg/ml至64pg/ml不等。
      結(jié)果顯示,清楚地檢測到所有測試的重組Her-2/neu胞外結(jié)構(gòu)域的水平(4pg/孔、16pg/孔和64pg/孔)且高于基線(見圖1)。
      實施例9方法為實施例8中使用的方法,不同之處在于·重組Her-2/neu(胞外結(jié)構(gòu)域)的量為16pg/孔至4096pg/孔不等。
      檢測Her-2/neu的能力是在存在或缺少0.02μl/孔的細胞溶解緩沖液中測試的。在分離的孔中測試Pierce Lysis Buffer[M-PERExtractionReagent(產(chǎn)品號為78501,獲自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL)]和Sigma Lysis Buffer[Sigma CelLyticTM-M(Sigma產(chǎn)品號為C 2978,Sigma-Aldrich,Inc.,St.Louis,MO 63103)]。
      結(jié)果提供在表3中??蓹z測到該實驗中所有含量(包括最低含量16pg/孔)的Her-2/neu且高于基線(表3)。該結(jié)果是在存在或缺少各細胞溶解緩沖液(Pierce Lysis Buffer或Sigma Lysis Buffer)中觀察到的。
      表3.ECL免疫測定檢測重組Her-2/neu

      實施例10免疫測定方法如同實施例8使用的免疫測定方法一樣,不同之處在于·分析了來自SK-BR-3乳癌細胞的細胞提取物。
      按照ATCC推薦的條件使SK-BR-3細胞(來自ATCC,Manassas,VA)在6孔組織培養(yǎng)板中生長,用PBS清洗兩次,使用血細胞計數(shù)器對等分試樣進行計數(shù)。使用Pierce Lysis Buffer或Sigma Lysis Buffer進行SK-BR-3細胞的溶解。這兩種溶解緩沖液描述于上面的實施例9中。為了溶解SK-BR-3細胞,每1百萬個細胞加入200μl溶解緩沖液。按照各制造商的推薦進行細胞溶解,在除去細胞碎片之前附加5分鐘的劇烈渦旋。通過在Eppendorf離心機(型號為5415C)中以14,000rpm離心30分鐘從細胞溶解物中除去細胞碎片。每孔溶解物上清液的量因從10至1000個SK-BR-3細胞中提取的量而異,使用實施例7中描述的采用PBS測定緩沖液1的免疫測定分析Her-2/neu。
      該實驗的結(jié)果提供在表4中。從本實驗的SK-BR-3細胞的溶解物中包括使用本實驗中最低量SK-BR-3溶解物的那些孔(每孔加入10個細胞的溶解物;表4)中可檢測到Her-2/neu且高于基線。無論使用何種細胞溶解緩沖液(Pierce Lysis Buffer或Sigma Lysis Buffer),均觀察到該結(jié)果。圖2和3為對于每孔測試的SK-BR-3細胞的三個最低量的溶解物(每孔10、30和100個SK-BR-3細胞),分別使用Sigma Lysis Buffer和PierceLysis Buffer的圖示結(jié)果,表明了使用該免疫測定利用細胞進行的Her-2/neu檢測呈線性。
      表4.在SK-BR-3乳癌細胞溶解物中ECL免疫測定檢測Her-2/neu

      實施例11在本實驗中,免疫測定方法如同實施例10中使用的免疫測定方法一樣,不同之處在于檢測使用Sigma Lysis Buffer從以下細胞獲得的溶解物·SK-BR-3人乳癌細胞(Her-2/neu的高表達;Goebel SU等,2002,Cancer Res 623702-10);制備見實施例10。該SK-BR-3細胞系是對于乳癌表達Her-2/neu蛋白的合適的陽性對照。
      ·MDA-MB-468人乳癌是對于Her-2/neu的過量表達的合適的陰性對照乳癌細胞系(Goebel SU等,2002,Cancer Res 623702-10)。對于MDA-MB-468細胞如同實施例10中對于SK-BR-3細胞一樣進行細胞培養(yǎng)和使用Sigma Cell Lysis Buffer的細胞溶解。
      本實驗的結(jié)果提供在圖4中。來自SK-BR-3細胞的溶解物(Her-2/neu過量表達的陽性對照)在Her-2/neu免疫測定中比來自MDA-MB-468細胞的溶解物(對于Her-2/neu過量表達呈陰性)給出高得多的信號,顯示了Her-2/neu檢測結(jié)果的特異性(圖4)。
      實施例12在該實驗中,免疫測定方法如同實施例11中使用的免疫測定方法一樣,不同之處在于50μl中加入的Tag-pAb和Biotin-pAb的濃度各自都為0.5μg/ml而不是1μg/ml。同樣,就Her-2/neu的表達來說,將來自SK-BR-3細胞的細胞溶解物與來自MDA-MB-468細胞的細胞溶解物進行比較。本實驗的結(jié)果提供在圖5中。來自SK-BR-3細胞的溶解物(Her-2/neu過量表達的陽性對照)在Her-2/neu免疫測定中比來自MDA-MB-468細胞的溶解物(對于Her-2/neu過量表達呈陰性)給出高得多的信號,顯示了Her-2/neu檢測結(jié)果的特異性(圖5)。同樣,從每孔少至0.9個SK-BR-3細胞的溶解物材料中可檢測到Her-2/neu;這給出了高于背景的ECL信號,也高于來自100個MDA-MB-468細胞的溶解物材料的信號(圖5)。
      實施例13在本實驗中,免疫測定方法如同實施例12中使用的免疫測定方法一樣,不同之處在于使用Sigma Lysis Buffer獲得另外的細胞溶解物(小鼠外周血單核細胞,PBMC)。PBMC由淋巴細胞和單核細胞組成,且可以在導致循環(huán)乳癌細胞從血液中分離乳癌的起始步驟中共同純化。
      將4ml小鼠血液采集到4ml的BECTON DICKINSON BD VacutainerCPT管中,在Jouan CR412離心機中以3000rpm離心30分鐘。在凝膠之上的細胞級分中收集PBMC并用PBS清洗4次。從4ml血液中總共收集到1百萬個PBMC。如同對于SK-BR-3細胞一樣進行細胞溶解。通過在Eppendorf離心機(型號為5415C)中以14,000rpm離心30分鐘從細胞溶解物中除去細胞碎片。然后將上清液用于本實驗的分析。
      通過將以下物質(zhì)加入到每個孔中來制備用于測試的樣品·12.5μl中來自1~10個SK-BR-3細胞的細胞溶解物。
      ·同樣,在12.5μl中來自100~10,000個PBMC或?qū)φ誔BS測定緩沖液1的細胞溶解物。
      ·每孔加入含有Tag-pAb和Biotin-pAb(各抗體為50μl中0.5μg/ml)的50μl溶液,并將96孔板在室溫持續(xù)搖動孵育2小時。
      ·將25μl中10μg磁性鏈抗生物素蛋白珠(例如Dynabeads M-280Streptavidin,目錄號為110028,BioVeris,Corporation,Gaithersburg,MD)加入到每個孔中并持續(xù)搖動孵育30分鐘。
      ·將PBS測定緩沖液-1加入到每個孔中使最終體積為250μl每孔。所有條件在至少三個重復孔中測試。然后使用M8M-Series分析儀(目錄號為310800,BioVeris,Corporation,Gaithersburg,MD)分析96孔板的電化學發(fā)光。
      本實驗的結(jié)果提供在表5和表6及圖6中。從100、1000和10,000個PBMC中無法檢測到Her-2/neu(表5)。相反,從使用的甚至最小量的SK-BR-3乳癌細胞溶解物(每孔來自1個SK-BR-3細胞的溶解物;見表6)中可檢測到Her-2/neu。而且,來自100、1000和甚至10,000個PBMC的細胞溶解物的添加不會干擾乳癌細胞中Her-2/neu的檢測(表6和圖6)。在導致循環(huán)乳癌細胞從血液中分離乳癌的起始步驟中可共同純化的PBMC,具有無法檢測到的Her-2/neu表達,而且也不會干擾SK-BR-3細胞上Her-2/neu的檢測。
      表5.在大量(例如10,000)PBMC上用ECL免疫測定進行檢測時未檢測到Her-2/neu。

      *陰性ECL信號略低于背景水平。
      表6.在存在或缺少PBMC溶解物的情況下在SK-BR-3乳癌細胞溶解物中進行Her-2/neu的ECL免疫測定檢測。

      NT未測試。
      權(quán)利要求
      1.一種檢測血液樣品中循環(huán)癌細胞上Her-2/neu蛋白的表達的方法,該方法包括從所述血液樣品中分離所述癌細胞,然后在所分離的癌細胞上進行能檢測癌細胞相關(guān)Her-2/neu的免疫測定,其中陽性免疫測定結(jié)果表明所述癌細胞上存在Her-2/neu;其中所述免疫測定具有下述限定的靈敏度a)能以每毫升所述血液樣品0.1皮克~20皮克的Her-2/neu的水平檢測癌細胞相關(guān)Her-2/neu;或b)能從以每毫升血液少于或等于100個SK-BR-3細胞的濃度摻入血液中時的SK-BR-3乳癌細胞檢測Her-2/neu。
      2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中a)中的所述靈敏度水平是每毫升所述血液樣品1皮克~20皮克的Her-2/neu。
      3.如權(quán)利要求2所述的方法,其中a)中的所述靈敏度水平是每毫升所述血液樣品1皮克~10皮克的Her-2/neu。
      4.如權(quán)利要求3所述的方法,其中a)中的所述靈敏度水平是每毫升所述血液樣品1皮克~5皮克的Her-2/neu。
      5.如權(quán)利要求1所述的方法,其中b)中的所述靈敏度水平是每毫升血液少于或等于10個SK-BR-3細胞。
      6.如權(quán)利要求5所述的方法,其中b)中的所述靈敏度水平是每毫升血液少于或等于3個SK-BR-3細胞。
      7.如權(quán)利要求6所述的方法,其中b)中的所述靈敏度水平是每毫升血液少于或等于1個SK-BR-3細胞。
      8.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述免疫測定使用電化學發(fā)光進行檢測。
      9.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述免疫測定使用選自化學發(fā)光、熒光發(fā)生化學發(fā)光、熒光偏振和時間分辨熒光的技術(shù)進行檢測。
      10.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述免疫測定在完整的癌細胞上進行且利用選擇性結(jié)合于Her-2/neu胞外結(jié)構(gòu)域的抗體。
      11.如權(quán)利要求1所述的方法,該方法進一步包括在免疫測定之前溶解所分離的癌細胞,且其中所述免疫測定在所述細胞溶解物上進行。
      12.如權(quán)利要求11所述的方法,其中所述免疫測定使用一種或兩種選擇性結(jié)合于Her-2/neu胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體。
      13.如權(quán)利要求12所述的方法,其中所述免疫測定使用兩種選擇性結(jié)合于Her-2/neu胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體。
      14.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述免疫測定使用針對Her-2/neu的多克隆抗體。
      15.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述免疫測定使用針對Her-2/neu的單克隆抗體。
      16.權(quán)利要求15所述的方法,其中所述單克隆抗體是人源化的小鼠單克隆抗體。
      17.如權(quán)利要求16所述的方法,其中所述單克隆抗體是群司珠單抗。
      18.如權(quán)利要求1所述的方法,其中通過將所述血液與能選擇性結(jié)合于所述癌細胞的免疫磁珠接觸而分離所述癌細胞。
      19.如權(quán)利要求18所述的方法,其中所述免疫磁珠選擇性結(jié)合于上皮細胞。
      20.一種鑒定有望受益于用靶向Her-2/neu的抗癌劑所進行的治療的癌癥患者的方法,該方法包括權(quán)利要求1至19任一項所述的方法,其中從該患者中抽取含有所述癌細胞的血液樣品。
      21.如權(quán)利要求20所述的方法,其中來自所述患者的腫瘤活組織檢查組織先前已通過Her-2/neu組織測定確定為Her-2/neu表達呈陰性。
      22.如權(quán)利要求21所述的方法,其中所述組織測定選自由免疫組織化學和FISH分析組成的列表。
      23.一種治療有望受益于用靶向Her-2/neu的抗癌劑所進行的治療的癌癥患者的方法,該方法包括給按照權(quán)利要求16所述的方法鑒定的患者施用Her-2/neu靶向抗癌劑。
      24.如權(quán)利要求23所述的方法,其中所述抗癌劑是群司珠單抗。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及循環(huán)癌細胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的檢測以及治療。具體地說,通過從血液樣品中分離癌細胞,然后在所分離的癌細胞上進行靈敏的Her-2/neu免疫測定,來檢測血液樣品中循環(huán)癌細胞上Her-2/neu蛋白的表達。陽性結(jié)果表明Her-2/neu在血液樣品中癌細胞上的表達。該方法可用于鑒定有望受益于用靶向Her-2/neu的抗癌劑如群司珠單抗(赫賽汀)所進行的治療的癌癥患者。
      文檔編號A61K38/00GK101036055SQ200580033986
      公開日2007年9月12日 申請日期2005年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月6日
      發(fā)明者羅伯特·M·洛朗斯, 魯明 申請人:威爾斯達特生物制劑公司
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