專利名稱：哺乳動物細胞系和獲得糖蛋白的方法
Epstein—Barr病毒是引起人類傳染性的單核細胞增多癥的病原體，這種病是年輕人中最常見的傳染病之一。
90％以上的成人已受Epstein—Barr病毒感染。那些EBV陽性的人們以后可能發(fā)病如鼻炎癌、B細胞淋巴瘤，T細胞淋巴瘤，某些何杰金(Hodgkin)淋巴瘤，并且可能發(fā)生其它的惡性疾病。已經(jīng)報道，在原發(fā)感染或后繼階段發(fā)生慢性形式，稀有病例中，發(fā)生急性致死形式。
既然兒童中的Epstein—Barr病毒感染在臨床上是難以察覺的，而且用表達Epstein—Barr病毒膜抗原gp250/350(BLLF—1閱讀框，Baer等，1984)的重組疫苗病毒接種可以賦予對感染和/或疾病的抗性，必然假定，抵抗與Epstein—Barr病毒有關(guān)的疾病的疫苗是有可能的。
由于活疫苗的可能的副作用，開發(fā)純蛋白疫苗是一個重要目標。既然Epstein—Barr病毒膜蛋白gp 250/350(BLLF—1)是高度糖基化的，并且這種翻譯后修飾是正確免疫原性的重要因素(Emini等，1988)，那么，在可生產(chǎn)糖蛋白的真核生物細胞中以gp 250/350(Epstein—Barr病毒的閱讀框BLLF—1)為基礎(chǔ)開發(fā)疫苗是很有前景的。
本發(fā)明涉及哺乳動物細胞系，特別是穩(wěn)定表達作為Epstein—Barr病毒抗原的糖蛋白(gp 250(220))，糖蛋白(gp 350)和/或雜交糖蛋白(gp 250(220)/(gp 350)的倉鼠細胞系(尤其是在無蛋白培養(yǎng)基中)，由此可避免通過補充培養(yǎng)基而受病毒或細菌污染的危險。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)上述糖蛋白的方法。
穩(wěn)定表達作為EBV抗原的gp 250(220)，gp 350和/或gp250(220)/gp 350的倉鼠細胞系是公知的；參見，例如，Motz等，在Gene，44(1986)，353—359和Vaccines，87(1987)，374—379，以及Gu Shyan等，在100 Jahre Blutserum—Therapie 1890—1990，Halle(Saale)，(1991)，93—100。然而，尚不知道可用來穩(wěn)定地表達上述糖蛋白的倉鼠細胞系。根據(jù)Motz等，在Vaccines 87(1987)，374—379，376中的報道，病毒外源糖蛋白在CHO細胞膜中的整合超過某一點時，會是毒性的。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，通過下面的遺傳學方法提出一種倉鼠細胞系，該細胞系穩(wěn)定地表達和分泌上述糖蛋白，通過下述方法得到—用表達上述糖蛋白而不是膜錨蛋白(Membrananker)的載體轉(zhuǎn)感細胞系(Motz等，1987)，—其中，載體含有一種細胞系所沒有的選擇標記，—培養(yǎng)細胞系，利用選擇標記選擇出一旦選擇因子(抑制劑)被消除就能穩(wěn)定地表達和分泌糖蛋白的細胞。
另外的實施例提出在無蛋白培養(yǎng)基中生產(chǎn)穩(wěn)定地表達上述糖蛋白的倉鼠細胞系的方法的應用，它是通過下述步驟得到的(A)從沒有選擇標記的倉鼠細胞系(宿主細胞系)開始，該選擇標記后來被按照(A)(d)染色體整合的載體表達，或被按照(B)染色體整合的載體表達(重組細胞系)，(a)在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，并使它們附著在底物上或相互附著，(b)重復更換部分被消耗的培養(yǎng)基，同時逐步降低培養(yǎng)基的血清含量，最后對其進行無血清培養(yǎng)在此—不主動地消除細胞的附著，—可選地，使細胞球形體形成和分開，分離分開的細胞球形體，在懸浮液中培養(yǎng)同時搖動，選擇出在小團粒中生長的或單個生長的細胞(c)最后，使選擇出的細胞經(jīng)過權(quán)利要求1的步驟，或者(B)使如權(quán)利要求1所述的倉鼠細胞系經(jīng)步驟(A)(a)至(A)(b)。
由于初始細胞系既不能在無血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染也不能在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所以使初始細胞系或宿主細胞系在含血清培養(yǎng)基中，例如在MEMα-或α-＋5％FCS中生長。這種培養(yǎng)基的例子是DIF1000，RPMI 1640，ASF 103和HDB。
為實現(xiàn)在無蛋白培養(yǎng)基中的生長，存在三個相互關(guān)聯(lián)的問題。
1.例如，在使用培養(yǎng)瓶時，利用培養(yǎng)基血清消耗過程中的附著。這種方法的結(jié)果是正生長刺激。另外，消耗的舊培養(yǎng)基和死細胞以及溶胞作用的產(chǎn)物能被簡便而溫和地分離(不用離心)。
2.為確保血清消耗過程中培養(yǎng)基良好的自我調(diào)節(jié)能力，只重復更換部分培養(yǎng)基。
3.使細胞進行緩慢攪拌下的長期培養(yǎng)，例如在有球形體形成的懸浮培養(yǎng)物的旋轉(zhuǎn)瓶中。對降低的附著趨勢的特定選擇使在小團粒中生長的或單個生長的細胞得以分離。首先，分離出大的球形體。然后，在低g值下使上清液分級離心，分離出的小球形體和單個細胞用于進一步轉(zhuǎn)接。
當采用權(quán)利要求2中所述方法時，在下面的無蛋白培養(yǎng)基中的生長是可能的。下文中，培養(yǎng)基用來指代SMIF(Scharfenberg′s改良Iscove′s培養(yǎng)基，F(xiàn)12培養(yǎng)基)。它是一種特別加富培養(yǎng)基，由約11 Iscove′s改良Dulbecco′s培養(yǎng)基和Ham′s F12營養(yǎng)物(IF)的混合物組成，可以向其中加入例如腐胺(如1.2微摩爾升-1)和L—羥脯氨酸(如153微摩爾升-1)(SMIF1)。另外，對懸浮液中的生長，為螯合二價離子、改善代替無血清培養(yǎng)基(SMIF2)中常采用的蛋白成分運鐵蛋白的無機鐵的有效性，應優(yōu)選加入螯合劑，例如，金紅三羧酸(ATA，如3微摩爾升-1)(Bertheussen，1993)，EDTA(如4.3微摩爾升-1)和檸檬酸(如40微摩爾升-1)。
根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，從中國倉鼠細胞系(CHO)，如CHO K1＝ATCC CCL61，或從小倉鼠腎臟細胞系(BHK)，如BHK21C13＝ATCC CCL10開始，可以得到倉鼠細胞系。
如果根據(jù)本發(fā)明，能產(chǎn)生世代時間為例如15至40小時，特別是20至30小時、穩(wěn)定地表達上述糖蛋白的倉鼠細胞系，這種成就必被視為有創(chuàng)造性的，因為，至今沒有人不使用選擇性遺傳操作而成功地在無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)倉鼠細胞系。至今，一般認為，要表達所需基因產(chǎn)物，必須借助遺傳工程使哺乳動物細胞系在無蛋白培養(yǎng)基中生長(NSO Cell line，Hassel等，1992)。
至于選擇標記和抑制劑的選擇，熟練人員可根據(jù)已有的相關(guān)技術(shù)。合適的選擇標記的一個例子是二氫葉酸還原酶基團(DHFR基因)，合適的抑制劑的一個例子是氨甲蝶呤(MTX)(Motz等，1987)。
本發(fā)明的一個特定實施方案是倉鼠細胞系CHO pPMDIIIGP-TR－PFC6＝DSM ACC 2121。
根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)下述步驟得到gp 250(220)，gp 350和/或gp250(220)/gp 350，(a)培養(yǎng)本發(fā)明的細胞系，使表達所需糖蛋白，(b)從培養(yǎng)基中分離細胞，特別是借助微量過濾，(c)再借助超濾，特別是交叉流超濾，濃縮和純化清澈的粗上清液，(d)再用陰離子交換柱純化，(e)超濾以及(f)凝膠過濾，得到最后的純糖蛋白(gp)級分。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以得到天然形式和糖基化形式的糖蛋白。它們因此具有天然的抗原性潛力。由此方法得到的疫苗因而顯示與活性EB病毒的各種蛋白質(zhì)相一致的抗原性特征。得到的疫苗是一種具有高抗原性保護潛力而沒有致病潛力的安全疫苗。因為沒有產(chǎn)生病毒逆轉(zhuǎn)的可能，也沒有滅活病毒的最小危險和毒性，所以就安全性而言，重組疫苗優(yōu)于滅活疫苗或減活疫苗。
實施例1CHO pMDIIIGPTR—PFC6的獲得按照Motz等，在Gene，44(1986)，353—359，Motz等，在Gene，58(1987)，149—154和Vaccines，87(1987)374—379中所述方法，用質(zhì)粒pMDIIIGP轉(zhuǎn)染源于缺少二氫葉酸還原酶基因(dhfr—1)的細胞系CHO K1＝ATCC CCL61的克隆。培養(yǎng)細胞，用氨甲蝶呤(MTX)選擇出即使不用抑制劑能穩(wěn)定地表達gp 250/350的克隆。穩(wěn)定表達gp 250/350的克隆被稱為CHO C6。實施例2在無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO C6在標準的細胞培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。在1至2個培養(yǎng)瓶(185cm2，體積約40至50ml；Falcon)中的IF培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHOC6，直至細胞完全鋪滿。在一些情況下已形成多層。隨后，通過每次用新鮮、預熱過的SMIF1更換含有活和死游離細胞以及溶胞產(chǎn)物的舊培養(yǎng)基的4/5，以1，0.2，0.04和0.008％的FCS含量，逐步進行FCS的稀釋。如果在低FCS含量下培養(yǎng)基中形成游離的球形體，它們在移出培養(yǎng)基之前可以沉降。更換的時間取決于活力和培養(yǎng)條件，分別決定，最后，培養(yǎng)物上清液營養(yǎng)物含量太低。用于更換的優(yōu)選標準值是葡萄糖含量約為0.7至1g/l。為補充未分解的營養(yǎng)物，至少在一周后更換少量培養(yǎng)基。
當培養(yǎng)物消耗到FCS含量為0.008％時，用新鮮、無蛋白、預熱過的SMIF1更換全部培養(yǎng)基，進一步在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。如果在這些條件下，已經(jīng)有足夠量的球形體形成或分開，就將這些球形體轉(zhuǎn)入一個小旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(最小體積40ml)中，約40rpm下在40mlSMIF1(1/4舊條件培養(yǎng)基的＋3/4新鮮培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。如果細胞不分開，只能用酶法將細胞層從底物中分離，就象通常用來轉(zhuǎn)接附著細胞所做的那樣。用SMIF1培養(yǎng)基洗滌兩次以使細胞分開后，從蛋白酶中提取出那些在此條件容易聚集的細胞，在此之前，細胞也可轉(zhuǎn)移至小旋轉(zhuǎn)瓶中。
在旋轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)細胞，直至得到低于40小時的世代時間，培養(yǎng)物在小球形體中生長。在培養(yǎng)基中殘留葡萄糖標準值為0.5至1g/l時，進行轉(zhuǎn)接。選擇性地轉(zhuǎn)接小球形體和單個細胞。為此目的，在一短時間內(nèi)不攪拌培養(yǎng)懸浮液，以使大球形體分開。然后，通過離心移出上清液(100g)。菌絲球中的細胞轉(zhuǎn)入下代。通過加入20—30％(體積)已經(jīng)由過濾或離心從死細胞或細胞碎片中清洗出的前代培養(yǎng)基來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。
兩個適應實驗的全過程，每個都需兩個月。實施例3從培養(yǎng)物上清液中處理和純化重組蛋白質(zhì)I.交叉流超濾，再進行循環(huán)緩沖為此目的，使用經(jīng)微量過濾的無蛋白SMIF1或SMIF2中的發(fā)酵產(chǎn)物，即得自直至1l規(guī)模的連續(xù)環(huán)流培養(yǎng)物，或從10l氣升式發(fā)酵器中的分批培養(yǎng)物。為過濾，使用具有100kD公稱截留分子量的濾罩(Millipore或Filtron)。交叉流超濾過程中，使用下述標準值(相對隨機地選擇)—跨膜壓力不超過約1巴；—管路中存在的要過濾的粗上清液的約1/3從體積流動中以濾液形式移出；這相當于每一濾罩大約2—3升濾液，吸取能力為如8升/分鐘?！诰彌_交換過程中，使用更低的泵唧本領(lǐng)。
概括地提出下列步驟。前兩個步驟可以省去，但它們能提高產(chǎn)率。
1.測定產(chǎn)物總體積，為控制膜，即通過給膜加載和使其極化來調(diào)節(jié)恒定有效的過濾截留分子量，產(chǎn)生約15％(體積)濾液(以正常過濾條件下的體積流動計)。
2.上述濾液返回到殘留物(Retentat)。
3.實際的交叉流超濾進行到殘留物降至初始體積的1/50.為止。然而，可以進一步濃縮殘留物，尤其是通過使用無蛋白培養(yǎng)基。
4.達到終體積時，緩沖—交換并洗滌初級殘留物。為此，用磷酸緩沖液(20mM；pH7)充滿殘留物至雙倍體積(包括泵和超濾系統(tǒng)的死體積)，每次重新將殘留物濃縮至最小體積，如此進行3至4次，為進一步處理提供殘留物。這一步驟用于除去低分子外源蛋白質(zhì)，降低后繼純化步驟的離子強度。II.用陰離子交換柱純化使用下述設(shè)備。
柱材料Q—Sepharose High Performance(Pharmacia的一種生物處理材料緩沖體系緩沖液A20mM磷酸緩沖液(pH5.1)緩沖液B含1M NaCl的20mM磷酸緩沖液(pH5.1)規(guī)模例如，裝有FPLC和1ml柱體積的HR5/5柱的小規(guī)模(Pharmacia)；可能放大。
流速恒定的5.1cm/min，相當于HR5/5柱中的1ml/min。
用MiliQ處理水將超濾殘留物稀釋至電導為3ms，用HCl調(diào)節(jié)pH至5.1(例如，為分離大量外源蛋白質(zhì)，先調(diào)至pH4.2再調(diào)至5.1)。通過離心除去渾濁。然后，通過FPLC泵給柱加入清澈的上清液，同時加入5％份緩沖液B來洗脫第一種外源蛋白質(zhì)。最大負荷約為8mg總蛋白/ml凝膠。之后，通過達0.4M NaCl的梯度(梯度高于22倍柱體積)洗脫蛋白質(zhì)。
在0.15和0.35M NaCl之間，洗脫掉所需gp 250/350蛋白質(zhì)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后精確地選擇出準備進一步純化的級分。不加入緩沖液B以及在不同的pH(例如pH7)下也能完成蛋白質(zhì)負載和分離。對色譜法中的gp蛋白質(zhì)，進樣過程中較低的pH和加入緩沖液B可提高容量。
如果使用磷酸緩沖液，后繼處理步驟之前的循環(huán)緩沖步驟可以省略。然而，其它緩沖體系如檸檬酸緩沖液也是有用的。III.超濾在凝膠過濾柱上通過超濾將步驟II中選擇和收集的蛋白質(zhì)級分濃縮到約1/10至1/20。蛋白質(zhì)最終濃度在例如1至2mg/ml的范圍內(nèi)。Minicon CS15室(Amico)用于超濾。(在更大的溶劑體積下，可考慮采用相應具有更高容量的更大裝置。例如，攪拌細胞或交叉流超濾元件)。IV.用凝膠過濾法純化柱材料用Superose6(Pharmacia)預填充的HR10/30柱；用于放大，采用XK 26/100柱中的Sephacryl S—300 High Resolution和Sephacryl S—400 High Resolution。
緩沖體系20mM磷酸緩沖液(pH7)中的同溶劑100或200mMNaCl。
流速例如，2—2.5mm/min。
例如，柱平衡后，用10g蛋白(先被濃縮(CS15)，通過離心從中除去渾濁物)每ml凝膠。以大約2.5mm/min的流速洗脫并分離。收集那些含有g(shù)p 250和/或gp 350、經(jīng)PAGE和銀染色后沒有可見污染的洗脫級分。
可在約-20℃下、在凝膠過濾法收集的gp級分中以冷凍形態(tài)穩(wěn)定貯藏純gp 250/350。純化步驟僅有約25—40％粗產(chǎn)品的總產(chǎn)率。對比實施例1重復進行實施例2，不同的是，血清消耗階段不允許細胞鋪滿，當消除細胞附著之后進行FCS的消耗。用這種方法，不能實現(xiàn)細胞在無蛋白培養(yǎng)基中的生長。
文獻Baer，R.et al.DNA sequence and expression of the B95-8Epstein-Barr virus genome.Nature，310(1984)207-211.Bertheussen，K.Growth of cells in a new defined protein-free medium.Cytotechnology，11(1993)，219-231.Emini，E.A.et al.Antigenic Analysis of the Epstein-Barrvirus major membrane antigen(gp 350/220)expressed in yeastand mammalian cells；implications for the development of asubunit vaccine.Virology，166(1988)387-93.Gu，S.et al.On the first EBV vaccine trial in humans usingrecombinant vaccina virus expressing the major membraneantigen.Proceedings of the Vth International Symposium on″Epstein-Barr virus and associated Diseases″，Annecy，1992(1993).Hassel，T.et al.Stability of recombinant antibodies fromglutamine synthetase amplified CHO and NSO cell lines.InAnimal Cell TechnologyDevelopments，Processes and Products(Spier，R.E.，Griffiths，J.B.，MacDonald，C.，eds.)Butterworths-Heinemann，Oxford，(1992)42-47.Motz M.et al.Truncated versions of the two major Epstein-Barr viral glycoproteins(gp 250/350)are secreted byrecombinant Chinese hamster ovary cells.Gene，58(1987)149-154.
權(quán)利要求
1.在無蛋白培養(yǎng)基中穩(wěn)定地表達作為Epstein—Barr病素抗原的糖蛋白(gp)250(220)、糖蛋白(gp)350和/或雜交糖蛋白(gp)250(220)/(gp)350的哺乳動物細胞系，它是通過下述步驟得到的(A)從沒有選擇標記的倉鼠細胞系開始，該選擇標記后來被按照(A)(c)所述方法進行染色體整合的載體表達，或被按照(B)所述方法進行染色體整合的載體表達，(a)在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，并使它們附著在底物上或相互附著，(b)重復更換部分被消耗的培養(yǎng)基，同時緩慢降低培養(yǎng)基的血清含量，最后對其進行無血清培養(yǎng)—不主動地消除細胞的附著，—可選地，使細胞球形體形成或分開，分離分開的細胞球形體，在懸浮液中培養(yǎng)同時搖動，選擇出在小團粒中生長的或單個生長的細胞(c)最后，使選擇出的細胞經(jīng)過如下處理步驟，(ca)用表達上述糖蛋白(gp)的載體轉(zhuǎn)染細胞系，其中，載體含有一種細胞系所沒有的選擇標記，(cb)培養(yǎng)細胞系，利用選擇標記選擇出一旦不再使用選擇因予(抑制劑)就能穩(wěn)定地表達糖蛋白的細胞，或者(B)使哺乳動物細胞系首先經(jīng)過處理步驟(A)(ca)和(A)(cb)，再經(jīng)過處理步驟(A)(a)至(A)(b)。
2.如權(quán)利要求1所述的哺乳動物細胞系，其特征在于，將一種倉鼠細胞系，特別是中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)如CHO K1＝ATCC CCL61或小倉鼠腎臟細胞系(BHK)如BHK 21 C13＝ATCC CCL10作為該哺乳動物細胞系。
3.如前述任何權(quán)利要求所述的倉鼠細胞系，其特征在于，將二氫葉酸還原酶基因(DHFR基因)用作選擇標記，將氨甲蝶呤(MTX)用作抑制劑。
4.倉鼠細胞系CHO K1 pMDIHGPTR—PFC6＝DSM ACC2121。
5.生產(chǎn)糖蛋白(gp)250(220)，糖蛋白(gp)350和/或雜交蛋白質(zhì)(gp)250(220)/(gp)350的方法，特征是(a)按權(quán)利要求1至4任何權(quán)項所述方法培養(yǎng)細胞系，使其表達所需糖蛋白并將糖蛋白分泌到培養(yǎng)基中，(b)從培養(yǎng)基中分離出糖蛋白。
6.生產(chǎn)糖蛋白(gp)250(220)，糖蛋白(gp)350和/或雜交蛋白質(zhì)(gp)250(220)/(gp)350的方法，特征是(a)按權(quán)利要求1至4任何權(quán)項所述方法培養(yǎng)細胞系，使其表達所需糖蛋白并將糖蛋白分泌到培養(yǎng)基中。(b)從培養(yǎng)基中分離出細胞，特別是利用微量過濾，(c)用交叉流超濾法進行濃縮和純化，(d)然后，借助陰離子交換柱純化，(e)超濾和
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動物細胞系，特別是能以穩(wěn)定形式表達作為Epstein-Barr病毒抗原的糖蛋白gp250(220)，350和250(220)/350的倉鼠細胞系，還涉及從無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中獲得糖蛋白的方法。
文檔編號C12N5/10GK1124502SQ94192251
公開日1996年6月12日 申請日期1994年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月26日
發(fā)明者H·沃爾夫, K·查爾芬伯格, R·瓦格納 申請人:H·沃爾夫