專利名稱：基于樹枝狀大分子的組合物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的治療和診斷用樹枝狀大分子(dendrimers)。特別地，本發(fā)明涉及基于樹枝狀大分子的用于疾病診斷和療法的多功能組合物和系統(例如癌癥診斷和療法)。這些組合物和系統包含一種或多種用于靶向、成像、傳感和/或提供治療或診斷物質并且監(jiān)測細胞或組織(例如腫瘤)對療法的反應的組分。
背景技術：
癌癥在美國是第二位的主要死亡原因，使得每4個死亡病例中就有1個癌癥。在1997年，據估計的新的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌和卵巢癌的診斷總數約為2百萬。由于在美國老齡化人群始終在增加，所以合理的預計是癌癥的發(fā)病率會持續(xù)增長。
目前使用各種方式治療癌癥，包括手術、放療和化療。治療方式的選擇取決于癌癥的類型、位置和散布。例如，許多常見的腫瘤，諸如結腸癌對可利用的療法難以起反應。
就對目前方法起反應的腫瘤類型而言，僅部分癌癥對療法的反應充分。此外，盡管對許多癌癥的療法得到改善，但是最新使用的活性劑存在嚴重的副作用。這些副作用通常限制了化療劑的應用并且導致大部分癌癥沒有任何治療選擇。其它類型的治療嘗試，諸如基因療法或免疫療法可以證實為更具有特異性的并且比化療的副作用少。然而，盡管在幾個臨床試驗中表現出了一定的進展，但是這些手段的實際應用在目前仍然有限。
盡管現存療法的成功有限，但是對腫瘤細胞的基礎生物學的理解已經得到發(fā)展。目前鑒定了涉及瘤性轉化的細胞性活動和改變的細胞生長并且已經記錄了幾種人體腫瘤的癌發(fā)生中的多個步驟(例如，參見Isaacs，Cancer 701810(1992))。已經鑒定了導致無法調節(jié)的細胞生長的癌基因并且將其表征為遺傳來源和功能。已經詳細表征了調節(jié)細胞復制周期的特異性途徑并且已經克隆和表征了這種調節(jié)中涉及的蛋白質。此外，已經詳細闡明了介導細胞凋亡反向調節(jié)細胞生長的分子(Kerr等，Cancer 732013(1994))。目前已經證實操縱這些細胞調節(jié)途徑能夠終止腫瘤細胞中生長并且誘導其中的細胞凋亡(例如，參見Cohen和Tohoku，Exp.Med.，168351(1992)；和Fujiwara等J.Natl.Cancer Inst.，86458(1994))?？刂颇[瘤細胞中的細胞生長和復制是重要的治療靶標。
盡管已經取得了令人注目的成就，但是在這些療法可以應用于體內治療癌細胞前，仍然存在許多阻礙。例如，這些療法需要鑒定個體特定腫瘤細胞的特異性病理生理學改變。這就要求對腫瘤的機械性侵害(活組織檢查)和一般通過體外細胞培養(yǎng)和測試進行診斷。然后在可以選擇和執(zhí)行療法前必須分析腫瘤表型。這類步驟是耗時、復雜和昂貴的。
對與正常細胞相比，對腫瘤細胞具有選擇性的治療方法存在需求。目前的療法僅對治療細胞具有相對特異性。盡管腫瘤靶向解決了這一選擇性問題，但是它仍然是不足的，因為腫瘤不具有獨特的抗原。此外，理想的是療法應具有平行起作用以防止選擇抗性腫瘤的幾種不同作用機制，并且在驗證腫瘤位置和類型后可以由臨床醫(yī)師解除。最后，理想的是，療法應能夠使臨床醫(yī)師在治療前后即刻鑒定殘留或最低程度的疾病，并且監(jiān)測對療法的反應。這是關鍵的，因為幾個殘留的細胞就可能導致再生長，或惡化，產生對療法產生抗性的腫瘤。鑒定療法結束時殘留的疾病(即非腫瘤再生長后)可以有利于根除少許剩余的腫瘤細胞。
因此，理想的療法應具有靶向腫瘤，使腫瘤的程度(即腫瘤轉移)成像和鑒定在腫瘤細胞中存在治療劑的能力。因此，需要使臨床醫(yī)師能夠基于腫瘤細胞中的病理生理學異常選擇治療分子的療法，以便在在異常細胞中激活治療劑，記錄對療法的反應，并且鑒定殘留的疾病。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的治療和診斷用樹枝狀大分子。特別地，本發(fā)明涉及基于樹枝狀大分子的用于疾病診斷和療法(例如癌癥診斷和療法)的多功能組合物和系統。這些組合物和系統包含一種或多種靶向、成像、傳感和/或提供治療或診斷物質并且監(jiān)測細胞或組織(例如腫瘤)對療法的反應的組分。
因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了包含樹枝狀大分子的組合物，所述的樹枝狀大分子包含部分乙酰化的第五代5(G5)樹枝狀大分子(例如聚酰胺型胺(polyamideamine)(PAMAM)、聚丙胺(POPAM)或PAMAM-POPAM樹枝狀大分子)，該樹枝狀大分子進一步包含一種或多種官能團。本發(fā)明并不限于G5樹枝狀大分子的應用。在某些實施方案中，一種或多種官能團包括治療劑、靶向劑和/或成像劑。在某些實施方案中，官能團中的至少一種通過酯鍵與樹枝狀大分子綴合。在優(yōu)選的實施方案中，治療劑包括化療化合物(例如甲氨蝶呤)。在某些優(yōu)選的實施方案中，化療化合物通過酯鍵與樹枝狀大分子綴合。在某些優(yōu)選的實施方案中，靶向劑包括葉酸。在其它優(yōu)選的實施方案中，成像劑包括異硫氰酸熒光素或其它可檢測標記。在某些實施方案中，官能團為治療劑、靶向劑或生物監(jiān)測劑之一。在某些實施方案中，G5樹枝狀大分子與官能團綴合。在某些實施方案中，綴合包含共價鍵、離子鍵、金屬鍵、氫鍵、范德瓦耳斯鍵、酯鍵或酰胺鍵。
在本發(fā)明的某些實施方案中，治療劑包括但不限于化療劑、抗-致腫瘤劑、抗血管化劑、腫瘤抑制劑、抗微生物劑或包含編碼治療蛋白的核酸的表達構建體，盡管本發(fā)明并不受限于治療劑的性質。在其它實施方案中，用選自對光不穩(wěn)定的保護基、對放射不穩(wěn)定的保護基和對酶不穩(wěn)定的保護基的保護基保護治療劑。在某些實施方案中，化療劑選自鉑復合物、維拉帕米、鬼臼毒素、卡鉑、丙卡巴肼、mechloroethamine、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亞硝基脲(nitrosurea)、阿霉素、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、博來霉素、普卡霉素(plicomycin)、絲裂霉素、博來霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、泰素、transplatinum、5-氟尿嘧啶、長春花新堿、長春堿和甲氨蝶呤組成的組，但不限于它們。在某些實施方案中，抗-致腫瘤劑包含反義核酸(例如RNA分子)。在某些實施方案中，反義核酸包含與癌基因的RNA互補的序列。在優(yōu)選的實施方案中，癌基因包括但不限于abl、Bcl-2、Bcl-xL、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf；ras、ret、src或trk。在某些實施方案中，編碼治療蛋白的核酸編碼因子，包括但不限于腫瘤抑制蛋白、細胞因子、受體、細胞凋亡誘導物和分化劑。在優(yōu)選的實施方案中，腫瘤抑制蛋白包括但不限于BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb和p27。在優(yōu)選的實施方案中，細胞因子包括但不限于GMCSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-干擾素、γ-干擾素和TNF。在優(yōu)選的實施方案中，受體包括但不限于CFTR、EGFR、雌激素受體、IL-2受體和VEGFR。在優(yōu)選的實施方案中，細胞凋亡誘導物包括但不限于AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakid和ICE-CED3蛋白酶。在某些實施方案中，治療劑包含短半衰期的放射性同位素。
本發(fā)明并不限于所用抗癌劑或化療劑的類型(例如與本發(fā)明的樹枝狀大分子綴合)。實際上，預期可用于本發(fā)明的各種抗癌劑和化療劑包括但不限于阿西維辛；阿柔比星；鹽酸阿考達唑；阿克羅寧；阿多來新；多柔比星；阿地白介素；阿利維A酸；別嘌醇鈉；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨魯米特；安吖啶；阿那曲唑；AnnonaceousAcetogenins；氨茴霉素；Asimicin；門冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴馬司他；苯佐替派；貝沙羅??；比卡魯胺；鹽酸比生群；二甲磺酸雙奈法德；比折來新；硫酸博來霉素；布喹那鈉；溴匹立明；Bullatacin；白消安；卡麥角林；放線菌素C；卡普睪酮；卡醋胺；卡醋胺；卡鉑；卡莫司??；鹽酸卡柔比星；卡折來新；Cedefingol；塞來考昔；苯丁酸氮芥；西羅霉素；順鉑；克拉屈濱；甲磺酸克立那托；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；達卡巴嗪；DACA(N-[2-(二甲基-氨基)乙基]吖啶-4-甲酰胺)；放線菌素D；鹽酸柔紅霉素；柔紅霉素；地西他濱；地尼白介素-毒素連接物；右奧馬鉑；地扎胍寧；甲磺酸地扎胍寧；地吖醌；多西他賽；多柔比星；鹽酸多柔比星；屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸甲雄烷酮；達佐霉素；依達曲沙；鹽酸依氟鳥氨酸；依沙蘆星；恩洛鉑；恩普氨酯；依匹哌啶；鹽酸表柔比星；厄布洛唑；鹽酸依索比星；雌莫司?。淮贫嫉媪姿徕c；依他硝唑；乙碘油I 131；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；鹽酸法羅唑啉；法扎拉濱；芬維A胺；氟脲嘧啶脫氧核苷；磷酸氟達拉濱；氟尿嘧啶；5-FdUMP；氟西他濱；磷喹酮；福司曲星鈉；FK-317；FK-973；FR-66979；FR-900482；吉西他濱；鹽酸吉西他濱(GeimcitabineHydrochloride)；吉姆單抗奧佐米星(Gemtuzumab Ozogamicin)；Gold Au 198；醋酸戈舍瑞林；Guanacone；羥基脲；鹽酸伊達比星；異環(huán)磷酰胺；伊莫福新；干擾素α-2a；干擾素α-2b；干擾素α-n1；干擾素α-n3；干擾素β-Ia；干擾素γ-Ib；異丙鉑；鹽酸依立替康；醋酸蘭瑞肽；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索鈉；洛莫司??；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚；美登素；鹽酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕酮；美法侖；美諾立爾；巰嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤鈉；甲氧沙林；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；Mitocarcin；絲裂紅素；米托潔林；米托馬星；絲裂霉素；絲裂霉素C；米托司培；米托坦；鹽酸米托蒽醌；麥考酚酸；諾考達唑；諾拉霉素；奧普瑞白介素；奧馬鉑；奧昔舒侖；紫杉醇；帕米膦酸二鈉；培門冬酶；培利霉素；溴新斯的明；硫酸培來霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；鹽酸吡羅蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆鈉；泊非霉素；潑尼莫司??；鹽酸甲基芐肼；嘌羅霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；美羅華；羅谷亞胺；Rolliniastatin；沙芬戈；鹽酸沙芬戈；釤/Lexidronam；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸鈉；司帕霉素；鹽酸螺旋鍺；螺莫司??；螺鉑；Squamocin；Squamotacin；鏈黑霉素；鏈佐星；氯化鍶Sr 89；磺氯苯脲；他利霉素；紫杉烷(Taxane)；紫杉烷(Taxoid)；替可加蘭鈉；替加氟；鹽酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替羅昔隆；睪內酪；硫咪嘌呤；硫鳥嘌呤；塞替派；Thymitaq；噻唑呋林；替拉扎明；雷替曲噻；TOP-53；鹽酸拓撲替康；枸櫞酸托瑞米芬；曲妥單抗；醋酸7-甲諾酮；磷酸曲西立濱；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；鹽酸妥布氯唑；烏拉莫司??；烏瑞替派；戊柔比星；伐普肽；維替泊芬；長春堿；硫酸長春堿；長春新堿；硫酸長春新堿；長春地辛；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定；硫酸長春甘酯；硫酸環(huán)氧長春堿；酒石酸長春瑞濱；硫酸異長春堿；硫酸長春利定；伏氯唑；折尼鉑；凈司他??；鹽酸佐柔比星；2-氯脫氧腺苷；2′-脫氧間型霉素；9-氨基喜樹堿；雷替曲塞；N-炔丙基-5，8-二脫氮雜葉酸(dideazafolic ac d)；2-氯-2′-阿拉伯糖(arabino)-氟-2′-脫氧腺苷；2-氯-2′-脫氧腺苷；茴香霉素；曲古抑菌素A；hPRL-G129R；CEP-751；利諾胺；芥子氣；氮芥(nitrogen mustard)(氮芥(mechlorethamine))；環(huán)磷酰胺；美法侖；苯丁酸氮芥；異環(huán)磷酰胺；白消安；N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)；N，N′-雙(2-氯乙基)-N-亞硝基脲(BCNU)；N-(2-氯乙基)-N′-環(huán)己基-N-亞硝基脲(CCNU)；N-(2-氯乙基)-N′-(反式-4-甲基環(huán)己基-N-亞硝基脲(MeCCNU)；N-(2-氯乙基)-N′-(二乙基)乙基膦酸-N-亞硝基脲(福莫司汀)；鏈脲菌素；達卡巴嗪(diacarbazine)(DTIC)；米托唑胺；替莫唑胺；塞替派；絲裂霉素C；AZQ；阿多來新；順鉑；卡鉑；奧馬鉑；奧沙利鉑；C1-973；DWA 2114R；JM216；JM335；雙(鉑)；拓優(yōu)得；阿扎胞苷；阿糖胞苷；吉西他濱；6-巰嘌呤；6-硫鳥嘌呤；次黃嘌呤；替尼泊苷；9-氨基喜樹堿；托泊替康；CPT-11；多柔比星；柔紅霉素；表柔比星；依達比星；米托蒽醌；洛索蒽醌；放線菌素D(Dactinomycin)(放線菌素D(Actinomycin D))；安吖啶；吡唑啉吖啶；全反式視黃醇；14-羥基-反視黃醇；全反式維甲酸；N-(4-羥苯基)retinamide；13-順式維A酸；3-甲基TTNEB；9-順式維A酸；氟達拉濱(2-F-ara-AMP)；和2-氯脫氧腺苷(2-Cda)。
其它抗癌劑和化療劑包括抗增殖藥(例如異硫代硫酸吡曲克辛)、抗前列腺肥大藥(例如西托糖苷)、良性前列腺增治療劑(例如鹽酸坦洛新)、前列腺生長抑制劑(例如噴托孟)和放射性試劑。
其它抗癌劑和化療劑可以包含抗癌補充強化劑，包括三環(huán)抗抑郁藥(例如丙米嗪、地昔帕明、阿米替林、氯米帕明、曲米帕明、多塞平、去甲替林、普羅替林、阿莫沙平和馬普替林)；非-三環(huán)抗抑郁藥(例如舍曲林、曲唑酮和西酞普蘭)；Ca++拮抗劑(例如維拉帕米、硝苯地平、尼群地平和卡羅維林)；鈣調素抑制劑(例如普尼拉明、三氟拉嗪和氯米帕明)；兩性霉素B；曲帕拉醇類似物(例如他莫昔芬)；抗心律失常藥(例如奎尼丁)；抗高血壓藥(例如利舍平)；thiol depleters(例如buthionine和sulfoximine)和多重抗藥性緩解劑，諸如CremaphorEL。
其它抗癌劑和化療劑為那些選自下列組成的組的抗癌劑和化療劑annonaceous acetogenins；asimicin；rolliniastatin；guanacone、squamocin、bullatacin；squamotacin；紫杉烷類；紫杉醇；吉西他濱；甲氨蝶呤FR-900482；FK-973；FR-66979；FK-317；5-FU；FUDR；FdUMP；羥基脲；多西他賽；discodermolide；埃坡霉素；長春新堿；長春堿；長春瑞濱；meta-pac；伊立替康；SN-38；10-OHcampto；托泊替康；依托泊苷；多柔比星；flavopiridol；Cis-Pt；carbo-Pt；博來霉素；絲裂霉素C；普卡霉素；卡培他濱；阿糖胞苷；2-C1-2′脫氧腺苷；氟達拉濱-PO.sub.4；米托蒽醌；米托唑胺；噴司他丁；和雷替曲塞。
其它抗癌劑和化療劑包含紫杉烷類(例如紫杉醇和多西他賽)。在某些實施方案中，抗癌劑和化療劑包含他莫昔芬或芳香酶抑制劑瑞寧得(例如阿那曲唑)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，生物監(jiān)測劑包含測定治療劑作用的試劑(例如直接或間接測定細胞因子或治療劑誘導的反應)，然而，本發(fā)明并不受限于生物監(jiān)測劑的性質。在某些實施方案中，所述的監(jiān)測劑能夠測定治療劑的量或檢測由治療劑引起的細胞凋亡。
在本發(fā)明的某些實施方案中，成像劑包含放射性標記，包括但不限于14C、36Cl、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、75Se、Tc-99m和175Yb。在某些實施方案中，成像劑包含熒光本體。在一個優(yōu)選的實施方案中，成像劑為異硫氰酸熒光素或6-TAMARA。
在本發(fā)明的某些實施方案中，靶向劑包括但不限于抗體、受體配體、激素、維生素和抗原，不過，本發(fā)明并不受限于靶向劑的性質。在某些實施方案中，抗體對疾病特異性抗原具有特異性。在某些優(yōu)選的實施方案中，疾病特異性抗原包含腫瘤特異性抗原。在某些實施方案中，受體配體包括但不限于CFTR、FGFR、雌激素受體、FGR2、葉酸受體、IL-2受體、糖蛋白和VEGFR的配體。在一個優(yōu)選的實施方案中，受體配體為葉酸。可用于本發(fā)明的其它實施方案描述在美國專利US6,471,968和WO 01/87348中，將這些文獻各自完整地引入本文作為參考。
在某些實施方案中，本發(fā)明的樹枝狀大分子(例如G5PAMAM樹枝狀大分子)含有表面上的2-250，10-200或100-150個反應位置(例如參見實施例13)。在優(yōu)選的實施方案中，反應位置包含伯胺基。在某些實施方案中，樹枝狀大分子含有50-250個反應位置。在某些實施方案中，樹枝狀大分子包含150-400個反應位置。在優(yōu)選的實施方案中，反應位置與官能團綴合，所述的官能團包括但不限于治療劑(例如甲氨蝶呤)、靶向劑(例如葉酸)、成像劑(例如FITC)和生物監(jiān)測劑。
在某些實施方案中，在單一樹枝狀大分子上可以形成多個拷貝的官能團中的任意一種(例如治療劑)。因此，在某些實施方案中，單一樹枝狀大分子包含2-100個拷貝的單一官能團(例如治療劑，諸如甲氨蝶呤)。在某些實施方案中，樹枝狀大分子包含2-5，5-10，10-20或20-50個拷貝的單一官能團。在某些實施方案中，樹枝狀大分子包含5-20個拷貝。在某些實施方案中，樹枝狀大分子包含50-100或100-200個拷貝的官能團(例如治療劑、靶向劑或成像劑)。在某些實施方案中，樹枝狀大分子包含200個以上拷貝的官能團。本發(fā)明進一步提供了包含兩種或多種不同官能團的多個拷貝的樹枝狀大分子。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了包含一種類型的官能團(例如治療劑，諸如甲氨蝶呤，或本文所討論的其它靶向劑中的任意一種)的多個拷貝(例如2-10，5-10，10-15，15-50，50-100，100-200或200個以上拷貝)和第二中類型的官能團(例如靶向劑，諸如葉酸或本文所述的其它靶向劑中的任意一種)的多個拷貝(例如2-10，15-50，50-100，100-200或200個以上拷貝)的樹枝狀大分子。在某些實施方案中，樹枝狀大分子包含2-10種不同官能團的多個拷貝。例如，在某些實施方案中，基于本發(fā)明研發(fā)過程中產生的數據(例如表示樹枝狀大分子可以含有100-150個不同位置(例如反應位置，諸如伯胺基)，綴合官能團(例如參見實施例13)的數據，樹枝狀大分子可以含有2-100個拷貝的治療劑(例如甲氨蝶呤)，2-100個拷貝的靶向劑(例如葉酸)和2-100個拷貝的成像劑(例如FITC或6-TAMARA)。
本發(fā)明還提供了制備樹枝狀大分子的方法，該方法包含一個或多個步驟(以任意順序)乙?；疓5樹枝狀大分子而生成部分乙?；臉渲畲蠓肿?；使成像劑(例如異硫氰酸熒光素)與部分乙?；臉渲畲蠓肿泳Y合而生成單官能樹枝狀大分子；使靶向劑(例如葉酸)與部分乙酰化的單官能樹枝狀大分子綴合以便生成雙官能樹枝狀大分子；使縮水甘油與部分乙酰化的雙官能樹枝狀大分子綴合；并且使治療劑(例如甲氨蝶呤)與部分乙酰化的雙官能縮水甘油化(glycidylated)雙官能樹枝狀大分子綴合。在優(yōu)選的實施方案中，按照下列步驟產生G5樹枝狀大分子(a)獲得引發(fā)劑核心脂族二胺；(b)進行與Michael接受體的Michael反應；(c)與單保護的二胺NH2-(CH2)n-NHPG(n＝1-10)縮合；和(d)重復步驟(a)-(c)；其中在每代的酰胺形成過程中使用單保護的二胺。本發(fā)明并不受限于選擇的引發(fā)劑核心脂族二胺的性質。在某些實施方案中，引發(fā)劑核心脂族二胺選自包括下列物質的組，但不限于它們NH2-(CH2)n-NH2(n＝1-10)；NH2-(CH2)n-NHPG，(n＝1-10)；NH2-((CH2)nNH2)3(n＝1-10)；或未被取代或取代的1，2-；1，3-；或1，4-亞苯基二-正-烷基胺。在一個優(yōu)選的實施方案中，Michael接受體為丙烯酸甲酯。在某些實施方案中，所用的保護基(PG)選自包括下列物質的組，但不限于它們叔丁氧基氨基甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基甲酸酯(N-Alloc)、芐基氨基甲酸酯(N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(FMOC)或鄰苯二甲酰亞胺(Phth)。
本發(fā)明還提供了包含樹枝狀大分子的組合物，所述的樹枝狀大分子包含被保護的核心二胺。在某些實施方案中，樹枝狀大分子包含聚酰胺型胺(PAMAM)、聚丙胺(POPAM)或PAMAM-POPAM樹枝狀大分子。在特別優(yōu)選的實施方案中，核心二胺為單保護的。在某些實施方案中，核心二胺為NH2-(CH2)n-NHPG(n＝1-10)。在優(yōu)選的實施方案中，被保護的核心二胺為NH2-CH2-CH2-NHPG。在某些實施方案中，被保護的核心二胺包含保護基(PG)，保護基選自包括下列的組，但不限于它們叔丁氧基氨基甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基甲酸酯(N-Alloc)、芐基氨基甲酸酯(N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(FMOC)或鄰苯二甲酰亞胺(Phth)。在優(yōu)選的實施方案中，樹枝狀大分子為部分乙?；?。在特別優(yōu)選的實施方案中，樹枝狀大分子與官能團綴合。
本發(fā)明還提供了制備包含被保護的核心二胺的樹枝狀大分子的方法，該方法包含下列步驟a)使用單保護的引發(fā)劑核心脂族二胺NH2-(CH2)n-NHPG，(n＝1-10)；b)進行與Michael接受體的Michael反應；(c)與單保護的二胺的等效物縮合；和(d)重復步驟(a)-(c)；其中在每代的酰胺形成過程中使用單保護的引發(fā)劑核心脂族二胺。在一個優(yōu)選的實施方案中，Michael受體為丙烯酸甲酯。在某些實施方案中，每次重復產生新的一代(G＝1-10)的帶有表面氨基的重復單元的共價結合的放射狀外殼。在某些實施方案中，保護基(PG)包含叔丁氧基氨基甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基甲酸酯(N-Alloc)、芐基氨基甲酸酯(N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(FMOC)或鄰苯二甲酰亞胺(Phth)。
本發(fā)明還提供了制備包含樹枝狀大分子的組合物的方法，該方法包含下列步驟a)使用單保護的引發(fā)劑核心脂族二胺；b)進行與Michael接受體的Michael反應；(c)與單保護的二胺NH2-(CH2)n-NHPG，(n＝1-10)縮合；和(d)重復步驟(a)-(c)；其中在每代的酰胺形成過程中使用單保護的二胺。本發(fā)明并不受限于選擇的引發(fā)劑核心二胺的性質。在某些實施方案中，引發(fā)劑核心脂族二胺選自包括下列物質的組，但不限于它們NH2-(CH2)n-NH2(n＝1-10)，NH2-((CH2)nNH2)3(n＝1-10)；或未被取代或取代的1，2-；1，3-；或1，4-亞苯基二-正-烷基胺。在一個優(yōu)選的實施方案中，Michael接受體為丙烯酸甲酯。在某些實施方案中，每次重復產生新的一代(G＝1-10)的帶有表面氨基的重復單元的共價結合的放射狀外殼。在某些實施方案中，保護基(PG)包含叔丁氧基氨基甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基甲酸酯(N-Alloc)、芐基氨基甲酸酯(N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(FMOC)或鄰苯二甲酰亞胺(Phth)。
本發(fā)明還提供了治療疾病(例如癌癥或感染性疾病)的方法，包含給予患有或易感疾病的受試者治療有效量的包含本發(fā)明樹枝狀大分子的組合物。在優(yōu)選的實施方案中，配置本發(fā)明的樹枝狀大分子，使得它們易于從受試者中清除(例如以便在有效劑量下極少至幾乎不可檢測出毒性)。在某些實施方案中，所述的疾病為腫瘤性疾病，其選自但不限于白血病、急性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、成髓細胞白血病、前髓細胞性白血病、粒-單核細胞型白血病、單核細胞性白血病、紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病、慢性淋巴細胞性白血病、真性紅細胞增多、淋巴瘤、何杰金病、非何杰金病、多發(fā)性骨髓瘤、特發(fā)性巨球蛋白血癥、重鏈病、實體瘤、肉瘤和癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、硬腦膜肉瘤、黑素瘤和神經母細胞瘤視網膜成神經細胞瘤(neuroblastomaretinoblastoma)。在某些實施方案中，所述的疾病為炎性疾病，其選自下列疾病組成的組，但不限于它們濕疹、炎性腸病、類風濕性關節(jié)炎、哮喘、牛皮癬、局部缺血/再灌注損傷、潰瘍性結腸炎和急性呼吸窘迫綜合征。在某些實施方案中，所述的疾病為病毒性疾病，其選自下列疾病組成的組，但不限于它們由下列病毒導致的病毒性疾病乙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒；輪狀病毒；人免疫缺陷癥病毒I型(HIV-I)；人免疫缺陷癥病毒II型(HIV-II)；人嗜T淋巴細胞病毒I型(HTLV-I)；人嗜T淋巴細胞病毒II型(HTLV-II)；AIDS；DNA病毒，諸如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒；細小病毒，諸如腺伴隨病毒和巨細胞病毒；乳多空病毒，諸如乳頭瘤病毒、多瘤病毒和SV40；腺病毒；皰疹病毒，諸如單純皰疹I型(HSV-I)、單純皰疹II型(HSV-II)和EB病毒；痘病毒，諸如天花(天花)和痘苗病毒；和RNA病毒，諸如人免疫缺陷癥病毒I型(HIV-I)、人免疫缺陷癥病毒II型(HIV-II)、人嗜T淋巴細胞病毒I型(HTLV-I)、人嗜T淋巴細胞病毒II型(HTLV-II)、流感病毒、麻疹病毒、狂犬病毒、仙臺(Sendai)病毒、小核糖核酸病毒，諸如細小核糖核酸病毒、柯薩奇病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、披膜病毒類，諸如德國麻疹病毒(德國麻疹)和塞姆利基森林病毒、蟲傳病毒和甲型肝炎病毒。
本發(fā)明還提供了治療疾病的方法，包含給予患有或易感疾病的受試者治療有效量的包含本發(fā)明樹枝狀大分子的組合物，所述的樹枝狀大分子包含部分乙?；腉5PAMAM、POPAM或PAMAM-POPAM樹枝狀大分子，該樹枝狀大分子進一步包含一種或多種官能團，所述的一種或多種官能團選自治療劑、靶向劑和成像劑組成的組。在某些實施方案中，所述的疾病為腫瘤性疾病。在某些實施方案中，所述的腫瘤性疾病選自白血病、急性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、成髓細胞白血病、前髓細胞性白血病、粒-單核細胞型白血病、單核細胞性白血病、紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病、慢性淋巴細胞性白血病、真性紅細胞增多、淋巴瘤、何杰金病、非何杰金病、多發(fā)性骨髓瘤、特發(fā)性巨球蛋白血癥、重鏈病、實體瘤、肉瘤和癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、硬腦膜肉瘤、黑素瘤和神經母細胞瘤視網膜成神經細胞瘤組成的組。
本發(fā)明還提供了改變受試者腫瘤生長的方法，包含提供包含樹枝狀大分子的組合物，所述的樹枝狀大分子包含部分乙?；臉渲畲蠓肿?，該樹枝狀大分子進一步包含一種或多種官能團，所述的一種或多種官能團選自治療劑、靶向劑和成像劑組成的組；并且在使得腫瘤生長得到改變的條件下給予受試者所述的組合物。在某些實施方案中，改變包含抑制受試者腫瘤生長。在某些實施方案中，改變包含減小受試者中的腫瘤大小。在某些實施方案中，將包含樹枝狀大分子的組合物與化療劑或抗癌劑共同給藥。在某些實施方案中，改變腫瘤生長使腫瘤對化療或抗-致腫瘤治療敏感。
附圖描述附

圖1描繪了用于合成PAPAM樹枝狀大分子的(A)傳統方法與(B)本發(fā)明某些實施方案中的方法的比較。
附圖2描繪了被保護的核心結構域的優(yōu)選保護基(PG)。
附圖3描繪了當核心二案為苯二胺N-((CH2)n-NH2)3(n＝1-10)時的核心二胺。
附圖4描繪了附圖3的苯二胺，但帶有取代基，其中R和R1獨立地選自氫、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C6環(huán)烷基、未被取代或被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、1，3-二氧戊環(huán)基、三鹵代烷基、羧基、C1-C6二烷氨基、C1-C6 sulfanatoalkyl、C1-C6氨磺酰烷基或C1-C6phosphanatoalkyl取代的C5-C10芳基。
附圖5描繪了通過對商購亞苯基雙乙腈的催化還原合成苯二胺類。
附圖6描繪了用于生成多官能G5PAMAM樹枝狀大分子的合成方案。
附圖7描繪了G5PAMAM樹枝狀大分子的電位滴定曲線。
附圖8描繪了部分乙?；d體和終產物的凝膠滲透色譜洗脫圖(eluograms)，其中在90°重疊的是RI信號和激光散射信號。
附圖9描繪了G5PAMAM樹枝狀大分子的理論和缺損的化學結構。
附圖10描繪了G5-Ac2樹枝狀大分子的(A)H1-NMR光譜和(B)HPLC洗脫圖。
附圖11描繪了異硫氰酸熒光素、葉酸和甲氨蝶呤的化學結構，其中用于綴合的基團被星號標記。
附圖12描繪了異硫氰酸熒光素、葉酸和甲氨蝶呤的質子NMR成像。
附圖13描繪了在305nm處(A)G5-Ac2-FITC-OH-MTXe和(B)G5-Ac3-FITC-OH-MTXe的HPLC洗脫圖。
附圖14描繪了G5-Ac2-FITC-FA-OH-MTXe的H1-NMR光譜。
附圖15描繪了在305nm處的G5-Ac-FITC-FA-OH-MTXe的HPLC洗脫圖。
附圖16描繪了游離異硫氰酸熒光素、葉酸和甲氨蝶呤的UV光譜。
附圖17描繪了G5-Ac、G5-Ac3-FITC、G5-Ac3-FITC-FA和G5-Ac3-FITC-FA-MTXe的UV光譜。
附圖18描繪了G5-FITC-FA-MTX在KB細胞中劑量依賴性結合的(A)粗的和(B)標準化熒光。
附圖19描繪了游離FA在表達高和低FA受體的KB細胞中對G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX的攝取的作用。
附圖20描繪了用樹枝狀大分子處理的KB細胞的共聚焦顯微術。
附圖21描繪了使用樹枝狀大分子對細胞生長的(A)時程和(B)劑量依賴性抑制。
附圖22描繪了通過XTT試驗測定的樹枝狀大分子對KB細胞的生長抑制。
附圖23描繪了使用G5-FITC-FA-MTX和等摩爾濃度的MTX與游離FA的混合物的細胞生長抑制比較。
附圖24描繪了G5-FA-MTX-誘導的由游離FA產生的細胞生長抑制的逆轉。
附圖25描繪了樹枝狀大分子在細胞培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性。
附圖26描繪了樹枝狀大分子的細胞毒性。
附圖27表示放射性標記的(A)非靶向的和(B)靶向的綴合物在帶有KB異種移植物腫瘤的nu/nu小鼠中的生物分布，表示為每克器官中回收的注射劑量的樹枝狀大分子的百分比。
附圖28表示對來自SCID小鼠的冷凍切片的腫瘤樣品的共聚焦顯微術分析，其中給所述的小鼠注射了10nmol(A)非靶向的G5-6-TAMRA或(B)靶向的G5-FA-6-TAMRA綴合物(B)15小時或(D)4天，此后分離腫瘤。G5-FA-6-TAMRA與G5-6-TAMRA比較的腫瘤細胞特異性攝取如(C)中所示。
附圖29描繪了在用G5-FI-FA-MTX綴合和游離甲氨蝶呤(MTX)處理過程中帶有KB異種移植物的SCID小鼠的腫瘤生長。
附圖30描繪了帶有KB腫瘤的SCID小鼠的存活率。
附圖31描繪了G5-Ac-AF-RGD的合成方案。
附圖32表示G5-Ac-AF-RGD與HUVEC細胞的結合。
附圖33表示G5-Ac-AF-RGD與不同細胞系的結合。
附圖34表示通過共聚焦顯微術測定的G5-Ac-AF-RGD與HUVEC細胞的劑量依賴性結合。
附圖35表示添加游離肽對HUVEC細胞攝取G5-Ac-AF-RGD的抑制。
定義為了有利于理解本發(fā)明，下文定義了大量術語和措詞本文所用的術語″活性劑″意旨具有生物相關活性或性質的組合物。生物相關活性為與能夠檢測、監(jiān)測或表征生物反應或活動的生物反應或活動相關的活性。生物相關活性包括但不限于治療活性(例如改善生物健康或預防與不需要的生物情況相關的持續(xù)變性的能力)、靶向活性(例如結合或連接生物分子或復合物的能力)、監(jiān)測活性(例如監(jiān)測生物活動進展或監(jiān)測生物組成改變的能力)、成像活性(例如觀察，乃至監(jiān)測生物組成或反應的能力)和標記鑒定活性(例如識別某些細胞組成或條件并且產生表示該組成或條件存在的可檢測到的反應)。本發(fā)明的活性劑并不限于這些特定的解釋性實例。實際上，可以使用任意的有用的活性劑，包括遞送或破壞生物物質、化妝品試劑等的活性劑。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，活性劑或多種活性劑與至少一種樹枝狀大分子結合(例如引入樹枝狀大分子，表面暴露在樹枝狀大分子上等)。在本發(fā)明的某些實施方案中，一種樹枝狀大分子與兩種或多種為″彼此不同的活性劑結合(例如與靶向劑和治療劑有關的一種樹枝狀大分子)?！灞舜瞬煌逡庵荚诨瘜W組成和/或官能團方面彼此不同的活性劑。
本文所用的術語″納米裝置″意旨含有或結合一種或多種″活性劑″的小(例如人肉眼不可見)組合物。在其最簡單的形式中，納米裝置由結合了至少一種提供生物官能團(例如治療劑)的活性劑的物理組合物(例如樹枝狀大分子)組成。然而，納米裝置還可以包含額外的成分(例如額外的樹枝狀大分子和/或活性劑)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，納米裝置的物理組合物包含至少一種樹枝狀大分子并且生物官能團由至少一種結合樹枝狀大分子的活性劑提供。
本文所用的術語″生物活性″意旨具有天然存在分子的結構、調節(jié)或生化功能的蛋白質或其它生物活性分子(例如催化RNA或小分子)。
本文所用的術語″激動劑″意旨一種分子，它在與生物活性分子發(fā)生相互作用時，導致生物活性組分改變(例如促進)，調節(jié)生物分子活性。激動劑可以包括蛋白質、核酸、碳水化合物或任意其它結合生物活性分子或與之發(fā)生相互作用的分子。例如，激動劑可以通過直接與RNA聚合酶發(fā)生相互作用或通過轉錄因子改變基因轉錄活性。
本文所用的術語″拮抗劑″或″抑制劑″意旨一種分子，但它與生物活性分子發(fā)生相互作用時，阻斷或調節(jié)生物活性分子的生物活性。拮抗劑和抑制劑可以包括蛋白質、核酸、碳水化合物或任意其它結合生物活性分子或與之發(fā)生相互作用的分子。抑制劑和拮抗劑可以影響完整細胞、器官或生物體的生物學特性(例如減緩腫瘤生長的抑制劑)。
本文所用的術語″調節(jié)″意旨生物活性分子的生物活性改變。調節(jié)可以為活性的增加或降低，結合特性改變，或活生物性分子的任意其它生物學、功能或免疫特性的改變。
術語″基因″意旨包含產生多肽或前體所必需的編碼序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可以被全長編碼序列或被該編碼序列的任意部分編碼，只要全長或片段的所需活性或功能特性(例如酶促活性、配體結合、信號傳導等)得以保留。該術語還包括結構基因的編碼區(qū)并且包括的序列位于與5′和3′端上的編碼區(qū)相鄰的位置，距每端約1kb或1kb以上，使得該基因相當于全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)的5′并且存在于mRNA上的序列稱作5′未-翻譯序列。位于編碼區(qū)3′或下游并且存在于mRNA上的序列稱作3′未-翻譯序列。術語″基因″包括基因的cDNA和基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆含有稱作″內含子″或″間插區(qū)″或″間插序列″的被非-編碼序列打斷的編碼區(qū)。內含子為轉錄成核RNA(hnRNA)的基因片段；內含子可以含有調節(jié)元件，諸如增強子。從核或原始轉錄物中除去或″剪接掉″內含子；內含子由此不存在于信使RNA(mRNA)轉錄物中。mRNA在翻譯過程中起指定新生多肽中的序列或氨基酸順序的作用。
本文所用的術語″核酸分子編碼″、″DNA序列編碼″和″DNA編碼″意旨沿脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸的順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定了沿多肽(蛋白質)鏈的氨基酸順序。DNA序列由此編碼氨基酸序列。
本文所用的術語″抗原決定簇″意旨接觸特定抗體的抗原部分(例如表位)。當蛋白質或蛋白質片段用于賦予宿主動物免疫性時，蛋白質的眾多區(qū)可以誘導產生特異性結合蛋白質上的指定區(qū)或三維結構的抗體；這些區(qū)或結構稱作抗原決定簇?？乖瓫Q定簇可以與完整抗原(例如用于引起免疫應答的″免疫原″)競爭結合抗體。
術語″特異性結合(specific binding)″或″特異性結合(specifically binding)″在用于指抗體和蛋白質或肽的相互作用時意旨這種相互作用依賴于蛋白質上存在的特定結構(例如抗原決定簇或表位)；換句話說，抗體識別并且結合特異性蛋白質結構而不是一般性地結合蛋白質。例如，如果抗體對表位″A″具有特異性，那么在含有標記的″A″和抗體的反應體系中含有表位A(或游離的未標記的A)的蛋白質的存在會減少與抗體結合的標記的A的量。
本文所用的術語″轉基因″意旨外源基因，例如通過將該外源基因導入新受精卵或早期胚胎而將其置于生物體內。術語″外源基因″意旨通過實驗操縱導入動物基因組并且可以包括在該動物中發(fā)現的基因序列的任意核酸(例如基因序列)，只要導入的基因不存在于與天然存在基因相同的位置上。
本文所用的術語″載體″用于指將DNA片段從一種細胞轉移至另一種細胞的核酸分子。術語″載體(vehicle)″有時與″載體(vector)″可互換使用。載體通常來源于質粒、噬菌體或植物或動物病毒。
本文所用的術語″表達載體″意旨重組DNA分子，其含有所需編碼序列和表達特定宿主生物體內可操作連接的編碼序列所必需的適宜核酸序列。原核細胞中表達所必需的核酸序列通常包括啟動子、操縱子(任選)和核糖體結合位點，通常與其它序列一起。已知真核細胞利用啟動子、增強子并終止和聚腺苷酸化信號。
本文所用的術語″基因轉移系統″意旨將包含核酸序列的組合物遞送至細胞或組織的任意工具。例如，基因轉移系統包括但不限于載體(例如逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和其它基于核酸的遞送系統)、裸核酸的顯微注射和基于聚合物的遞送系統(例如基于脂質體和基于金屬顆粒的系統)。本文所用的術語″病毒基因轉移系統″意旨包含有利于將樣品遞送至所需細胞或組織的病毒元件的基因轉移系統(例如完整病毒和修飾的病毒)。本文所用的術語″腺病毒基因轉移系統″意旨包含屬于腺病毒科的完整或改變的病毒的基因轉移系統。
本文所用的術語″轉染″意旨將外源性DNA導入真核細胞。可以通過各種本領域中公知的方式進行轉染，包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導的轉染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物-介導的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂轉染、原生質體融合、逆轉錄病毒感染和生物射彈(biolistics)。
本文所用的術語″細胞培養(yǎng)物″意旨細胞的任意體外培養(yǎng)物。該術語中包括連續(xù)的細胞系(例如含有無限增殖化表型)、原代細胞培養(yǎng)物、有限細胞系(例如未-轉化細胞)和維持在體外的任意其它細胞群。
本文所用的術語″體外″意旨人工環(huán)境和出現在人工環(huán)境內的過程或反應。體外環(huán)境可以由試管和細胞培養(yǎng)物組成，但不限于它們。術語″體內″意旨天然環(huán)境(例如動物或細胞)和出現在天然環(huán)境中的過程或反應。
術語″測試化合物″意旨可以用于治療或預防疾病(disease)、疾病(illness)、疾病(sickness)或身體功能障礙的任意化學本體、藥、藥物等。測試化合物包括已知和潛在的治療化合物?？梢酝ㄟ^使用本發(fā)明的篩選方法進行篩選將測試化合物確定為治療劑?！逡阎闹委熁衔铩逡庵家呀涀C實(例如通過動物試驗或在先對人體給藥的經驗)為在這類治療或預防中有效的治療化合物。
本文所用的術語″樣品″以其最廣泛的含義使用并且包括環(huán)境和生物樣品。環(huán)境樣品包括來自諸如土壤和水這類環(huán)境的材料。生物樣品可以為動物，包括人類、流體(例如血液、血漿和血清)、固體(例如糞便)、組織、液體食物(例如牛奶)和固體食物(例如蔬菜)。
本文所用的術語″光敏劑″和″光動力學染料″意旨在接觸光量子時進行轉化而達到激發(fā)態(tài)的物質。光敏劑和光動力學染料的實例包括但不限于光卟啉2、苯并卟啉、間-四羥基苯基二氫卟酚、本紅紫素錫(tinetiopurpurin)、苯并二氫卟酚銅和其它卟啉類。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于治療、分析和監(jiān)測疾病(例如癌癥)的新的系統和組合物。例如，本發(fā)明提供了系統和組合物，其靶向、成像和傳感病理生理缺陷，基于患病狀態(tài)提供合適的治療劑，監(jiān)測對遞送的治療劑的反應并且鑒定殘留的疾病。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，組合物足夠小以易于進入患者或受試者細胞和從體內清除，而在治療劑量下幾乎沒有毒性。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的系統和組合物用于在癌癥療法過程中的治療和/或監(jiān)測。然而，本發(fā)明的系統和組合物應用于治療和監(jiān)測各種疾病狀態(tài)或其它生理情況，并且本發(fā)明并不限于用于任何具體的疾病狀態(tài)或情況。具體應用于本發(fā)明的其它疾病狀態(tài)包括但不限于心血管疾病、病毒性疾病、炎性疾病和其它增殖性病癥。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了部分乙?；牡?代(G5)聚酰胺型胺(PAMAM)、樹枝狀大分子(例如，參見實施例1)。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了制備多官能G5樹枝狀大分子(例如，參見實施例2)的方法和制備包含被保護的核心二胺的樹枝狀大分子的方法(例如，參見附圖1-5)。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案提供了包含與一種或多種官能團綴合的樹枝狀大分子的組合物，所述的官能團包括但不限于治療劑、生物監(jiān)測成分、生物成像成分、靶向成分和鑒定細胞異常的特異性標記的成分。照此，治療納米裝置由各樹枝狀大分子制成，它們各自帶有特別地與樹枝狀大分子綴合或共價結合的一種或多種官能團(例如，參見實施例2和6)。在優(yōu)選的實施方案中，官能團中的至少一種通過酯鍵與樹枝狀大分子綴合(例如，參見實施例7)。
下文的討論描述了樹枝狀大分子的各成分部分和在本發(fā)明某些實施方案中制備和使用它們的方法。為了解釋本發(fā)明系統和組合物的設計和應用，討論部分集中在組合物在治療和監(jiān)測乳腺癌和結腸腺癌中的應用的具體實施方案。這些具體的實施方案僅用于解釋本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案，但并不用來限制其范圍(例如本發(fā)明的組合物和方法應用于鑒定和治療前列腺癌和病毒感染的細胞和組織)。在某些實施方案中，本發(fā)明的樹枝狀大分子通過細胞表面部分靶向腫瘤性細胞并且例如通過受體介導的胞吞由腫瘤細胞吸收(例如，參見實施例9，附圖20)。在優(yōu)選的實施方案中，成像成分(例如與本發(fā)明的樹枝狀大分子綴合)使腫瘤成像(例如通過使用MRI)。
在某些實施方案中，通過使治療成分與不穩(wěn)定保護基結合，諸如，例如使順鉑與不耐光的保護基結合有利于治療劑的釋放，其中所述的不耐光的保護基由定向于發(fā)射如上所述活化的熒光顏色的那些細胞(例如發(fā)射紅色的細胞)的激光釋放。任選治療裝置(例如包含本發(fā)明樹枝狀大分子的組合物)還可以帶有監(jiān)測靶細胞或組織(例如腫瘤)對療法的反應的成分。例如，如果與本發(fā)明的樹枝狀大分子綴合的化療劑(例如甲氨蝶呤)誘導靶向的細胞細胞凋亡，靶向的細胞的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性可以用于激活綠色熒光。這使得凋亡性細胞變?yōu)槌壬?紅色與綠色的結合)，而殘留細胞仍保持紅色。誘導側枝中發(fā)生細胞凋亡的任何正常細胞均可以伴隨損害綠色熒光。
正如從上述實例中清楚看出的，本發(fā)明組合物的應用有利于在癌癥和其它疾病和情況中的非侵害性傳感、信號傳導和介入。由于使用這項技術鑒定癌細胞中分子改變的具體方案，所以實現了樹枝狀大分子的非侵害性傳感且然后可以對各種腫瘤表型進行自動化應用。
I.樹枝狀大分子在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包含樹枝狀大分子(例如，參見附圖1-5和實施例2)。已經廣泛描述了樹枝狀聚合物(參見，Tomalia，Advanced Materials 6529(1994)；Angew，Chem.Int.Ed.Engl.，29138(1990)；將這些文獻完整地引入本文作為參考)。可以將樹枝狀聚合物合成為一般直徑在1-20納米的確定的球狀結構。顯示了制備帶有被保護核心的G5PAMAM樹枝狀大分子的方法(附圖1-5)。在某些實施方案中，被保護的核心二胺為NH2-CH2-CH2-NHPG。分子量和端基數量作為聚合物的代(層數量)的函數呈指數增加(例如，參見附圖9)。可以基于啟動聚合過程的核心結構合成不同類型的樹枝狀大分子(例如，參見附圖1-5)。
樹枝狀大分子的核心結構描述了分子的幾種特征，諸如總體形狀、密度和表面官能度(Tomalia等Chem.Int.Ed.Engl.，295305(1990))。球形樹枝狀大分子可以帶有氨作為三價引發(fā)劑核心或乙二胺(EDA)作為三價引發(fā)劑核心(例如，參見附圖9)。目前描述的棒狀樹枝狀大分子(Yin等J.Am.Chem.Soc.，1202678(1998))使用不同長度的聚乙烯亞胺線性核心(例如核心越長，則棒狀物越長)。樹枝狀大分子為按千克量計的商購的并且在用于生物技術應用的目前良好的制備方法(GMP)中產生。
可以通過許多技術來表征樹枝狀大分子，包括但不限于電噴射離子化質譜、13C核磁共振光譜法、1H核磁共振光譜法(例如，參見實施例5，附圖10(A)和實施例7，附圖14)、高效液相色譜法(例如，參見實施例5，附圖10(B)；和實施例6，附圖13)、使用多角度激光散射的大小排阻色譜法(例如，參見實施例4，附圖8)、紫外分光光度法(例如，參見實施例8，附圖17)、毛細管電泳和凝膠電泳。這些試驗確保了聚合物群的均勻性并且對監(jiān)測用于GMP應用和體內應用的樹枝狀大分子制備的質量控制而言是重要的。
眾多美國專利中描述了用于生產樹枝狀大分子的方法和組合物。下面給出了這些專利中的某些的實施例，以便提供對可以用于本發(fā)明的某些樹枝狀大分子組合物的描述，不過，應理解這些僅為解釋性實施例并且眾多其它類似的樹枝狀大分子組合物可以用于本發(fā)明。
美國專利US4,507,466、美國專利US4,558,120、美國專利US4,568,737和美國專利US4,587,329中各自描述了制備具有大于常規(guī)星形聚合物的末端密度的致密星形聚合物的方法。這些聚合物具有大于/高于常規(guī)的星形聚合物的均勻反應性，即第3代致密星形聚合物。這些專利中進一步描述了酰氨基胺樹枝狀大分子的性質(amidoamine)和該樹枝狀大分子的3-維分子直徑。
美國專利US4,631,337中描述了水解穩(wěn)定的聚合物。美國專利US4,694,064中描述了棒形樹枝狀大分子。美國專利US4,713,975中描述了致密的星形聚合物及其在表征病毒、細菌和蛋白質包括酶的表面中的應用。橋連的致密星形聚合物描述在美國專利US4,737,550中。美國專利US4,857,599和美國專利US4,871,779中描述了作為離子交換樹脂、螯合型樹脂使用的固定化核心上的致敏星形聚合物和這類聚合物的制備方法。
美國專利US5,338,532涉及結合了至少一種攜帶的農業(yè)、藥物或其它物質的單元的樹枝狀大分子的星形爆裂狀(starburst)綴合物。該專利描述了每單位聚合物、受控遞送、靶向遞送和/或多種類中高濃度攜帶物質的遞送裝置，所述的多種類諸如，例如藥物抗生素、一般和具體的毒素、金屬離子、放射性核素、信號發(fā)生器、抗體、白細胞介素、激素、干擾素、病毒、病毒片段、殺蟲劑和抗微生物劑。
美國專利US6,471,968中描述了包含共價連接的第一種和第二種樹枝狀大分子的樹枝狀大分子復合物，其中第一種樹枝狀大分子包含第一種活性劑，并且第二種樹枝狀大分子包含第二種活性劑，其中第一種樹枝狀大分子不同于第二種樹枝狀大分子，并且其中第一種活性劑不同于第二種活性劑。
其它有用的樹枝狀大分子類組合物描述在美國專利US5,387,617、美國專利US5,393,797和美國專利US5,393,795中，其中通過用能夠提供疏水外殼的疏水性基團封端修飾致密的星形聚合物。美國專利US5,527,524中披露了氨基封端的樹枝狀大分子在抗體綴合物中的應用。
樹枝狀大分子作為金屬離子載體的應用描述在美國專利US5,560,929中。美國專利US5,773,527中披露了梳形爆裂狀結構的非交聯多分支聚合物及其制備方法。美國專利US5,631,329中描述了生成高分子量多分支聚合物的方法，通過下列步驟進行由分支形成第一組支化聚合物；與核心接枝；使第一組支化聚合物脫保護，然后形成第二組因分支而被保護的支化聚合物并且與具有第一組支化聚合物的核心接枝等。
美國專利US5,902,863中描述了含有親脂性有機硅氧烷和親水性polyanicloamine nanscopic domains的樹枝狀大分子網狀構造。該網狀構造由具有PAMAM(親水性)或聚丙烯亞胺內部和有機硅外層的共聚樹枝狀大分子前體制備。這些樹枝狀大分子具有可控的大小、形狀和空間分布。它們?yōu)榫哂锌梢杂糜趯Ｓ媚?、保護涂層、含有有機金屬或無機添加劑的復合物，皮膚貼劑遞送，吸收劑，層析個人護理產品和農產品的帶有有機硅外層的疏水性樹枝狀大分子。
美國專利US5,795,582中描述了樹枝狀大分子作為流感抗原的佐劑的應用。樹枝狀大分子的應用產生了帶有降低的抗原劑量的抗體滴度水平。美國專利US5,898,005和美國專利US5,861,319中描述了用于測定分析物濃度的特異性免疫結合試驗。美國專利US5,661,025中提供了包含樹枝狀大分子聚陽離子的自我裝配的多核苷酸遞送系統以便有助于將核苷酸遞送至靶位點的詳細描述。該專利提供了在體外將多核苷酸導入真核細胞的方法，包含使細胞接觸一種組合物，該組合物包含多核苷酸和與該多核苷酸非共價偶聯的樹枝狀大分子polyeation。
預先已經證實了樹枝狀大分子-抗體綴合物在體外診斷應用(Singh等Clin.Chem.，401845(1994))、在生產樹枝狀大分子-螯合劑-抗體構建體和在研發(fā)硼化樹枝狀大分子-抗體綴合物(用于中子俘獲療法)中的應用；后面這些化合物中的每一種可以用作癌癥治療劑(Wu等Bioorg.Med.Chem.Lett.，4449(1994)；Wiener等Magn.Reson.Med.311(1994)；Barth等Bio綴合物Chem.558(1994)；和Barth等)。
在腫瘤的磁共振成像中也使用了這些綴合物中的一些(Wu等(1994)和Wiener等(1994)，文獻同上)。從這項工作中獲得的結構記錄了當進行體內給藥時，抗體可以使樹枝狀大分子-結合的治療劑定向于具有抗原的腫瘤。還證實樹枝狀大分子抗原特異性地進入細胞并且攜帶化療劑或遺傳治療劑。特別地，研究表明包囊在樹枝狀大分子聚合物中的順鉑增加了功效并且毒性低于提供其它方式遞送的順鉑(Duncan和Malik，Control Rel.Bioact.Mater.23105(1996))。
樹枝狀大分子還可以與熒光染料或分子指示標綴合經證實可進入細胞。然后可以按照與評價細胞內生理改變的傳感儀器相容的方式在細胞內檢測它們(Baker等Anal.Chem.69990(1997))。最終，將樹枝狀大分構建為差別化嵌段共聚物，其中可以用酶或光誘導的催化消化分子的外部分(Urdea和Hom，Science 261534(1993))。這能夠控制聚合物的降解以便在疾病部位釋放治療劑并且可以為釋放治療劑的外部觸發(fā)器提供機理。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了樹枝狀大分子，其中單一樹枝狀大分子中形成有各自帶有具體官能度的一種或多種官能團(例如，參見實施例7和8，附圖14和15)。例如，本發(fā)明優(yōu)選的組合物包含部分乙酰化的第5代(G5)PAMAM樹枝狀大分子，該樹枝狀大分子進一步包含治療劑、靶向劑和成像劑，其中治療劑包括甲氨蝶呤，靶向劑包括葉酸，且成像劑包括異硫氰酸熒光素(例如，參見實施例7和8)。由此，本發(fā)明提供了單一的多官能樹枝狀大分子。在某些實施方案中，在單一樹枝狀大分子上形成了多個拷貝的上述官能團中的任意一種(例如治療劑)。例如，在某些實施方案中，單一樹枝狀大分子包含2-100個拷貝的單一官能團(例如治療劑，諸如甲氨蝶呤)。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了部分乙?；牡?代(G5)PAMAM樹枝狀大分子，該樹枝狀大分子進一步包含治療劑、靶向劑和成像劑，其中靶向劑包含RGD肽(例如，參見實施例14)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了部分乙?；牡?代(G5)PAMAM樹枝狀大分子，該樹枝狀大分子包含治療劑、靶向劑和成像劑，其中治療劑包含氚(例如，參見實施例13)。
II.治療劑各種治療劑應用于本發(fā)明。因此，本發(fā)明并不限于可以與本發(fā)明樹枝狀大分子綴合的治療劑的類型?？梢允褂帽景l(fā)明的方法、系統和組合物遞送結合樹枝狀大分子的任意治療劑。為了解釋治療劑的遞送，下文的討論主要集中在甲氨蝶呤、順鉑和泰素在治療癌癥中的遞送。還討論了各種光動力療法化合物和各種抗微生物化合物。
i.甲氨蝶呤、順鉑和泰素甲氨蝶呤的細胞毒性取決于維持閾值胞內水平的持續(xù)時間(Levasseur等Cancer Res 58，5749(1998)；Goldman & Matherly，Pharmacol Ther 28，77(1985))。細胞含有高濃度的DHFR，并且完全中斷了DHFR活性，需要高于DHFR的Ki 6個數量級的抗葉酸鹽劑水平(Sierrra & Goldman，Seminars in Oncology 26，11(1999))。此外，低于5％的酶活性對完整的細胞酶促功能而言是足夠的(White &Goldman，Biol Chem 256，5722(1981))。順鉑和泰素具有充分確定的在腫瘤細胞中誘導細胞凋亡的作用(例如，參見Lanni等Proc.Natl.Acad.Sci.，949679(1997)；Tortora等Cancer Research575107(1997)；和Zaffaroni等Brit.J.Cancer 771378(1998))。然而，使用這些和其它化療劑治療難以在沒有招致的明顯毒性的情況下進行。目前應用的這些活性劑一般難溶于水，毒性明顯并且在影響正常細胞和患病細胞的劑量下給予。例如，發(fā)現的最理想的抗癌化合物之一紫杉醇(泰素)難溶于水。
紫杉醇已經在各種腫瘤模型中顯示出極佳的抗腫瘤活性，諸如B16黑素瘤、L1210白血病、MX-1乳房腫瘤和CS-1結腸腫瘤異種移植物。然而，紫杉醇在水溶性差對人體給藥提出了一個難題。因此，目前使用的紫杉醇制劑需要cremaphor增溶藥物。人體臨床劑量范圍在200-500mg。將該劑量溶于1∶1的乙醇∶cremaphor溶液并且稀釋成經靜脈內給予的1升流體。目前使用的cremaphor為聚乙氧基化蓖麻油。通過溶于cremaphor混合物并且用大體積的含水媒介物稀釋來將其通過輸注給予。直接給藥(例如皮下)產生局部毒性和低水平的活性。因此，對這些化療劑而言，對更有效和有效遞送系統存在需求。
本發(fā)明通過提供用于具體遞藥的方法和組合物而克服了這些難題。本發(fā)明還提供了給予活性劑的組合(例如兩種或多種不同治療劑)以產生累加效應的能力。多種活性劑的應用可以用于抵抗疾病對任何單一活性劑產生的耐藥性。例如，已經報導了某些癌癥對單一藥物(泰素)的耐藥性(Yu等Molecular Cell.2581(1998))。在本發(fā)明研發(fā)過程中進行的實驗已經證實與樹枝狀大分子綴合的甲氨蝶呤能夠有效殺傷癌細胞(參見實施例10、附圖21和22以及實施例12、附圖26)。
本發(fā)明還提供了監(jiān)測在將甲氨蝶呤和/或順鉑和/或泰素遞送給受試者后的治療成功的機會。例如，將測定這些藥物體外誘導細胞凋亡的能力報導為體內功效的標志(Gibb，Gynecologic Oncology6513(1997))。因此，除這些藥物(或其它治療劑)之一、其中兩種或所有的靶向遞送以提供有效抗腫瘤療法并且降低毒性外，還可以通過本發(fā)明監(jiān)測細胞凋亡誘導的技術評估療法的有效性。重要的是，這些療法對廣泛腫瘤類型具有活性，包括但不限于乳腺癌和結腸癌(Akutsu等Eur.J.Cancer 31A2341(1995))。
盡管上述討論描述了三種特異性活性劑，但是常規(guī)用于癌癥療法內容的任意活性劑(例如藥物)均可應用于本發(fā)明。在按照本發(fā)明治療癌癥的過程中，樹枝狀大分子的治療成分可以包含化合物，包括但不限于阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、喜樹堿、放線菌素D、絲裂霉素C，更優(yōu)選順鉑?？梢灾苽湓摶钚詣┎⑶彝ㄟ^將其如本文所述與免疫治療劑合并作為合并的治療組合物或試劑盒等使用。
在本發(fā)明的某些實施方案中，預期樹枝狀大分子包含一種或多種活性劑，它們直接交叉連接核酸(例如DNA)以便有利于DNA損害，從而產生本發(fā)明的具有協同作用的抗腫瘤藥?？梢允褂弥T如順鉑這類活性劑和其它DNA烷化劑。順鉑已經廣泛應用于治療癌癥，其中用于臨床施用的有效性劑量為20mg/M2，持續(xù)5天，每3周進行1次，總計3個療程?？梢酝ㄟ^任意合適的方法遞送樹枝狀大分子，包括但不限于靜脈內、皮下、腫瘤內、腹膜內或局部(例如遞送至粘膜表面)。
損害DNA的活性劑還包括干擾DNA復制、有絲分裂和染色體分離的化合物。這類化療化合物包括阿霉素，也稱作多柔比星；依托泊苷；維拉帕米；鬼臼毒素等。通過靜脈內快速濃注給予在治療腫瘤的臨床背景中廣泛使用的這些化合物，就阿霉素而言，劑量范圍為25-75Mg/M2，間隔21天，就依托泊苷而言，靜脈內或靜脈內口服雙重劑量為35-50Mg/M2。
破壞核酸前體和亞單位合成和精確度的活性劑也導致DNA損害并且用作本發(fā)明中的化療劑。已經研發(fā)了大量核酸前體。特別有用的為已經進行廣泛測試并且用于獲得的活性劑。照此，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)這類活性劑優(yōu)先被腫瘤性組織利用，使得該活性劑特別用于靶向腫瘤性細胞。遞送的劑量可以在3-15mg/kg/天的范圍，不過，其它劑量可以根據不同因素明顯改變，包括疾病的階段、細胞對療法的依從性、對活性劑耐受的量等。
應用于本發(fā)明的抗癌治療劑為那些易于引入樹枝狀大分子結構，或否則就與樹枝狀大分子結構結合的治療劑，使得它們可以被遞送入受試者、組織或細胞，而其抗癌作用的精確度不會喪失。為了更詳細描述癌癥治療劑，諸如鉑復合物、維拉帕米、鬼臼毒素、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亞硝基脲(nitrosurea)、阿霉素、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、博來霉素、plicomycin、博來霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、泰素、transplatinum、5-氟尿嘧啶、新長春堿、長春堿和甲氨蝶呤和其它類似抗癌藥，本領域技術人員查閱了許多說明性手冊，包括但不限于Physician′s Desk reference和Goodman和Gilman的″Pharmaceutical Basis of Therapeutics″ninthedition，Eds.Hardman等1996。
在某些實施方案中，優(yōu)選使用光可裂解的連接基使藥物與樹枝狀大分子結合。例如，應用于本發(fā)明的幾種異雙官能光可裂解連接基由Ottl等描述(Ottl等Bio綴合物Chem.，9143(1998))。這些連接基可以為水或有機可溶性的。它們含有活化的酯，該酯可以與可與巰基反應的胺類或醇類和環(huán)氧化物反應。在兩種基團之間為3，4-二甲氧基6-硝基苯基光致異構化基團，該基團在接觸近紫外光(365nm)時，釋放完整形式的胺或醇。因此，在使用這類連接基與本發(fā)明組合物連接時，通過使靶區(qū)接觸近紫外光，治療劑可以以生物活性或可活化的形式被釋放。
在一個優(yōu)選的實施方案中，甲氨蝶呤通過酯鍵與樹枝狀大分子綴合(參見例如實施例7)。在一個典型的實施方案中，泰素的醇基與有機可溶性連接基的活化酯反應。該產物由此與合適的樹枝狀大分子的部分硫醇化表面反應(樹枝狀大分子的伯胺類可以通過與亞化學計算量的2-iminothiolano反應而被部分轉化成含硫氫基的基團)。就順鉑而言，藥物的氨基與連接基的水溶性形式反應。如果氨基反應不完全，那么可以使用順鉑的含伯氨基的活性類似物，諸如Pt(II)磺胺嘧啶二氯化物(Pasani等Inorg.Chim.Acta 8099(1983)和Abel等，Eur.J.Cancer 94(1973))。因此，綴合的藥物無活性并且不會損害正常細胞。當綴合物位于腫瘤細胞中時，它接觸適當近-UV波長的激光，從而導致活性藥物被釋放入細胞。
類似地，在本發(fā)明的其它實施方案中，使順鉑(或其類似物)的氨基與極具疏水性的光可裂解保護基、諸如2-硝基芐氧羰基連接(Pillai，V.N.R.Synthesis1-26(1980))。由于連接了這一疏水性基團，所以藥物被加載入PAMAM樹枝狀大分子的疏水腔并且極為優(yōu)先地被其保留(例如，參見Esfand等Pharm.Sci.，2157(1996))，與水環(huán)境隔離。當接觸近-LV光(約365nm)時，疏水性基團被裂解，釋放完整藥物。由于藥物自身為親水性的，所以它從樹枝狀大分子中擴散出來并且進入腫瘤細胞，在那里它可以啟動細胞凋亡。
作為光可連接的連接基的備選物為酶可裂解連接基。已經證實大量可裂解連接基為有效的抗腫瘤綴合物并且可以通過使癌癥治療劑，諸如多柔比星與帶有適當短的肽連接基的水溶性聚合物結合制備(例如，參見Vasey等Clin.Cancer Res.，583(1999))。連接基在細胞外部為穩(wěn)定的，但一旦在細胞內就被巰基蛋白酶裂解。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用PK1。作為光可裂解連接基策略的備選，可以使用酶可降解的連接基，諸如Gly-Phe-Leu-Gly。
本發(fā)明并不限于治療技術的性質。例如，應用于本發(fā)明的其它綴合物包括但不限于使用用于BNCT的綴合的硼撒粉器(Capala等Bio綴合物Chem.，77(1996))，使用放射性同位素和諸如蓖麻毒素這類毒素與納米裝置結合。
ii.光動力療法光動力療法治療劑也可以用作本發(fā)明中的治療劑。在某些實施方案中，照射本發(fā)明含有光動力化合物的樹枝狀大分子組合物，導致單線態(tài)氧和自由基產生，它們從無纖維放射效應物中擴散出來而對生物靶標(例如腫瘤細胞或細菌細胞)起作用。某些優(yōu)選的光動力化合物包括但不限于那些參與II型光化學反應的化合物
→PS+hv PS*(1)→PS*(1) PS*(3)→PS*(3)+O2PS+*O2→*O2+T 細胞毒性其中PS＝光致敏劑，PS*(1)＝激發(fā)的PS的單線態(tài)，PS*(3)＝激發(fā)的PS的三線態(tài)，hv＝光量子，*O2＝激發(fā)的氧的單線態(tài)，且T＝生物靶標。用于本發(fā)明的其它光動力化合物包括那些通過非單線態(tài)氧產生的不同機制產生細胞毒性的化合物(例如copper benzochlorin，Selman，等Photochem.Photobiol.，57681-85(1993)，引入本文作為參考)。應用于本發(fā)明的光動力化合物的實例包括但不限于光敏素2、酞菁(phtalocyanins)(例如，參見Brasseur等Photochem.Photobiol.，47705-11(1988))、苯并卟啉、四羥基苯基卟啉類、naphtalocyanines(例如，參見Firey和Rodgers，Photochem.Photobiol.，45535-38(1987))、sapphyrins(Sessler等Proc.SPIE，1426318-29(1991))、卟吩酮類(porphinones)(Chang等Proc.SPIE，1203281-86(1990))、本紅紫素錫(tin etiopurpurin)、醚取代的卟啉類(Pandey等Photochem.Photobiol.，5365-72(1991))和陽離子染劑，諸如吩嗪類(例如，參見Cincotta等SPIE Proc.，1203202-10(1990))。
iii.抗微生物治療劑本發(fā)明的抗微生物治療劑也可以用作本發(fā)明中的治療劑?？梢允褂每蓺?、抑制，或否則就是減弱微生物生物體功能的任意活性劑，以及關注具有這類活性的任意活性劑。抗微生物劑包括但不限于天然和合成的抗生素、抗體、抑制蛋白、反義核酸、膜破壞劑等，可以將它們單獨或聯合使用。實際上，可以使用任意類型的抗生素，包括但不限于抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑等。
III.標記鑒定劑在某些實施方案中，本發(fā)明的納米裝置含有一種或多種由標記成分(″標記″)活化或能夠與之發(fā)生相互作用的標記鑒定劑。在優(yōu)選的實施方案中，標記鑒定劑為特異性結合標記的抗體，優(yōu)選單克隆抗體(例如對靶向的細胞具有特異性的細胞特異性分子)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，鑒定了腫瘤細胞。腫瘤細胞具有各種標記，包括確定表達的癌特異性抗原，諸如乳腺癌中的Muc1、HER-2和突變的p53。它們作為癌癥的特異性標記起作用，在乳腺癌中的存在量為30％(HER-2)-70％(突變的p53)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的樹枝狀大分子包含特異性結合存在于乳腺癌中的p53突變形式的單克隆抗體。
在本發(fā)明的某些實施方案中，鑒定了表達易患基因的癌細胞。例如，在某些實施方案中，存在兩種用作乳腺癌特異性標記的乳腺癌易患基因染色體17上的BRCA1和染色體13上的BRCA2。當個體攜帶BRCA1或BRCA2中的突變時，他們被診斷為處于在生命中的某些點時乳腺或卵巢癌的風險度增加中。這些基因參與修復雙鏈DNA中放射誘導的斷裂。認為BRCA1或BRCA2中的突變可能使這一機制喪失，導致DNA修復中的錯誤更多并且最終導致癌生長。
此外，大量不同細胞表面受體的表達用作納米裝置結合和吸收的靶標。這類受體包括但不限于EGF受體、葉酸受體、FGR受體2等。
在本發(fā)明的某些實施方案中，與染色體異常(abborations)相關的基因表達改變?yōu)闃擞洺煞?。例如，伯基特淋巴瘤因涉及Myc基因的染色體易位導致。染色體易位意旨染色體斷裂，使得它與其它染色體的部分連接。伯基特淋巴瘤中的傳統伯基特淋巴瘤涉及染色體8，即Myc基因的位點。這種Myc表達模式的改變，由此破壞其在控制細胞生長和增殖的常用功能。
在其它實施方案中，將與接觸癌相關的基因表達鑒定為標記成分。已知兩種關鍵基因涉及結腸癌染色體2上的MSH2和染色體3上的MLH1。一般而言，這些基因的蛋白質產物有助于修復DNA復制中形成的錯誤。如果MSH2和MLH1蛋白質突變，那么復制中的錯誤仍然無法修復，從而產生受損的DNA和結腸癌。幾年來已知涉及多發(fā)性內分泌腺瘤綜合征的MEN1基因在染色體11上發(fā)現，在1997年對其更為精細地進行了作圖，并且用作這類癌癥的標記。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使對檢測的改變的蛋白質或表達的基因具有特異性的抗體與本發(fā)明的納米裝置復合。
在另一個實施方案中，結腸腺癌已經確定了CEA和突變的p53的表達，這兩者均為充分證實的腫瘤標記。在這些細胞的某些中的p53突變與在某些乳腺癌細胞中觀察到的突變相似，并且能夠共有用于這些癌癥各自的兩種納米裝置之間的p53傳感成分(即在裝配納米裝置中，包含相同標記鑒定劑的樹枝狀大分子可以用于每種癌癥類型)?？梢允褂迷诼闶笾挟a生腫瘤的細胞系可靠地研究結腸和乳腺癌細胞，以便在動物中的優(yōu)化和表征。
從上述討論中可以清楚地看出，存在許多不同的應用于本發(fā)明的腫瘤標記，其中的某些對特定類型的癌癥具有特異性，而其它屬于其來源方面偶然(promiscuous)的。本發(fā)明并不限于任何特定腫瘤標記或任意其它疾病特異性標記。例如，用作本發(fā)明的標記的腫瘤阻抑物包括但不限于p53、Mucl、CEA、p16、p21、p27、CCAM、RB、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-1、MEN-II、p73、VHL、FCC和MCC。
IV.生物學成像成分在本發(fā)明的某些實施方案中，納米裝置包含至少一種基于樹枝狀大分子的易于成像的nanoscopic構造單元。本發(fā)明并不受限于使用成像成分的性質。在本發(fā)明的某些實施方案中，成像組件包含量子點的表面修飾(例如，參見Chan和Nie，Science 2812016(1998))，諸如與生物分子偶聯的硫化鋅-封端的硒化鎘(Sooklal，Adv.Mater.，101083(1998))。
然而，在優(yōu)選的實施方案中，成像組件包含按照″納米復合物″概念的生產的樹枝狀大分子(Balogh等Proc.of ACS PMSE 77118(1997)和Balogh和Tomalia，J.Am.Che.Soc.，1207355(1998))。在這些實施方案中，通過反應性包囊生產樹枝狀大分子，其中反應劑由樹枝狀大分子模板預構造且隨后被第二種反應劑固定在聚合物分子內/上。測定這些納米粒的大小、形狀、大小分布和表面官能度并且由樹枝狀大分子控制。這些材料具有宿主的溶解性和相容性并且具有包嵌分子(guest molecule)(即允許成像的分子)的光學或生理特性。盡管樹枝狀大分子宿主可以根據介質的不同而改變，但是能夠給樹枝狀大分子宿主加載不同的化合物和不同的客體濃度水平。復合物和組合物可以涉及各種金屬或其它無機材料的應用。這些物質的高電子密度明顯簡化了通過電子顯微鏡術和相關散射技術的成像。此外，無機原子的特性引入了在存在或不存在干擾性生物材料下用于成像的新的和可測定的特性。在本發(fā)明的某些實施方案中，將包囊的金、銀、鈷、鐵原子/分子和/或無機染料分子，諸如熒光素包囊入樹枝狀大分子以便用作nanoscopic復合物標記/示蹤物，不過，可以使用有利于成像或檢測的任意材料。在一個優(yōu)選的實施方案中，成像劑為異硫氰酸熒光素。
在本發(fā)明的某些實施方案中，成像基于對研究的復雜物質的選擇的物理特性中密度的局部差異的被動或主動觀察結果。這些差異可能是因不同形狀(例如通過原子力顯微鏡檢查檢測的質量密度)、改變的組成(例如通過X射線檢測的射線不透性)、不同的光發(fā)射(例如通過分光光度法檢測的熒色物)、不同的衍射(例如通過TEM檢測的電子束)、對比的吸收(例如通過光學方法檢測的光)或專用的輻射發(fā)射(例如同位素方法)等所致。因此，成像的質量和靈敏度取決于觀察到的特性和使用的技術。癌細胞的成像技術必須提供對觀察小的局部濃度的選擇細胞的足夠水平的靈敏度。最初的癌標記鑒定需要高度選擇性(即通過適當靶向提供的高度特異性識別)和最高可能的靈敏度。
A.磁共振成像一旦靶向的納米裝置結合(或已經攝入)腫瘤細胞，則該裝置上的一種或多種組件用于使其位置成像。樹枝狀大分子已經用作生物醫(yī)學成像劑，對磁共振成像(MRI)而言，這可能是最值得注意的(例如，參見Wiener等Mag.Reson.Med.311(1994)；使用PAMAM樹枝狀大分子的實例)。這些試劑一般通過使螯合的順磁性離子，諸如Gd(III)-二亞乙基三胺五乙酸(Gd(III)-DTPA)與水溶性樹枝狀大分子綴合構成。本發(fā)明上下文中可以使用的其它順磁性離子包括但不限于釓、錳、銅、鉻、鐵、鈷、鉺、鎳、銪、锝、銦、釤、鏑、釕、鐿、釔和鈥粒子及其組合。在本發(fā)明的某些實施方案中，樹枝狀大分子還與靶向基團、諸如表皮生長因子(EGF)綴合，以便形成特異性結合所需細胞類型的綴合物(例如就表達EGF、EGFR的腫瘤細胞而言)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，如Wiener所述，DTPA通過DTPA的異硫氰酸酯與樹枝狀大分子結合(Wiener等Mag.Reson.Med.311(1994))。
樹枝狀大分子MRI試劑因樹枝狀大分子的多價性、大小和結構而特別有效，產生具有大質子馳豫強化、高分子反應性(relaxivity)和在靶部位上的高順磁性離子濃度的分子。樹枝狀大分子釓造影劑甚至已經用于使用動態(tài)MRI用來區(qū)分良性與惡性乳腺腫瘤，基于后一種類型的腫瘤圖像的脈管系統更為致密(Adam等Ivest.Rad.3126(1996))。因此，MRI提供了本發(fā)明特別有用的成像系統。
B.顯微鏡成像傳統上在患者體外進行癌細胞和組織的靜態(tài)結構顯微鏡成像。組織活組織檢查的傳統組織學提供了精細的例證性實例，并且已經證實為癌診斷和治療的有力輔助。取出后，由病理學者將樣本切成薄片(例如小于40微米)，染色，固定并且檢查。如果獲得圖像，那么它們最常見的是2-D傳送明視野投射影像。專用的染料用于提供選擇性對比，而在未染色的組織不幾乎不存在，并且還提供對異常細胞成分的鑒定。諸如在核倍性測定中使用計算機輔助的分析對亞細胞結構特征進行定量通常因組織學背景缺失而易混淆，這歸因于樣本和所有3-D信息缺乏。盡管存在靜態(tài)成像手段的局限，但是能夠鑒定活組織檢查組織中的瘤形成是非常重要的。此外，其應用通常為決定進行侵害性和危險性的化療、手術操作和放療組合中的關鍵因素，而化療、手術操作和放療通常伴隨嚴重的附帶組織損害、并發(fā)癥和甚至患者死亡。
本發(fā)明的納米裝置能夠進行腫瘤的功能性顯微鏡成像并且為成像提供改善的方法。這些方法應用于體內、體外和離體。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，設計本發(fā)明的樹枝狀大分子以便在接觸光時發(fā)射光或其它可檢測信號。盡管標記的樹枝狀大分子在外形上小于顯微鏡檢查技術的光學分辨率極限，但是它們在被激發(fā)時變成自我發(fā)光并且易于使用光學技術觀察到和可測定。在本發(fā)明的某些實施方案中，顯微鏡中的傳感熒光生物傳感器包括使用可調諧的激發(fā)和發(fā)射過濾器和微波源(Farkas等SPEI 2678200(1997))。在成像劑存在于較深的組織中的實施方案中，使用近紅外(NMR)中較長的波長(例如，參見Lester等Cel Mol.Biol.4429(1998))。已經使用樹枝狀大分子生物傳感觸角樣結構證實了近-IR中的樹枝狀大分子的生物傳感(Shortreed等J.Phys.Chem.，1016318(1997))。用于本發(fā)明的生物傳感器包括但不限于熒光染料和分子指示標。
在本發(fā)明的某些實施方案中，使用功能性成像技術進行體內成像。功能性成像為與靜態(tài)結構成像互補性的并且可能為比靜態(tài)結構成像更有效力的技術。已知功能性成像最好應用于在宏觀水平上，其中實例包括磁共振機能成像(fMRI)和正電子發(fā)射斷層攝影術(PET)。然而，也進行功能性顯微鏡成像并應用于活組織的體內和離體分析。功能性顯微鏡成像為3-D成像、3-D空間多譜體積排布和臨時取樣的有效組合簡言之，為一種3-D光譜顯微鏡影片循環(huán)類型。有意義的是，細胞和組織自發(fā)熒光。當被幾種波長激發(fā)時，提供眾多基本3-D結構需要在無特異性標記的情況下表征幾種細胞成分(例如核)。斜光照射也用于采集結構信息并且通常使用。與結構光譜的縮微成像(microimaging)相反，可以將光譜縮微成像用于使生理信號在細胞或組織內定位作用的生物傳感器。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，包含生物傳感器的本發(fā)明樹枝狀大分子用于使增量調節(jié)的受體家族成像，諸如葉酸鹽或EGF類。在這類實施方案中，功能性生物傳感由此涉及檢測與癌發(fā)生或惡性腫瘤、甚至在其早期階段相關的生理異常?？梢允褂帽景l(fā)明的組合物和方法使許多生理條件成像，包括但不限于檢測nanoscopic樹枝狀大分子生物傳感器的pH、氧濃度、Ca2+濃度和其它生理相關分析物。
V.生物學監(jiān)測成分本發(fā)明納米裝置的生物檢測或傳感成分為可以監(jiān)測由活性劑(例如通過納米裝置中的治療成分提供的治療劑)誘導的腫瘤細胞中的特定應答的成分。盡管本發(fā)明并不限于任何特定的監(jiān)測系統，但是本發(fā)明通過用于監(jiān)測癌癥腫瘤的方法和組合物來解釋。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，試劑誘導細胞中的細胞凋亡并且監(jiān)測涉及檢測細胞凋亡。在具體的實施方案中，監(jiān)測成分為在細胞凋亡發(fā)生時在特定波長下發(fā)熒光的試劑。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性活化監(jiān)測成分中的綠色熒光。已經轉變成紅色作為由具有紅色標記的特定標記靶向的結果的細胞凋亡性癌細胞變橙色，而殘留的癌細胞仍然為紅色。如果存在，那么被誘導進行細胞凋亡的正常細胞(例如通過附帶損害)會發(fā)綠色熒光。
在這些實施方案中，熒光基團，諸如熒光素用于監(jiān)測成分。熒光素易于通過獲自Molecular Probes，Inc.的異硫氰酸酯衍生物與樹枝狀大分子表面結合。這允許通過共聚焦顯微鏡，使用細胞使納米裝置成像。優(yōu)選通過使用熒光肽酶底物對納米裝置的的效力進行傳感。例如，由治療劑誘導的細胞凋亡導致肽酶天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(ICE)產生。Calbiochem銷售了大量用于這種酶的釋放熒光部分的肽底物。用于本發(fā)明的特別有用的肽為MCA-Tyr-Glu-Val-Asp-Gly-Trp-Lys-(DNP)-NH2(SEQ ID NO1)其中MCA為(7-甲氧基香豆素-4-基)乙?；⑶褼NP為2，4-二硝基苯基(Talanian等J.Biol.Chem.，2729677(1997))。在這種肽中，MCA基團具有顯著減弱的熒光，這是因熒光共振能轉移(FRET)至DNP基團所致。當酶裂解天冬氨酸與甘氨酸殘基之間的肽時，MCA和DNP得以分離，并且MCA基團強烈發(fā)出綠色熒光(在325nm處為最大激發(fā)并且在392nm處為最大發(fā)射)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，肽的賴氨酸末端與納米裝置連接，使得MCA基團在被裂解時釋放入胞質溶膠。肽的賴氨酸末端為綴合的有用的合成柄(handle)，因為，例如它可以與雙官能連接基，諸如Mal-PEG-Osu的活化酯基反應。因此，使用這些方法產生的靶細胞中綠色熒光的出現提供了一種清晰的指示，即細胞凋亡已經開始(如果細胞已經因存在聚集的量子點而具有紅色，那么細胞從合并的顏色變成橙色)。
應用于本發(fā)明的額外的熒光染料包括但不限于報導為對細胞凋亡性細胞中DNA改變敏感的吖啶橙(Abrams等Development11729(1993))和伴隨細胞凋亡的脂質過氧化敏感的順式-十八碳四烯酸(Hockenbery等Cell 75241(1993))。應注意所述的肽和熒光染料僅為舉例性的。預期有效起作為細胞凋亡結果產生的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶底物的作用的任意肽可應用于本發(fā)明。
VI.靶向成分如上所述，本發(fā)明的另一個組成部分在于納米裝置組合物能夠特異性靶向特定的細胞類型(例如腫瘤細胞)。盡管理解機理不一定能夠實施本發(fā)明并且本發(fā)明并不限于任何特定的作用機理，但是在某些實施方案中，納米裝置通過細胞表面部分靶向細胞(例如腫瘤性細胞)并且通過受體介導的胞吞被攝入細胞。
已知位于靶細胞(例如腫瘤細胞)表面上的任意部分可以應用于本發(fā)明。例如，定向于這類部分的抗體使本發(fā)明的組合物靶向至含有該部分的細胞表面?；蛘?，靶向部分可以為定向于存在于細胞表面上的受體的配體，或反之亦然。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，靶向部分為葉酸受體。在某些實施方案中，靶向部分為RGD肽受體(例如αVβ3整聯蛋白)。類似地，維生素也用于使本發(fā)明的治療劑靶向至特定的細胞。
在本發(fā)明的某些實施方案中，靶向部分還可以作為標記成分起作用。例如，腫瘤特異性抗原應用于本發(fā)明，包括但不限于癌胚抗原、前列腺特異性抗原、酪氨酸酶、ras、唾液路易絲抗原(sialyly lewis抗原)、erb、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、MN、gp100、gp75、p97、蛋白酶3、粘蛋白、CD81、CID9、CD63；CD53、CD38、CO-029、CA125、GD2、GM2和O-乙?；鵊D3、M-TAA、M-胎兒或M-泌尿?；蛘撸邢虿糠挚梢詾槟[瘤抑制蛋白、細胞因子、趨化因子、，腫瘤特異性受體配體、受體、細胞凋亡誘導物或分化劑。
預期用于靶向的腫瘤抑制蛋白包括但不限于p16、p21、p27、p53、p73、Rb、Wilns腫瘤(WT-1)、DCC、1型神經纖維瘤病(NF-1)、希-林(VHL)病腫瘤抑制蛋白、Maspin、Brush-1、BRCA-1、BRCA-2、多種腫瘤抑制蛋白(MTS)、人黑素瘤gp95/p97抗原、腎細胞癌-相關G250抗原、KS 1/4泛癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺特異性抗原、黑素瘤抗原gp75、CD9、CD63、CD53、CD37、R2、CD81、CO029、TI-1、L6和SAS。當然，這些僅為典型的腫瘤抑制蛋白并且預計本發(fā)明抗原可與任意其它為或成為本領域技術人員公知作為腫瘤阻抑制蛋白的活性劑聯用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，靶向定向于由癌基因表達的因子。它們包括但不限于酪氨酸激酶，既可以為膜-結合的，也可以為胞質形式的，諸如Src家族成員；絲氨酸/蘇氨酸激酶，諸如Mos；生長因子和受體，諸如血小板衍生的生長因子(PDDG)；SMALL GTPases(G蛋白)，包括ras家族、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cdk)、myc家族成員中的成員，包括c-myc、N-myc和L-myc以及bcl-2和家族成員。
本發(fā)明可以靶向的細胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、ILA 1、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、TNF、GMCSF、β-干擾素和γ-干擾素?？梢允褂玫内吇蜃影ǖ幌抻贛1P1α、M1P1β和RANTES。
本發(fā)明可以靶向的酶包括但不限于胞嘧啶脫氨酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、1-磷酸半乳糖尿苷酸轉移酶、苯丙氨酸羥化酶、葡糖腦苷脂酶(glucocerbrosidase)、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、HSV胸苷激酶和人胸苷激酶。
應用于本發(fā)明上下文中的受體及其相關配體包括但不限于葉酸受體、腎上腺素能受體、生長激素受體、黃體生成素受體、雌激素受體、表皮生長因子受體、成纖維細胞生長因子受體等。
應用于本發(fā)明靶向部分的激素及其受體包括但不限于生長激素、催乳素、胎盤催乳素、黃體生成素、促卵泡激素(foilicle-stimulatinghormone)、絨毛膜促性腺激素、促甲狀腺激素、瘦蛋白、促腎上腺皮質激素(ACTH)、血管緊張素I、血管緊張素II、β-內啡肽、β-促黑激素(β-MSH)、縮膽囊素、內皮素I、促生長激素神經肽、抑胃肽(GIP)、胰高血糖素、胰島素、支鏈淀粉、促脂解素、GLP-1(7-37)神經垂體激素運載蛋白和生長抑素。
此外，本發(fā)明預期置于納米裝置靶向成分中的維生素(脂溶性和非-脂溶性維生素)可以用于靶向具有這些維生素的受體，或否則就是吸收這些維生素的細胞。在這方面特別優(yōu)選的是脂溶性維生素，諸如維生素D及其類似物、維生素E、維生素A等或水溶性維生素，諸如維生素C等。
在本發(fā)明的某些實施方案中，任意數量的癌細胞靶向基團與樹枝狀大分子結合。靶向樹枝狀大分子依次與核心樹枝狀大分子綴合。因此，本發(fā)明的納米裝置使得它對靶向癌細胞具有特異性(即更不用說結合癌細胞且不與健康細胞結合)。此外，多價樹枝狀大分子能夠結合聚乙二醇(PEG)或聚乙基唑啉(PEOX)鏈以便有助于增加血液循環(huán)時間并且減少綴合物的免疫原性。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，靶向基團與具有短(例如直接偶聯)、中(例如使用小-分子雙官能連接基，諸如SPDP，由Pierce ChemicalCompany銷售)或長(例如PEG雙官能連接基，由Shearwater Polymers銷售)鍵的樹枝狀大分子綴合。因為樹枝狀大分子具有大量官能團，所以一種以上靶向基團可以與每一樹枝狀大分子結合。作為結果，在樹枝狀大分子與靶細胞之間存在多種結合情況。在這些實施方案中，樹枝狀大分子通過″協同結合″或多價相互作用效應對其靶細胞具有極高的親和力。
由于空間原因，所以配體越小，那么可以結合樹枝狀大分子表面的越多。近來，Wiener報導了具有結合的葉酸的樹枝狀大分子特別可以蓄積在表達高親和力葉酸受體(hFR)的腫瘤細胞表面和內部(Wiener等Invest.Radiol.，32748(1997))。hFR受體在上皮細胞瘤上得到表達或增量調節(jié)，包括乳腺癌。缺乏hFR的對照細胞未表現出葉酸鹽-衍生的樹枝狀大分子的顯著蓄積。葉酸可以與所有代的PAMAM樹枝狀大分子通過碳化二亞胺偶聯反應結合。葉酸為良好的樹枝狀大分子的靶向候選物，因為其具有較小的大小和簡單的綴合操作步驟。
較大的、而仍然屬于相對小的配體為表皮生長因子(EGF)，即帶有53個氨基酸殘基的單鏈。已經證實通過連接基SPDP與EGF綴合的PAMAM樹枝狀大分子結合至人神經膠質瘤細胞的表面并被胞吞(endocytosed)，從而蓄積在溶酶體中(Casale等Bio綴合物Chem.，77(1996))。由于EGF受體密度在腦腫瘤細胞上達到高于正常細胞上100倍，所以EGF提供了用于這些類型腫瘤的有用的靶向劑。因為EGF受體還在乳腺和結腸癌中超表達，所以EGF也可以用作這些細胞的靶向劑。類似地，成纖維細胞生長因子受體(EGER)也結合相對小的多肽類(FGF)，并且已知它們中的許多以高水平在乳腺腫瘤細胞系中得到表達(特別是附圖1、2和4)(Penault-Llorca等Int.J.Cancer61170(1995))。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，靶向部分為抗體或抗體的抗原結合片段(例如Fab單位)。例如，在許多癌(包括乳腺HER2腫瘤)表面上發(fā)現的得到充分研究的抗原為糖蛋白p185，它僅在惡性細胞中得到表達(Press等Oncogene 5953(1990))。甚至已經證實重組人源化抗-HER2單克隆抗體(rhuMabHER2)可抑制超表達HER2的乳腺癌細胞生長，并且在用于腫瘤晚期乳腺癌的III期臨床試驗中得到了評價(與常規(guī)化療劑結合)(Pegram等Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，14106(1995))。Park和Papahadjopoulos已經將rhuMabHER2的Fab片段與小單層脂質體進行了結合，然后可以給其加載化療劑多柔比星(dox)并且靶向至超表達HER2的腫瘤異種移植物(Park等Cancer Lett.，118153(1997)和Kirpotin等Biochem.，3666(1997))。這些加載了dox的″免疫脂質體″與相應的未靶向的加載dox的脂質體或游離dox相比，表現出對腫瘤增加的細胞毒性以及比游離dox降低的全身毒性。
可以產生抗體以便能夠靶向各種生物靶標(例如病原體、腫瘤細胞、正常組織)上的抗原或免疫原(例如腫瘤、組織或病原體特異性抗原)。這類抗體包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fab片段和Fab表達文庫。
在某些優(yōu)選的實施方案中，所述的抗體識別腫瘤特異性表位(例如TAG-72(Kjeldsen等Cancer Res.482214-2220(1988)；美國專利US5,892,020；5,892,019；和US5,512,443)；人癌抗原(美國專利US 5,693,763；US5,545,530；和US5,808,005)；來自骨瘤細胞的TP1和TP3抗原(美國專利US5,855,866)；來自腺癌細胞的Thomsen-Friedenreich(TF)抗原(美國專利US5,110,911)；來自人前列腺腺癌的″KC-4抗原″(美國專利US 4,708,930和US 4,743,543)；人結腸直腸癌抗原(美國專利US4,921,789)；來自膀胱腺癌的CA125抗原(美國專利US4,921,790)；來自人乳腺癌的DF3抗原(美國專利US4,963,484和US 5,053,489)；人乳腺腫瘤抗原(美國專利US4,939,240)；人黑素瘤p97抗原(美國專利US4,918,164)；癌或血清類粘蛋白-相關抗原(CORA)(美國專利US4,914,021)；與人鱗狀細胞肺癌反應但不與人小細胞肺癌反應的人肺癌抗原(美國專利US4,892,935)；人乳腺癌糖蛋白中的T和Tn半抗原(Springer等Carbohydr.Res.178271-292(1988))；命名的MSA乳腺癌糖蛋白(Tjandra等Br.J.Surg.75811-817(1988))；MFGM乳腺癌抗原(Ishida等Tumor Biol.1012-22(1989))；DU-PAN-2胰腺癌抗原(Lan等Cancer Res.45305-310(1985))；CA125卵巢癌抗原(Hanisch等Carbohydr.Res.17829-47(1988))；YH206肺癌抗原(Hinoda等(1988)Cancer J.42653-658(1988))。特別將上述各參考文獻引入本文作為參考。
在其它優(yōu)選的實施方案中，所述的抗體識別特異性病原體(例如侵肺軍團菌(Legionella peomophilia)、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenzae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、白喉棒桿菌(Cornebacteriumdiphtheria)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、人乳頭狀瘤病毒、人免疫缺陷癥病毒、德國麻疹病毒、脊髓灰質炎病毒等)。
本領域中公知的各種操作步驟可用于生產多克隆抗體。為了生產抗體，可以通過注射相應于所需表位的肽對各種宿主動物進行免疫接種，包括但不限于家兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個優(yōu)選的實施方案中，使所述的肽與免疫原性載體綴合(例如白喉類毒素、牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍蛋白(KLH))。各種佐劑用于根據宿主種類的不同增加免疫應答，包括弗氏(完全和不完全)佐劑；礦物凝膠，諸如氫氧化鋁；表面活性物質，諸如溶血卵磷脂；普盧蘭尼克多元醇類；聚陰離子；肽類；油乳劑；鑰孔血藍蛋白；二硝基苯酚；和潛在有用的人佐劑，諸如BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。
為了制備單克隆抗體，可以使用提供由培養(yǎng)物中的連續(xù)細胞系產生抗體分子的技術(例如，參見Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)。它們包括但不限于Kohler和Milstein研發(fā)的雜交瘤技術(Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975))；以及三源雜交瘤技術；人B-細胞雜交瘤技術(例如，參見Kozbor等Immunol.Today 472(1983))和產生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole等在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985)中所述)。
在本發(fā)明一個額外的實施方案中，可以使用最新技術在無菌動物中產生單克隆抗體(例如，參見PCT/US90/02545)。按照本發(fā)明，可以使用人抗體并且可以使用人雜交瘤(Cote等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2030(1983))或通過在體外用EBV病毒轉化人細胞B(Cole等在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，pp.77-96(1985)中所述)獲得該抗體。
按照本發(fā)明，為生產單鏈抗體描述的技術(美國專利US4,946,778；引入本文作為參考)可以適合于生產特異性單鏈抗體。本發(fā)明額外的實施方案使用了為構建Fab表達文庫描述的技術(Huse等Science 2461275-1281(1989))以便能夠快速和方便地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段。
可以通過公知技術產生含有抗體分子的獨特型(抗原結合區(qū))的抗體片段。例如，這類片段包括但不限于可以通過抗體分子的胃蛋白酶消化產生的F(ab′)2片段；可以通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵產生的Fab′片段；和可以通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產生的Fab片段。
在生產抗體的過程中，可以通過本領域公知的技術進行所需抗體的篩選(例如放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、″夾心式″免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、原位免疫測定(例如，使用膠態(tài)金、酶或放射性同位素)、蛋白質印跡、沉淀反應、聚集測定(例如凝膠聚集測定、血細胞凝集測定等)、補體結合測定、蛋白質A測定和免疫電泳測定等)。
本發(fā)明的樹枝狀大分子系統具有超過脂質體的許多優(yōu)點，諸如其更大的穩(wěn)定性、對大小和多分散性的更好控制，以及一般更低的毒性和免疫原性(例如，參見Duncan等Polymer Preprints 39180(1998))。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，抗-HER2抗體片段以及其它靶向抗體與樹枝狀大分子綴合，作為本發(fā)明納米裝置的靶向劑。
在某些實施方案中，就癌癥(例如乳腺癌)而言，用針對腫瘤相關抗原原MUC1、cMet受體和CD56(NCAM)的葉酸、EGF、FGF和抗體(或抗體片段)靶向細胞表面。一旦被攝入細胞，納米裝置就結合(通過綴合的抗體)HER2、MUC1或突變的p53。
雙官能連接基SPDP和SMCC和較長的Mal-PEG-OSu連接基特別用于抗體-樹枝狀大分子綴合。此外，許多腫瘤細胞含有結合寡糖類的表面凝集素，其中特異性識別主要歸因于后者的末端碳水化合物殘基(Sharon和Lis，Science 246227(1989))。合適的單糖類與非糖基化蛋白質、諸如BSA的結合提供了比游離單糖更緊密結合腫瘤凝集素的綴合物(Monsigny等Biochemie 701633(1988))。
甘露糖基化PAMAM樹枝狀大分子結合甘露糖苷-結合凝集素比單體甘露糖苷結合甘露糖苷-結合凝集素更為緊密達400倍以上(Page和Roy，生物綴合物Chem.，8714(1997))。唾液酸化樹枝狀大分子和其它樹枝狀聚合物在體外和體內結合和抑制各種唾液酸鹽-結合病毒。通過使多單糖殘基(例如用于結合半乳糖的細胞的α-半乳糖苷)與樹枝狀大分子綴合，產生對相應類型腫瘤細胞具有高度親和力的多價綴合物。所述附著反應易于通過末端胺類與商購α-半乳糖基-苯基異硫氰酸酯反應來進行。碳水化合物的小尺寸允許高濃度存在于樹枝狀大分子表面上。
鑒定和選擇合適的肽靶向基團的極為靈活的方法為噬菌體展示技術(例如，參見Cortese等Curr.Opin.Biotechol.，673(1995))，其可以使用商購試劑盒便利地進行。噬菌體展示方法產生附著于噬菌體表面的肽類的大而不同的組合文庫，篩選針對固定化表面受體的肽類用于緊密結合。在緊密結合后，分離病毒構建體并且測序以便鑒定肽序列。使用最佳肽類作為用于下一個肽文庫的起點重復該循環(huán)。最終鑒定了合適的高親和力肽類且然后對其篩選生物相容性和靶特異性。在這種方式中，能夠產生可以綴合樹枝狀大分子的肽類，從而產生具有對靶細胞受體(例如腫瘤細胞受體)或其它所需靶標具有高度特異性和親和力的多價綴合物。
涉及上述靶向手段的為″預靶向″手段(例如，參見Goodwin和Meares，Cancer(suppl.)802675(1997))。該策略的實例包括開始用腫瘤特異性單克隆抗體和鏈霉抗生物素蛋白綴合物治療患者。使用合適的生物素化清除劑從血流中除去剩余的可溶性綴合物。當定位于腫瘤的綴合物均保留時，導入生物素化劑，由此通過強力和特異性生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用定位于腫瘤部位。因此，以與癌細胞接近的劑量使放射性劑量最大化并且將它在可能損害健康細胞的剩余部分身體中的量減少到最低限度。
已經證實，如果首先用生物素化樹枝狀大分子處理結合聚苯乙烯的鏈霉抗生物素蛋白分子且然后引入放射性標記的鏈霉抗生物素蛋白，那么每個聚苯乙烯-結合的鏈霉抗生物素蛋白中有達4個標記的鏈霉抗生物素蛋白分子(Wilbur等Bio綴合物Chem.，9813(1998))。因此，生物素化樹枝狀大分子可以用于本發(fā)明的方法中，從而作為用于體內放射性標記的多價受體起作用，其中對所得的每次結合的抗體綴合物中的放射性劑量進行擴大。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，簇狀樹枝狀大分子上的一種或多種多-生物素化組件提供了放射性標記或硼酸化(Barth等Cancer Investigation 14534(1996))抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的多價靶標，從而再次產生用于腫瘤細胞的擴大的放射劑量。
樹枝狀大分子還可以用作清除劑，例如，通過使具有多價半乳糖或甘露糖表面的樹枝狀大分子部分生物素化來進行。然后綴合物-清除劑復合物可以對相應的肝細胞受體具有極強的親和力。
在本發(fā)明其它的實施方案中，增強的滲透性和保留(EPR)方法用于靶向。增強的滲透性和保留(EPR)效應為更″被動的″靶向腫瘤方式(參見Duncan和Sat，Ann.Oncol.，939(1998))。EPR效應為由腫瘤的超滲透性脈管系統和極弱的淋巴管引流導致的大分子和小顆粒在腫瘤微環(huán)境中的選擇性集中。本發(fā)明的樹枝狀大分子組合物為此應用提供了理想的聚合物，即它們相對較硬，多分散性有限，大小和表面化學受控以及具有可以攜帶且然后釋放抗腫瘤藥物的內部″負荷″空間。實際上，已經證實PAMAM樹枝狀大分子-鉑酸鹽可蓄積在實體瘤內(Pt水平高于使用順鉑獲得的Pt水平約50倍)，并且具有順鉑對其不具有作用的實體瘤模型中的體內活性(Malik等Proc.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.，24107(1997)和Duncan等Polymer Preprints39180(1998))。
本發(fā)明的靶向部分可以識別生物靶標(例如病原體上)上的各種其它表位。在某些實施方案中，引入分子識別元件以便識別、靶向或檢測各種病原生物體，包括但不限于靶向HIV(Wies等Nature 333426(1988))、流感(White等Cell 56725(1989))、衣原體屬(Chlamydia)(Infect.Imm.572378(1989))、腦膜炎萘瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、沙門氏菌屬(Salmonella)、腮腺炎、新城疫和各種病毒的唾液酸，所述的病毒包括呼腸病毒、仙臺病毒和粘液病毒；和靶向冠形病毒、腦脊髓炎病毒和輪狀病毒的9-OAC唾液酸；檢測巨細胞病毒(Virology176337(1990))和麻疹病毒(Virology 172386(1989))的非-唾液酸糖蛋白；靶向HIV的CD4(Khatzman等Nature 312763(1985))、腸道血管活性肽(Sacerdote等J.of Neuroscience Research 18102(1987))和肽T(Ruff等FEBS Letters 21117(1987))；靶向牛痘的表皮生長因子(Epstein等Nature 318663(1985))；靶向狂犬病的乙酰膽堿受體(Lentz等Science 215182(1982))；靶向EB病毒的Cd3補體受體(Carel等J.Biol.Chem.26512293(1990))；靶向呼腸病毒的β-腎上腺素能受體(Co等Proc.Natl.Acad.Sci.821494(1985))；靶向鼻病毒的ICAM-1(Marlin等Nature 34470(1990))、N-CAM和髓磷脂-相關糖蛋白MAb(Shephey等Proc.Natl.Acad.Sci.857743(1988))；靶向脊髓灰質炎病毒的脊髓灰質炎病毒受體(Mendelsohn等Cell 56855(1989))；靶向皰疹病毒的成纖維細胞生長因子受體(Kaner等Science 2481410(1990))；靶向大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)的寡甘露糖；靶向腦膜炎萘瑟氏球菌(Neissetia meningitidis)的神經節(jié)苷脂G.sub.M1；和檢測廣泛各種病原體的抗體(例如淋病奈瑟氏球菌(Neissetiagonorrhoeae)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、霍亂弧菌(V.cholerae)和解藻朊酸弧菌(V.alginolyticus))。
在本發(fā)明的某些實施方案中，靶向部分優(yōu)選為核酸(例如RNA或DNA)。在某些實施方案中，設計核酸的靶向部分以便通過堿基配對與特定核酸(例如染色體DNA，mRNA或核糖體RNA)雜交。在其它實施方案中，核酸結合配體或生物靶標。已經鑒定了結合下列蛋白質的核酸HIV的逆轉錄酶、Rev和Tat蛋白(Tuerk等Gene 137(1)33-9(1993))；人神經生長因子(Binkley等Nuc.Acids Res.23(16)3198-205(1995))；和血管內皮生長因子(Jellinek等Biochem.83(34)10450-6(1994))。優(yōu)選通過SELEX操作步驟鑒定結合配體的核酸(例如，參見美國專利US5,475,096；US5,270,163；和US5,475,096；和在PCT公開號WO 97/38134、WO 98/33941和WO 99/07724，將所有這些文獻引入本文作為參考)，不過許多方法為本領域中公知的。
VII.合成和綴合本發(fā)明提供了納米裝置中的各組分(即含有上述成分中的一種或多種的各樹枝狀大分子)合成和形成以及這類組分與樹枝狀大分子綴合的描述。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，按照典型分支(由引發(fā)劑核構成大分子)合成制備PAMAM樹枝狀大分子。它包括兩步生長順序，由氨基與丙烯酸甲酯(MA)的雙鍵的Michael加成，隨后用乙二胺(EDA)使所得末端甲酯基--(CO2CH3)酰胺化組成。
在該方法的第一步中，使氨在47℃下和惰性氮氣環(huán)境中與MA(摩爾比1∶4.25)反應48小時。所得化合物稱作第0代星形-支化PAMAM三-酯。下一步包括使三-酯與過量的EDA反應而產生星形-支化的PAMAM三-胺(G＝O)。在惰性氣體(氮氣)環(huán)境和甲醇中進行該反應并且需要在0℃下48小時完成。重復此Michael加成和酰胺化順序產生第1代。
這種三-胺的制備完成了PAMAM樹枝狀大分子的分支合成的第一個完整循環(huán)。重復該反應順序導致合成較高代的(G＝1-5)樹枝狀大分子(即分別為酯-和胺-封端的分子)。例如，第二次重復這一順序產生分別帶有六-酯和六-胺表面的第1代。按照與所有隨后1-9代相同的方式進行相同的反應，從而構成了產生核心-外殼結構的分支單元層，該結構如上所示具有精確的分子量和端基數量。可以通過水解-酯封端的PAMAM樹枝狀大分子或使琥珀酸酐與以胺為表面的樹枝狀大分子(例如全代PAMAM、POPAM或POPAM-PAMAM雜交樹枝狀大分子)反應產生以羧酸酯為表面的樹枝狀大分子。
可以基于啟動聚合過程的核心結構合成各種樹枝狀大分子。這些核心結構指定了樹枝狀大分子的結構重要特征，諸如總體形狀、密度和表面官能度(Tomalia等Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，295305(1990))。來源于氨的球形樹枝狀大分子具有三價引發(fā)劑核心，而EDA為四-價引發(fā)劑核心。近來，已經報導了棒形樹枝狀大分子基于不同長度的線性聚(乙烯亞胺)核心，核心越長，則棒越長(Yin等J.Am.Chem.Soc.，1202678(1998))。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的樹枝狀大分子包含被保護的核心二胺。在特別優(yōu)選的實施方案中，被保護的引發(fā)劑核心二胺為NH2-(CH2)n-NHPG(n＝1-10)。在其它優(yōu)選的實施方案中，引發(fā)劑核心選自下組，包括但不限于NH2-(CH2)n-NH2(n＝1-10)、NH2-((CH2)nNH2)3(n＝1-10)或未取代或取代的1，2-；1，3-；或1，4-亞苯基二-正-烷基胺，其中在每代酰胺形成過程中使用單被保護的二胺(例如NH2-(CH2)n-NHPG)。在這些手段中，被保護的二胺能夠大規(guī)模產生樹枝狀大分子，而不產生不均勻的可能使表征和分析產生困難的納米結構。通過將二胺的反應性僅限于一個末端，二聚體/聚合物形成和分子內反應的機會就會被消除而無需使用大量過量的二胺。易于純化末端單被保護的中間體，因為保護基為通過傳統技術、如結晶和/或色譜進行生產純化提供合適的處理。
可以在脫保護步驟中使被保護的中間體脫保護，并且使所得代的樹枝狀大分子進行接下來的反復化學反應而無需純化，本發(fā)明并不限于特定的保護基。實際上，關注各種保護基，包括但不限于叔丁氧基氨基甲酸酯(N-t-Boc)、烯丙氧基氨基甲酸酯(N-Alloc)、芐基氨基甲酸酯(N-Cbz)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(FMOC)或鄰苯二甲酰亞胺(Phth)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，保護基為芐基氨基甲酸酯(N-Cbz)。N-Cbz對本發(fā)明而言是理想的，因為它易于在″中性″條件下通過催化氫化(Pd/C)被裂解，而無需采取強酸或堿條件除去F-MOC。被保護的單體特別應用于高流通量生產過程，因為可以使用較低量的單體，從而降低了生產成本。
可以通過任意合適的分析技術表征樹枝狀大分子的大小和均勻性。它們包括但不限于原子力顯微鏡檢查法(AFM)、電噴射離子化質譜、MALDI-TOF質譜、13C核磁共振分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、大小排阻色譜法(SEC)(安裝了多角度激光散射、雙重UV和折射指數檢測器)、毛細管電泳和凝膠(get)電泳。這些分析方法可以確保樹枝狀大分子群體的均勻性并且在樹枝狀大分子生產的質量控制方面是重要的，以便最終在體內施用中的應用。最重要的是，已經使用樹枝狀大分子進行了廣泛工作，當通過靜脈內給予時，未顯示出毒性證據(Roberts等J.Biomed.Mater.Res.，3053(1996)和Boume等J.Magnetic Resonance Imaging，6305(1996))。
VIII.納米裝置抗腫瘤功效和毒性的評價可以使用本發(fā)明的納米裝置評價不同治療劑對癌細胞系和原代細胞培養(yǎng)物的抗腫瘤作用。例如，在優(yōu)選的實施方案中，使用建立的腫瘤細胞系模型或原代培養(yǎng)細胞(參見例如實施例10-12)在體外進行試驗，或者，可以使用動物模型在體內進行試驗(參見例如實施例13)。
A.體外人腫瘤細胞細胞凋亡誘導的定量在本發(fā)明的一個典型實施方案中，本發(fā)明的納米裝置用于檢測體外人腫瘤細胞的細胞凋亡。對細胞中細胞凋亡的測試確定了治療劑的功效?？梢郧覒獪y定細胞凋亡的多個方面。這些方面包括那些如上所述的方面以及如下方面，包括但不限于對磷脂酰絲氨酸(PS)從質膜內易位到外表面的測定；DNA片段化的測定；細胞凋亡相關蛋白質的檢測；和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3活性的測定。
B.體外毒理學在本發(fā)明的某些實施方案中，為了獲得對特定納米裝置平臺或該系統組分的安全性的一般性洞察，進行毒性測試。毒理學信息可以來源于許多來源，包括但不限于歷史數據庫、體外測試和體內動物研究。
近年來體外毒理學方法已經得到了普及，這是因對動物實驗的選擇需要的增加和可能的倫理、經濟和科學價值的感知的增加所致。體外毒性測試系統具有許多優(yōu)勢，包括改善的功效、降低的成本和實驗之間的變異性降低。這些系統還減少了動物的使用、消除了混亂的全身作用(例如免疫性)并且控制了環(huán)境條件。
盡管任何體外測試系統可以用于本發(fā)明，但是用于體外實驗的最常用手段為使用培養(yǎng)的細胞模型。這些系統包括新鮮分離的細胞、原代細胞或轉化的細胞培養(yǎng)物。作為研究體外毒理學的細胞培養(yǎng)物因快速篩選多種培養(yǎng)物而是有利的，從而在細胞、亞細胞或分子水平上鑒定和評價毒性作用是有用的。體外細胞培養(yǎng)方法通常通過測定膜的完整性、代謝活性和亞細胞干擾而顯示出基本的細胞毒性。常用的膜完整性指示劑包括細胞存活率(細胞計數)、克隆擴充試驗、錐蟲藍排除、胞內酶釋放(例如乳酸脫氫酶)、小離子(K1、Ca2+)的膜滲透性和小分子(例如51Cr、琥珀酸鹽)的胞內Ala蓄積。亞細胞干擾包括例如通過MTT試驗監(jiān)測線粒體酶活性水平、測定細胞三磷酸腺苷(ATP)水平、中性紅攝入溶酶體和對總蛋白質合成定量。代謝活性指示劑包括谷胱甘肽含量、脂質過氧化(peroxiidation)和乳酸鹽/丙酮酸鹽比例。
C.MTT測定法MTT試驗為快速、精確和可靠的獲得細胞存活率測定值的方法。MTT測定法首先由Mosmann(Mosmann，J.Immunol.Meth.，6555(1983))研發(fā)。它是一種許多實驗室已經用于獲得毒性結果的簡單的比色測定法(例如，參見Kuhlmann等Arch.Toxicol.，72536(1998))。簡言之，線粒體產生ATP以便為細胞提供足夠的能量。為了達到這一目的，線粒體代謝丙酮酸鹽而產生乙酰CoA。在線粒體內，乙酰CoA與不同的酶在三羧酸循環(huán)中反應，得到隨后產生的ATP。特別用于MTT測定的酶為琥珀酸脫氫酶。MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2二苯基四唑鹽)為一種通過琥珀酸脫氫酶裂解而形成紫色甲產物的黃色底物。色素改變鑒定了線粒體功能的改變。不存活的細胞胞內不能產生甲，且由此直接產生的量與存活細胞的量相關。540nm處的吸收度用于測定甲產物的量。
將體外試驗結果與體內毒性試驗比較以便推斷得到活的動物條件(例如參見實施例13)。一般而言，評價單劑量物質的急性毒性。在14天內監(jiān)測動物的任何毒性征兆(體溫增加、呼吸困難、死亡等)。按照傳統，急性毒性標準為半數致死量(LD50)，其為致半數治療群體死亡時的預測劑量。測定該劑量通過使測試動物在受控條件下接觸幾何學系列的劑量來進行。其它試驗包括亞急性毒性測試，它測定動物對重復劑量的納米裝置不超過14天的反應。亞慢性毒性測試包括將重復劑量測試90天。慢性毒性測試與亞慢性測試相似，但是可以持續(xù)90-天期限以上。還可以進行體內測試以便測定某些組織方面的毒性。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，測定了腫瘤毒性(即本發(fā)明組合物對腫瘤組織存活的作用)(例如通過檢測腫瘤組織大小和/或生長的改變)。
IX.基因療法載體在本發(fā)明的具體實施方案中，樹枝狀大分子組合物包含用于在體外、離體或體內遞送至靶細胞或組織并且用于表達的轉基因。在這類實施方案中，樹枝狀大分子復合物包含表達載體構建體而不含實際的蛋白質，所述的表達載體構建體例如含有編碼所關注基因的異源DNA和有利于所關注的特定蛋白質在靶細胞中產生的各種調節(jié)元件。
在某些實施方案中，基因為用于治療癌癥、取代缺陷基因的治療基因或用于選擇或監(jiān)測目的的標記或報道基因。就基因療法載體而言，基因可以為DNA的異源片段。異源DNA可以來源于一種以上來源(即多基因構建體或融合蛋白)。此外，異源DNA可以包括來源于一種來源的調節(jié)序列和來源于不同來源的基因。
組織-特異性啟動子可以用于影響特定組織或細胞中的轉錄以便降低對非靶向組織的潛在的毒性或不需要的作用。例如，諸如PSA、probasin、前列腺酸性磷酸酶或前列腺-特異性腺激肽釋放酶(hK2)這類啟動子可以用于靶向前列腺中的基因表達。類似地，啟動子可以用于靶向其它組織中的基因表達(例如胰島素、彈性蛋白淀粉酶pdr-1、pdx-1和葡萄糖激酶啟動子靶向至胰腺；白蛋白PEPCK、HBV增強子、α胎兒球蛋白載脂蛋白C、α-1抗胰蛋白酶、卵黃原蛋白、NF-AB和運甲狀腺素蛋白啟動子靶向至肝；肌球蛋白H鏈、肌酸激酶、營養(yǎng)障礙基因、鈣蛋白酶p94、骨骼α-肌動蛋白、快肌鈣蛋白1啟動子靶向至骨骼?。唤堑鞍讍幼影邢蚱つw；sm22α；SM-.α.-肌動蛋白啟動子靶向平滑??；CFTR；人細胞角蛋白18(K18)；肺表面活性蛋白A、B和Q CC-10；P1啟動子靶向肺組織；內皮素-1；E-選擇蛋白；馮維勒布蘭德因子；KDR/flk-1靶向內皮；酪氨酸酶靶向黑素細胞)。
核酸可以為cDNA或基因組DNA。核酸可以編碼任意合適的治療蛋白。優(yōu)選核酸編碼腫瘤抑制蛋白、細胞因子、受體、細胞凋亡誘導物或分化劑。核酸可以為反義核酸。在這類實施方案中，可以將反義核酸引入表達載體環(huán)境外部的本發(fā)明的納米裝置。
在優(yōu)選的實施方案中，核酸編碼腫瘤抑制蛋白、細胞因子、受體或細胞凋亡誘導物。合適的腫瘤抑制蛋白包括BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p211、p53、p73或Rb。合適的細胞因子包括GMCSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-干擾素、γ-干擾素或TNF。合適的受體包括CFTR、EGFR、雌激素受體、IL-2受體或VEGFR。合適的細胞凋亡誘導物包括AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakiri或ICE-CED3蛋白酶。
X.聯合療法的方法耐受DNA損傷劑的腫瘤細胞代表了臨床腫瘤學中的主要問題。本發(fā)明的納米裝置通過有效給予聯合療法手段提供改善這一難題的方式。然而，應注意傳統的聯合療法可以與本發(fā)明的納米裝置聯用。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，可以在傳統療法之前、之后或與傳統療法聯合使用納米裝置。
為了在聯合療法中使用本發(fā)明的方法和組合物殺傷細胞，抑制細胞生長或轉移或血管發(fā)生，乃至使腫瘤細胞的惡性表型逆轉或減少，使″靶″細胞接觸本文所述納米裝置組合物和至少一種其它活性劑。以有效殺傷或抑制細胞組織的聯合用量提供這些組合物。該方法可以包括使細胞同時接觸所述的免疫治療劑和所述的活性劑或因子?？梢酝ㄟ^使細胞接觸包括兩種活性劑的單一組合物或藥物制劑，或通過使細胞同時接觸兩種不同組合物或制劑來實現這一目的，其中一種組合物包括例如表達構建體，而另一種組合物包括治療劑。
或者，納米裝置腫瘤可以在間隔幾分鐘到幾周在另一種活性劑治療之前或之后進行。在另一種活性劑和免疫療法單獨應用于細胞的實施方案中，一般可以確保顯著的時間期限不會在每次遞送時間之間中斷，使得活性劑和納米裝置仍然能夠對細胞發(fā)揮有利的聯合作用。在這類情況中，預期使細胞在約12-24小時內，并且更優(yōu)選在約6-12小時內彼此接觸兩種這兩種形式(modality)，最優(yōu)選僅約12小時的延遲時間。然而，在某些情況中，需要為治療顯著延長時間期限，其中在相應的給藥之間存在幾天(2-7)到幾周(1-8)的推移。
在某些實施方案中，使用一種以上本發(fā)明免疫治療組合物或其它活性劑的給藥。可以使用各種組合，其中樹枝狀大分子為″A″，而另一種活性劑為″B″，以如下為典型
A/B/A，B/A/B，B/B/A，A/A/B，B/A/A，A/B/B，B/B/B/A，B/B/A/B，A/A/B/B，A/B/A/B，A/B/B/A，B/B/A/A，B/A/B/A，B/A/A/B，B/B/B/A，A/A/A/B，B/A/A/A，A/B/A/A，A/A/B/A，A/B/B/B，B/A/B/B，B/B/A/B。
也預期其它組合。此外，為了實現殺傷細胞，以有效殺傷或使細胞失去活力的聯合用量將兩種活性劑遞送至細胞。
可以用于與本發(fā)明納米裝置的聯合療法的其它因素包括但不限于產生DNA損害的因素，諸如.γ.-射線、X-射線和/或放射性同位素至腫瘤細胞的定向遞送。還關注其它形式的DNA損害因素，諸如微波和UV-照射。X-射線的劑量范圍在50-200倫琴的每日劑量，持續(xù)延長的時間期限(3-4周)，到2000-6000倫琴的單劑量。放射性同位素的劑量范圍可以廣泛改變，并且取決于同位素的半衰期、發(fā)射的射線的強度和類型以及被腫瘤性細胞的攝入量。本領域技術人員參照″Remington′s Pharmaceutical Sciences″15th Edition，chapter 33，特別是624-652頁。劑量上的某些變化當然取決于所治療的受試者的病情。負責給藥的人在任何情況下均可以決定對個體受試者的合適劑量。此外，對人體給藥而言，制劑應滿足如FDA Office of Biologics標準所要求的無菌性、熱原性、全身安全性和純度標準。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，將納米裝置對患有癌癥的患者的局部遞送用于使遞送活性劑的治療有效性最大化。類似地，可以使包含一種或多種官能團的納米裝置(例如治療劑，諸如化療劑或放療劑)定向于受試者身體特定的受侵害區(qū)域?；蛘?，在某些情況中，全身遞送納米裝置(nanodevide)(例如包含治療劑、靶向劑和/或成像劑的樹枝狀大分子)是合適的，例如，其中已經發(fā)生廣泛轉移或懷疑發(fā)生轉移。
除合并納米裝置與化療和放療外，還關注使用傳統的基因療法。例如，靶向p53或p16突變與納米裝置的治療可以提供改善的抗癌治療。本發(fā)明關注與其它治療相關基因的共同治療，包括但不限于p21、Rb、APC、DCC、NF-I、NF-2、BCRA2、p16、FHIT、WT-I、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC、ras、myc、neu、raf erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl和abl。
使用為用于特定受試者的特定構建體的基因遞送而研發(fā)的合適的方法施用體內和離體治療。例如，就病毒載體而言，一般將1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109，1×1010，1×1011或1×1012感染顆粒遞送至患者?？梢酝ㄟ^比較相應的攝取效率對脂質體或其它非病毒制劑推定類似的數據。
本發(fā)明有吸引力的特征在于可以通過醫(yī)用裝置將治療組合物遞送至患者的局部位置。適用于本發(fā)明的醫(yī)用裝置包括已知用于治療劑局部遞送的裝置。這類裝置包括但不限于導管，諸如注射導管、球形導液管、雙球形導液管、微孔性球形導液管、通道球形導液管、輸注導管、灌流導管等，例如，給它們涂敷治療劑或通過它們給予活性劑；針狀注射裝置，諸如皮下注射針和針狀注射導管；針狀注射裝置，諸如噴射注射器；涂敷的支架、分叉的支架、血管移植物等；和涂敷的血管-咬合裝置，諸如金屬線圈。
典型的裝置描述在美國專利US5,935,114；US5,908,413；US5,792,105；US5,693,014；US5,674,192；US5,876,445；US5,913,894；US5,868,719；US5,851,228；US5,843,089；US5,800,519；US5,800,508；US5,800,391；US5,354,308；US5,755,722；US5,733,303；US5,866,561；US5,857,998；US5,843,003；和US5,933,145；將這些文獻的全部內容引入本文作為參考。商購和可以用于本發(fā)明的典型支架包括RADIUS(Scimed LifeSystems，Inc.)、SYMPHONY(Boston Scientific Corporation)、Wallstent(Schneider Inc.)、PRECEDENT II(Boston ScientificCorporation)和NIR(Medinol Inc.)。通過公知技術將這類裝置遞送至和/或植入體內的靶位置。
XI.光動力療法在某些實施方案中，本發(fā)明的治療復合物包含對患者給予的光動力化合物和靶向劑。在某些實施方案中，然后使靶向劑與″靶″細胞結合一定時間期限(例如約1分鐘-24小時)，從而形成靶細胞-靶向劑復合物。在某些實施方案中，然后照射包含靶向劑和光動力化合物的治療復合物(例如用紅光激光器、白熾燈、X-射線或濾過的日光)。在某些實施方案中，使光定向于頸靜脈或某些其它表淺血管或淋巴管。在某些實施方案中，單線態(tài)氧和自由基從光動力化合物擴散至靶細胞(例如癌細胞或病原體)，從而導致其破壞。
XII.藥物制劑在本發(fā)明的某些實施方案中，如果關注臨床應用，那么制備納米裝置作為適合于指定應用的形式藥物組合物的組成部分。一般而言，這要求制備基本上不含熱原和其它可能對人或動物有害的雜質的組合物。然而，在本發(fā)明的某些實施方案中，使用本文所述途徑中的一種或多種給予直鏈樹枝狀大分子制劑。
在優(yōu)選的實施方案中，將納米裝置與合適的鹽和緩沖液聯用以便以穩(wěn)定的形式遞送組合物，從而能夠被靶細胞攝取。當將納米裝置導入患者時，還可以使用緩沖液。含水組合物包含對分散于藥學上可接受的載體或含水介質中的細胞而言有效量的納米裝置。這類組合物也稱作接種物。術語″藥學上可接受的或藥理學上可接受的″意旨在對動物或人給予時不產生不利、過敏性或其它不良反應的分子本體和組合物。本文所用的術語″藥學上可接受的載體″包括任意和所有的溶劑、分散介質、包衣材料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。除與本發(fā)明載體或細胞不相容的任何常用介質或試劑外，各種它們在治療組合物中的應用。還可以將補充的活性組分摻入組合物。
在本發(fā)明的某些實施方案中，活性組合物包括傳統的藥物制劑。本發(fā)明這些組合物的給藥通過任意常用的途徑進行，只要靶組織可通過該途徑得到。這種途徑包括口服、鼻部、口含、直腸、陰道或局部?；蛘?，給藥可以通過常位、真皮內、皮下、肌內、腹膜內或靜脈內注射進行。
還可以通過非腸道或腹膜內或腫瘤內給予活性納米裝置。制備作為游離堿或藥理學可接受的鹽的活性化合物在適當混合有表面活性劑，諸如羥丙基纖維素的水中的溶液。還可以制備在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中的分散體。在常規(guī)的儲存和使用條件下，這些制劑含有防止微生物生長的防腐劑。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了包含樹枝狀大分子的組合物，所述的樹枝狀大分子包含靶向劑、治療劑和成像劑。在優(yōu)選的實施方案中，將樹枝狀大分子在體內遞送治療劑(例如甲氨蝶呤)至腫瘤細胞(參見例如實施例13，附圖27)。在某些實施方案中，使治療劑通過酸敏感性連接基與樹枝狀大分子綴合。因此，在某些實施方案中，在靶細胞內(例如內含體內)治療劑從樹枝狀大分子上釋放。關注這種類型的胞內釋放(例如酸敏感性連接基的內體(endosomal)破壞)以便提供對本發(fā)明組合物和方法額外的特異性。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的樹枝狀大分子(例如G5PAMAM樹枝狀大分子)在表面上含有100-150個伯胺類(例如，參見實施例13)。因此，本發(fā)明提供了具有綴合官能團的多個反應位點(例如100-150個)的樹枝狀大分子，所述的官能團包括但不限于治療基、靶向劑、成像劑和生物監(jiān)測劑。
無論本發(fā)明的樹枝狀大分子組合物是否包含熒光素(例如FITC)成像劑，預期本發(fā)明的組合物和方法是同樣有效的(例如，參見實施例13)。因此，存在于樹枝狀大分子組合物上的各官能團能夠與其它官能團獨立地起作用。因此，本發(fā)明提供了可以包含多種靶向、治療、成像和生物監(jiān)測官能團的組合的樹枝狀大分子。
本發(fā)明還提供了將分子(例如治療和成像官能團)遞送至靶細胞(例如癌細胞)內部的極為有效和特異性的方法。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了包含或需要將分子遞送入細胞以便起作用的療法(例如遞送遺傳物質，siRNAs)。
在某些實施方案中，適合于注射應用的藥物劑型包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。載體可以為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油的溶劑或分散介質。例如，可以通過使用包衣材料，諸如卵磷脂，就分散液而言通過維持所需顆粒大小并且通過使用表面活性劑來維持適當的流動性?？梢杂酶鞣N抗菌劑、抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等產生預防微生物的作用。在許多情況中，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖類或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中使用延緩吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠延長可注射組合物的吸收。
通過將所需量的活性化合物摻入含有上述各種其它組分的合適的溶劑制備無菌可注射溶液，如果需要，隨后進行無菌過濾來制備無菌可注射溶液。一般而言，通過將各種無菌活性組分摻入含有堿性分散介質和來自上述那些的所需其它組分的無菌媒介物中制備分散液。就用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術，它們可由上述無菌過濾溶液產生活性組分與任意額外所需的組分的粉末。
在配制時，以與劑型相容的方式和諸如治療上有效的這類用量給予樹枝狀大分子組合物。易于以各種劑型，諸如可注射溶液、藥物釋放膠囊等給予制劑。例如，就以水溶液進行非腸道給藥而言，如果必要，將該溶液適當緩沖，并且液體稀釋劑首先使與足夠的鹽水或葡萄糖等滲。這些特定的水溶液尤其適合于靜脈內、肌內、皮下和腹膜內給藥。例如，可以將一種劑量溶于1ml等滲NaCl溶液并且加入到1000ml皮下輸液中或在指定的輸注部位注射(例如，參見″Remington′sPharmaceutical Sciences″15th Edition，1035-1038和1570-1580頁)。在本發(fā)明的某些實施方案中，在治療混合物中活性顆粒或活性劑的配制量約占0.0001-1.0毫克，或約0.001-0.1毫克或約0.1-1.0，乃至約10毫克/劑量等?？梢越o予多劑量。
適合于其它給藥方式的額外制劑包括陰道栓劑和陰道栓。還可以使用直腸陰道栓或栓劑。栓劑為不同重量和形狀的通常含藥的固體劑型，它用于插入直腸、陰道或尿道。插入后，栓劑軟化、熔化或溶于腔液。一般就栓劑而言，傳統粘合劑和載體可以包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酯類；這類栓劑可以由含有0.5％-10％，優(yōu)選1％-2％的活性組分的混合物形成。陰道栓劑或陰道栓通常為球形的或卵形的并且各自重約5g。陰道用藥物以各種物理形式獲得，例如霜劑、凝膠或液體，它們已經脫離了傳統的栓劑概念。此外，栓劑可以用于結腸癌。還可以將納米裝置配制成用于治療肺癌等的吸入劑。
XIII.治療或預防癌癥和病原性疾病的方法在本發(fā)明具體的實施方案中，提供了在癌癥療法中治療腫瘤的方法和組合物(例如，參見實施例13)。預期本發(fā)明的療法可以用于治療已經鑒定了特異性標記或可以靶向的任意癌癥。各種可用本發(fā)明方法治療的細胞增殖性障礙或癌癥包括但不限于人肉瘤和癌，包括但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、尤因瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、硬腦膜肉瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤、視網膜成神經細胞瘤；白血病、急性淋巴細胞性白血病和急性髓細胞性白血病(成髓細胞白血病、前髓細胞性白血病、粒-單核細胞型白血病、單核細胞性白血病和紅白血病)；慢性白血病(慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病和慢性淋巴細胞性白血病)；和真性紅細胞增多、淋巴瘤(何杰金病和非-何杰金病)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥和重鏈病。
各種本發(fā)明的療法可以用于治療已經鑒定了特異性標記或可以對指定病原體靶向的任意病原性疾病?？捎帽景l(fā)明方法治療的病原體的實例包括但不限于侵肺軍團菌、結核分枝桿菌、破傷風梭菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟氏球菌、蒼白密螺旋體、炭疽芽孢桿菌、霍亂弧菌、布氏疏螺旋體、白喉棒桿菌、金黃色葡萄球菌、人乳頭狀瘤病毒、人免疫缺陷癥病毒、德國麻疹病毒、脊髓灰質炎病毒等。
實驗提供下列實施例是為了例證和進一步解釋本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方面，但并不用來限定本發(fā)明的范圍。
在下文的實驗公開內容中，使用如下的縮寫g(克)；l或L(升)；μg(微克)；μl(微升)；μm(微米)；μM(微摩爾)；μmol(微摩爾)；mg(毫克)；ml(毫升)；mm(毫米)；mM(毫摩爾)；mmol(毫摩爾)；M(摩爾)；mol(摩爾)；ng(納克)；nm(納米)；nmol(納摩爾)；N(標準)；pmol(皮摩爾)；Aldrich(Sigma/Aldrich，Milwaukee，WI)；Sigma(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)；Fisher Scientific(FisherScientific，Pittsburgh，PA)；Millipore(Millipore，Billerica，MA)；Mettler Toledo Mettler Toledo(Columbus，OH)；Waters(WatersCorporation，Milford，Massachusetts)；Wyatt Technology(WyattTechnology Corp.，Santa Barbara，CA)；TosoHaas(TosoHaas Corp.，Montgomeryville，PA)；Perkin Elmer(Perkin Elmer，Wellesley，MA)；Beckman Coulter(Beckman Coulter Corp.，Fullerton，CA)；Phenomenex(Phenomenex，Torrance，CA)；GiboBRL(GibcoBRL/LifeTechnologies，Gaithersburg，MD.)；Pierce(Pierce ChemicalCompany，Rockford，IL.)；Roche(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel，Switzerland)。
實施例1材料和方法在Center for Biologic Nanotechnology，University ofMichigan合成和表征G5PAMAM樹枝狀大分子。MeOH(HPLC級)、乙酸酐(99％)、三乙胺(99.5％)、DMSO(99.9％)、異硫氰酸熒光素(98％)、縮水甘油(外消旋形式，96％)、DMF(99.8％)、1-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳化二亞胺HCl(EDC，98％)、檸檬酸(99.5％)、疊氮化鈉(99.99％)、D2O、NaCl和用于電位滴定的滴定液(0.1M HCl和0.1M NaOH)均購自Aldrich并且作為標準的使用。甲氨蝶呤(99+％)和葉酸(98％)來自Sigma，Spectra/Por透析膜(MWCO 3,500)、Millipor Centricon超濾性膜YM-10和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH＝7.4)來自FisherScientific。
電位滴定法。使用Mettler Toledo MP230 pH Meter和MicroCombpH電極在室溫23±1℃下進行手工滴定。將10mL 0.1M NaCl溶液加入到精確稱量的100mg PAMAM樹枝狀大分子中以防止胺基相互作用。使用0.1028N HCl進行滴定并且將0.1009N NaOH用于反向滴定。根據反向滴定數據確定伯胺類和叔胺類的數量。
凝膠滲透色譜法(GPC)。使用安裝了2487雙波長UV吸收檢測器(Waters)、Wyatt DawnDSP激光分光計、Optilab DSP干涉測量折光計(Wyatt Technology)的Alliance Waters 2690 Separation Module并且使用TosoHaas TSK-GelGuard PHW 06762(75×7.5mm，12μm)，G 2000 PW 05761(300×7.5mm，10μm)，G 3000 PW 05762(300×7.5mm，10μm)，和G 4000 PW(300×7.5mm，17μm)柱進行GPC實驗。用WatersTemperature Control Module將柱溫維持在25±0.1℃。等度流動相為0.1M檸檬酸和0.025w％疊氮化鈉，pH 2.74，流速1ml/分鐘。樣品濃度為10mg/5ml，且注射體積為100μL。使用Astra 4.7軟件(Wyatt Technology)測定PAMAM樹枝狀大分子及其綴合物的分子量和分子量分布。
核磁共振光譜法在D2O中取1H和13C NMR光譜并且用于提供積分值，以便通過Bruker AVANCE DRX 500儀進行結構分析。
UV分光光度法。使用Perkin Elmer UV/VIS分光計λ20和λ20軟件記錄在PBS中的UV光譜。
反相高效液相色譜法。反相離子配對高效液相色譜(RP-HPLC)系統由System GOLDTM126溶劑組件、安裝了100μl環(huán)的Model 507自動采樣器和Model 166 UV檢測器(Beckman Coulter)組成。將基于Phenomenex Jupiter C5二氧化硅的HPLC柱(250×4.6mm，300)用于分離分析物。另外將兩個Phenomenex Widepore C5保護柱(4×3mm)裝在HPLC柱的上游。用于洗脫PAMAM樹枝狀大分子的流動相為以1ml/分鐘流速從90∶10水/乙腈(ACN)開始，并且在30分鐘后達到50∶50的線性梯度。將在水中以及在ACN中的濃度為0.14w％的三氟乙酸(TFA)用作抗衡離子以使樹枝狀大分子-綴合物表面為疏水性的。將所述的綴合物溶于流動相(90∶10水/ACN)。在每種情況中的注射體積為50μl，樣品濃度約為1mg/ml且在210或242或280nm對洗脫的樣品進行檢測。使用Beckman’s System GOLDTMNouveau軟件進行分析。已經通過使用UV、HPLC、NMR和GPC對每種裝置和所有中間體進行了表征。
KB細胞獲自ATCC(CLL17；Rockville，MD)。胰蛋白酶-EDTA、Dulbecco磷酸-緩沖鹽水(PBS)、胎牛血清、細胞培養(yǎng)抗生素和RPMI培養(yǎng)基獲自Gibco/BRL。所有其它試劑均來自Sigma。將樹枝狀大分子-綴合物的合成和表征報導為單獨的信息。在本研究中使用的所有樹枝狀大分子制品均在我們的中心合成，并且已經通過對游離表面氨基進行乙?；瘜ζ浔砻孢M行了中和。
細胞培養(yǎng)和處理。將KB細胞維持在不含葉酸的含有10％血清(例如，參見Quintana等Pharm.Res.19，1310(2002))的培養(yǎng)基中以便提供與在人血清中發(fā)現的類似的胞外FA。將細胞在12-孔平板中鋪板以便進行攝取研究，在24-孔平板中進行鋪板以便進行細胞生長分析，并且在96-孔平板中鋪板以便進行XTT測定。用不含FA的含有透析的血清的培養(yǎng)基沖洗細胞并且在37℃下與樹枝狀大分子-藥物綴合物一起孵育指定的時間期限和濃度。另外將KB細胞維持在含有2μM FA的RPMI培養(yǎng)基中以便獲得表達低FAR的細胞。
流式細胞計量術和共聚焦顯微鏡術。使用Beckman熒光分光光度計對樹枝狀大分子溶液的標準熒光進行定量。為了對靶向的聚合物攝取進行流式細胞檢測分析，將細胞胰蛋白酶化并且懸浮于含有0.1％牛血清白蛋白(PBSB)的PBS中，并且使用Becton Dickinson FACScan分析器進行分析。測定10,000個細胞的FL1-熒光并且對門控的存活細胞熒光平均值進行定量。使用Carl Ziess共焦顯微鏡對在玻璃蓋玻片上鋪板的細胞進行共焦顯微鏡分析。使用氬激光器，應用用于FITC的合適的過濾器同時采集熒光和鑒別干涉對比(DIC)圖象。
樹枝狀大分子細胞毒性的評價。通過使用雙金雞納酸試劑(PIERCE)檢測處理細胞裂解物中的總蛋白質來確定細胞生長并且通過使用來自Roche的試劑盒進行XTT測定。
實施例2樹枝狀大分子的合成按照下列方法合成樹枝狀大分子(例如，參見附圖6)1.G5載體 7.G5-Ac1(82)-FITC-FA-MTXa2.G5-Ac3(82) 8.G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH3.G5-Ac3(82)-FITC 9.G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH-MTXe4.G5-Ac3(82)-FITC-OH 10.G5-Ac2(82)-FA5.G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe11.G5-Ac2(82)-FA-OH6.G5-Ac3(82)-FITC-FA 12.G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe(注意Ac1、Ac2、Ac3中所示的上標用于區(qū)分不同組的乙酰化反應)。
1.G5載體。在Biologic Nanotechnology，University ofMichigan合成和表征PAMAM G5樹枝狀大分子。PAMAM樹枝狀大分子由乙二胺(EDA)引發(fā)劑核心與4個放射狀樹枝狀臂組成，并且使用由丙烯酸甲酯(MA)的徹底Michael加成和所得酯與大量過量的EDA縮合(酰胺化)而產生依次的各代組成的重復反應序列合成。連續(xù)的反應由此各自在理論上使表面氨基的數量加倍，可以使它們活化以便官能化。已經分析了合成的樹枝狀大分子并且通過GPC測定分子量為26,380g/mol，且通過電位滴定法已將伯氨基的數量測定為110。
2.G5-Ac3(82)。使2.38696g(8.997*10-5mol)的在160ml abs.MeOH中的G5PAMAM樹枝狀大分子(通過GPC測定MW＝26,380g/mol，通過電位滴定法測定伯胺類的數量＝110)與679.1μl(7.198*10-3mol)乙酸酐在有1.254ml(8.997*10-3mol，25％摩爾過量)三乙胺存在下反應。在充分透析并且凍干后，得到2.51147g(93.4％)G5-Ac3(82)產物。已經基于1H NMR校準測定了乙?；钠骄鶖?82)(Majoros，I.J.，Keszler，B.，Woehler，S.，Bull，T.，和Baker，J.R.，Jr.(2003))。
3.G5-Ac3(82)-FITC。使1.16106g(3.884*10-5mol)的在110mlabs.DMSO中的G5-Ac3(82)部分乙?；腜AMAM(通過GPC測定MW＝29,880g/mol)與0.08394g(90％純)(1.94*10-4mol)的FITC在氮氣環(huán)境中反應過夜。在充分透析、凍干后，得到1.10781g(89.58％)的G5-Ac3(82)-FITC產物。通過膜過濾進行進一步純化。
4.G5-Ac3(82)-FITC-OH。使0.20882g(6.51*10-6mol)的G5-Ac3(82)-FITC與19.9μl(2.99*10-4mol)的縮水甘油(外消旋)在150ml DI水中反應。對每個剩余的伯氨基計算兩個縮水甘油分子。將該反應混合物在室溫下劇烈攪拌3小時。在充分透析2天并且凍干后，G5-Ac3(82)-FITC-OH的產率為0.18666g(84.85％)。
5.G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe。使0.02354g MTX(5.18*10-5mol)與0.13269g(6.92*10-4mol)EDC在室溫下于27ml DMF和9ml DMSO中反應反應1小時，同時劇烈攪拌。將該溶液滴加到含有0.09112g(2.72*10-6mol)G5-Ac3(82)-FITC-OH的150ml DI水溶液中。將該反應體系在室溫下劇烈攪拌3天。在充分透析并且凍干后，靶向的分子G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe的產率為0.08268g(73.5％)。
6.G5-Ac3(82)-FITC-FA。使0.03756g(8.51*10-5mol)FA(MW＝441.4g/mol)與0.23394g(1.22*10-3mol)的EDC(1-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳化二亞胺HCl；MW＝191.71g/mol)在27ml干燥DMF和9ml干燥DMSO混合物中和氮氣環(huán)境下反應1小時。然后將該有機反應混合物中滴加到0.49597g(1.55*10-5mol；MW＝32,150g/mol)G5-Ac3(82)-FITC的DI水溶液(100ml)中。將該反應混合物劇烈攪拌2天。在透析并且凍干后，G5-Ac3(82)-FITC-FA重量為0.5202g(98.1％)。通過膜過濾進行進一步純化。
7.G5-Ac1(82)-FITC-FA-MTXa。使2.1763*10-5mol(0.00989g)的MTX(MW＝454.45g/mol)與3.0948*10-4mol(0.05933g)的EDC在66ml干燥DMF和22ml干燥DMSO混合物中和氮氣環(huán)境下反應1小時。將該有機反應混合物滴加到0.09254g(2.7051*10-6mol；通過GPC測定MW＝34,710g/mol)G5-Ac1(82)-FITC-FA-NH2的DI水溶液(260ml)中。將該溶液劇烈攪拌2天。在透析并且凍干后，G5-Ac1(82)-FITC-FA-MTXa重量為0.09503g(96.5％)。在分析前通過膜過濾進行進一步純化。將三官能裝置用作體外細胞毒性研究中藥物裂解的對照化合物。
8.G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH。使在200ml DI水中的0.29597g(8.63*10-6mol)的G5-Ac3(82)-FITC-FA部分乙酰化的PAMAM樹枝狀大分子綴合物(通過GPC測定MW＝34,710g/mol)與20.6μl(3.1*10-4mol，25％摩爾過量)的縮水甘油(MW＝74.08g/mol)反應3小時。在充分透析、凍干和反復膜過濾后，得到0.27787g(90.35％)完全縮水甘油化的G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH產物。在體外研究中未觀察到非特異性攝取(參見用于攝取研究的此研究的第II部分(24)。
9.G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH-MTXe。使0.03848g(8.4674*10-5mol)的MTX(MW＝454.45g/mol)與0.22547g(1.176*10-3mol)的EDC在54ml干燥DMF和18ml干燥DMSO混合物中和氮氣環(huán)境下反應1小時。將該有機反應混合物滴加到0.16393g(4.6339*10-6mol；MW＝36,820g/mol)G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH的DI水溶液(240ml)中。將該溶液劇烈攪拌3天。在透析、反復膜過濾和凍干后，G5-Ac3(82)-FITC-FA-MTXe重量為0.18205g(90.88％)。
10.G5-Ac2(82)-FA。使FA在兩步連續(xù)的反應中與G5-Ac2(82)結合。使0.03278g(7.426*10-5mol)FA與14-倍過量的EDC 0.19979g(1.042*10-3mol)在24ml DMF、8ml DMSO溶劑混合物中和室溫下反應，然后將該FA-活性酯溶液滴加到部分乙?；漠a物G5-Ac2(82)(0.40366g，1.347*10-5mol)在90ml水中的水溶液中。在透析和凍干后，產物重量為0.41791g(96.7％)。通過UV光譜法測定FA分子的數量。作為額外的表征，通過安裝了UV檢測器的GPC或通過瓊脂糖凝膠未觀察到游離的FA。
11.G5-Ac2(82)-FA-OH。使0.21174g(6.60*10-6mol)的單-官能樹枝狀裝置G5-Ac2(82)-FA與20.1μl(3.04*10-4mol)縮水甘油在154ml DI水中和劇烈攪拌下反應3小時。在透析和凍干后，在表面上帶有羥基的縮水甘油化的單-官能裝置(產率0.20302g，91.05％)參與與甲氨蝶呤的綴合反應。
12.G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe。在7ml DMF和9ml DMSO的溶劑混合物中，使0.02459g(5.41*10-5mol)的MTX和0.14315g(7.46*10-4mol)的1-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳化二亞胺(EDC)在室溫下和氮氣環(huán)境中反應1小時。劇烈攪拌該反應混合物。將MTX-活性酯溶液滴加到在150ml DI水中的在表面上帶有羥基的0.09975g(2.95*10-6mol)單-官能樹枝狀裝置中，并且將該反應混合物在室溫下攪拌3天。在透析和凍干后，用組合和生物物質測試這一雙官能裝置G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe(產率0.11544g，93.9％)。
實施例3分析G5PAPAM樹枝狀大分子的末端伯氨基的電位滴定曲線進行電位滴定以便測定伯和叔氨基的數量。在理論上，G5PAMAM樹枝狀大分子在其表面上帶有128個伯氨基和126個叔胺基。可以通過使用數學模型測定這些值。電位滴定揭示出在G5PAMAM樹枝狀大分子載體表面上存在110個伯胺類(例如，參見附圖7，它表示通過用0.1M HCl滴定液直接滴定和使用0.1M NaOH滴定液反向滴定得到的滴定曲線)。使用應用0.1M NaOH滴定液獲得的反向滴定數據計算伯氨基的平均數。
測定各綴合物結構的分子量也是必要的，以便產生充分定義的多官能樹枝狀大分子。將安裝了多角度激光散射的GPC和作為濃度檢測器的RI檢測器用于該目的(例如，參見表1，它代表具有各自指定的分子量和分子量分布的PAMAM樹枝狀大分子載體及其單-、雙-和三-官能綴合物。上標數字2和3(ex.-G5-Ac2和G5-Ac3)表示它們?yōu)閮煞N獨立的乙?；磻?。
表1 實施例4通過凝膠滲透色譜法進行的樹枝狀大分子表征測定的26,380g/mol的G5樹枝狀大分子的分子量稍低于理論值(28,826g/mol)。這些結果表明了離子理論結構的偏差。使用個綴合物的GPC數據計算表1中的值(例如，參見附圖8)并且計算以便衍生與所述載體結合的各官能團的精確數量?？梢酝ㄟ^從含有官能分子的綴合物的 值中扣除不含所述官能分子的綴合物的 值并且除以功能分子的分子量計算每個官能分子的平均數?？梢蕴峁〨5-Ac2、G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe、G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe和G5-Ac2(82)-FITC-FA-OH-MTXe的GPC洗脫圖(eluograms)，其中RI信號和激光散射信號在90°處重疊(例如，參見附圖8)。
基于GPC分析，可以測定綴合的FITC、FA、MTX和縮水甘油分子的數量(例如，參見附圖8FITC5.8，FA5.7，MTXe5-6，OH28-30)。如通過GPC測定的綴合分子的數量稍高于推定值；這一結果最大的可能性是因洗脫液中檸檬酸的作用所致，它根據所述裝置的不同具有可變的作用。將這些值與通過NMR和UV光譜分析獲得的值聯合應用于精確測定與樹枝狀大分子結合的各綴合分子的數量。
提供了G5PAMAM樹枝狀大分子的理論和有缺陷的化學結構(例如，參見附圖9)。副反應、諸如橋連，以及每代產生少于理論預計值的臂有助于產生與G5PAMAM樹枝狀大分子的理論值代表稍不同的結構。G5PAMAM樹枝狀大分子的有缺陷的化學結構表現出從每代中失去臂，這可能成為問題，因為它們破壞了樹枝狀大分子的球形，由此影響了可能結合的官能分子的數量并且降低了每個官能分子可能在靶向的細胞中具有的效應。
實施例5樹枝狀大分子官能團的表征樹枝狀大分子的乙?；?。乙酰化為合成樹枝狀大分子中首要必須的步驟。將部分乙?；糜谥泻蛠碜粤硪环磻蛏锵到y內分子間相互作用的樹枝狀大分子表面的部分，由此防止非特異性相互作用在合成過程和藥物遞送過程中發(fā)生。離開未乙酰化的表面胺類的部分能夠結合官能團。使剩余的氨基乙?；瘜е滤苄栽黾?在FITC綴合后)，使得樹枝狀大分子更自由地分散在具有靶向特異性增加的含水介質內，從而使得它與許多常用介質相比更能夠用作靶向遞送系統(Quintana等Pharm.Res.19，1310(2002))。
徹底透析、凍干和使用PBS和DI水反復膜過濾用于產生純化的部分乙?；腉5-Ac2(82)和G5-Ac3(82)PAMAM樹枝狀大分子(例如，參見Majoros等Macromolec 36，5526(2003))。在異硫氰酸熒光素(FITC)和(FITC-FA)綴合后，按照與(Wang等，.Blood.15，3529(2000))中發(fā)現的相同的反應順序再使樹枝狀大分子完全乙?；员阌糜隗w外攝取研究。進行徹底透析、凍干和反復膜過濾，得到完全乙?；腉5-Ac1(82)-FITC和G5-Ac1(82)-FITC-FA PAMAM。
當乙?；潭仍黾訒r，樹枝狀大分子的直徑減小，從而表明了乙?；潭扰c樹枝狀大分子直徑之間的反相關性(例如，參見Majoros等Macromolec 36，5526(2003))。用于質子化的較低數量的伯胺類(與較低程度相比，在較高乙?；潭认?導致結構受到電荷-電荷相互作用的影響程度較低，由此使得結構更致密。然而，分子量與乙?；潭染哂衅叫邢嚓P性，分子量隨乙酰化程度的增加而增加。
通過監(jiān)測在210nm處檢測UV洗脫的級分而用H1-NMR和HPLC進一步表征PAMAM樹枝狀大分子(例如，分別參見附圖10(A)和(B))。G5-Ac的H1-NMR光譜展示如下在4.71ppm出現的峰為D2O的代表，而在3.67ppm的峰為外標二烷的代表，且在1.89ppm的峰代表乙酰胺的甲基質子。峰2.34ppm、2.55ppm、2.74ppm、3.04ppm、3.21ppm和3.39ppm為存在于乙酰化樹枝狀大分子中的質子的代表。
官能團的結構。提供具有與用星號標記樹枝狀大分子結合的基團的FITC、FA和MTX的結構(例如，參見附圖11，其中在FA和MTX分子上標記了α-和γ-羧基)。當FA上的γ-羧基用于與樹枝狀大分子綴合時，FA保持了對其受體的強親和力，使得FA能夠保持其起靶向劑作用的能力。另外，γ-羧基在碳化二亞胺(carboiimide)為介體的與氨基偶聯的過程中具有高于α-羧基的反應性(例如，參見Quintana，等Pharm.Res.19，1310(2002))。
官能團的H1-NMR。為了最終測定與樹枝狀大分子結合的各類官能團的數量，必須比較官能團自身的H-NMR和與官能團綴合的樹枝狀大分子的H1-NMR。官能團的H1-NMR(參見，例如附圖12)FITC H1-NMR-芳香族化合物峰7.9ppm，7.68ppm，7.23ppm，6.6ppm，6.65ppm，6.75ppm；FA H1-NMR-芳香族化合物峰8.73ppm，6.75ppm，7.65ppm，在4.85ppm的D2O，在3.3ppm的CH3OD，在如下的脂肪族化合物峰2.15ppm，2.2ppm，2.4ppm；和MTX H1-NMR-芳香族化合物峰8.65ppm，8.75ppm，7.85ppm，在4.8ppm的D2O，在3.35ppm的CH3OD，在如下的脂肪族化合物峰2.05ppm，2.25ppm，2.45ppm。
實施例6官能團與乙酰化樹枝狀大分子的綴合異硫氰酸熒光素與乙?；瘶渲畲蠓肿拥木Y合。部分乙?；腉5-Ac3(82)PAMAM樹枝狀大分子用于綴合異硫氰酸熒光素(FITC)。使部分乙?；臉渲畲蠓肿优c異硫氰酸熒光素反應，并且在充分透析、凍干和反復膜過濾后，得到G5-Ac3(82)-FITC產物。形成的硫脲鍵在裝置的研究過程中是穩(wěn)定的。
葉酸與乙酰化的單-官能樹枝狀大分子的綴合。通過葉酸的γ-羧基與樹枝狀大分子的伯氨基之間的縮合進行葉酸與部分乙?；膯?官能樹枝狀裝置的綴合。將該反應混合物滴加到含有G5-Ac3(82)-FITC的DI水溶液中并且劇烈攪拌2天(在氮氣環(huán)境中)以使FA與G5-Ac3(82)-FITC完全綴合。顯然α羧基參與了縮合反應，但其反應性在與γ羧基比較時更低。NMR也用于證實與樹枝狀大分子結合的FA分子的數量。就存在于樣品中的游離FA而言，尖峰可以在光譜中出現。取游離FA的1H NMR光譜(參見，例如附圖12)和G5-Ac3(82)-FITC-FA。G5-Ac3(82)-FITC-FA光譜中芳香族化合物質子峰的增寬表明FA與樹枝狀大分子之間存在共價鍵?；谝阴０坊械募谆|子和FA中芳族化合物質子的積分值，將結合的FA分子的數量計算為4.5。通過UV光譜法，使用游離FA濃度校準曲線測定FA分子的數量(4.8)。
MTX與乙酰化雙-官能樹枝狀大分子的綴合(通過酰胺鍵)。由G5-Ac3(82)-FITC-FA合成對照品MTX三官能綴合物。常用抗癌藥MTX與FA在結構上的相似性允許其與G5-Ac3(82)-FITC-FA通過用于使FA與伯氨基結合相同的縮合反應結合。從反應劑的摩爾比預計每個樹枝狀大分子中可以結合5個藥物分子。取三官能裝置的1H NMR光譜。芳香族化合物質子峰的增寬表明甲氨蝶呤與樹枝狀大分子之間存在共價鍵。基于乙酰胺基中的甲基質子和綴合分子中芳族化合物質子的積分值，將結合的甲氨蝶呤分子的數量計算為5。MTX通過酰胺鍵的綴合用作用于比較MTX通過酯鍵綴合的對照裝置。與MTX通過酰胺鍵與樹枝狀大分子連接相比，甲氨蝶呤通過酯鍵結合能夠相對更易于將藥物裂解并釋放進入系統。
縮水甘油與乙?；p官能樹枝狀大分子的綴合。縮水甘油與乙?；p官能裝置的綴合為重要的前序步驟，以便通過酯鍵結合MTX和消除剩余的NH2，從而避免生物系統內任何不需要的非特異性靶向?？s水甘油與G5-Ac3(82)-FITC-FA的綴合將所有剩余的伯氨基轉化成醇基，從而產生G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH。為了表征的目的，MTX與含有FA或FITC的縮水甘油化樹枝狀裝置的綴合產生G5-Ac2-FA-OH-MTXe1*和G5-Ac3-FITC-OH-MTXe2*(例如，參見附圖13(A)和(B)，分別為各樣品的HPLC洗脫圖)。
實施例7MTX與乙?；涂s水甘油化雙官能樹枝狀大分子通過酯鍵綴合的表征顯示了G5-Ac2-FA-OH-MTXe的H1-NMR(例如參見，附圖14)。綴合裝置中芳香族化合物的質子的峰代表無法與在游離FA和MTX的H1-NMR中發(fā)現的芳香族化合物的峰相區(qū)別。芳香族質子在6.59ppm、7.53ppm呈雙峰出現，而在8.37ppm呈單峰出現。將游離FA和游離MTX的H1-NMR與綴合裝置的H1-NMR進行比較顯示芳族化合物區(qū)幾乎同樣地重疊，由此不能測定芳族化合物質子的位置。FA和MTX的結合分子的數量也影響峰的分布。在4.70ppm出現的峰代表了溶劑D2O，在3.67ppm出現的峰為外標二烷的代表，并且在1.89ppm出現的峰為乙酰胺基的甲基質子的代表。峰2.31ppm、2.52ppm、2.71ppm和3.26ppm為樹枝狀大分子質子的代表。
實施例8樹枝狀大分子的UV光譜表征測試通過酯鍵的MTX綴合與通過酰胺鍵與樹枝狀大分子綴合比較在裂解方面的改善。通過使用EDC化學結合MTX。顯示了在305nm的G5-Ac-FITC-FA-OH-MTXe的HPLC洗脫圖(例如，參見附圖15)?？梢詫⒂坞xFA、MTX和FITC的合并UV光譜與G5-Ac(82)、單-、雙-和三-官能樹枝狀大分子的UV光譜進行比較(例如，分別參見附圖中的附圖16和17)。UV光譜提供了精確地在281nm和349nm的FA確定峰，對于MTX依次在258nm、304nm和374nm，且對FITC在493nm。FA、FITC和MTX可見的差別峰(例如，參見附圖16)依賴于各分子與樹枝狀大分子的綴合。通過比較游離物質和樹枝狀大分子-綴合的物質的UV光譜對每種裝置的表征用于確定已經結合樹枝狀大分子的功能。
實施例9樹枝狀大分子的細胞攝取使用熒光分光光度計測定綴合物G5-FI、G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX的標準溶液的熒光。在10-1000nM觀察到了樹枝狀大分子濃度與熒光之間的線性關系。G5-FITC、G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX的100nM溶液的熒光分別為0.57、0.23和0.11個熒光分光光度測定單位。這些熒光上的差別可以指示因樹枝狀大分子上存在FA和MTX而猝滅。
測定表達高細胞表面FA受體(FAR)的KB細胞中樹枝狀大分子的細胞攝取。FA-綴合的樹枝狀大分子以劑量依賴性方式與細胞結合，其中對G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX的結合率在10-15nM下為50％，而在KB細胞中未檢測到對照樹枝狀大分子G5-FITC(例如，參見附圖18A)。當將獲得的熒光對在樹枝狀大分子標準溶液中觀察到的猝滅校準時，對G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX獲得了相同的結合曲線(例如，參見附圖18B)。對G5-FITC-FA-MTX(100nM)的結合動力學分析顯示在30分鐘內獲得了最大結合率，這一結果與對游離葉酸(folate)結合率報告的結果相似。
測試了表達高和低FAR的KB細胞中游離FA對樹枝狀大分子攝取的作用。對G5-FITC-FA和G5-FITC-FA-MTX而言，綴合物與表達低FAR的KB細胞的結合為表達高FAR的細胞的結合的30％(例如，參見附圖19，左側組)。50μM FA完全阻斷了靶向的樹枝狀大分子(30nM)在表達低-和高-FAR的細胞中的攝取(例如，參見附圖19，左側組)。通過共聚焦顯微鏡術評價樹枝狀大分子與KB細胞的結合和細胞內攝作用。將KB細胞與250nM所指定的樹枝狀大分子一起孵育24小時并且取共焦圖像。含有靶分子FA的綴合物在24小時內攝入KB細胞(例如，參見附圖20)。與用對照綴合物處理的細胞相比，接觸G5-FITC-FA-MTX的細胞較不粘著并且聚集，表明了由藥物-綴合物誘導的細胞毒性。
實施例10官能團綴合的樹枝狀大分子抑制細胞生長由于綴合物與KB細胞結合在1小時內達到最大攝取值(Quintana等2002.Pharmaceutical Research 191310-1316.)，開始通過將細胞與綴合物一起孵育1小時測試G5-FI-FA-MTX對細胞生長的作用，隨后在不含藥物的培養(yǎng)基中孵育5天。在這類條件下，綴合物在KB細胞中不能表現出任何生長抑制作用。當將細胞與樹枝狀大分子一起孵育4小時時，如通過XTT試驗測定的，存在約10％的細胞生長適度減少。由此通過與樹枝狀大分子一起孵育最少24小時進行細胞毒性測定，這一時間期限為顯示出誘導明顯的細胞毒性的預孵育時間期限。
細胞生長的時程和劑量依賴性抑制。上述研究已經證實，如果培養(yǎng)基中完全喪失了FA，那么在體外可檢測到MTX-誘導的細胞毒性(例如，參見Sobrero & Bertino，Int.J.Cell Cloning 4，51(1986))。測試在FA-不足的培養(yǎng)基中孵育的細胞中三官能樹枝狀大分子對細胞生長的作用。用300nM綴合物(相當于1500nM MTX)或1500nM游離MTX將細胞處理1-4天并且通過估計細胞蛋白質含量測定細胞增殖。用不同濃度的綴合物或游離MTX將細胞處理2天(將綴合物濃度指定為MTX當量，其中每個樹枝狀大分子中有5個MTX)。將表達高和低FAR的KB細胞與30nM的樹枝狀大分子一起在37℃下孵育1小時，沖洗并且通過流式細胞檢測分析測定細胞熒光(例如，參見附圖21，左側組)。與50μM游離FA一起預孵育30分鐘完全防止了細胞結合和攝取聚合物綴合物(例如，參見附圖21，左側組)。
還通過基于經活細胞的活性線粒體將XTT轉化成甲的XTT試驗測試了對綴合物誘導的細胞生長的抑制(例如，參見Roehm等JImmunol Methods 142，257(1991))。G5-FITC或G5-FITC-FA在1、2或3天時對細胞無生長抑制作用，而G5-FITC-FA-MTX和游離MTX表現出時間依賴性細胞毒性(例如，參見附圖22)。因此，G5-FITC-FA-MTX和游離MTX以時間-和劑量依賴性方式抑制細胞生長，而對照樹枝狀大分子不能抑制細胞生長(例如，參見附圖21和22)。
實施例11葉酸拯救細胞不發(fā)生甲氨蝶呤誘導的細胞毒性當游離MTX誘導的生長抑制高于使用等摩爾濃度的在低于1μM的G5-FITC-FA-MTX中的MTX誘導的生長抑制時(例如，參見附圖21)，測試G5-FITC-FA-MTX中的FA部分是否可以拯救細胞不發(fā)生MTX-誘導的細胞毒性。G5-FITC-FA-MTX制品含有等摩爾濃度的MTX和FA，測定相似濃度的游離MTX和游離FA對細胞生長抑制的作用。在等摩爾濃度的游離FA和MTX下，FA逆轉了MTX誘導的細胞生長抑制(例如，參見附圖23)。用150或500nM MTX在有或沒有等摩爾濃度的游離FA將KB細胞處理24小時。還用30和100nM G5-FI-FA-MTX(相當于150和500nM MTX)平行處理細胞。沖洗細胞以便除去藥物并且與新鮮的培養(yǎng)基一起再孵育6天，且測定總細胞蛋白質。存在的150nM FA幾乎完全逆轉了由150nM MTX導致的生長停滯。此外，由G5-FITC-FA-MTX誘導的細胞毒性(例如，參見附圖23，實心正方形符號)和等摩爾的FA和MTX組合(例如，參見附圖23，實心圓圈符號)相似。
當游離FA阻斷樹枝狀大分子攝取并且拯救細胞不發(fā)生MTX-誘導的細胞毒性時，測試了將細胞與過量的FA預孵育對G5-FITC-FA-MTX的抗增殖的作用。使KB細胞在沒有或有50μM FA存在下接觸不同濃度的綴合物或游離MTX 24小時。除去孵育培養(yǎng)基，沖洗細胞并且在沒有藥物存在下與新鮮培養(yǎng)基一起再孵育5天，且進行XTT試驗(例如，參見附圖24，□，■，代表用MTX處理的細胞；△，▲，代表用G5-FITC-FA-MTX處理的細胞)。過量的游離FA不僅阻斷了生長抑制，而且增加的細胞生長高于對照組細胞20％(例如，參見附圖24)。
實施例12樹枝狀大分子的穩(wěn)定性在細胞培養(yǎng)基中測試樹枝狀大分子的穩(wěn)定性，以便檢查在進入細胞前，MTX是否從樹枝狀大分子中釋放。將G5-FITC-FA-MTX與細胞培養(yǎng)基一起溫育1、2、4和24小時，并且使用10,000-MW截止的超濾裝置過濾溫育培養(yǎng)基。測試截留物和濾液對KB細胞生長的作用。將G5-FITC-FA-MTX與2μM濃度的培養(yǎng)基一起孵育24小時。通過10K-MW截止的濾膜過濾溫育培養(yǎng)基。將截留物(調整至預過濾體積)和濾液與KB細胞(在200nM綴合物下，如根據預過濾樣品濃度測定的)一起孵育2天并且進行XTT試驗。對獲自已經與樹枝狀大分子預溫育1、2和4小時的培養(yǎng)基的截留物和濾液獲得了相似的結果。在24小時溫育時間期限過程中，截留物為細胞毒性的，而濾液未表現出任何細胞毒性(例如，參見附圖25)，表明游離MTX無法從綴合物中釋放。24小時后MTX緩慢釋放，在1周內達到40-50％釋放的最大值。
將MTX-綴合物的抗增殖作用與缺乏FA或FITC分子的綴合物進行比較。將KB細胞與30nM的綴合物(＝150nM有效MTX濃度)一起孵育24小時并且除去孵育培養(yǎng)基。沖洗細胞并且在沒有藥物存在下的新鮮培養(yǎng)基中再孵育5天，且進行XTT試驗。缺乏FA的MTX-綴合的樹枝狀大分子不能誘導細胞毒性，而靶向的樹枝狀大分子在沒有或有染料分子FITC存在下誘導細胞毒性(例如，參見附圖26)。
實施例13樹枝狀大分子在體內靶向腫瘤中的應用本發(fā)明的組合物(例如多官能樹枝狀大分子)和方法用于測定癌癥動物模型(例如人上皮細胞癌)中的治療反應。
材料和試劑。所有試劑均獲自商品來源。葉酸、青霉素/鏈霉素、胎牛血清、IV型膠原酶、TX100、雙-苯甲亞胺(benzimide)、FITC、甲氨蝶呤、過氧化氫、乙酸酐、乙二胺、甲醇、二甲基甲酰胺和DMSO購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。胰蛋白酶-EDTA、Dulbecco’s PBS和RPMI 1640(有或沒有葉酸)來自Invitrogen(Gaithersburg，MD)。“可溶的”溶液和hionic熒光體來自Packard Bioscience(DownersGrove，IL)。OCT包埋培養(yǎng)基來自Electron Microscopy Sciences(FortWashington，PA)，2-甲基丁烷來自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)，且6-羧基四甲基若丹明(6-TAMRA)和Prolong來自MolecularProbes，Inc.(Eugene，OR)。氚-標記的乙酸酐(CH3CO)2O[3H](100mCi，3.7GBq)購自ICN Biomedicals(Irvine，CA)。注射用甲氨蝶呤來自Bedford Laboratories(Bedford，OH)。將葉酸溶于鹽水，用1N NaOH調整至pH 7.0并且進行無菌過濾以便注射。
PAMAM樹枝狀大分子綴合物的合成和表征。合成G5PAMAM樹枝狀大分子并且從低摩爾質量污染物和高摩爾質量二聚體或寡聚體中純化(例如，參見Majoros等Macromolecules 36，5529(2003))。通過大小排阻色譜法，使用多角度激光散射、UV和屈光指數檢測器將樹枝狀大分子的數均摩爾質量測定為26,530g/mol。使用電位滴定與摩爾質量將樹枝狀大分子中的表面伯胺基的平均數量測定為110。對理想的單分散性樣品定義為重均摩爾質量與數均摩爾質量之比的多分散性指數等于1.0。將G5樹枝狀大分子的多分散性指數計算為1.032，表明在平均值周圍有極窄的分布并且證實為高純度的G5樹枝狀大分子。使用乙酸酐將G5PAMAM樹枝狀大分子表面胺類乙酰化以便減少樹枝狀大分子的非特異性結合。選擇乙酸酐與樹枝狀大分子之比以便獲得50-80和100個伯胺類的不同乙酰化水平。在純化后，使乙?；臉渲畲蠓肿优c成像劑(例如FITC或6-TAMRA)綴合以便檢測和成像。然后使成像-綴合的(例如染料-綴合的)樹枝狀大分子與靶向劑(例如葉酸)的活化酯反應，并且通過1H核磁共振(NMR)分析該反應純化的產物，以便測定綴合的靶向劑(例如葉酸分子)的數量。隨后通過酯鍵綴合治療劑(例如甲氨蝶呤)(例如，參見Quintana等Pharm Res 19，1310(2002))。
使用氚化的乙酸酐(Ac-3H)由G5-(Ac)50-(FA)6或G5-(Ac)50合成放射性標記的化合物(例如，參見Malik等J Control Release 65，133(2000)；Nigavekar等Pharm Res 21，476(2004)；Wilbur等Bioconjug Chem 9，813(1998))。使氚化的綴合物、G5-3H-FA和G5-3H完全乙?；?。G5-NHCOC-3H和G5-FA-NHCOC-3H綴合物的特異性活性分別為10.27和38.63mCi/g。殘余的游離氚＜0.3％的總活性。
使用PAGE、1H NMR、13C NMR和質譜法測試PAMAM樹枝狀大分子綴合物的質量。將毛細管電泳用于證實終產物的純度和均勻性。
葉酸-靶向的綴合物特別含有下列分子G5-(Ac)82-(FITC)5-(FA)5，G5-(Ac)82-(6-TAMRA)3-(FA)4，G5-(Ac)82-(FITC)5-(FA)5-MTX5和G5-(Ac)50-(Ac-3H)54-(FA)6，分別使用首字母縮略詞G5-FI-FA、G5-6T-FA、G5-FI-FA-MTX和G5-3H-FA鑒定它們。非靶向的對照品含有下列分子G5-(Ac)82-(FITC)5，G5-(Ac)82-(6-TAMRA)3，G5-(Ac)82-(FITC)5-MTX5和G5-(Ac)50-(Ac-3H)54，分別使用首字母縮略詞G5-FI、G5-6T、G5-FI-MTX和G5-3H鑒定它們。
受體動物和腫瘤模型。免疫缺陷型6-至8-周齡無胸腺雌性裸鼠[Sim(NCr)nu/nu fisol]購自Simonsen Laboratories，Inc.(Gilroy，CA)。5-至6-周齡Fox Chase嚴重的聯合型免疫缺陷病(SCID；CB-17/1crCrl-scidBR)雌性小鼠購自Charles RiverLaboratories(Wilmington，MA)，并且按照University’s Committeeon the Use and Care of Animals的條例以及聯邦政府的指導原則，包括Principles of Laboratory Animal Care使它們寄居在University of Michigan Medical Center的不含特定病原體的動物實驗室內。動物在可以隨意攝取Laboratory Autoclavable RodentDiet 5010(PMI Nutrition International，St.Louis，MO)。在注射腫瘤細胞前3周，將食物改變?yōu)槿~酸-缺乏的膳食(TestDiet，Richmond，IN)。為了采集尿和糞便，使動物寄居在可代謝的嚙齒動物籠(Nalgene，Rochester，NY)中。
腫瘤細胞系。超表達葉酸受體的KB人細胞系(例如，參見Turek等JCell Sci 106，423(1993))購自American Type TissueCollection(Manassas，VA)并且將它們維持在體外37℃，5％CO2下和葉酸鹽-缺乏的補充了青霉素(100單位/mL)、鏈霉素(100μg/mL)和10％熱滅活胎牛血清的RPMI 1640中。在注入小鼠前，使用胰蛋白酶-EDTA溶液收集細胞，洗滌并且重新懸浮于PBS中。30-號計量注射針將細胞混懸液(在0.2mL中5×106個細胞)經皮下注入每只小鼠的脅腹。在生物分布研究中，使腫瘤生長2周，直到達到～0.9cm3的體積。選擇計算腫瘤體積的公式針對的是橢圓體的標準體積，其中V＝4/3π(1/2長×1/2寬×1/2深度)。由于推定寬等于深度且k等于3，所以使用的公式為V＝1/2×長×寬2。在植入KB細胞后第4天使開始使用綴合物注射進行靶向的遞藥。
氚化樹枝狀大分子的生物分布和排泄。通過側尾靜脈給動物注射含有174μg G5-NHCOC-3H(1.8ACi)或200μg G5-FA-NHCOC-3H(7.7μCi)的0.5mL PBS溶液。以等摩爾濃度的修飾的樹枝狀大分子遞送兩種氚化的氚標記的綴合物。在注射后5分鐘、2小時、1天、4天和7天時，對動物實施安樂死，并且取腫瘤、心、肺、肝、脾、胰腺、腎和腦的樣品。第3組小鼠在注射200μg G5-3H-FA5分鐘前接受80μg游離快速濃注。這一181nmol濃度的游離葉酸在血液中產生～150μmol/L濃度，而與之相比，放射性標記的靶向的樹枝狀大分子(G5-3H-FA)在血液中產生～5μmol/L濃度，并且基于1.2mL 20g小鼠的血量。在注射后5分鐘、1天和4天時對動物實施安樂死5，并且如上所述采集組織。通過心臟穿刺在每一時間點采血。每組包括3-5只小鼠。在2、4、8和12小時和1、2、3和4天時采集尿和糞便樣品。
如Nigavekar等在Pharm Res 21，476(2004)中所述制備放射性組織樣品。使用液體閃爍計數器(LS 6500，Beckman Coulter，Fullerton，CA)測定氚含量。調整測定的放射性值以便統計儀器的效率且用于導出放射性(1μCi＝2.22×106dpm)/樣品。然后用組織重量校準這些值并且將綴合物的特異性放射性報導為注射劑量的百分比(％ID/g)。將通過尿和糞便排泄的放射性(樹枝狀大分子)報導為注射劑量的百分比(％ID)。
熒光樹枝狀大分子綴合物的生物分布。通過側尾靜脈給小鼠注射含有0.2mg G5-6T或G5-6T-FA綴合物的0.5mL鹽水。在注射后15小時和達4天時，對動物實施安樂死并且取腫瘤樣品且立即冷凍以便切片和成像。使用分離自腫瘤的單細胞混懸液實施流式細胞計量術。切碎腫瘤，通過70μm尼龍過濾篩(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)過濾細胞混懸液并且用PBS洗滌。使用EPICS XL流式細胞測定器(Coulter，Miami，FL)分析樣品。正如通過預先碘化丙錠染色測定的，為進行分析僅門控活細胞。將數據報導為細胞群的通道熒光平均值。
為了進行共焦顯微鏡成像，剖離組織，包埋在OCT中并且在干冰浴中冷凍在2-甲基-丁烷中。在恒冷切片機上切片(15μm)，在載玻片上融化固定并且儲存在-80℃下，直到染色為止。在染色后，將載玻片固定在4％低聚甲醛中，用磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L；pH 7.2)沖洗，并且固定在Prolong中。使用安裝了帶有校正環(huán)的x40 Plan-Apo 1.2數值孔徑(水浸裝置)物鏡的Zeiss 510金屬激光掃描共焦顯微鏡獲取圖像。將共焦圖像記錄為512×512×48像素，其具有的標度為每個像素0.45×0.45×0.37μm。將每個圖像的立方通過光學手段切割成48個切片，并且提供通過細胞核和細胞質切割的切片。
靶向的納米顆粒治療劑的遞送。從腫瘤植入后第4天開始，每周2次經皮下給予KB異種移植物的SCID小鼠通過尾靜脈注射接受靶向的或非靶向的含有甲氨蝶呤的綴合物、不含甲氨蝶呤的綴合物、游離甲氨蝶呤或作為對照品的鹽水。以0.2mL體積鹽水/20g小鼠遞送化合物。每次遞送的甲氨蝶呤的單劑量等于0.33mg/kg。還測試了較高劑量的1.67和3.33mg/kg游離甲氨蝶呤。以基于存在于納米粒中的甲氨蝶呤的數量計算的等摩爾濃度的甲氨蝶呤遞送綴合物。以等摩爾濃度的樹枝狀大分子遞送不含甲氨蝶呤的綴合物。在最初的試驗中，每組僅有5只小鼠的6組小鼠接受達15次注射。在隨后的試驗中，根據其存活情況的不同，小鼠接受達28次注射。在整個實驗過程中監(jiān)測小鼠體重，作為藥物不良反應的指征。在每次試驗終止時進行多器官組織病理學測定，并且每次因毒性作用或腫瘤負荷對小鼠實施安樂死。分析來自肺、心、肝、胰腺、脾、腎和腫瘤的組織。另外，從腫瘤中分離細胞，用靶向的熒光素-標記的綴合物染色，并且使用流式細胞測定器測試葉酸受體的存在。
統計學方法。計算數據的平均值、SD和SE。使用Student’s-Newman-Keuls’檢驗來檢驗實驗組與對照組之間的差異，并且將Ps＜0.05考慮為具有顯著性。
氚化樹枝狀大分子的生物分布。實現檢驗氚化G5-3H-FA的生物分布和消除以便測試其靶向在免疫缺陷裸鼠中建立的葉酸受體-陽性人KB腫瘤異種移植物的能力。在實驗期限中對小鼠維持葉酸-缺乏膳食，以便將葉酸的循環(huán)水平降至最低限度(例如，參見Mathias等J Nucl Med29，1579(1998))。在實驗接近人血清水平前在小鼠血清中獲得游離葉酸水平(參見Belz等Anal Biochem 265，157(1998)；Nelson等AnalBiochem 325，41(2004))。在靜脈內給予綴合物后不同的時間點(5分鐘-7天)評價小鼠。2組小鼠接受非靶向的氚化G5-3H樹枝狀大分子對照品或靶向的氚化G5-3H-FA綴合物(附圖27A和B)。在注射后第1天中綴合物通過腎從血液中快速清除，其中G5-3H從在5分鐘時的23.4％ID/g組織下降至24小時時的1.8％ID/g(附圖27A)。G5-3H-FA的血藥濃度從在5分鐘時的29.1％ID/g下降至24小時時的0.2％ID/g(附圖27B)。在幾個器官，諸如肺中，組織分布顯示了與G5-3H從在5分鐘時的9.7％ID/g下降至24小時時的1.6％ID/g和G5-3H-FA從在5分鐘時的9.6％ID/g下降至24小時時的1.7％ID/g的血藥濃度相似的趨勢。由于肺的多血管性，在每一時間點測定的綴合物水平能夠反映出血藥濃度。對心、胰腺和脾觀察到了類似的清除模式。已知這些器官不表達葉酸受體(folatereceptor)并且在非靶向與靶向的樹枝狀大分子之間未顯示出顯著性差異。G5-3H和G5-3H-FA在腦中的濃度在所有時間點處均低，提示所述的聚合物綴合物不通過血腦屏障(附圖27A和B)。盡管腎為這些樹枝狀大分子的主要清除器官，但是已知它還表達在其小管上的高水平的葉酸受體。非靶向的G5-3H在腎中的水平快速下降并且在接下來的幾天內維持在適度水平(附圖27A)。相反，G5-3H-FA水平在前24小時內稍微增加并且最可能的原因在于腎小管上存在葉酸受體。此后在接下來的幾天內下降，因為化合物通過腎臟清除(附圖27B)。
G5-3H和G5-3H-FA在注射后24小時內主要通過腎快速排泄。兩種化合物排泄增加看起來與綴合物的腎保留完全一致(附圖27A和B)。盡管靶向和非靶向的綴合物也出現在糞便中，但是其量仍然極低。任何物質是否實際在糞便中排泄因糞便中的尿污染而難以測定。靶向的G5-3H-FA在前4天內的累積清除率低于G5-3H的累積清除率，這反映出G5-3H-FA在表達葉酸受體的組織內保留。已知肝和KB腫瘤細胞表達高水平的葉酸受體。在這些組織中，非靶向的G5-3H的濃度隨樹枝狀大分子從血液中的清除而快速下降；濃度在剩余的研究組織的天數內維持在低水平(附圖27A)。相反，在肝和腫瘤內，靶向的G5-3H-FA含量在前4天內增加(附圖27B)。當放射性綴合物血藥濃度低時，發(fā)生這一情況，提示了與通過脈管系統單純截留樹枝狀大分子的情況相反，在這些組織中針對濃度梯度的樹枝狀大分子的特異性攝取。
在注射G5-3H-FA前接受181nmol游離葉酸的小鼠組中進一步找到了靶向藥物遞送的特異性(附圖27C)。在注射后4天時，在不具有排泄樹枝狀大分子能力的腫瘤組織中觀察到了與用游離葉酸阻斷葉酸受體相關的放射性顯著減弱(附圖27C)。這提示靶向與非靶向的聚合物綴合物之間的腫瘤濃度差異是因這些分子通過在腫瘤中超表達的葉酸受體的特異性攝取所致。在注射靶向的綴合物前通過遞送游離葉酸未顯著改變在所有其它組織中的生物分布。
熒光樹枝狀大分子綴合物的靶向和攝入。為了進一步證實和定位腫瘤組織內的樹枝狀大分子納米粒，使用與6-TAMRA綴合的樹枝狀大分子。在靜脈內注射靶向的G5-6T-FA和非靶向的G5-6T綴合物后15小時時從腫瘤樣品中獲得共焦顯微鏡圖像(附圖28)。與使用非靶向的樹枝狀大分子相比(附圖28A)，使用靶向的染料-綴合的樹枝狀大分子G5-6T-FA的腫瘤組織顯示出大量熒光細胞(附圖28B)。對分離自相同腫瘤的單細胞混懸液的流式細胞計量分析顯示了來自接受G5-6T-FA的小鼠的腫瘤細胞的較高通道熒光(附圖28C)。
共焦顯微鏡還顯示綴合物存在于腫瘤中，與許多腫瘤細胞結合并且被其攝入(附圖28D)。從頂部經中間到基底部的組織載玻片中取光學重疊部分。本文提供的腫瘤細胞中間切片在整個胞質溶膠中顯示出來自綴合物6T的熒光，其中細胞和細胞核邊界清晰可見(附圖28D)。
樹枝狀大分子綴合物的毒性。在研究期限中觀察所有小鼠脫水、不能飲食或飲水、虛弱或活動水平改變的征兆。在達99天時未觀察到急性或慢性存在嚴重毒性，與樹枝狀大分子綴合物是否含有甲氨蝶呤無關。在整個實驗過程中監(jiān)測體重并且未觀察到體重減輕；實際上，動物的體重增加。在每一時間點時，對肝、脾、腎、肺和心進行總體檢查和組織病理學檢查。在組織病理學檢查時未觀察到形態(tài)異常。在注射樹枝狀大分子后的任意動物組中未注意到體內毒性。
靶向的藥物通過葉酸受體遞送至腫瘤細胞。測試不同劑量的綴合物對具有皮下人KB異種移植物的SCID CB-17小鼠的功效并且與等劑量和較高劑量的游離甲氨蝶呤相比。對小鼠維持葉酸-缺乏膳食3周，此后注射KB腫瘤細胞以便獲得接近人血清中并且預防腫瘤異種移植物上葉酸受體減量調節(jié)的葉酸循環(huán)水平(參見Mathias等J Nucl Med 29，1579(1998))。給每組中有5只小鼠的6組SCID小鼠的一側脅腹經皮下注射在0.2mL PBS中的5×106KB細胞混懸液。所用的G5-FI-FA-MTX治療劑的最高總劑量等于55.0mg/kg并且相當于5.0mg/kg游離甲氨蝶呤的總蓄積劑量(附圖29)。將綴合物的治療劑量與相當于蓄積在基于小鼠存活率的10-15次注射中的33.3、21.7和5.0mg/kg的游離甲氨蝶呤的三種蓄積劑量進行比較。將鹽水和不含甲氨蝶呤的綴合物(G5-FI-FA)用作對照品。
在整個實驗過程中監(jiān)測小鼠體重，作為藥物不良反應的指征，并且體重改變顯示在最高和次最高蓄積劑量的游離甲氨蝶呤下的急性和慢性毒性分別等于33.3和21.7mg/kg。盡管兩種劑量的游離藥物均影響腫瘤生長，但是它們在截止到本試驗的第32-36天時變成致死性的(附圖29)。剩余的實驗組具有極為均勻的體重波動，在與使用鹽水或不含甲氨蝶呤的綴合物的對照組相比時，未表現出毒性。就所用的最高蓄積劑量的游離甲氨蝶呤而言，對肝的組織病理學分析揭示出晚期肝損傷，炎癥細胞聚集和門靜脈周炎癥。相反，相當于5.0mg/kg游離甲氨蝶呤的治療綴合物的總蓄積劑量和相同劑量下的游離甲氨蝶呤均無毒性(附圖29)。重要的是，等于所用游離甲氨蝶呤的最低劑量的綴合物治療劑量與次最高劑量的游離甲氨蝶呤(21.7mg/kg，13次注射)具有等同的有效性。而在該濃度下的游離藥物對腫瘤生長沒有作用(附圖29)，不含甲氨蝶呤的綴合物(G5-FI-FA)在與注射鹽水的對照組相比時無治療作用(附圖29)。來自接受綴合物(G5-FI-FA-MTX)的小鼠的肝載玻片顯示偶見門靜脈周淋巴細胞，指示非不同于注射鹽水的對照組動物的炎癥和單細胞壞死。
在第二個99-天試驗過程中，用G5-FI-FA-MTX或G5-FA-MTX綴合物而不用FITC治療的腫瘤比那些用非靶向的G5-FI-MTX綴合物、游離甲氨蝶呤或鹽水治療的腫瘤在生長得緩慢方面存在統計學顯著性(P＜0.05)。使用兩種靶向的綴合物遞送至存活小鼠的甲氨蝶呤的等效劑量高于游離甲氨蝶呤的劑量，因為所有接受游離甲氨蝶呤的小鼠在本試驗的第66天時死亡(附圖30)。接受G5-FI-FA-MTX或G5-FA-MTX綴合物的組中的小鼠存活率表明，基于終點時的4cm3體積的腫瘤生長可以被延遲至少30天(附圖30)。這一數值表明了綴合物的抗腫瘤有效性，因為它模擬了臨床終點并且需要在整個疾病進展過程中觀察小鼠。此外，在本試驗的第39天時，在1只使用G5-FA-MTX綴合物治療的小鼠中獲得了完全治愈。在該小鼠中的腫瘤在隨后的20天，直到本試驗的第60天時不可觸及。在本試驗終止時，接受G5-FA-MTX的有3只(8只中)存活者，而接受G5-FI-FA-MTX的有2個存活者(8只中)。在接受游離甲氨蝶呤的組或任意其它對照組中沒有小鼠存活。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了包含樹枝狀大分子的組合物，所述的樹枝狀大分子包含靶向劑、治療劑和成像劑。在優(yōu)選的實施方案中，將樹枝狀大分子以靶向特異性方式用于在體內將治療劑遞送(例如甲氨蝶呤)至腫瘤細胞。
基于進行的體重改變和組織病理學檢查發(fā)現綴合物的有效劑量無毒性。在兩種試驗終止時，組織病理學檢查未顯示出心臟毒性征兆并且未發(fā)生肌病。在這些動物中未觀察到腎中的急性腎小管壞死。對腫瘤載玻片的分析顯示對照組和注射鹽水的動物中存活的腫瘤僅有輕度的壞死，而治療綴合物與等劑量的游離甲氨蝶呤相比在腫瘤中導致重度到顯著性壞死。在本試驗終止時，與KB細胞相比評價腫瘤細胞因小鼠長期葉酸-缺乏膳食而在腫瘤中葉酸受體可能的增量調節(jié)。對用靶向的熒光素-標記的綴合物染色后的腫瘤細胞的流式細胞計量分析揭示出細胞保持了葉酸受體陽性，但低于原始KB細胞系2-5倍。
實施例14PAMAM-樹枝狀大分子-RGD4C肽綴合物的合成藥物靶向對有效的癌癥化療而言是關鍵。靶向遞送可提高化療作用并且使正常組織免受這些劇烈藥物的毒性副作用?？寡馨l(fā)生療法通過抑制內皮細胞增殖、遷移和分化預防新生血管形成(例如，參見Los和Voest，Semin.Oncol.，2001，28，93)?？梢詤^(qū)分新的由其成熟配對物形成的毛細血管的分子標記的鑒定提供了將細胞毒性劑靶向遞送至腫瘤脈管系統的方式(例如，參見Baillie等Br.J.Cancer，1995，72，257；Ruoslahti，Nat.Rev.Cancer，2002，2，83；Arap等Science，1998，279，377)。αVβ3整聯蛋白為這些獨特標記中最具有特異性的一種標記。
僅在血管發(fā)生過程中的內皮細胞腔表面上發(fā)現了αVβ3整聯蛋白。該標記可以由在血管發(fā)生過程中限于血管空間的靶向劑識別(參見例如Brooks等Science，1994，264，569；Cleaver和Melton，Nat.Med，.2003，9，661)。已經通過噬菌體展示研究鑒定了αVβ3選擇性配體Arg-Gly-Asp(RGD)的高度親和力(Pasqualini等Nat.Biotech.，1997，15，542)。雙重環(huán)化的肽(RGD4C，含有通過4個半胱氨酸殘基的2個二硫鍵)和構象束縛的RGD比具有單一二硫橋的肽類或線性肽類更易于結合αVβ3。對合成用于基因遞送(例如，參見Kunath等J.Gene.Med.，2003，5，588-599)、腫瘤靶向(例如，參見Mitra等J.Controlled Release，2005，102，191)和成像應用(例如，參見Chen等J.Nucl.Med.，2004，45，1776)的聚合物(poymer)-RGD綴合物的關注已經在增長。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與熒光標記的第5代樹枝狀大分子綴合的RGD4C的合成。另外，本發(fā)明提供了這些綴合物的結合特性和細胞攝取。
據報導胺終止的樹枝狀大分子以歸因于表面正電荷的非特異性方式與細胞結合。為了改善靶向功效和減少非特異性相互作用，使用乙酸酐(75％×摩爾過量)在有三乙胺作為堿存在下對胺終止的G5樹枝狀大分子進行部分表面修飾(例如，參見Majoros等Macromolecules，2003，36，5526.4)。最初通過對PBS緩沖液且然后對水透析純化綴合物。75摩爾過量的乙酸酐的應用使某些胺基脫離以便進一步修飾并且防止因聚集、分子間相互作用和降低的溶解度產生的問題。
可以使用1H NMR光譜法監(jiān)測乙?；疓5樹枝狀大分子(G5-Ac)的乙?；潭群图兌?。為了通過流式細胞計量術或共焦顯微鏡術檢測綴合物，可以使用可檢測探針(例如熒光探針)。例如，可以將Alexa Fluor488(AF)用作熒光標記。使部分乙?；臉渲畲蠓肿优c5摩爾過量的Alexafluor-NHS酯如制造商所述的方案進行反應，而得到熒光標記的綴合物(G5-Ac-AF)。通過凝膠過濾和隨后透析純化該綴合物。通過1HNMR和UV-vis光譜法，按照制造商所述的方案(Molecular Probes)，將染料分子的數量估計為每個樹枝狀大分子中～3個。
用于本發(fā)明某些實施方案的RGD肽(RGD4C)具有以高親和力特異性結合αVβ3的構象束縛的RGD序列。雜二聚化αVβ3整聯蛋白中的RGD結合位點位于兩個亞單位之間的斷裂處。為了保持接觸靶位點的肽的結合部分，將ε-Aca(?；核?間隔基用于使肽與樹枝狀大分子綴合。由此，RGD-4C肽的質子化NH2末端對生物活性而言并非必不可少的。因此，在某些實施方案中，用乙?；oNH2末端封端(例如，參見deGroot等Mol.Cancer Therap.，2002，1，901)。
通過使用DMF/DMSO溶劑混合物中的EDC，在有HOBt存在下制備所述肽的活性酯，且然后將其滴加到G5-Ac-AF的水溶液中。反應時間分別為2小時和3天。酰胺化主要發(fā)生在?；核徇B接部分的羧酸酯基上(例如與1.1eq.在DMSO中的烯丙基胺的A模型反應得到單酰胺化的產物，純度為67％(HPLC)。ESI-MS m/z 1282[M+H]+)。通過膜過濾和透析純化與AlexaFluor和RGD肽G5-Ac-AF-RGD綴合的部分乙?；腜AMAM樹枝狀大分子。綴合物的1H NMR顯示在AlexaFluor和肽的苯環(huán)的芳香族化合物區(qū)中的重疊信號遠離對樹枝狀大分子預計的脂肪族化合物信號?；贛ALDI-TOF質譜將肽類的數量計算為每個樹枝狀大分子中有2-3個肽。
MALDI-TOF MS已經成為廣泛應用于表征不均勻官能化的樹枝狀大分子的表面官能化的技術(例如，參見Woller等J.Am.Chem.Soc.，2003，125，8820-8826)。
使用Waters TOfspec-2E記錄質譜，使用高質量PAD檢測器以延遲提取模式運行并且使用在芥子酸中的BSA校準。為了測定含有肽的樹枝狀大分子的官能化，從產物的(m/z 32770[M+H]+)中扣除原料的(m/z 29650[M+H]+)。
描述上述合成G5-Ac-AF-RGD的方案如附圖31中所示。
實施例15PAMAM-樹枝狀大分子-RGD4C肽綴合物的體外靶向功效測定表達高細胞表面αVβ3受體的人臍靜脈細胞(HUVEC)中樹枝狀大分子-RGD4C綴合物的細胞攝取。簡言之，在補充了內皮細胞生長因子的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVEC細胞。用不同濃度的G5-Ac-AF-RGD綴合物處理細胞并且通過流式細胞計量術監(jiān)測攝取。正如附圖32中所示，流式細胞檢測分析顯示了與HUVEC細胞的劑量-依賴性和可飽和結合。
還使用流式細胞計量術測試了該綴合物與具有不同整聯蛋白受體表達水平的幾種不同細胞系的結合(參見附圖33)。該綴合物表現出與不同細胞系的不同結合親和力，其中HUVEC細胞最有效地結合綴合物，其后是Jurkat細胞。已經預先報導了人淋巴細胞系Jurkat具有大量整聯蛋白受體并且能夠結合RGD 4C肽(例如，參見Assa-Munt等Biochemistry，2001，40，2373)。L1210小鼠淋巴細胞系不能結合綴合物，而KB細胞僅表現出中度結合。
顯而易見，本發(fā)明的綴合物對具有不同細胞表面整聯蛋白受體表達水平的細胞系表現出可變的特異性。通過共焦顯微鏡分析證實了通過流式細胞計量術觀察到的結合。洗滌用G5-AF-RGD4C(0，30，60，100nm)濃度處理的HUVEC細胞并且用多聚甲醛(p-formaldehyde)固定，用DAPI對細胞核進行復染。從附圖34中共焦顯微鏡圖像的有關表現中顯而易見，攝取隨綴合物濃度的增加而增加。添加游離肽抑制HUVEC細胞攝取綴合物達到顯著性水平，表明受體介導的綴合物攝取(參見附圖35)。
為了確定多價相互作用在與單價相互作用比較時是否表現出更強的結合，使用BIAcore instrument(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)對人整聯蛋白αvβ3純化的蛋白質(Chemicon International，Inc.Temecula，CA)監(jiān)測G5-Ac-AF-RGD4C綴合物和RGD4C肽的結合親和力。通過使用BIAevaluation 3.2軟件BIAcore AB)對二價結合模型進行總體擬合來分析對兩種分析物獲得的數據。根據解離和結合速率常數之比(koff/kon)計算平衡解離常數(KD)。游離RGD4C肽與人整聯蛋白αvβ3的結合極為快速地達到10RU的最大結合值。相反，結合G5-Ac-AF-RGD4C綴合物速度較慢地達到約1500RU的最大結合值。兩種分析物表現出不同的解離速率(off-rates)。游離RGD4C肽在使用試驗緩沖液洗滌過程中從配體中快速解離。納米裝置的解離比游離肽慢約522倍。因此，本發(fā)明提供了多功能樹枝狀大分子，其中在單一樹枝狀大分子上的多種肽的綴合結果對結合功效發(fā)揮協同作用。
因此，本發(fā)明提供了PAMAM-樹枝狀大分子RGD4C肽綴合物。在某些實施方案中，樹枝狀大分子被表達αVβ3受體的細胞攝取。因此，在某些優(yōu)選的實施方案中，樹枝狀大分子綴合物用于使成像劑和/或化療劑定向于血管發(fā)生的腫瘤脈管系統。
將上述說明書中提及的所有公開文獻和專利引入本文作為參考。在不脫離本發(fā)明實質和范圍的情況下對本發(fā)明所述的方法和系統的各種變型和變化對本領域技術人員而言顯而易見。盡管結合具體的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但是應理解請求保護的本發(fā)明不應過度限于這類具體的實施方案。實際上，對相關領域技術人員顯而易見的用于實施本發(fā)明所述方式的變型屬于本發(fā)明的范圍。
權利要求
1.組合物，包含樹枝狀大分子，所述的樹枝狀大分子包含部分乙?；牡?代(G5)聚酰胺型胺(PAMAM)、聚丙胺(POPAM)或PAMAM-POPAM樹枝狀大分子，所述的樹枝狀大分子包含用于綴合官能團的兩個或更多個反應位置。
2.權利要求1所述的組合物，其中所述的樹枝狀大分子包含兩個或更多個官能團，其中所述的官能團選自治療劑、靶向劑、成像劑和生物監(jiān)測劑組成的組。
3.權利要求2所述的組合物，其中所述官能團中的至少一種與所述的樹枝狀大分子通過酯鍵綴合。
4.權利要求2所述的組合物，其中所述的治療劑包含甲氨蝶呤。
5.權利要求2所述的組合物，其中所述的靶向劑包含葉酸。
6.權利要求2所述的組合物，其中所述的靶向劑包含RGD肽。
7.權利要求2所述的組合物，其中所述的成像劑包含熒光劑。
8.權利要求7所述的組合物，其中所述的熒光劑包含異硫氰酸熒光素。
9.權利要求7所述的組合物，其中所述的熒光劑包含6-TAMARA。
10.權利要求4所述的組合物，其中所述的甲氨蝶呤與所述的樹枝狀大分子通過酯鍵綴合。
11.權利要求1所述的組合物，其中所述的樹枝狀大分子包含2-20個反應位置。
12.權利要求2所述的組合物，其中所述的樹枝狀大分子與所述的官能團綴合。
13.權利要求12所述的組合物，其中所述的綴合包含共價鍵、離子鍵、金屬鍵、氫鍵、范德瓦耳斯鍵、酯鍵或酰胺鍵。
14.權利要求2所述的組合物，其中所述的治療劑包含化療劑、抗-致腫瘤劑、抗血管化劑、腫瘤抑制劑、抗微生物劑或包含編碼治療蛋白的核酸的表達構建體。
15.權利要求14所述的組合物，其中所述的治療劑被保護基保護。
16.權利要求15所述的組合物，其中所述的保護基選自對光不穩(wěn)定的保護基、對輻射不穩(wěn)定的保護基和對酶不穩(wěn)定的保護基組成的組。
17.權利要求1所述的組合物，其中所述的樹枝狀大分子包含被保護的核心二胺。
18.權利要求1所述的組合物，其中所述的反應位置包含伯胺基。
19.組合物，包含樹枝狀大分子，所述的樹枝狀大分子包含部分乙?；腉5PAMAM、POPAM或PAMAM-POPAM樹枝狀大分子，所述的樹枝狀大分子進一步包含一種或多種官能團，所述的一種或多種官能團選自治療劑、靶向劑和成像劑組成的組。
20.權利要求19所述的組合物，其中所述的治療劑包含抗-致腫瘤劑。
21.權利要求19所述的組合物，其中所述的治療劑包含化療劑。
22.權利要求19所述的組合物，其中所述的治療劑包含甲氨蝶呤。
23.權利要求19所述的組合物，其中所述的治療劑包含氚。
24.權利要求19所述的組合物，其中所述的靶向劑包含葉酸。
25.權利要求19所述的組合物，其中所述的靶向劑包含RGD肽。
26.權利要求19所述的組合物，其中所述的成像劑包含熒光劑。
27.權利要求26所述的組合物，其中所述的熒光劑包含異硫氰酸熒光素。
28.權利要求26所述的組合物，其中所述的熒光劑包含6-TAMARA。
29.權利要求22所述的組合物，其中所述的甲氨蝶呤與所述的樹枝狀大分子通過酯鍵綴合。
30.權利要求19所述的組合物，其中所述的治療劑選自化療劑、抗-致腫瘤劑、抗血管化劑、腫瘤抑制劑、抗微生物劑和包含編碼治療蛋白的核酸的表達構建體組成的組。
31.權利要求19所述的組合物，其中所述的治療劑被保護基保護。
32.權利要求31所述的組合物，其中所述的保護基選自對光不穩(wěn)定的保護基、對輻射不穩(wěn)定的保護基和對酶不穩(wěn)定的保護基組成的組。
33.權利要求21所述的組合物，其中所述的化療劑選自鉑復合物、維拉帕米、鬼臼毒素、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亞硝基脲(nitrosurea)、阿霉素、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、博來霉素、普卡霉素(plicomycin)、絲裂霉素、博來霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、泰素、transplatinum、5-氟尿嘧啶、長春花新堿、長春堿和甲氨蝶呤組成的組。
34.權利要求20所述的組合物，其中所述的抗-致腫瘤劑包含反義核酸。
35.權利要求34所述的組合物，其中所述的反義核酸包含與癌基因的RNA互補的序列。
36.權利要求35所述的組合物，其中所述的癌基因選自abl、Bcl-2、Bcl-xL、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf、ras、ret、src和trk組成的組。
37.權利要求30所述的組合物，其中所述的核酸編碼選自腫瘤抑制蛋白、細胞因子、受體、細胞凋亡誘導物和分化劑組成的組的蛋白質。
38.權利要求37所述的組合物，其中所述的腫瘤抑制蛋白選自BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb和p27組成的組。
39.權利要求37所述的組合物，其中所述的細胞因子選自GMCSF、IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IFN-β、IFN-γ和TNF組成的組。
40.權利要求37所述的組合物，其中所述的受體選自CFTR、EGFR、雌激素受體、IL-2受體和VEGFR組成的組。
41.權利要求37所述的組合物，其中所述的細胞凋亡誘導物選自AdElB、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakid和ICE-CED3蛋白酶組成的組。
42.權利要求19所述的組合物，其中所述的治療劑包含短半衰期的放射性同位素。
43.權利要求19所述的組合物，其中所述的成像劑包含選自14C、36Cl、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、75Se、Tc-99m和175Yb組成的組的放射性標記。
44.權利要求19所述的組合物，其中所述的靶向劑選自抗體、受體配體、激素、維生素和抗原組成的組。
45.權利要求44所述的組合物，其中所述的抗體對疾病特異性抗原具有特異性。
46.權利要求45所述的組合物，其中所述的疾病特異性抗原包含腫瘤特異性抗原。
47.權利要求44所述的組合物，其中所述的受體配體選自CFTR配體、FGFR配體、雌激素受體配體、FGR2配體、葉酸受體配體、IL-2受體配體、糖蛋白、EGFR配體和VEGFR配體組成的組。
48.權利要求44所述的組合物，其中所述的受體配體為葉酸。
49.權利要求44所述的組合物，其中所述的受體配體為RGD肽。
50.治療疾病的方法，包含給予患有或易感所述疾病的受試者治療有效量的權利要求19所述的組合物。
51.權利要求50所述的方法，其中所述的疾病為腫瘤性疾病。
52.權利要求51所述的方法，其中所述的腫瘤性疾病選自白血病、急性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、成髓細胞白血病、前髓細胞性白血病、粒-單核細胞型白血病、單核細胞性白血病、紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病、慢性淋巴細胞性白血病、真性紅細胞增多、淋巴瘤、何杰金病、非何杰金病、多發(fā)性骨髓瘤、特發(fā)性巨球蛋白血癥、重鏈病、實體瘤、肉瘤和癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、硬腦膜肉瘤、黑素瘤和神經母細胞瘤視網膜成神經細胞瘤組成的組。
53.改變受試者腫瘤生長的方法，包含a)提供包含樹枝狀大分子的組合物，所述的樹枝狀大分子包含部分乙?；腉5 PAMAM、POPAM或PAMAM-POPAM樹枝狀大分子，所述的樹枝狀大分子進一步包含一種或多種官能團，所述的一種或多種官能團選自治療劑、靶向劑和成像劑組成的組；和b)在使所述的腫瘤生長改變的條件下給予所述的受試者所述的組合物。
54.權利要求53所述的方法，其中所述的改變包含抑制所述的受試者中的腫瘤生長。
55.權利要求53所述的方法，其中所述的改變包含減小所述受試者中的所述腫瘤大小。
56.權利要求53所述的方法，其中將所述的包含樹枝狀大分子的組合物與化療劑或抗-致腫瘤劑共同給藥。
57.權利要求53所述的方法，其中所述的改變腫瘤生長使所述的腫瘤對化療或抗-致癌療法敏感。
58.權利要求53所述的方法，其中所述的治療劑包含抗-致腫瘤劑。
59.權利要求53所述的方法，其中所述的治療劑包含化療劑。
60.權利要求53所述的方法，其中所述的治療劑包含甲氨蝶呤。
61.權利要求53所述的方法，其中所述的治療劑包含氚。
62.權利要求53所述的方法，其中所述的靶向劑包含葉酸。
63.權利要求53所述的方法，其中所述的靶向劑包含RGD肽。
64.權利要求53所述的方法，其中所述的成像劑包含熒光劑。
65.權利要求53所述的方法，其中所述的熒光劑包含異硫氰酸熒光素。
66.權利要求53所述的方法，其中所述的熒光劑包含6-TAMARA。
67.權利要求53所述的方法，其中所述的甲氨蝶呤與所述的樹枝狀大分子通過酯鍵綴合。
68.權利要求53所述的方法，其中所述的治療劑選自化療劑、抗-致癌劑、抗血管化劑、腫瘤抑制劑、抗微生物劑和包含編碼治療蛋白的核酸的表達構建體組成的組。
69.權利要求53所述的方法，其中所述的治療劑被保護基保護。
70.權利要求69所述的方法，其中所述的保護基選自對光不穩(wěn)定的保護基、對輻射不穩(wěn)定的保護基和對酶不穩(wěn)定的保護基組成的組。
71.權利要求59所述的方法，其中所述的化療劑選自鉑復合物、維拉帕米、鬼臼毒素、卡鉑、丙卡巴肼、氮介、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亞硝基脲(nitrosurea)、阿霉素、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、博來霉素、普卡霉素(plicomycin)、絲裂霉素、博來霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、泰素、transplatinum、5-氟尿嘧啶、長春新堿、長春堿和甲氨蝶呤組成的組。
72.權利要求58所述的方法，其中所述的抗-致腫瘤劑包含反義核酸。
73.權利要求72所述的方法，其中所述的反義核酸包含與癌基因的RNA互補的序列。
74.權利要求73所述的方法，其中所述的癌基因選自abl、Bcl-2、Bcl-xL、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf、ras、ret、src和trk組成的組。
75.權利要求68所述的方法，其中所述的核酸編碼選自腫瘤抑制蛋白、細胞因子、受體、細胞凋亡誘導物和分化劑組成的組的蛋白質。
76.權利要求75所述的方法，其中所述的腫瘤抑制蛋白選自BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb和p27組成的組。
77.權利要求75所述的方法，其中所述的細胞因子選自GMCSF、IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IFN-β、IFN-γ和TNF組成的組。
78.權利要求75所述的方法，其中所述的受體選自CFTR、EGFR、雌激素受體、IL-2受體和VEGFR組成的組。
79.權利要求75所述的方法，其中所述的細胞凋亡誘導物選自AdElB、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakid和ICE-CED3蛋白酶組成的組。
80.權利要求53所述的方法，其中所述的治療劑包含短半衰期的放射性同位素。
81.權利要求53所述的方法，其中所述的成像劑包含選自14C、36Cl、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、75Se、Tc-99m和175Yb組成的組的放射性標記。
82.權利要求53所述的方法，其中所述的靶向劑選自抗體、受體配體、激素、維生素和抗原組成的組。
83.權利要求82所述的方法，其中所述的抗體對疾病特異性抗原具有特異性。
84.權利要求83所述的方法，其中所述的疾病特異性抗原包含腫瘤特異性抗原。
85.權利要求82所述的方法，其中所述的受體配體選自CFTR配體、FGFR配體、雌激素受體配體、FGR2配體、葉酸受體配體、IL-2受體配體、糖蛋白、EGFR配體和VEGFR配體組成的組。
86.權利要求82所述的方法，其中所述的受體配體為葉酸。
87.權利要求82所述的方法，其中所述的受體配體為RGD肽。
88.權利要求53所述的方法，其中所述的腫瘤與腫瘤性疾病相關。
89.權利要求88所述的方法，其中所述的腫瘤性疾病選自白血病、急性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、成髓細胞白血病、前髓細胞性白血病、粒-單核細胞型白血病、單核細胞性白血病、紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病、慢性淋巴細胞性白血病、真性紅細胞增多、淋巴瘤、何杰金病、非何杰金病、多發(fā)性骨髓瘤、特發(fā)性巨球蛋白血癥、重鏈病、實體瘤、肉瘤和癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、硬腦膜肉瘤、黑素瘤和神經母細胞瘤視網膜成神經細胞瘤組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的治療和診斷用樹枝狀大分子。特別地，本發(fā)明涉及基于樹枝狀大分子的用于疾病診斷和療法的多功能組合物和系統(例如癌癥診斷和療法)。這些組合物和系統包含一種或多種用于靶向、成像、傳感和/或提供治療或診斷物質并且監(jiān)測細胞或組織(例如腫瘤)對療法的反應的組分。
文檔編號A61B5/055GK101039620SQ200580034777
公開日2007年9月19日 申請日期2005年8月25日 優(yōu)先權日2004年8月25日
發(fā)明者I·J·馬約羅斯, T·P·托馬斯, J·B·貝克, 曹政一, J·F·庫克夫斯加－拉塔洛 申請人:密執(zhí)安州立大學董事會