專利名稱：間苯三酚的生物合成和由其制備1,3－二羥基苯的制作方法
政府利益聲明本發(fā)明是部分地在海軍研究部門授予的N00014-02-1-0725號基金的政府支持下完成的。政府可以擁有本發(fā)明的當(dāng)然的權(quán)利。
相關(guān)申請的交叉引用本申請是2004年10月12日同時(shí)遞交的“間苯三酚的生物合成和由其制備1，3-二羥基苯”的美國臨時(shí)申請60/617,959和60/618,024的部分的繼續(xù)申請。
背景技術(shù)：
間苯三酚(1，3，5-三羥基苯)及其衍生物廣泛應(yīng)用于商業(yè)中。間苯三酚及其衍生物，如三甲基間苯三酚，用作藥劑，如抗痙攣藥。間苯三酚用作藥物、殺微生物劑和其它有機(jī)合成的起始材料或中間體。間苯三酚用作含有木質(zhì)素的顯微鏡檢查樣本(如木材樣本)的著色劑，并且用于染料的生產(chǎn)，包括皮革染料、紡織品染料和染發(fā)劑。它用于生產(chǎn)粘合劑，用作環(huán)氧樹脂固化劑，并用于炸藥的制備，如熱穩(wěn)定性和震動(dòng)穩(wěn)定性高的炸藥，1，3，4-三氨基-2，4，6-三硝基苯(TATB)。間苯三酚還用作抗氧化劑、穩(wěn)定劑和抗腐蝕劑，并用作感光復(fù)印紙的偶聯(lián)劑、人工降雨的碘化銀的替代物、骨樣本脫鈣劑和花的保存劑。間苯三酚也能通過催化氫化作用轉(zhuǎn)化成間苯二酚。
間苯二酚(1，3-二羥基苯)是間苯三酚特別有用的衍生物，雖然間苯二酚目前沒有通過上述路徑來制備。與間苯三酚一樣，間苯二酚用于染料和粘合劑的制備，并用作環(huán)氧樹脂固化試劑；并且它用作藥物和其它有機(jī)合成的起始材料和中間體。間苯二酚及其衍生物或者單獨(dú)或者與其它活性成分如硫一起，進(jìn)一步常常用于化妝品，以及治療包括痤瘡、頭皮屑、濕疹和牛皮癬之類疾病的局部皮膚藥物，部分地起殺菌劑和止癢劑的作用。間苯二酚也用作氯丁橡膠的交聯(lián)劑、橡膠組合物中的粘性增強(qiáng)劑，用在有機(jī)聚合物(如三聚氰胺和橡膠)的鍵合劑中以及纖維質(zhì)的和其它復(fù)合材料的制備中。間苯二酚用于樹脂和樹脂粘合劑的生產(chǎn)中，例如同時(shí)作為單體和UV吸收劑；炸藥的生產(chǎn)中，例如像收斂酸(2，4，6-三硝基苯-1，3-二酚)和重金屬收斂酸鹽這樣的高能化合物；以及重氮染料、增塑劑、己基間苯二酚和對氨基水楊酸的合成中。
間苯二酚類樹脂中最常見的是間苯二酚-醛和間苯二酚-苯酚-醛樹脂。這些類型的間苯二酚樹脂用于例如樹脂粘合劑、復(fù)合材料基質(zhì)、以及制造人造纖維和尼龍產(chǎn)品的起始材料。復(fù)合材料的例子包括間苯二酚-甲醛碳(或其它有機(jī)的)微粒水凝膠、氣凝膠以及干凝膠，用于例如金屬的和有機(jī)金屬的催化劑的基質(zhì)材料。間苯二酚-甲醛樹脂和與它的微粒復(fù)合材料也用于牙科中作為根管填料。
間苯二酚-醛樹脂粘合劑特別用于需要高結(jié)合強(qiáng)度的應(yīng)用中，包括，例如木制桁架、托梁、桶和小船；以及飛行器。改良的間苯二酚-乙醛樹脂粘合劑還用作局部創(chuàng)傷和體內(nèi)創(chuàng)傷或外科手術(shù)切口，如血管切口的生物創(chuàng)傷密封劑成分。這經(jīng)常用于軍用的野外用藥，例如，環(huán)境暴露的最小化、減少出血和體液流失、以及加速痊愈進(jìn)程。這種改良的樹脂粘合劑包括，例如，凝膠-間苯二酚-甲醛和凝膠-間苯二酚-戊二醛組合物，其中的醛可以先與間苯二酚-凝膠成分分開存放，然后需要時(shí)再混合來形成粘合劑。
目前，間苯三酚和間苯二酚都是通過使用腐蝕性材料和高溫條件，從石油衍生的起始材料開始，并且產(chǎn)生很多有環(huán)境問題的廢物的化學(xué)有機(jī)合成法來進(jìn)行商業(yè)上的生產(chǎn)。
所以，為這些有價(jià)值的化合物的生產(chǎn)提供更有效更干凈的方法將會是本技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)步。一種可能的解決方法是提供生物合成途徑來生產(chǎn)間苯三酚，并對生物合成的間苯三酚選擇性氫化以得到間苯二酚。已經(jīng)報(bào)道了植物、藻類和微生物中的涉及間苯三酚的化合物的生物合成，例如來自假單胞菌屬(Pseudomonsa)的乙?；g苯三酚；來自金絲桃屬植物(Hypericum)的貫葉金絲桃素(hyperforins)、hyperfoliatins、hyperjovinols和hyperatomarins；來自野桐屬(Mallotus)的pallidusol、dehydropallidusol、白藜蘆醇(pallidol)、mallopallidol和homomallopallidol；來自藤黃屬植物(Garcinia)的garcinielliptone；來自鱗毛蕨屬(Dryopteris)的黃綿馬酸化合物(flavaspidicacids)；來自桉屬(Eucalyptus)的macrocarpals和sideroxylonals；來自薔薇屬(Rosa)的1，3，5-三甲氧基苯；以及含間苯三酚的苷和褐藻多酚化合物(phlorotannins)。
然而，報(bào)道的這些植物和微生物中的間苯三酚的生產(chǎn)僅僅是更復(fù)雜的降解產(chǎn)物，因此較少量的和/或更貴重的起始材料。參見，例如L.Schoefer etal.，Appl.Environ.Microbiol.70(10)6131-37(2004)；D.Baas & J.Rétey，Eur.J.Biochem.265896-901(1999)。此外，二乙酰基間苯三酚的微生物生物合成的生產(chǎn)已經(jīng)被建議作為一種提高釋放到農(nóng)業(yè)環(huán)境中作為生物防除劑來抵抗植物病原體的重組細(xì)菌的抗真菌活性的方法。參見Thomashow等的美國專利6,051,383和M.G.Bangera & L.S.Thomashow，J Bact.181(10)3155-63(1999)。但是，間苯三酚合成代謝的生物合成生產(chǎn)途徑，例如從便宜的起始材料如葡萄糖開始的生產(chǎn)途徑卻并未給出。
最近，已經(jīng)詳細(xì)闡述了間苯三酚(1a)的一個(gè)替代途徑(圖2)，該途徑包括從葡萄糖到三乙酸內(nèi)酯(3a)的微生物催化合成；然而，發(fā)現(xiàn)將三乙酸內(nèi)酯(3a)轉(zhuǎn)化為間苯三酚(1a)需要多個(gè)化學(xué)步驟。參見W.Zha et al.，J.Am.Chem.Soc.126(14)4534-35(2004)；和C.A.Hansen & J.W.Frost，J.Am.Chem.Soc.124(21)5926-27(2002)。那么，這條途徑最多是部分生物合成，部分化學(xué)合成的途徑。
因此，至今，沒有完全的生物合成途徑來商業(yè)生產(chǎn)間苯三酚本身(1，3，5-三羥基苯)的報(bào)道。沒有催化形成間苯三酚本身的酶或編碼基因被鑒定出來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從丙二酸單酰輔酶A，并最終是從諸如葡萄糖的簡單起始材料開始的生物合成制備間苯三酚的方法、酶和細(xì)胞。具體地說，本發(fā)明提供了第一個(gè)完整的用于間苯三酚合成的生物合成的合成代謝途徑，該途徑不需要全部的四個(gè)phlABCD操縱子酶，而能夠僅僅用phlD酶或其它間苯三酚合成酶來進(jìn)行商業(yè)化的間苯三酚生產(chǎn)。還提供了包括如間苯二酚的生物合成的間苯三酚的衍生物的制備方法。所述酶系統(tǒng)、重組細(xì)胞和方法在制備間苯三酚中的應(yīng)用；以及所制備的間苯三酚。所述的酶系統(tǒng)、重組細(xì)胞和方法在制備諸如間苯二酚的間苯三酚衍生物中的應(yīng)用；所制得的間苯三酚和諸如間苯二酚的衍生物。所述的酶系統(tǒng)、重組細(xì)胞、方法、間苯三酚、或者衍生物在制備化合物或組合物中的應(yīng)用，所述化合物或組合物例如炸藥或推進(jìn)劑化合物和組合物；所述的酶系統(tǒng)、重組細(xì)胞、方法、間苯三酚、或衍生物在制備非炸藥、非推進(jìn)劑的化合物和組合物中的應(yīng)用，所述非炸藥、非推進(jìn)劑的化合物和組合物例如藥物、化妝品、染料、聚合物樹脂、橡膠、粘合劑、密封劑、涂料、復(fù)合材料、或?qū)訅旱幕蚪Y(jié)合的材料。所制備的炸藥或推進(jìn)劑化合物和組合物；所制備的非炸藥、非推進(jìn)劑的化合物和組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)；PhlD+重組細(xì)胞，所述PhlD+重組細(xì)胞是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)；和已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD的表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，其中酶系統(tǒng)和重組細(xì)胞能夠?qū)⒈釂熙］o酶A轉(zhuǎn)化為間苯三酚；是PhlA-，PhlB-和PhlC-的酶系統(tǒng)和細(xì)胞；進(jìn)一步包含至少一種合成丙二酸單酰輔酶A的酶的酶系統(tǒng)和細(xì)胞；一種制備合成代謝的間苯三酚的方法，包括提供這樣的酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞以及丙二酸單酰輔酶A或其它碳源，其中所述其它碳源能夠被所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A；在能夠合成間苯三酚的條件下使丙二酸單酰輔酶A與所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞接觸，或者在能夠使所述碳源轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A并能由其合成間苯三酚的條件下，使其它碳源與所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞接觸；在該方法中，所述碳源是簡單碳源，例如糖類、脂肪族多羥基化合物或其組合；在該方法中，細(xì)胞培養(yǎng)于含有所述碳源的培養(yǎng)基中，或所述培養(yǎng)以萃取發(fā)酵方法來實(shí)施，和/或所述培養(yǎng)采用諸如雙溫度曲線的多溫度曲線來進(jìn)行；以及由所述方法制備的間苯三酚；一種能夠?qū)⒈釂熙］o酶A轉(zhuǎn)化為間苯三酚的分離的或重組的合成間苯三酚的酶；包含氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2有至少70％同源性的氨基酸序列，如氨基酸序列SEQ ID NO2的保守取代變體的所述酶；一種包含至少一個(gè)編碼PhlD酶的開放閱讀框的分離的或重組的核苷酸，并且是phlA-，phlB-或phlC-中的至少一個(gè)；進(jìn)一步包含至少一個(gè)編碼合成丙二酸單酰輔酶A的酶的開放閱讀框的核苷酸；核苷酸，其中編碼PhlD的ORF包括SEQ ID NO1的堿基序列、與SEQ ID NO1具有至少80％同源性的堿基序列、與之相應(yīng)的RNA堿基序列、或隨其冗余的密碼子序列；一種已經(jīng)用核苷酸轉(zhuǎn)化的phlD+重組細(xì)胞，所述細(xì)胞可由所述核苷酸表達(dá)間苯三酚合成酶；為phlA-，phlB-或phlC-中至少一個(gè)的細(xì)胞；為phlA-，phlB-和phlC-的細(xì)胞；進(jìn)一步是phlE-或phlF中至少一個(gè)的細(xì)胞；一種制備間苯二酚的方法，包括提供用所述分離的或重組的酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞生物合成的合成代謝的間苯三酚，以及氫和銠催化劑，在間苯三酚可氫化形成間苯二酚的條件下使間苯三酚與氫和銠催化劑接觸；以及由合成代謝的間苯三酚制備的間苯二酚；所述的合成代謝的間苯三酚，或由其制備的間苯二酚，在生產(chǎn)藥物、化妝品、染料、聚合物樹脂、橡膠、粘合劑、密封劑、涂料、復(fù)合材料、或?qū)訅旱幕蚪Y(jié)合的材料中的應(yīng)用；含有所述合成代謝的間苯三酚或由其制備的間苯二酚，或由所述合成代謝的間苯三酚或由其制備的間苯二酚的化學(xué)修飾得到的藥物、化妝品、染料、聚合物樹脂、橡膠、粘合劑、密封劑、涂料、復(fù)合材料、或?qū)訅旱幕蚪Y(jié)合的材料的組合物；
一種制備能從丙二酸單酰輔酶A生物合成間苯三酚的重組細(xì)胞的方法，包括用編碼PhlD核苷酸轉(zhuǎn)化該細(xì)胞，所述核苷酸能夠通過所述細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，或包括在phlD+細(xì)胞中滅活基因，該步驟包括提供為phlA+、phlB+或phlC+中至少一個(gè)的phlD+細(xì)胞，并滅活其中phlA、phlB或phlC基因中的至少一個(gè)；是微生物的重組細(xì)胞，所述微生物為例如細(xì)菌，其例子包括大腸埃希氏菌(Escherichia coli)和熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)；所述方法中酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞包括合成丙二酸單酰輔酶A的酶；所述方法包括提供phlABCD+細(xì)胞，并滅活其中的至少一個(gè)phlA、phlB或phlC基因，和/或在其中插入至少一個(gè)phlD+核苷酸，所述phlD+核苷酸是phlA-、phlB-或phlC-中的至少一個(gè)；所述方法中的phlD+重組細(xì)胞是phlA-、phlB-和phlC-；所述方法包括提供phlABCD+細(xì)胞，并且滅活其中全部的phlA、phlB和phlC基因；所述方法包括提供phlABCD-細(xì)胞并在其中插入phlD基因；所述方法中phlD+核苷酸定位于細(xì)胞的基因組DNA中；所述方法中phlD+核苷酸定位于細(xì)胞的基因組外的DNA中。
一種制備推進(jìn)劑或炸藥化合物的方法，包括提供通過所述分離的或重組的酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞來生物合成合成代謝的間苯三酚，并化學(xué)修飾該合成代謝的間苯三酚，或化學(xué)修飾由其制備的間苯二酚；所述合成代謝的間苯三酚，或由其制備的間苯二酚在炸藥或推進(jìn)劑的生產(chǎn)中的應(yīng)用；以及包含所述合成代謝的間苯三酚或由其制備的間苯二酚，或由所述合成代謝的間苯三酚或由其制備的間苯二酚的化學(xué)修飾得到的炸藥或推進(jìn)劑組合物。


圖1提供了圖解1，圖示說明了文獻(xiàn)報(bào)道的途徑(a)不用間苯三酚作中間體的乙酰基間苯三酚的生物合成，見M.G.Bangera & L.S.Thomashow，J Bact.181(10)3155-63(1999)；(c)三乙酸內(nèi)酯的生物合成，見S.Eckermann et al.，Nature396387(1998)，J.M.Jez et al.，Chem.Bio.7919(2000)；W.Zha et al.，J.Am.Chem.Soc.1264534(2004)。還顯示了在本工作中假設(shè)和鑒定的用間苯三酚作為中間體的乙?；g苯三酚的生物合成路徑(b)和(b’)。
圖2提供了圖解2，圖示說明了間苯三酚通常的商業(yè)化學(xué)合成途徑(a、b、c)；以前提出的從葡萄糖合成間苯三酚的多步驟途徑(d、e、f、g)；間苯二酚合成的首選的通常的商業(yè)化學(xué)合成途徑(i，j)；間苯二酚合成的第二的通常商業(yè)化學(xué)合成途徑(k，l)。還用圓圈箭頭說明了(1)本工作中報(bào)道的用于間苯三酚生產(chǎn)的完全生物合成途徑(用圓圈星號指出)；(2)從間苯三酚到間苯二酚的化學(xué)氫化作用(h)。所示的特定反應(yīng)或反應(yīng)步驟是(a)Na2Cr2O7，H2SO4；(b)Fe，HCl；(c)H2SO4，108℃；(d)參見W.Zha et al.，J.Am.Chem.Soc.1264534(2004)；(e)Dowex 50 H+，MeOH；(f)Na，甲醇，185℃；(g)12 N HCI；(h)i)H2，負(fù)載在Al2O3上的Rh，ii)0.5 M H2SO4，回流；(i)SO3，H2SO4；(j)NaOH，350℃；(k)HZSM-12沸石，丙烯；和(l)i)O2，ii)H2O2，iii)H+。
圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的推定的反應(yīng)路徑，通過這條路徑丙二酸單酰輔酶A通過間苯三酚合成酶被生物合成地轉(zhuǎn)化為間苯三酚，或者通過酶激活的3，5-二酮庚二酸鹽(diketopimelate)(3，5-二酮庚二酸鹽(diketoheptanedioate))，或者通過酶激活的3，5-二酮己酸鹽(diketohexanoate)(3，5-二酮己酸鹽(3，5-diketocaproate))。
圖4說明了在合成代謝的間苯三酚合成過程中利用不同的碳源的各種示例性的途徑。虛線箭頭表示可選擇的碳源利用途徑；方括號中為在某些途徑中可能不出現(xiàn)的中間體。
應(yīng)該注意的是，在此給出的附圖用來例示本發(fā)明的儀器、材料和方法中的一般性特征，目的是在此描述這些實(shí)施方式。這些圖可能沒有精確地反映任何給出的實(shí)施方式的特征，且不必要限定或限制本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實(shí)施方式
。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了生產(chǎn)間苯三酚及其衍生物的方法、材料和生物體。本發(fā)明是基于過去的工作基礎(chǔ)上的，在該工作中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，單基因的表達(dá)就能夠產(chǎn)生具有相當(dāng)含量的間苯三酚，而不是通過在微生物乙酰基間苯三酚路徑中的多基因，如phlABCDEF的表達(dá)。公開物，例如美國專利No.6,051,383，得出這樣的結(jié)論如果間苯三酚用這樣的基因來生產(chǎn)，那么很可能最好或者僅有的這么做的途徑將會是至少在該路徑中再加入一種酶以使乙?；g苯三酚脫乙酰。
然而，現(xiàn)在意外發(fā)現(xiàn)在此被命名為“間苯三酚合成酶”并且從phlD基因表達(dá)得來的單一酶的表達(dá)可直接導(dǎo)致間苯三酚的形成，也就是說，不經(jīng)過乙?；幕蚨阴；闹虚g體。從而，這一個(gè)酶能夠離開其它任何其它phl操縱子基因而被單獨(dú)表達(dá)，來達(dá)到間苯三酚合成的顯著水平。此外，該間苯三酚合成的途徑通過3，5-二酮己酸硫酯中間體進(jìn)行，而不是通過3，5，7-三酮辛酸硫酯。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與其它任何phl操縱子基因分開的間苯三酚合成酶本身的表達(dá)現(xiàn)在已經(jīng)被證明能夠生產(chǎn)出的間苯三酚比此前提出的任何其它生物合成和半生物合成途徑都顯著地多；因此，間苯三酚是可通過比已經(jīng)提出的任何其它生物合成和半生物合成途徑都更簡單、更有效并且更經(jīng)濟(jì)的方式的生產(chǎn)出來的。
在此用到的這些標(biāo)題(如“背景技術(shù)”和“發(fā)明內(nèi)”)和副標(biāo)題僅僅用來對本發(fā)明的公開內(nèi)容的主題進(jìn)行一般性的組織，而不是用來限制本發(fā)明的公開或其任何方面。具體地說，在“背景技術(shù)”中公開的主題內(nèi)容可以包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的技術(shù)方面，而不構(gòu)成在先技術(shù)引用。在“發(fā)明內(nèi)容”中公開的主題不是本發(fā)明的全部范圍或其任何實(shí)施方式的詳盡徹底或完全地公開。
在此引用的參考文獻(xiàn)不構(gòu)成對那些參考文獻(xiàn)是在先技術(shù)或與在此公開的本發(fā)明的專利性有任何的相關(guān)性的承認(rèn)。在背景技術(shù)中對引用文獻(xiàn)內(nèi)容的任何討論僅僅用于提供這些參考文獻(xiàn)的作者主張的一般性概述，而不構(gòu)成對這些參考文獻(xiàn)內(nèi)容的正確性的承認(rèn)。本說明書的具體實(shí)施方式
部分引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用，其整個(gè)內(nèi)容被合并于此。
當(dāng)說明本發(fā)明的實(shí)施方式時(shí)的描述和具體實(shí)施例，僅僅為了說明的目的而不是為了限制本發(fā)明的范圍。并且，具有確定特征的多個(gè)實(shí)施方式的引用不是為了排除具有附加特征的其它實(shí)施方式，或者其它合并了這些確定特征的不同組合的其它實(shí)施方式。
如此處用到的詞語“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”指的是本發(fā)明中在某些情況下提供某些益處的實(shí)施方式。然而，其它實(shí)施方式在同樣的或其它情況下也可以是優(yōu)選的。此外，一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式的引用并不意味著其它實(shí)施方式無用，也不是用來排除其它源于本發(fā)明范圍內(nèi)的實(shí)施方式。
如此處用到的詞語“包括”及其變體，是非限制性的，這樣所列項(xiàng)目的引用就不會排除其它在本發(fā)明的材料、成分、裝置和方法中有用的相似項(xiàng)目。
在此所用的詞語“重組”指所用到的核苷酸操作。因此，短語如“重組”核苷酸、“重組”多肽、以及“重組”細(xì)胞是指至少部分是通過核苷酸操作產(chǎn)生的實(shí)體。在此所用的術(shù)語“體內(nèi)的”包括“細(xì)胞內(nèi)的”，其中所述細(xì)胞是指活細(xì)胞。
序列同源性在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的突變的多肽具有和原有的與該突變體行使同樣功能的多肽至少50％的同源性的氨基酸序列。例如，根據(jù)本發(fā)明的間苯三酚合成酶具有與SEQ ID NO2至少50％同源性的氨基酸序列；優(yōu)選實(shí)施方式中，該序列具有與SEQ ID NO2至少60％的同源性；優(yōu)選實(shí)施方式中，該序列具有與SEQ ID NO2至少70％的同源性；優(yōu)選實(shí)施方式中，該序列具有與SEQID NO2至少80％的同源性；優(yōu)選實(shí)施方式中，該序列具有與SEQ ID NO2至少90％的同源性。
在一個(gè)實(shí)施方式中，如上所述，根據(jù)本發(fā)明的編碼目的多肽的重組多核苷酸是任何編碼與行使同樣功能的原有多肽具有同源性的多肽的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的編碼目的多肽的重組多核苷酸，具有與編碼行使與突變體相同功能的多肽的原有核苷酸大于80％的同源性的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多核苷酸具有與原有核苷酸至少85％的同源性；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多核苷酸具有與原有核苷酸至少90％的同源性；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多核苷酸具有與原有核苷酸至少95％的同源性。
序列同源性是指在兩個(gè)序列的氨基酸殘基之間，或兩個(gè)序列的核苷酸之間的一致程度。這可以通過兩個(gè)序列的視覺上的比對來確定，或者利用生物信息學(xué)的算法排列序列來比對或確定所比較序列間同源性的百分比。有用的自動(dòng)的算法可以在威斯康星遺傳學(xué)軟件包(可以從遺傳性計(jì)算機(jī)軟件集團(tuán)，美國威斯康星州的Madison)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA計(jì)算機(jī)軟件模塊中得到。在那些模塊中的自動(dòng)的排列算法包括Needleman & Wunsch、Pea rson &Lipman和Smith & Waterman序列排列算法。其它序列排列和同源性確定的有用的算法在下列軟件中是自動(dòng)的，包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和CLUSTAL V；參見，例如，N.P.Brown et al.，BioinformaticsApplications Note，1998，14380-81；美國國家生物技術(shù)信息中心(the U.S.National Center forBiotechnology Information)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Tools/index.html；和美國專利6,790,639，其中提供了用于此處同源性確定的軟件參數(shù)設(shè)置。
由核酸堿基聚合物如核苷酸和核苷酸類似物所顯示的序列同源性，可以通過第一序列與第二序列的互補(bǔ)物之間的雜交檢驗(yàn)來確定。任何已知的雜交檢驗(yàn)可以用于此目的，這些檢驗(yàn)的例子包括那些在美國專利6,767,744和6,783,758中描述的限定在“高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹彪s交條件下的那些雜交檢驗(yàn)。
保守取代另外，保守的氨基酸取代可出現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明的多肽中。術(shù)語“保守的氨基酸取代”指對給定氨基酸殘基的任意氨基酸取代，其中該取代殘基與該給定殘基化學(xué)上如此相似以至于不會造成多肽功能(如酶活性)的實(shí)質(zhì)性降低。保守氨基酸取代為本領(lǐng)域所公知，并且其例子被描述于，例如，美國專利6,790,639、6,774,107、6,194,167或5,3 50,576中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，保守氨基酸取代將出現(xiàn)在下列六組中的任何一個(gè)中1.小的脂肪族，實(shí)質(zhì)上的非極性殘基Ala、Gly、Pro、Ser和Thr；2.大的脂肪族，非極性殘基Ile、Leu和Val；Met；
3.極性，帶負(fù)電荷的殘基及其氨基化合物Asp和Glu；4.極性的氨基化合物，帶負(fù)電荷的殘基Asn和Gln；His；5.極性，帶正電荷的殘基Arg和Lys；His；以及6.大的芳香殘基Trp和Tyr；Phe.
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，保守的氨基酸取代將是下列原有殘基(保守取代)對中的任意一個(gè)Ala(Ser)；Arg(Lys)；Asn(Gln；His)；Asp(Glu)；Gln(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Pro)；His(Asn；Gln)；Ile(Leu；Val)；Leu(Ile；Val)；Lys(Arg；Gln；Glu)；Met(Leu；Ile)；Phe(Met；Leu；Tyr)；Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)和Val(Ile；Leu)。
正如多肽可以含有保守氨基酸取代一樣，此處的多核苷酸也可含有保守密碼子取代。密碼子取代在當(dāng)表達(dá)時(shí)產(chǎn)生如上所述的保守氨基酸取代下的情況下被認(rèn)為是保守的。導(dǎo)致無氨基酸取代的退化的密碼子取代，也用于根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸中。因此，例如，編碼所選擇的用于本發(fā)明的實(shí)施方式中的多肽的多核苷酸可以通過退化的密碼子取代來突變，以接近用來轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主細(xì)胞所展示的該密碼子使用頻率，或者用來提高其表達(dá)。
此外，含有核酸堿基序列的聚合物，例如核酸，會優(yōu)選地包括那些編碼根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或更多個(gè)酶。而且，這些聚合物會包括，例如，與編碼給定酶的核酸分享了至少80％序列同源性的核酸。舉例來說，根據(jù)本發(fā)明的間苯三酚合成酶編碼序列會具有與SEQ ID NO1序列至少80％同源性的堿基序列；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該序列具有與SEQ ID NO1序列至少85％的同源性；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該序列具有與SEQ ID NO1序列至少90％的同源性；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該序列具有與SEQ ID NO1序列至少95％的同源性。
間苯三酚及其衍生物的生產(chǎn)如圖3所示，目前間苯三酚合成酶已經(jīng)被識別并表征，并且該酶催化間苯三酚合成的機(jī)制已經(jīng)被出人意料地發(fā)現(xiàn)是依照下列一系列步驟進(jìn)行的，或者通過另外的另一個(gè)機(jī)制，其中提供被轉(zhuǎn)化形成圖示的硫酯(-SR)鍵合的基團(tuán)的第一個(gè)丙二酸單酰輔酶A，提供了丙二酸單酰基，而不是乙酰基。
●乙?；せ?第一步包括乙?；募せ睢＿@通過丙二酸單酰輔酶A的脫羧作用以將產(chǎn)生的乙?；D(zhuǎn)移到酶，從而形成酶激活的乙?；蝓?圖3中的“R”代表酶或與酶相連的一部分)；在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一步包括整個(gè)丙二酸單?；募せ睿孕纬擅讣せ畹谋釂熙；蝓?；●鏈的延伸-下一階段包括兩個(gè)連續(xù)的丙二酸單酰輔酶A脫羧作用以將乙酰基進(jìn)一步轉(zhuǎn)移形成酶激活的3-酮丁酸硫酯，然后形成酶激活的3，5-二酮己酸硫酯；在另一個(gè)實(shí)施方式中，連續(xù)的轉(zhuǎn)移形成酶激活的3-酮戊二酸硫酯和3，5-二酮庚二酸硫酯；●環(huán)化-最后一步包括3，5-二酮己酸硫酯中間體的環(huán)化來形成間苯三酚；在另一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)生了3，5-二酮庚二酸的脫羧作用以環(huán)化成為間苯三酚。
所有的三個(gè)步驟都被間苯三酚合成酶催化。
根據(jù)本發(fā)明的酶系統(tǒng)包含至少一個(gè)間苯三酚合成酶。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該間苯三酚合成酶從假單胞菌中得到；在優(yōu)選的實(shí)施方式中從假單胞菌屬(Pseudomonas)種的一個(gè)成員中得到在優(yōu)選的實(shí)施方式中，從熒光假單胞菌(P.fluorescens)中得到。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，從熒光假單胞菌Pf-5中得到。本工作中鑒定的熒光假單胞菌Pf-5間苯三酚合成酶的氨基酸序列如SEQ IDNO2所示，它的原有的編碼序列如SEQ ID NO1所示。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的酶系統(tǒng)進(jìn)一步含有至少一個(gè)酶，該酶能夠或者單獨(dú)或者與其它酶共同催化丙二酸單酰輔酶A的形成。丙二酸單酰輔酶A可以生物合成制備，例如，用合成丙二酸單酰輔酶A的酶從乙酰輔酶A制備，合成丙二酸單酰輔酶A的酶例如源于豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)的丙二酸單酰輔酶A合成酶(MatB)(參見GenBank Accession AAC83455[gi3982573])，它將丙二酸單?；D(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A；源于豌豆根瘤菌丙二酸單酰輔酶A脫羧酶(MatA)(參見GenBank Accession AAC83456[gi3982574])，它將丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A；或者乙酰輔酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)的轉(zhuǎn)羧基酶活性，該酶羧化乙酰輔酶A來形成丙二酸單酰輔酶A。丙二酸、丙二酸半醛或乙酰輔酶A這些起始材料可以是，并且優(yōu)選是生物合成的；例如，乙酰輔酶A可生物合成地來源于諸如葡萄糖、光合的3-磷酸甘油酸酯等的各種來源中的任意一種。
根據(jù)本發(fā)明的酶系統(tǒng)可在生物體內(nèi)也可在生物體外。當(dāng)不提供合成丙二酸單酰輔酶A的酶時(shí)，將丙二酸單酰輔酶A加入與細(xì)胞和/或酶接觸的培養(yǎng)基中。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼間苯三酚合成酶的核苷酸可轉(zhuǎn)化到能夠合成丙二酸單酰輔酶A的生物體的細(xì)胞內(nèi)，在這種情況下間苯三酚可在其中生成。生物體合成丙二酸單酰輔酶A的例子包括植物、藻類、動(dòng)物和人。體外系統(tǒng)包括，例如批量酶懸液或(吸收的或共價(jià)結(jié)合的)固定化酶生物反應(yīng)器。體內(nèi)系統(tǒng)包括，例如，固定化的細(xì)胞生物反應(yīng)器、連續(xù)發(fā)酵和批量發(fā)酵。此處用到的“發(fā)酵”指在任何有效的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞生長，而不一定是在例如厭氧條件或厭氧代謝的條件下，這樣的條件僅僅是這里的另一個(gè)實(shí)施方式。在任意一個(gè)實(shí)施方式中，丙二酸單酰輔酶A的來源會提供給間苯三酚合成酶，無論該來源是添加的(例如外源的)丙二酸單酰輔酶A還是原位生物合成的(例如內(nèi)源的)丙二酸單酰輔酶A。
根據(jù)本發(fā)明的重組細(xì)胞能夠表達(dá)至少一種間苯三酚合成酶，和或者表達(dá)或者不表達(dá)至少一種合成丙二酸單酰輔酶A的酶，但是既不是全部的phlABCD操縱子也不是所有三個(gè)phlA、phlB和phlC基因。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組細(xì)胞是一種能夠在其中表達(dá)重組的間苯三酚合成酶的細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，能夠表達(dá)間苯三酚合成酶并且可表達(dá)或可不表達(dá)合成丙二酸單酰輔酶A的酶的重組細(xì)胞是有壁細(xì)胞。有壁細(xì)胞的例子包括植物細(xì)胞、酵母菌/真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、古生菌細(xì)胞以及一些原生生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，重組細(xì)胞可為無管植物(如苔蘚)、原生生物(如藻類)、酵母菌、真菌、細(xì)菌或古生菌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，重組細(xì)胞可為重組的微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，重組細(xì)胞可為酵母菌、真菌、細(xì)菌或古生菌細(xì)胞，更優(yōu)選的是酵母菌、真菌或細(xì)菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該重組細(xì)胞可為細(xì)菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該重組細(xì)胞會是蛋白質(zhì)菌細(xì)胞(proteobacterial cell)。優(yōu)選地，該重組細(xì)胞缺乏表達(dá)源于phlABC，phlE和phlF基因的功能酶的能力。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞可為phlABC-，phlE-和phlF-細(xì)胞。重組的宿主細(xì)胞可包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的間苯三酚合成酶的核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核苷酸會以載體的形式存在，如質(zhì)粒或轉(zhuǎn)位子。
用于形成有用的phlD+重組細(xì)胞的實(shí)施方式中，通過任何基因敲除技術(shù)(也就是說，任何導(dǎo)致細(xì)胞不能制造由敲除前基因編碼的功能表達(dá)產(chǎn)物的基因除去或突變的技術(shù))，將phlD+和phlA+、phlB+和/或phlC+的細(xì)胞可被制成phlA-、phlB-和/或phlC-的細(xì)胞。優(yōu)選地，將細(xì)胞中所有的phlA、phlB和phlC基因都敲除。得到的細(xì)胞會保持它的PhlD+表型?？蓪⑺黾?xì)胞中存在的phlE和/或phlF基因敲除，也可不敲除。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，phlABCD+細(xì)胞可被制成phlABC-。在一個(gè)實(shí)施方式中，phlD-和phlA-、phlB-和/或phlC-的細(xì)胞中可插入可表達(dá)的PhlD編碼的核苷酸，或者插到其基因組DNA中或者作為染色體外單位的部分，如質(zhì)粒，或者兩者都有，從而制成phlD+細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，phlABCD-細(xì)胞可被制成phlD+。
在某些實(shí)施方式中，PhlD+的原有的或重組的細(xì)胞，如phlD+細(xì)胞，能被進(jìn)一步用附加的phlD基因補(bǔ)充，通過用含有一個(gè)或多個(gè)可表達(dá)的編碼間苯三酚合成酶的開放閱讀框的核苷酸轉(zhuǎn)化。PhlD+細(xì)胞可以是PhlA-，PhlB-，和/或PhlC-細(xì)胞，如phlA-、phlB-和/或phlC-的細(xì)胞；或者可以是PhlA+、PhlB+和/或PhlC+細(xì)胞，如phlA+、phlB+和/或phlC+的細(xì)胞(例如phlABCD+細(xì)胞)。所得的能夠表達(dá)附加的phlD基因的重組細(xì)胞，能夠顯示增強(qiáng)的間苯三酚合成能力。
與重組細(xì)胞相似，根據(jù)本發(fā)明的分離的或重組的酶系統(tǒng)包含至少一種間苯三酚合成酶，還可包含或不包含至少一種合成丙二酸單酰輔酶A的酶或一套酶，但是不包含全部三個(gè)PhlA、PhlB和PhlC酶，并且優(yōu)選是不包含PhlA、PhlB和PhlC酶中的任何一個(gè)。因此，包含至少一種間苯三酚合成酶和可包含或不包含至少一種合成丙二酸單酰輔酶A的酶，但是包含少于全部三個(gè)PhlA、PhlB和PhlC酶的根據(jù)本發(fā)明的重組細(xì)胞和酶系統(tǒng)，是指PhlA-、PhlB-和PhlC-中的至少一個(gè)，優(yōu)選是PhlABC-的PhlD+實(shí)體。
生產(chǎn)間苯三酚的方法包括將間苯三酚合成酶與丙二酸單酰輔酶A接觸。生產(chǎn)間苯二酚的方法包括在生物合成的間苯三酚上進(jìn)行氫化反應(yīng)，例如用氫以及銠催化劑。用根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的間苯三酚和間苯二酚可以被用于或作為、或來制備，諸如藥物、化妝品、染料、聚合物樹脂、橡膠、粘合劑、密封劑、涂料、推進(jìn)劑、炸藥、復(fù)合材料和層壓的或結(jié)合的材料的組合物。
全細(xì)胞發(fā)酵模式此處的重組細(xì)胞的全細(xì)胞發(fā)酵可以在任何培養(yǎng)模式中進(jìn)行，優(yōu)選在分批式、流加式或連續(xù)式(或半連續(xù)式，也就是再接種式)模式中進(jìn)行。在此處的一些實(shí)施方式中，通過培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的重組細(xì)胞而產(chǎn)生的含間苯三酚的用過的培養(yǎng)基被處理來萃取間苯三酚。然而，在某些情況下，間苯三酚本身，當(dāng)在生長培養(yǎng)基中達(dá)到了極限濃度時(shí)，能夠在被稱為終產(chǎn)物抑制作用的過程中對所培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生毒性。這種抑制存在時(shí)會降低間苯三酚的細(xì)胞生產(chǎn)并能導(dǎo)致降低的細(xì)胞存活力。因此，在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選在細(xì)胞活躍地生產(chǎn)間苯三酚的階段從另外仍然有用的生長培養(yǎng)基中對間苯三酚和還可對間苯三酚衍生物(如果存在的話)進(jìn)行萃取。這樣的實(shí)施方式在此稱為“萃取發(fā)酵”。
在此萃，取發(fā)酵能夠以本領(lǐng)域已知有用的任何模式來進(jìn)行。例如，一些實(shí)施方式使用了分散的萃取發(fā)酵模式，其中能夠提取間苯三酚的萃取吸收劑或吸收劑液體或微粒相被引入重組細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中，在那里萃取微粒或液體區(qū)域得以接觸并提取間苯三酚。如任何萃取過程一樣，用該吸收劑或吸收劑材料對這個(gè)產(chǎn)品的提取可以是非特異性的、優(yōu)先的或特異性的，并且優(yōu)選的是對間苯三酚優(yōu)先的或特異性的提取。
在“承載”間苯三酚之后，“承載”著的萃取相被從培養(yǎng)基中移出，例如通過離心、過濾、對有磁性的或可磁化的微粒的磁力收集、和/或通過相分離方法，如萃取相上升到培養(yǎng)基的本體之上或者下降到它之下。在某些實(shí)施方式中，逆流或橫流萃取技術(shù)可以用于從培養(yǎng)基中萃取間苯三酚，如相對于培養(yǎng)基流的逆流或橫流包含如萃取液體或微粒相。
在某些實(shí)施方式中，膜式萃取發(fā)酵是使培養(yǎng)基通過諸如離子交換膜的萃取膜來進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，柱式萃取發(fā)酵式是使培養(yǎng)基通過萃取柱來進(jìn)行，萃取柱例如中空纖維膜萃取器柱或纖維性的或珠子樹脂柱。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞可以通過柱子，或者部分或全部的細(xì)胞在培養(yǎng)基通過柱子之前被除去，例如通過過濾。在任何萃取發(fā)酵方法中，萃取發(fā)酵可以進(jìn)行一次、多次或在發(fā)酵過程中連續(xù)進(jìn)行。在逆流、橫流、膜式和柱式萃取發(fā)酵模式中，其中一些或全部(優(yōu)選是大部分或全部)的間苯三酚已經(jīng)被移除的培養(yǎng)基然后又回到發(fā)酵容器中。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，柱式萃取發(fā)酵技術(shù)用于在生物合成過程中從培養(yǎng)基中移除間苯三酚。為此目的的有用的介質(zhì)包括陰離子交換介質(zhì)，如陰離子交換珠、陰離子交換纖維和陰離子交換中空纖維。同樣的，陰離子交換膜和陰離子交換介質(zhì)微粒分別用于膜式和分散的萃取發(fā)酵模式中。當(dāng)使用微粒陰離子交換基質(zhì)時(shí)，雖然固定的床模式也可以可選擇地使用，但是優(yōu)選采用流化床萃取發(fā)酵模式。
有用的陰離子交換介質(zhì)可以包含任何支持物，有機(jī)的或無機(jī)的，其包含或共價(jià)結(jié)合陰離子交換基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，會使用有機(jī)支持物，如苯乙烯-二乙烯基苯、聚苯乙烯、聚乙烯、丙烯酸類、苯酚-甲醛、有機(jī)硅化合物或纖維素的聚合物骨架，其中所述骨架包含或連接有陰離子交換基團(tuán)。
有用的陰離子交換基團(tuán)可以是任何陽離子基團(tuán)，優(yōu)選非金屬陽離子基團(tuán)，如有機(jī)銨、锍和膦基團(tuán)。優(yōu)選的陽離子基團(tuán)包括有機(jī)的叔銨(例如二乙基氨基乙基纖維素)、季銨、吡啶鹽、叔锍和季膦基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述陰離子交換基質(zhì)中的陰離子交換基團(tuán)是季銨或吡啶鹽基團(tuán)。季銨類樹脂的例子包括AG-1 X8樹脂(來自Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA)和DOWEX1樹脂(來自The DOW Chemical Co.，Midland，MI，USA)；吡啶鹽類樹脂的例子包括聚乙烯-烷基-吡啶鹽樹脂，可用鹵代烷處理聚乙烯-吡啶樹脂如REILLEX HP(來自Reilly Industries，Inc.，Indianapolis，IN，USA)來得到，或者直接通過市售來源得到，如聚(4-乙烯基N-甲基碘化吡啶)(來自Polymer SourceInc.，Montreal，QC，CA)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在使用前，處理陰離子交換介質(zhì)以制備該基質(zhì)的具有陽離子基團(tuán)的磷酸鹽配合物。當(dāng)陰離子交換介質(zhì)被再利用時(shí)(不干涉從中除去間苯三酚)，或者在與給定的發(fā)酵的連續(xù)接觸中，優(yōu)選用新的或更新的陰離子交換介質(zhì)以足夠的頻率進(jìn)行替換，以使培養(yǎng)基中的間苯三酚的濃度不會上升到引起終產(chǎn)物抑制發(fā)生的水平；優(yōu)選不高于約2g/L，或不高于約1.5g/L的間苯三酚。
通過萃取發(fā)酵或者發(fā)酵后萃取方法，已經(jīng)承載著間苯三酚的陰離子交換基質(zhì)優(yōu)選用水、酸化的水、酸化的醇(例如酸性的乙醇)或其組合進(jìn)行洗滌處理來去除間苯三酚。優(yōu)選的技術(shù)是先水洗然后用酸化的醇洗。(優(yōu)選地)大部分或全部的間苯三酚從陰離子交換基質(zhì)中去除后，可制備該基質(zhì)在間苯三酚的萃取中再利用，例如在再利用之前，通過用磷酸鹽溶液進(jìn)行平衡來形成陽離子基團(tuán)-磷酸鹽復(fù)合物。這些洗滌物中存在的間苯三酚可以用任何本領(lǐng)域已知技術(shù)來進(jìn)一步分離和/或純化，例如，相分離，溶劑揮發(fā)等。
全細(xì)胞發(fā)酵條件用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的間苯三酚的方法中的全細(xì)胞培養(yǎng)物將利用允許細(xì)胞生長的條件和允許生長的細(xì)胞生產(chǎn)合成代謝的間苯三酚的條件。在某些情況下，間苯三酚合成酶會在貫穿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)周期內(nèi)表達(dá)，例如構(gòu)成表達(dá)；然而，在很多情況下，所希望的是僅僅在接近指數(shù)生長期(EGP)終點(diǎn)時(shí)才開始表達(dá)間苯三酚合成酶。想得到后期表達(dá)時(shí)，在調(diào)節(jié)啟動(dòng)子控制下的間苯三酚合成酶編碼序列會在大約70％到100％的EGP已經(jīng)過去時(shí)被激活或去阻遏，優(yōu)選是當(dāng)大約70％到約90％，更優(yōu)選的是約70％到約80％的EGP已經(jīng)過去時(shí)被激活或去阻遏。用于此目的的啟動(dòng)子的例子包括tac、T5和T7啟動(dòng)子；其中優(yōu)選的是PT7；可以用乳糖或安慰誘導(dǎo)劑如IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)誘導(dǎo)。
在此處的一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組的微生物細(xì)胞，如重組細(xì)菌宿主細(xì)胞會被用作全細(xì)胞生物催化劑。用于此目的的優(yōu)選的細(xì)菌包括蛋白質(zhì)菌；優(yōu)選的變形菌的例子包括γ變形菌，如腸細(xì)菌和假單胞菌；埃希氏菌屬，如大腸埃希氏菌(E.coli)，和假單胞菌屬，如熒光假單胞菌，是其中優(yōu)選的。優(yōu)選的微生物是那些缺乏或已經(jīng)處理以降低或消除那些能夠降解根據(jù)本發(fā)明的間苯三酚合成酶和/或合成丙二酸單酰輔酶A的酶的蛋白酶活性的微生物。在細(xì)菌中，Lon和OmpT是兩個(gè)優(yōu)選缺乏或者被降低或消除的蛋白酶，如通過突變。E.coli菌株BL21和W3110是優(yōu)選的用來插入phlD基因的phlABCD-細(xì)胞的例子；熒光假單胞菌的菌株P(guān)f-5是優(yōu)選的phlABCD+細(xì)胞的例子，該細(xì)胞是用于具有或不具有附加的phlD基因的插入的phlA、phlB、和/或phlC的滅活，，或者用于具有插入附加的phlD基因的phlABCD的滅活，，或者用于具有附加的phlD基因的補(bǔ)充。E.coli菌株BL21可獲得的是BL21 STAR(DE3)ONE SHOT(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA.USA)；或者ULTRA BL21(DE3)(Edge BioSystems，Gaithersburg，MD，USA)。E.coli菌株W3110可獲得的是ATCC No.27325(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)；熒光假單胞菌的菌株P(guān)f-5可獲得的是ATCC No.BAA-477。
在E.coli的情況下，優(yōu)選的發(fā)酵溫度是從約20到約37℃，優(yōu)選約25到約37℃，更優(yōu)選約30℃到約37℃。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在合成代謝的間苯三酚合成的情況中，EGP期間或至少在EGP的誘導(dǎo)前部分期間的更高溫度，與至少部分的保持培養(yǎng)階段期間(例如，貫穿所有或部分的誘導(dǎo)后，或所有或部分保持期階段)的較低溫度的結(jié)合是較好的間苯三酚生產(chǎn)方案的重要特征。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在EGP或誘導(dǎo)前EGP期間，重組的E.coli細(xì)胞生長在約35～37℃下，優(yōu)選在約36～37℃，更優(yōu)選在約36℃下；在保持期或誘導(dǎo)之后的時(shí)期，重組的E.coli細(xì)胞生長在約30～34℃下，優(yōu)選在約30到約33℃，更優(yōu)選在約33℃或在約30℃下。在一些實(shí)施方式中，向低溫的轉(zhuǎn)換可以很好的發(fā)生于保持期，例如，在EGP結(jié)束后從培養(yǎng)開始直到約15小時(shí)的時(shí)候。因此，在EGR結(jié)束于從培養(yǎng)開始約15小時(shí)的時(shí)候的細(xì)胞(如E.coli)培養(yǎng)情況下，為形成雙溫度發(fā)酵特征而從較高溫度向較低溫度的轉(zhuǎn)換可以發(fā)生在，例如，約11或約12小時(shí)的時(shí)候(例如，大約與70％或80％EGR誘導(dǎo)點(diǎn)同時(shí))，或約15小時(shí)的時(shí)候，或甚至從培養(yǎng)開始約30小時(shí)的時(shí)候。或者，在這樣的雙溫度實(shí)施方式中例如用于EGR的較高溫度對整個(gè)培養(yǎng)周期是有用的溫度。在熒光假單胞菌的情況下，優(yōu)選的溫度是從約20到約30℃，優(yōu)選的較高溫度是從約27到約30℃，優(yōu)選的較低溫度是從約24到約27℃。
碳源根據(jù)本發(fā)明的用來生產(chǎn)間苯三酚的細(xì)胞、酶系統(tǒng)和方法的實(shí)施方式將利用碳源。其中除丙二酸單酰輔酶A之外的碳源與細(xì)胞或酶系統(tǒng)接觸，根據(jù)本發(fā)明的酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞可以利用任何所提供的其它碳源，這樣根據(jù)實(shí)踐的實(shí)施方式的酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞能將碳源代謝成為可用作在此所述的合成代謝地合成的間苯三酚的物質(zhì)。除間苯三酚合成酶外，其它酶學(xué)的性質(zhì)，和存在于反應(yīng)混合物中的可選擇的丙二酸單酰輔酶A的合成活性將決定哪種碳源可以利用。圖4說明了從不同碳源開始的合成代謝地合成間苯三酚的許多代表性途徑。
因此，對大多數(shù)碳源來說，細(xì)胞或酶系統(tǒng)或者將首先分解碳源或者固定它，來提供簡單的有機(jī)分子，由這些簡單的有機(jī)分子，細(xì)胞可以形成乙酰輔酶A?；蛘?，碳源會被直接轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。例如，對于乙酸鹽碳源來說，乙酸鹽可以被直接轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，或者可以先被轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸鹽。乙酰輔酶A本身也可用作碳源。一旦得到或被提供，乙酰輔酶A通過乙酰輔酶A羧化酶的作用可用于合成丙二酸單酰輔酶A。當(dāng)碳源的降解產(chǎn)生代謝的丙二酸或代謝的丙二酸半醛時(shí)，或當(dāng)丙二酸或丙二酸半醛存在于碳源中時(shí)，它們可以被分別被存在于細(xì)胞或酶系統(tǒng)的酶庫中的丙二酸單酰輔酶A合成酶或丙二酸單酰輔酶A脫羧酶轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A，或者它們可以被代謝用于乙酰輔酶A的合成，隨后轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A。一旦得到或被提供，丙二酸單酰輔酶A就被用作間苯三酚合成酶的底物，形成間苯三酚。
當(dāng)碳源含有生物分子類碳化合物時(shí)，該碳化合物優(yōu)選是初級代謝物型化合物。初級代謝物型化合物的例子優(yōu)選包括下列化合物中的任意一個(gè)優(yōu)選C1～C18脂肪酸、蠟、單-、二-、三-甘油酯；多羥基化合物；脂肪族羥基酸；磷脂；膦酸；單糖(例如丙糖、四糖、戊糖、己糖、庚糖等)；氨基酸；和核苷酸；以及來源于這些化合物的水解同源的和異源的寡聚物(例如包括二聚物)和多聚物；和這些化合物的生物活性形式(例如乙酰輔酶A)。生物分子型化合物可以是任何來源的，或者是生物來源的或者是合成的。其它優(yōu)選的化合物包括任何小的或不復(fù)雜的有機(jī)化合物，也就是通常的C1～C18的脂肪族、脂環(huán)族和芳香族化合物等，優(yōu)選每18個(gè)碳原子具有四個(gè)或更少的碳-碳支化點(diǎn)，例如C1～C18脂肪族烴和它們的單酸和多酸、單醇和多醇、單胺和多胺、單羰基和多羰基；以及從中形成的水解同源的和異源寡聚物和多聚物。
包含這樣的小的/不復(fù)雜的有機(jī)化合物，和/或初級代謝物型化合物，而沒有實(shí)質(zhì)濃度(優(yōu)選是少于10wt％的碳的濃度)的次級代謝物或者較大單體型或復(fù)雜的有機(jī)化合物的碳源也在此稱為“簡單”碳源。如此處用到的，次級代謝物包括，例如生物堿；香豆素；聚酮化合物；萜類化合物；類異戊二烯；固醇；類固醇；和前列腺素；兒茶酚胺；卟啉；氧雜蒽酮；類黃酮；苯丙醇類(phenylpropanoids)和苯酚類化合物(包括例如苯環(huán)型化合物和多酚)等。大的或復(fù)雜的有機(jī)化合物是脂肪族的、脂環(huán)族的和芳香族的化合物等，它們具有大于C18的單體的化合物大小和/或復(fù)雜性在每18個(gè)碳原子中大于4個(gè)碳-碳支化點(diǎn)的單體化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，碳源是簡單碳源。優(yōu)選的簡單碳源包含0％到約5％，更優(yōu)選0％到約2％，或0％到約1％，或0％到約0.5％，或優(yōu)選約0％重量的次級代謝物和較大的或復(fù)雜的有機(jī)物；或者優(yōu)選沒有或至少實(shí)質(zhì)上沒有次級代謝物和較大的/復(fù)雜的有機(jī)物。在一些實(shí)施方式中，簡單碳源包含初級代謝物型化合物。在此用到的初級代謝物型化合物優(yōu)選的例子包括糖類，優(yōu)選單糖和/或二糖；和多羥基化合物。葡萄糖、木糖和阿拉伯糖是在此所用的碳源中的優(yōu)選的單糖的例子；甘油是多羥基化合物的一個(gè)優(yōu)選的例子。在此的一個(gè)實(shí)施方式中，葡萄糖、木糖和/或阿拉伯糖可用作碳源，優(yōu)選用作貫穿細(xì)胞培養(yǎng)的指數(shù)生長期和保持期期間的碳源。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用單糖(優(yōu)選是葡萄糖、木糖和/或阿拉伯糖)和甘油的組合，例如，以1∶1或2∶1的重量比；優(yōu)選地，這樣的組合僅僅在保持期被用到，其中單糖(沒有甘油)被用在指數(shù)生長期期間。
實(shí)施例間苯三酚(1a，圖解1，也就是圖1)被發(fā)現(xiàn)是多種天然產(chǎn)物中的取代基。然而，間苯三酚1a作為獨(dú)立的分子的生物合成還沒有被記述過。作為這種生物合成活性的部分研究，分析了在熒光假單胞菌Pf-5中形成的乙?；g苯三酚(6和7，圖解1)。B.Novak-Thompson et al.，Can.J.Microbiol.401064(1994)。檢測了間苯三酚生物合成。后來的熒光假單胞菌phlD的異源表達(dá)導(dǎo)致了間苯三酚1a在大腸埃希氏菌培養(yǎng)物中的積聚。除了關(guān)于乙酰基間苯三酚的生物合成的推論之外，這些發(fā)現(xiàn)建立了間苯三酚和間苯二酚的新的環(huán)境良性的合成基礎(chǔ)。
激活的3，5-二酮己酸鹽(diketonhexanoate)2(即激活的3，5-二酮己酸鹽(3，5-diketocaproate))很可能是兩個(gè)結(jié)構(gòu)上最簡單的聚酮化合物天然產(chǎn)物，間苯三酚1a和三乙酸內(nèi)酯3a的前體(圖解1)，例如，來自非洲菊(Gerberahybrida)的2-吡喃酮合成酶催化丙二酸單酰輔酶A向三乙酸內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化。S.Eckermann et al.，Nature 396387(1998)；J.Jez et al.，Chem.Bio.7919(2000)?；钚晕稽c(diǎn)酪氨酸變化為苯丙氨酸導(dǎo)致了三乙酸內(nèi)酯的形成，作為產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)脂肪酸合成酶的唯一生物合成產(chǎn)物，B.W.Zha et al.，J.Am Chem.Soc.1264534(2004)。在具有任何這些天然存在的或突變的酶的情況下，未觀察到間苯三酚的形成。另一個(gè)可選擇的間苯三酚1a的可能前體是激活的3，5-二酮庚二酸鹽(diketoheptanedioate)12(也就是，激活的3，5-二酮庚二酸鹽(diketopimelate))。
對間苯三酚1a生物合成的探查指向熒光假單胞菌Pf-5和2，4-二乙酰基間苯三酚7的生物合成(圖解1)。B.Novak-Thompson et al.，Can.J.Microbiol.401064(1994)。乙?；g苯三酚生物合成由含有phlACBD、由phlE編碼的產(chǎn)物輸出的蛋白和離散轉(zhuǎn)錄phlE編碼的調(diào)節(jié)子的基因簇編碼。PhlD被認(rèn)為包括于激活的3，5，7-三酮辛酸5的形成與環(huán)化中(圖解2)。推測所得的中間體2-乙酰基間苯三酚6被乙?；纬?，4-二乙?；g苯三酚7(圖解2)。參見M.G.Bangera&L.S.Thomashow，J Bacteriol.1813155(1999)。間苯三酚1a的生物合成不是歸因于PhlD的活性。
分析熒光假單胞菌Pf-5/pME6031的培養(yǎng)上清中積聚的產(chǎn)物。除了(表1條目1)2，4-二乙?；g苯三酚7和2-乙酰基間苯三酚6外，，發(fā)現(xiàn)了間苯三酚的形成。為提高生物合成的間苯三酚的濃度，熒光假單胞菌PF-5用pJA2.232轉(zhuǎn)化，pJA2.232是衍生自將phlABCDE基因簇插入到pME6031的質(zhì)粒。目的是避免由基因組編碼的PhlF通過呈現(xiàn)生物合成基因簇的多拷貝來進(jìn)行的調(diào)節(jié)。這種方法導(dǎo)致了熒光假單胞菌PF-5/pJA2.232(項(xiàng)目2，表1)合成的間苯三酚類化合物1a，6，7的濃度相對于熒光假單胞菌PF-5/pME6031(表1條目1)大大提高。
表1.通過表達(dá)phlACBDE基因的構(gòu)建體而生物合成的間苯三酚1a、2-乙酰基間苯三酚6和2，6-二乙酰基間苯三酚7的最大濃度。

a細(xì)胞在振搖燒瓶的條件下培養(yǎng)于YM培養(yǎng)基中。
b細(xì)胞在振搖燒瓶的條件下培養(yǎng)于TB培養(yǎng)基中并收獲。
重懸浮于M9最小鹽基質(zhì)中后，細(xì)胞在振搖燒瓶的條件下培養(yǎng)。
c細(xì)胞在控制發(fā)酵罐的條件下培養(yǎng)于M9最小鹽基質(zhì)中。
d細(xì)胞重懸浮于M9最小鹽基質(zhì)中之后，加入間苯三酚(50mg/L)。
接著進(jìn)一步分析了E.coli中phlACBDE基因的T7啟動(dòng)子的外源表達(dá)(表1條目3～8)。所有的E.coli構(gòu)建體也攜帶插入了編碼T7RNA聚合酶的染色體基因1。攜帶質(zhì)粒phlACBDE插入物的E.coli BL21(DE3)/pJA3.085合成間苯三酚和2-乙?；g苯三酚，而不合成2，4-二乙?；g苯三酚(表1條目3)。E.coli BL21(DE3)/pJA3.156中phlE編碼的產(chǎn)物輸出體的缺乏對生物合成的間苯三酚1a和2-乙酰基間苯三酚2的濃度并沒有不利的影響(表1條目4)。然后用E.coli BL21(DE3)/pJA2.042評價(jià)了伴隨著僅有phlD的異源表達(dá)的產(chǎn)物形成(表1條目5)。只觀察到了間苯三酚1a的形成。E.coliBL21(DE3)/pJA2.042生物合成的間苯三酚1a的濃度相對于E.coliBL21(DE3)/pJA3.156的間苯三酚1a的濃度的差別(項(xiàng)目4對項(xiàng)目5，表1)很可能反映了phlD與T7啟動(dòng)子的接近度。用E.coli JWF1(DE3)/pJA3.131A檢測分析了控制發(fā)酵罐的條件下在最小鹽基質(zhì)中從葡萄糖開始的間苯三酚的合成(表1條目6)。
為進(jìn)一步研究PhlD在間苯三酚生物合成中的功能，PhlD被純化至同質(zhì)性并分析了其體外酶學(xué)性質(zhì)。當(dāng)乙酰輔酶A單獨(dú)用作底物時(shí)，沒有觀察到活性(表1)。丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A一起與PhlD孵育的情況與僅用丙二酸單酰輔酶A與PhlD一起孵育的情況相比，觀察到了大約相等的比活度。測定了PhlD對于丙二酸單酰輔酶A的Km＝37μM，并且kcat＝4.7min-1。作為比較，，像PhlD一樣使用激活的3，5-二酮己酸鹽2(圖解1)的2-吡喃酮合成酶，被純化至均質(zhì)。2-吡喃酮合成酶不能利用乙酰輔酶A作為底物。然而，將2-吡喃酮合成酶與丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A一起孵育產(chǎn)生的比活度是沒有乙酰輔酶A時(shí)與丙二酸單酰輔酶A共孵育時(shí)的比活的兩倍。2-吡喃酮合成酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括對丙二酸單酰輔酶A的Km＝XXμM，對乙酰輔酶A的Km＝2.2μM，并且kcat＝3.3min-1。
通過PhlACBDE和PhlD的異源表達(dá)形成的產(chǎn)物提高了激活的3，5-二酮己酸鹽2(圖解1)的環(huán)化可能性，并且后來的間苯三酚1a的逐步乙?；赡苁巧锖铣?-乙?；g苯三酚6和2，4-二乙?；g苯三酚7的基礎(chǔ)。為進(jìn)一步研究這種可能性，帶有質(zhì)粒-定位的phlACB的E.coli BL21(DE3)/pJA3.169被構(gòu)建。M.G.Bangera & L.S.Thomashow，J Bacteriol.1813155(1999)。通過這種缺乏質(zhì)粒-定位的phlD的構(gòu)建體的培養(yǎng)(表1條目7)沒有間苯三酚被合成。然而，向E.coli BL21(DE3)/pJA3.169培養(yǎng)基中加入間苯三酚1a確實(shí)導(dǎo)致了2-乙?；g苯三酚6和小量的2，4-二乙?；g苯三酚7的形成(項(xiàng)目8，表1)。
PhlD在建立間苯三酚的新合成的草案中也特別重要，現(xiàn)在間苯三酚是通過包括用Na2Cr2O7氧化的途徑自2，4，6-三硝基甲苯8合成(圖解2，即圖2)。G.Leston，In Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，Vol.19，p 778(J.I.Kroschwitz&M.Howe-Grant，eds.)(第4版，1996)(WileyNewYork)。除了爆炸的危險(xiǎn)外，在從2，4，6-三硝基甲苯8開始的間苯三酚1a的合成過程中產(chǎn)生了造成環(huán)境問題的鉻酸鹽廢液。最近，一個(gè)替代的合成間苯三酚1a的途徑(圖解2)已經(jīng)被闡明，該途徑包括三乙酸內(nèi)酯3a的微生物催化合成。W.Zha et al.，J.Am.Chem.Soc.1264534(2004)。需要多個(gè)化學(xué)步驟將三乙酸內(nèi)酯3a轉(zhuǎn)化為間苯三酚1a需要。C.A.Hansen & J.W.Frost，J.Am.Chem.Soc.1245926(2002)。與這些化學(xué)和化學(xué)酶合成間苯三酚的途徑形成對比，E.coli中的PhlD的異源表達(dá)可由葡萄糖以一個(gè)的微生物催化步驟制得間苯三酚1a(圖解2)。
現(xiàn)在間苯二酚9合成的替代方案也成為可能。間苯二酚目前通過1，3-苯基二磺酸10的與堿熔融或1，3-二異丙苯11的氫過氧化作用來制造(圖解2)。堿熔融法需要高溫，并產(chǎn)生大量鹽廢液。氫過氧化作用過程中產(chǎn)生的丙酮?dú)溥^氧化物有爆炸危險(xiǎn)。參見L.Krumenacker et al.，In Kirk-OthmerEncyclopedia of Chemical Technology，Vol.13，p 996(J.I.Kroschwitz & M.Howe-Grant，eds.)(第4版，1996)(WileyNew York)。此外，1，3-苯二磺酸10和1，3-二異丙苯11都從石油衍生的致癌的苯制得(圖解2)。合成間苯二酚9的新途徑是在間苯三酚1a的微生物合成的基礎(chǔ)上的，接著在銠催化下該中間體的氫化作用(圖解2)。C.A.Hansen&J.W.Frost，J.Am.Chem.Soc.1245926(2002)。既然間苯三酚1a現(xiàn)在可以從葡萄糖合成，間苯二酚和兒茶酚與對苯二酚一起成為應(yīng)該從無毒的、植物來源的葡萄糖合成的二羥基芳香化合物(圖解2)。分別參見K.D.Draths & J.W.Frost，J.Am.Chem.Soc.1172395(1995)；和N.Ran et al.，J.Am.Chem.Soc.12310927(2001)。
實(shí)施例2.E.coli中PhlD的表達(dá)和所導(dǎo)致的間苯三酚的合成質(zhì)粒pJA3.131(KanR，lacIQ，PT7-phlD，serA)被染色體地轉(zhuǎn)染到serA-E.coli菌株BL21(DE3)，W3110(DE3)，和JWF1(DE3)[也就是，RB791serA-(DE3)]，和菌株KL3(DE3)中[也就是AB2834(serA::aroB)](E.coli菌株RB791和AB2834可以從美國康奈提格州New Haven的the E.coli GeneticStock Center得到)。所有的DE3菌株通過將λDE3原噬菌體整合到細(xì)胞染色體中得到。
細(xì)胞培養(yǎng)于流加式模式的礦物鹽和有限的葡萄糖中。雖然所有轉(zhuǎn)化的菌株都表達(dá)豐富含量的間苯三酚，但是BL21和W3110菌株分別產(chǎn)生3.0和3.1g/L間苯三酚的較高滴度；并且，相對于供給到培養(yǎng)物中的葡萄糖的量，這些菌株產(chǎn)生每100摩爾葡萄糖4.4和3.1mol間苯三酚(％mol/mol)的較高的間苯三酚產(chǎn)率。
這些試驗(yàn)也比較了同樣用phlD在Ptac或PT5的控制下的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21菌株中的間苯三酚表達(dá)水平；發(fā)現(xiàn)PT7提供較高的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)。在這些試驗(yàn)中間苯三酚累聚到靜止期(或保持期)中所用菌株均停止增加。對BL21和W3110來說，最高的間苯三酚濃度分別出現(xiàn)在誘導(dǎo)起始也就是第一次加入IPTG后大約6小時(shí)和大約12小時(shí)。也觀察到了終產(chǎn)物抑制。進(jìn)一步的試驗(yàn)說明濃度在大于等于約2g/L時(shí)，間苯三酚成為抑制的原因(數(shù)據(jù)未給出)。
實(shí)施例3.萃取的間苯三酚發(fā)酵陰離子交換樹脂柱類萃取發(fā)酵被用于移除間苯三酚來減少或消除其細(xì)胞毒性和發(fā)酵過程中的間苯三酚合成抑制。振蕩箱反應(yīng)器配備有引入陰離子交換柱并回到振蕩箱的管道；該管道配備有蠕動(dòng)泵來使基質(zhì)循環(huán)通過該柱。裝有80mL(柱床體積)AG1-X8樹脂的Bio-Rad Econo柱(25×200mm)用15個(gè)柱床體積的KH2PO4(0.8M)洗，以在原位萃取前把叔銨鹽轉(zhuǎn)變成磷酸鹽形式。每次發(fā)酵用總共3到5個(gè)柱；每個(gè)柱在被更換為另一個(gè)柱之前使用約6～12小時(shí)，以保持培養(yǎng)基中的間苯三酚濃度低于約1.5g/L。所有的柱都以流化床模式運(yùn)轉(zhuǎn)，并且其循環(huán)流速是約8～12mL/min。
為了回收吸附到AG1-X8樹脂上的間苯三酚，用10柱床體積的蒸餾去離子水以流化床模式洗該柱以去除殘余的細(xì)胞；這也從該樹脂中回收了約15％的間苯三酚在水溶液中。然后，用15柱床體積的酸化的乙醇(乙酸，10％(v/v)；乙醇，75％(v/v)；水，15％(v/v))以固定床模式?jīng)_洗該柱以將殘留于樹脂中的間苯三酚回收到酸化乙醇溶液中。在間苯三酚回收后，該柱可以通過進(jìn)一步分別用15柱床體積的KH2PO4(0.8M)、2柱床體積的乙醇(70％)和5柱床體積的無菌蒸餾去離子水沖洗來再生。
為純化回收的間苯三酚，所得水溶液中的細(xì)胞通過離心去除；然后該溶液被濃縮到約原始體積的1/10。個(gè)別地，酸化乙醇溶液被濃縮至干燥。剩余物用上述濃縮的水溶液再溶解。然后得到的水相用相等體積的乙酸乙酯萃取三次。合并有機(jī)相，并在MgSO4上干燥，然后與硅凝膠混合，濃縮至干燥，并轉(zhuǎn)載到閃蒸塔上。通過用己烷∶醋酸酯(1∶1)漂洗，將間苯三酚與其它褐色雜質(zhì)分開，并用TCL鑒定。然后含有間苯三酚的組分被濃縮至干燥，并在高真空條件下干燥，得到間苯三酚灰白色晶體。
實(shí)施例4.間苯三酚發(fā)酵的最優(yōu)化多種雙溫度發(fā)酵曲線用于上述的轉(zhuǎn)化的W3110菌株的萃取和非萃取發(fā)酵中。葡萄糖通過pO2串級控制被穩(wěn)定地供應(yīng)，并且消耗的CO2量被維持在穩(wěn)定水平，直到發(fā)酵的終點(diǎn)。在這兩種類型的發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中降低的起始36℃溫度顯著提高了間苯三酚的滴度和產(chǎn)率，在萃取發(fā)酵中所得的滴度和產(chǎn)率更高。分別的發(fā)酵在12小時(shí)(第一次用IPTG誘導(dǎo)的時(shí)間)、15小時(shí)(保持期的開始)或30小時(shí)將溫度轉(zhuǎn)換到30℃。溫度轉(zhuǎn)變發(fā)生在15小時(shí)時(shí)得到了較好的結(jié)果，并且該萃取發(fā)酵進(jìn)行了一共60小時(shí)。在這些條件下，W3110serA-(DE3)/pJA3.131A以11％(mol/mol)的產(chǎn)率合成15g/L的間苯三酚。與非萃取發(fā)酵相比，萃取發(fā)酵能提供貫穿發(fā)酵過程的不減少的間苯三酚產(chǎn)量、穩(wěn)定的PhlD特異活性、保持的細(xì)胞存活力和更長的最大發(fā)酵時(shí)間。
在同樣的萃取發(fā)酵條件下，同樣的發(fā)酵曲線也被用于檢驗(yàn)上述的BL21serA-(DE3)/pJA3.131A菌株的間苯三酚的生產(chǎn)。得到了與W3110發(fā)酵相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。另一個(gè)雙溫度曲線，其中在15小時(shí)時(shí)起始的36℃溫度被轉(zhuǎn)變?yōu)?3℃，發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提高了從BL21合成間苯三酚的回收率，得到了17.3g/L的滴度和12.3％(mol/mol)的產(chǎn)率。
另外，重組phlD在酵母、S.cerevisiae中的表達(dá)也獲得成功，雖然在試驗(yàn)的條件下產(chǎn)率是0.5到約1.5mg/L(數(shù)據(jù)未給出)。
在對本發(fā)明的組合物和方法的全部范圍的描述中，在此描述的這些實(shí)施例和其它實(shí)施方式是例示性的而不是限制性的。具有基本相似的結(jié)果的具體實(shí)施方式
、材料、組合物和方法的等同替換、改變和變化可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行。
序 列 表<110>Michigan State UniversityFrost，John W.
<120>間苯三酚的生物合成和由其制備1，-二羥基苯<130>6550-000110POA<150>US 60/618,024<151>2004-10-12<150>US 60/617,959<151>2004-10-12<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1050<212>DNA<213>Pseudomonas fluorescens Pf-5<220>
<221>CDS<222>(1)..(1050)<223>間苯三酚合成酶ORF<400>1atg tct aca ctt tgc ctt cca cac gtc atg ttt ccg caa cac aag atc 48Met Ser Thr Leu Cys Leu Pro His Val Met Phe Pro Gln His Lys Ile1 5 10 15acc cag caa cag atg gtc gat cac ctg gaa aac ctg cac gcc gac cat 96Thr Gln Gln Gln Met Val Asp His Leu Glu Asn Leu His Ala Asp His20 25 30cea cgc atg gcc ctg gcc aag cgc atg atc gcc aac acc gaa gtc aac144Pro Arg Met Ala Leu Ala Lys Arg Met Ile Ala Asn Thr Glu Val Asn35 40 45gag cgc cac ctg gtg ttg ccg atc gac gaa ctg gca gtg cac acc ggt192Glu Arg His Leu Val Leu Pro Ile Asp Glu Leu Ala Val His Thr Gly50 55 60ttc acc cac cgc agc atc gtc tac gag cgt gaa gcc cgg cag atg tcg240Phe Thr His Arg Ser Ile Val Tyr Glu Arg Glu Ala Arg Gln Met Ser65 70 75 80
tcg gcc gcg gcg cgc cag gcc atc gag aat gcc ggg ctg cag atc agc288Ser Ala Ala Ala Arg Gln Ala Ile Glu Asn Ala Gly Leu Gln Ile Ser85 90 95gac att cgc atg gtg atc gtc act tcc tgc acc ggc ttc atg atg ccg336Asp Ile Arg Met Val Ile Val Thr Ser Cys Thr Gly Phe Met Met Pro100 105 110tcg ctg acc gcg cac ctg atc aac gac ctg gcc ctg cca acc tcc acc384Ser Leu Thr Ala His Leu Ile Asn Asp Leu Ala Leu Pro Thr Ser Thr115 120 125gtg cag ttg ccg atc gcc cag ctg ggc tgc gtg gcc ggt gcc gcg gcc432Val Gln Leu Pro Ile Ala Gln Leu Gly Cys Val Ala Gly Ala Ala Ala130 135 140atc aac cgc gcc aac gac ttc gcc cgg ctc gat gcc cgc aac cac gta480Ile Asn Arg Ala Asn Asp Phe Ala Arg Leu Asp Ala Arg Asn His Val145 150 155 160ctg atc gtg tcc ctg gaa ttc tcc tcg ctg tgc tac cag ccg gac gac528Leu Ile Val Ser Leu Glu Phe Ser Ser Leu Cys Tyr Gln Pro Asp Asp165 170 175acc aag ctg cac gcc ttc atc tcc gcg gcg ctg ttc ggc gat gcg gta576Thr Lys Leu His Ala Phe Ile Ser Ala Ala Leu Phe Gly Asp Ala Val180 185 190tcc gcc tgc gtg ctg cgc gcc gat gac cag gcc ggc ggc ttc aag atc624Ser Ala Cys Val Leu Arg Ala Asp Asp Gln Ala Gly Gly Phe Lys Ile195 200 205aag aag acc gag tcg tac ttc ctg ccc aag agc gag cac tac atc aag672Lys Lys Thr Glu Ser Tyr Phe Leu Pro Lys Ser Glu His Tyr Ile Lys210 215 220tac gac gtg aag gac acc ggc ttt cac ttc acc ctc gac aag gcg gtg720Tyr Asp Val Lys Asp Thr Gly Phe His Phe Thr Leu Asp Lys Ala Val225 230 235 240atg aac tcc atc aag gac gtg gca ccg gtc atg gag cgg ctc aac tac768Met Asn Ser Ile Lys Asp Val Ala Pro Val Met Glu Arg Leu Asn Tyr245 250 255gag agc ttc gaa cag aac tgt gcg cac aac gac ttc ttc atc ttc cac816Glu Ser Phe Glu Gln Asn Cys Ala His Asn Asp Phe Phe Ile Phe His260 265 270acc ggt ggt cgc aag atc ctc gac gag ctg gtg atg cac ctg gac ctg864Thr Gly Gly Arg Lys Ile Leu Asp Glu Leu Val Met His Leu Asp Leu275 280 285
gca tcc aac cgg gtc tcg caa tcg cgc agc agc ctg tcg gaa gcc ggc 912Ala Ser Asn Arg Val Ser Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ala Gly290 295 300aac att gcc agc gtg gtg gtg ttc gac gta ctc aag cgg cag ttc gat 960Asn Ile Ala Ser Val Val Val Phe Asp Val Leu Lys Arg Gln Phe Asp305 310 315 320tcc aac ctc aat cgc ggc gac atc ggc ctg ctg gca gcc ttc ggc ccg1008Ser Asn Leu Asn Arg Gly Asp Ile Gly Leu Leu Ala Ala Phe Gly Pro325 330 335ggg ttc acc gcg gaa atg gcg gtg ggc gag tgg acc gcc tga1050Gly Phe Thr Ala Glu Met Ala Val Gly Glu Trp Thr Ala340 345<210>2<211>349<212>PRT<213>Pseudomonas fluorescens Pf-5<400>2Met Ser Thr Leu Cys Leu Pro His Val Met Phe Pro Gln His Lys Ile1 5 10 15Thr Gln Gln Gln Met Val Asp His Leu Glu Asn Leu His Ala Asp His20 25 30Pro Arg Met Ala Leu Ala Lys Arg Met Ile Ala Asn Thr Glu Val Asn35 40 45Glu Arg His Leu Val Leu Pro Ile Asp Glu Leu Ala Val His Thr Gly50 55 60Phe Thr His Arg Ser Ile Val Tyr Glu Arg Glu Ala Arg Gln Met Ser65 70 75 80Ser Ala Ala Ala Arg Gln Ala Ile Glu Asn Ala Gly Leu Gln Ile Ser85 90 95Asp Ile Arg Met Val Ile Val Thr Ser Cys Thr Gly Phe Met Met Pro100 105 110
Ser Leu Thr Ala His Leu Ile Asn Asp Leu Ala Leu Pro Thr Ser Thr115 120 125Val Gln Leu Pro Ile Ala Gln Leu Gly Cys Val Ala Gly Ala Ala Ala130 135 140Ile Asn Arg Ala Asn Asp Phe Ala Arg Leu Asp Ala Arg Asn His Val145 150 155 160Leu Ile Val Ser Leu Glu Phe Ser Ser Leu Cys Tyr Gln Pro Asp Asp165 170 175Thr Lys Leu His Ala Phe Ile Ser Ala Ala Leu Phe Gly Asp Ala Val180 185 190Ser Ala Cys Val Leu Arg Ala Asp Asp Gln Ala Gly Gly Phe Lys Ile195 200 205Lys Lys Thr Glu Ser Tyr Phe Leu Pro Lys Ser Glu His Tyr Ile Lys210 215 220Tyr Asp Val Lys Asp Thr Gly Phe His Phe Thr Leu Asp Lys Ala Val225 230 235 240Met Asn Ser Ile Lys Asp Val Ala Pro Val Met Glu Arg Leu Asn Tyr245 250 255Glu Ser Phe Glu Gln Asn Cys Ala His Asn Asp Phe Phe Ile Phe His260 265 270Thr Gly Gly Arg Lys Ile Leu Asp Glu Leu Val Met His Leu Asp Leu275 280 285Ala Ser Asn Arg Val Ser Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ala Gly290 295 300Asn Ile Ala Ser Val Val Val Phe Asp Val Leu Lys Arg Gln Phe Asp305 310 315 320
Ser Asn Leu Asn Arg Gly Asp Ile Gly Leu Leu Ala Ala Phe Gly Pro325 330 335Gly Phe Thr Ala Glu Met Ala Val Gly Glu Trp Thr Ala340 34權(quán)利要求
1.一種分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)；或者是PhlD+重組細(xì)胞，所述PhlD+重組細(xì)胞PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)；或者是已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，其中所述酶系統(tǒng)和重組細(xì)胞能夠?qū)⒈釂熙］o酶A轉(zhuǎn)化為間苯三酚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶系統(tǒng)或細(xì)胞，其中所述酶系統(tǒng)或細(xì)胞是PhlA-，PhlB-和PhlC-。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)進(jìn)一步包含至少一種合成丙二酸單酰輔酶A的酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶系統(tǒng)，其中所述合成丙二酸單酰輔酶A的酶是丙二酸單酰輔酶A合成酶、丙二酸單酰輔酶A脫羧酶和乙酰輔酶A羧化酶中的任意一個(gè)。
5.一種生產(chǎn)合成代謝的間苯三酚的方法，包括下列步驟(A)提供(1)(a)分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(b)PhlD+重組細(xì)胞，所述PhlD+重組細(xì)胞是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(c)已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD的表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞能夠?qū)⑻荚崔D(zhuǎn)化為間苯三酚；和(2)丙二酸單酰輔酶A或其它碳源中的至少一種，其中所述其它碳源能夠被所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A；和(B)接觸(1)丙二酸單酰輔酶A和所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞，在能由其合成間苯三酚的反應(yīng)條件下，或(2)所述其它碳源和所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞，在能將所述碳源轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A并由其合成間苯三酚的反應(yīng)條件下；從而得到合成代謝的間苯三酚。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述酶系統(tǒng)(1)(a)或細(xì)胞(1)(b)是PhlA-，PhlB-和PhlC-。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞包括合成丙二酸單酰輔酶A的酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述合成丙二酸單酰輔酶A的酶是丙二酸單酰輔酶A合成酶、丙二酸單酰輔酶A脫羧酶或乙酰輔酶A羧化酶中的任意一個(gè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法制備的間苯三酚。
10.一種分離的或重組的合成間苯三酚的酶，所述酶能夠?qū)⒈釂熙］o酶A轉(zhuǎn)化為間苯三酚。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的酶，其中所述酶包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的酶，其中所述酶包含與SEQ ID NO2有至少70％同源性的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的酶，其中所述酶包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的保守取代變體。
14.一種分離的或重組核苷酸，所述核苷酸包含至少一個(gè)編碼PhlD酶的開放閱讀框，并且是phlA-，phlB-或phlC-中的至少一個(gè)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核苷酸，其中所述核苷酸進(jìn)一步包含至少一個(gè)編碼合成丙二酸單酰輔酶A的酶的開放閱讀框。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核苷酸，其中所述核苷酸包含SEQ ID NO1的堿基序列、與之相應(yīng)的RNA堿基序列、或隨其冗余的密碼子序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核苷酸，其中所述核苷酸包含與SEQ ID NO1至少80％同源的堿基序列。
18.一種phlD+重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)用根據(jù)權(quán)利要求14所述的核苷酸轉(zhuǎn)化，所述細(xì)胞可以通過所述核苷酸表達(dá)間苯三酚合成酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述phlD+重組細(xì)胞是phlA-，phlB-或phlC-中的至少一種。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述phlD+重組細(xì)胞是phlA-，phlB-和phlC-。
21.一種制備間苯二酚的方法，包括(A)提供(1)通過(a)分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(b)PhlD+重組細(xì)胞，所述PhlD+重組細(xì)胞是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(c)已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD的表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，來生物合成的合成代謝的間苯三酚；和(2)氫以及銠催化劑；和(B)在所述間苯三酚被氫化形成間苯二酚的條件下，將所述間苯三酚與所述氫和所述銠催化劑接觸，從而制備間苯二酚。
22.合成代謝的間苯三酚，或由其制備的間苯二酚，在藥物生產(chǎn)、化妝品、染料、聚合物樹脂、橡膠、粘合劑、密封劑、涂料、復(fù)合材料、或?qū)訅旱幕蚪Y(jié)合的材料中的應(yīng)用，其中所述合成代謝的間苯三酚是通過(a)分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(b)PhlD+重組細(xì)胞，所述PhlD+重組細(xì)胞是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(c)已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD的表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，來生物合成的。
23.一種含有合成代謝的間苯三酚或由其制備的間苯二酚，或由合成代謝的間苯三酚或由其制備的間苯二酚的化學(xué)修飾得到的藥物、化妝品、染料、聚合物樹脂、橡膠、粘合劑、密封劑、涂料、復(fù)合材料、或?qū)訅旱幕蚪Y(jié)合的材料的組合物，其中所述的合成代謝的間苯三酚是通過(a)分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(b)PhlD+重組細(xì)胞，所述是PhlD+重組細(xì)胞PhlA-、PhlB-或PhlC-中至少一個(gè)的，或(c)已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，來生物合成的，所述組合物用于或用作藥物、化妝品、染料、聚合物樹脂、橡膠、粘合劑、密封劑、涂料、復(fù)合材料、或?qū)訅旱幕蚪Y(jié)合的材料。
24.一種能夠從丙二酸單酰輔酶A生物合成間苯三酚的重組細(xì)胞的制備方法，包括(A)通過下列步驟用編碼PhlD的核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞(1)提供分離的或重組的核苷酸，所述核苷酸是phlA-，phlB-或phlC-中的至少一個(gè)，并包含至少一個(gè)編碼PhlD酶的開放閱讀框，或同時(shí)包含至少一個(gè)編碼PhlD酶的開放閱讀框和至少一個(gè)編碼合成丙二酸單酰輔酶A的酶的開放閱讀框，(2)提供(a)能夠用所述核苷酸轉(zhuǎn)化的PhlD-細(xì)胞，并且所述PhlD-細(xì)胞是phlA-、phlB-或phlC-中的至少一個(gè)，所述核苷酸也具有所述phlA-，phlB-或phlC-特征，或(b)能夠用所述核苷酸轉(zhuǎn)化的PhlD+細(xì)胞；和(3)在所述細(xì)胞能夠用所述核苷酸轉(zhuǎn)化的條件下，使所述細(xì)胞與所述核苷酸接觸，所述核苷酸能夠被所述細(xì)胞表達(dá)，從而得到重組的細(xì)胞；或(B)通過以下步驟減活phlD+細(xì)胞中的基因，(1)提供phlD+細(xì)胞，所述phlD+細(xì)胞是phlA+、phlB+或phlC+中的至少一個(gè)；并且(2)滅活其中所述phlA、phlB或phlC基因中的至少一個(gè)，從而得到重組的細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述重組細(xì)胞是phlA-、phlB-和phlC-。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是微生物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是酵母菌、真菌或細(xì)菌。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是細(xì)菌。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是埃希氏菌屬Escherichia或假單胞菌屬Pseudomonas中任意一個(gè)的成員。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是大腸埃希氏菌E.coli或熒光假單細(xì)胞P.fluorescens中的任意一個(gè)。
31.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述碳源是簡單碳源。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述碳源包括糖類、脂肪族多羥基化合物或其組合。
33.根據(jù)權(quán)利要求3 1所述的方法，其中所述碳源包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油或其組合。
34.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中提供重組細(xì)胞，并且所述接觸步驟(B)包括在含有所述碳源的生長介質(zhì)中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述培養(yǎng)以萃取發(fā)酵方法來實(shí)施。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述培養(yǎng)采用用雙溫度曲線來進(jìn)行。
37.一種生產(chǎn)推進(jìn)劑或炸藥化合物的方法，包括(A)提供合成代謝的間苯三酚，所述間苯三酚是通過(1)分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(2)PhlD+重組細(xì)胞，所述PhlD+重組細(xì)胞是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(3)已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD的表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，而生物合成的；和(B)化學(xué)修飾所述合成代謝的間苯三酚，或化學(xué)修飾由所述間苯三酚制備的間苯二酚，來生產(chǎn)推進(jìn)劑或炸藥化合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述合成代謝的間苯三酚是通過包括下列步驟的方法而生物合成的(A)提供(1)(a)分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(b)PhlD+重組細(xì)胞，所述PhlD+重組細(xì)胞是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(c)已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD的表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞能夠?qū)⑻荚崔D(zhuǎn)化為間苯三酚；和(2)丙二酸單酰輔酶A或其它碳源中的至少一個(gè)，其中所述碳源能夠被所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A；和(B)接觸(1)所述丙二酸單酰輔酶A和所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞，在能由其合成間苯三酚的條件下，或(2)所述的其它碳源和所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞，在能將所述碳源轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A并由其合成間苯三酚的條件下；從而得到合成代謝的間苯三酚。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述酶系統(tǒng)或重組細(xì)胞包含合成丙二酸單酰輔酶A的酶。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中合成丙二酸單酰輔酶A的酶是丙二酸單酰輔酶A合成酶、丙二酸單酰輔酶A脫羧酶和乙酰輔酶A羧化酶中的任意一個(gè)。
41.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述PhlD+酶系統(tǒng)(A)(1)或重組細(xì)胞(A)(2)是PhlA-，PhlB-和PhlC-。
42.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中提供重組細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是phlD+重組細(xì)胞，所述phlD+重組細(xì)胞是phlA-，phlB-或phlC-中的至少一種。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述phlD+重組細(xì)胞是phlA-，phlB-和phlC。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是通過包括提供phlABCD+細(xì)胞，并滅活其中phlA、phlB或phlC基因中的至少一個(gè)的方法來產(chǎn)生的。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是通過包括提供phlABCD+細(xì)胞，并滅活其中所有phlA、phlB和phlC基因的方法來產(chǎn)生的。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是通過包括提供phlABCD-細(xì)胞，并在其中插入phlD基因的方法來產(chǎn)生的。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述phlD基因定位于所述細(xì)胞的基因組DNA中。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述phlD基因定位于所述細(xì)胞的基因組外的DNA中。
50.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是通過進(jìn)一步包括插入編碼合成丙二酸單酰輔酶A的酶的基因的方法來制備的，其中所述合成丙二酸單酰輔酶A的酶是丙二酸單酰輔酶A合成酶、丙二酸單酰輔酶A脫羧酶或乙酰輔酶A羧化酶中的任意一個(gè)。
51.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是微生物。
52.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是酵母菌、真菌或細(xì)菌。
53.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是細(xì)菌。
54.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是埃希氏菌屬Escherichia或假單細(xì)胞屬Pseudomonas中的任意一個(gè)的成員。
55.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述重組細(xì)胞是大腸埃希氏菌E.coli或熒光假單細(xì)胞P.fluorescens中的任意一個(gè)。
56.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述碳源是簡單碳源。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述碳源包括糖類、脂肪族多羥基化合物或其組合。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述碳源包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油或其組合。
59.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中提供重組細(xì)胞，并且所述接觸步驟(B)包括在含有所述碳源的生長介質(zhì)中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述培養(yǎng)以萃取發(fā)酵方法實(shí)施。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述培養(yǎng)采用雙溫度曲線來進(jìn)行。
62.合成代謝的間苯三酚或由其制備的間苯二酚在生產(chǎn)炸藥或推進(jìn)劑中的應(yīng)用，其中所述間苯三酚是通過(a)分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(b)PhlD+重組細(xì)胞，所述PhlD+重組細(xì)胞是PhlA-、PhlB-或PhlC-中的至少一個(gè)，或(c)已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD的表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，來生物合成的。
63.一種包括合成代謝的間苯三酚或由其合成的間苯二酚，或由合成代謝的間苯三酚或由其合成的間苯二酚的化學(xué)修飾得到的炸藥或推進(jìn)劑組合物，其中所述合成代謝的間苯三酚是通過(a)分離的或重組的PhlD+酶系統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)是PhlA-、PhlB-、或PhlC-中的至少一個(gè)，或(b)PhlD+重組細(xì)胞，所述PhlD+重組細(xì)胞是PhlA-、PhlB-、或PhlC-中的至少一個(gè)，或(c)已經(jīng)遺傳設(shè)計(jì)來提高其中PhlD的表達(dá)的PhlD+重組細(xì)胞，來生物合成的，并且所述組合物用作炸藥或推進(jìn)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了從丙二酸單酰輔酶A生物合成生產(chǎn)間苯三酚的方法、酶和細(xì)胞，其中丙二酸單酰輔酶A最終是從諸如葡萄糖的簡單起始材料得到；還提供了生物合成的間苯三酚的衍生物包括例如間苯二酚的生產(chǎn)方法。
文檔編號A61K31/05GK101084311SQ200580034761
公開日2007年12月5日 申請日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月12日
發(fā)明者約翰·W·佛羅斯特 申請人:密歇根州州立大學(xué)托管理事會