專利名稱：：治療中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子抑制的制作方法治療中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子抑制
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)抑制劑在治療中的用途。技術(shù)背景Spadafora在其論文(CytogenetGenomeRes105:346350(2004))中討論內(nèi)源的、非端粒逆轉(zhuǎn)錄酶及其在胚胎發(fā)生和轉(zhuǎn)化中的意義。更特別地，逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)由兩類重復(fù)基因組元件編碼，即逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒。它們都需要RT作為其系統(tǒng)的基本組成?？赡孓D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子元件(retrotransposableelements),如長散布元件(LINEs)，長期以來認(rèn)為是"垃圾DNA"，除了作為不再需要的剩余DNA以外只有很少的用途，并沒有將其基因組中刪除。早在1971年(Temin，JNatlCancerInst46:5660)，這一部分已經(jīng)受到挑戰(zhàn)，但是，本領(lǐng)域繼續(xù)簡單地將這種序列認(rèn)為是"垃圾DNA"。Spadafora在其論文(同上)中回顧了該技術(shù)，并證明了RT編碼基因的表達(dá)通常在非病理、末期分化的細(xì)胞中被抑制，但是，在非常早期的胚胎、生殖細(xì)胞、胚胎和腫瘤組織中是活性的，所有這些都具有高的增殖潛能。在鼠科胚胎中阻斷RT停滯了其發(fā)育，并且去除阻斷影響都沒有重新啟動(dòng)胚胎發(fā)生。在癌細(xì)胞中，增殖得到顯著減少，在48和72小時(shí)之間觀察到區(qū)別。Kuo等人(BiochemandBiophysResCom253:566570(1998))從人類小細(xì)胞肺癌的cDNA文庫中確定出一個(gè)1.7kb的LINE-I(LI)轉(zhuǎn)錄本。他們發(fā)現(xiàn)，這種重復(fù)元件在人類組織中無處不在地表達(dá)，包括正常的(纖維原細(xì)胞和肝臟)和轉(zhuǎn)化的。此外，他們表明衍生自此轉(zhuǎn)錄本的正義寡核苷酸，與人類肝細(xì)胞瘤細(xì)胞孵育，降低了細(xì)胞增殖的速率。該元件在正常和癌組織中的存在顯示出這種重復(fù)元件與細(xì)胞增殖的常規(guī)功能有關(guān)。作者將細(xì)胞增殖的降低解釋為由于突變而對參與控制細(xì)胞生長的基因的沉默或功能性變更。作者并不認(rèn)為這種轉(zhuǎn)化是可逆事件。相反，我們現(xiàn)在確定，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的LINE-1族的抑制對于抑制或阻礙癌組織的增殖及剌激其分化是有效的。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明第一方面是提供RNA干擾抑制癌組織非特異性增殖的用途，其中RNA識別至少一個(gè)LINE-1重復(fù)元件的一部分。另一方面，本發(fā)明提供RNA干擾(RNAi)在治療癌損傷中的用途，其中RNA識別至少一個(gè)LINE-1重復(fù)元件的一部分。使用本發(fā)明RNAi的RT表達(dá)減少導(dǎo)致癌組織增殖的降低，常常大于50%，且至少在受治療的細(xì)胞中隨后的增殖主要為分化生長。因此，本發(fā)明的RNAi起到減少癌組織增殖，同時(shí)激勵(lì)分化的作用。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的RNAi特別指LINE-l，其用途避免使用一般的非核苷酸RT抑制劑(NNRTI)，其封閉所有的RTs。事實(shí)上，令人驚訝的是，本發(fā)明的RNAi，直接抗(against)LINE-1，起封閉或抑制癌組織增殖的作用，假定LINE-1只是RT編碼元件下的亞群。目前，LINE-1家族中只有少數(shù)成員(大約68個(gè))被識別為具有特別高的活性，本發(fā)明給出抗這些中任一個(gè)的RNAi。使用RNAi的聯(lián)合治療，其中設(shè)計(jì)每個(gè)rna對于單個(gè)line-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)來說都是特定的，但是優(yōu)選使用抗共有序列的RNA。這種共有序列可以用于兩個(gè)或多個(gè)LINE-1家族成員，但是優(yōu)選用于活性成員，如果多個(gè)都是同一的(identified)，則可以用于多個(gè)。優(yōu)選地，RNAi為短千擾RNA(siRNA)或雙鏈RNA(dsRNA)。還優(yōu)選，RNA為短發(fā)夾RNA，優(yōu)選適于且優(yōu)選通過siRNA表達(dá)載體方法來給藥。合適的載體包括本領(lǐng)域公知并在此仍要討論的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒質(zhì)粒。通常優(yōu)選，本發(fā)明中使用的RNA具有10或更大的片段，如15、20、30、40或更多核苷酸，其相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄LINE-1DNA區(qū)域的正鏈意義(directsense)。然而，特別優(yōu)選為21個(gè)核苷酸。轉(zhuǎn)錄的LINE-1DNA優(yōu)選選自共有區(qū)域。然而，并不必須要求核苷酸的片段與轉(zhuǎn)錄LINE-1DNA的所選區(qū)域完全一致，只要本發(fā)明的干擾RNA起到結(jié)合來自LINE-1DNA的轉(zhuǎn)錄RNA即可。然而，特別優(yōu)選的是，來自RNAi的RNA核苷酸片段與相應(yīng)來自LINE-1序列的轉(zhuǎn)錄DNA片段一致。RNAi優(yōu)選包括與相應(yīng)來自LINE-1序列的轉(zhuǎn)錄DNA片段一致的21個(gè)核苷酸序列，更優(yōu)選由相應(yīng)來自LINE-1序列的轉(zhuǎn)錄DNA片段一致的21個(gè)核苷酸序列組成。本發(fā)明的RNAi可以形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，其中，環(huán)可以位于上述核苷酸片段范圍內(nèi)，在這種情況下，片段可以被環(huán)中斷。該環(huán)可以采取dsRNA形式作為其結(jié)構(gòu)的一部分，可以在RNA片段中提供1、2或3個(gè)核苷酸缺口。通常優(yōu)選，沒有導(dǎo)致RNA片段省略的環(huán)，使得目標(biāo)mRNA沿著選定序列結(jié)合。本發(fā)明的RNAi可以簡單地為能夠連接來自LINE-1元件的對應(yīng)轉(zhuǎn)錄序列的短序列，或可以另外包括一個(gè)或兩個(gè)末端序列和/或內(nèi)部環(huán)序列。應(yīng)當(dāng)理解，選自LINE-1內(nèi)的序列應(yīng)當(dāng)是開放閱讀框架，例如可以選自RT的ORFl和ORF2。因此，優(yōu)選開放閱讀框架編碼逆轉(zhuǎn)錄酶。這包括具有逆轉(zhuǎn)錄活性的任何蛋白質(zhì)。RNAi治療可以以任何方便的方式給藥。通常，重要的是必須確保RNAi到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞。雖然本發(fā)明的RNAi可以以任何合適的載體直接注射到目標(biāo)位置，但是其還可以綁定至例如組織工程細(xì)胞支架(scaffolds)或納米顆粒(nanoparticles)而給藥。更優(yōu)選地，RNAi可以例如作為質(zhì)?；蛲ㄟ^逆轉(zhuǎn)錄酶病毒來給藥。腺病毒和腺相關(guān)病毒的載體可以得到使用以來分配RNAi的編碼序列，優(yōu)選以質(zhì)粒形式。其他類似的病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶病毒以及其他這種載體也可以使用。特別地，己經(jīng)確定，將編碼序列如質(zhì)粒傳遞至目標(biāo)位置的功效可以在循環(huán)中增加，如果使用滲透因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)c傳遞的其他合適方法為pSUPERRNAi系統(tǒng)kit(www.oligogengine.com)。圖l:通過抗RT藥物的增殖抑制作用。(A)用DMSO(對照)、奈韋拉平(nevirapine)(NEV)和依法韋侖(efavirenz)(EFV)處理培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞。每96小時(shí)對細(xì)胞計(jì)數(shù)并重新裝盤，進(jìn)行5個(gè)周期。然后，在沒有抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(2個(gè)周期)。然后，再將RT抑制劑加入進(jìn)行2個(gè)周期。細(xì)胞計(jì)數(shù)用對照數(shù)的％來表示，其確定為100%。數(shù)值代表了三個(gè)實(shí)驗(yàn)的合并數(shù)據(jù)。(B)RT抑制劑存在的4個(gè)96小時(shí)周期和去除藥物后的細(xì)胞周期圖。圖2:RT抑制劑導(dǎo)致黑素瘤細(xì)胞的形態(tài)分化。(A)在DMSO-(a、b、c)、奈韋拉平-(d、e、f)或依法韋侖-(g、h、i)處理培養(yǎng)的A-375細(xì)胞系。在姬姆薩(WrightGiemsa)染色后(左欄)、SEM(中欄)和oc微管蛋白(綠色)與細(xì)胞核PI著色(紅色)之后的共焦顯微鏡(右欄)后的相差顯微鏡觀察的培養(yǎng)物。(B)黑素瘤衍生的TVM-A12原代細(xì)胞。DMSO-(a、b、c)和奈韋拉平處理(d、e、f)的細(xì)胞在相差顯微鏡(左欄)、SEM(中欄)和共焦顯微鏡(右欄)下的情況，標(biāo)尺，20prn。圖3:RT抑制劑調(diào)節(jié)A-375(板A)和PC3(板B)細(xì)胞系中的基因表達(dá)。從用DMSO(ctr)、奈韋拉平(nev)或依法韋侖(efv)處理和去除奈韋拉平(neWr)或依法韋侖(efV/r)之后的細(xì)胞中提取的RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增，用內(nèi)部寡核苷酸來印跡和雜交。GAPDH用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。圖4:RNAi對LINE-1誘導(dǎo)A-375細(xì)胞的形態(tài)分化，減少A-375細(xì)胞的增殖并調(diào)節(jié)A-375細(xì)胞的中的基因表達(dá)。(A)完全長度LINE-1元件的結(jié)構(gòu)。給出了siRNA寡核苷酸的位置。箭頭表明用于RT-PCR分析的引物對的位置。(B)用對照(CTR)和LINE-1siRNA寡核苷酸(Ll-i)轉(zhuǎn)染A-375培養(yǎng)物的相差顯微鏡分析。(C)用CTR和Ll-i寡核苷酸轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生長。(D)來自用CTR或Ll-i寡核苷酸轉(zhuǎn)染的A-375細(xì)胞的RNA在半定量RT-PCR之后的示例性基因表達(dá)模式。定量變化(表示為Ll-i轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物的％信號比上CTR轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物的信號)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值；擴(kuò)增的產(chǎn)品由條帶的光密度計(jì)量和對相同實(shí)驗(yàn)中GAPDH信號的標(biāo)準(zhǔn)化來測定。圖5:依法韋侖減少了裸鼠中人類瘤的生長。監(jiān)控由指定細(xì)胞系所形成的瘤在未受處理動(dòng)物(紅色)和接種后用依法韋侖處理1天(紫色)或處理1周(黃色)的動(dòng)物中的生長。PC3和HT29中從上往下第二條開始的兩條曲線顯示了接種后開始1天處理但在14天后進(jìn)行不連續(xù)處理的動(dòng)物中PC3-和HT69-衍生瘤的生長。曲線顯示出一組五個(gè)動(dòng)物的瘤尺寸的平均值。圖6:用依法韋侖預(yù)處理的PC3細(xì)胞的降低的致腫瘤性。(A)未處理或依法韋侖預(yù)處理細(xì)胞形成的瘤的生長，這些細(xì)胞注射到?jīng)]有進(jìn)行處理或在活體內(nèi)依法韋侖后處理的老鼠體內(nèi)。(B)指定的處理30天之后PC3衍生的異種移植物的結(jié)果(n二20個(gè)動(dòng)物/組)。圖7:用pS-Ll感染的細(xì)胞表現(xiàn)出增殖的顯著減少。pS-Ll感染的細(xì)胞顯示為A-375pS-ll。增殖保持恒定至少39天。未感染細(xì)胞(A-375,圖7A)保持高增殖速率，pS感染的細(xì)胞(A-375pS，圖7B)顯示出增殖在感染后的最初幾天中緩和降低，但隨后快速恢復(fù)到與未感染細(xì)胞相當(dāng)?shù)母咴鲋乘俾?。圖8:與對照相比，瘤生長在接種LINE-1干擾(LINE1-interfered)細(xì)胞的老鼠中得到顯著降低。板A示出了接種A375pS和A375pS-Lli細(xì)胞的老鼠體內(nèi)瘤生長的進(jìn)程。板B的例子中示出了與那些接種對照細(xì)胞的老鼠相比，在接種UNE-1干擾細(xì)胞的老鼠體內(nèi)瘤生長得到顯著降低。具體實(shí)施方式本發(fā)明RNAi耙向的LlNE-l元件(Us)優(yōu)選根據(jù)Brouha等(2003)的教導(dǎo)來選擇，其全文作為參考合并于此。優(yōu)選為活性Lls,因?yàn)槿绻鼈兪腔钚缘?，則他們易于能夠表達(dá)RT。因此，本發(fā)明的RNAi優(yōu)選識別或靶向至少一個(gè)活性Ll的一部分。優(yōu)選，RT的表達(dá)受RNAi的抑制。應(yīng)當(dāng)理解，所使用RNAi序列將識別，并能夠結(jié)合通過從目標(biāo)L1內(nèi)包括的特殊ORF轉(zhuǎn)錄可獲得的RNA，Ll元件的特征在于其也包括在此討論的優(yōu)選序列。因此，Ll序列由本發(fā)明優(yōu)選序列來確定，例如SEQIDNo.27，其對應(yīng)的DNA序列或其同源，這將在其它地方說明，但是L1序列也優(yōu)選能夠表達(dá)蛋白質(zhì)，優(yōu)選為RT，其表達(dá)受RNAi抑制。優(yōu)選在嚴(yán)格的條件下將RNAi序列結(jié)合LINE-lRNA，如在含有50%甲酰胺和6xSSC的緩沖劑中。優(yōu)選用于表征Ll元件特征的序列其本身為ORF、ORF的一部分或包括ORF的至少一部分。優(yōu)選用于由RNAi靶向的Ll序列包括在所述Ll元件的ORF范圍內(nèi)。因此，那些制造特定DNA序列的參考可以優(yōu)選，應(yīng)當(dāng)理解，用于具有確定的序列，其可能包含在L1元件的較大序列中。這樣，確定L1元件的序列不必含有ORF，假設(shè)Ll元件本身含有可表達(dá)ORF，從ORF轉(zhuǎn)錄的RNA能夠由耙向特定Ll元件的RNAi來結(jié)合。這樣，RNAi優(yōu)選耙向包括該優(yōu)選DNA序列或其對應(yīng)序列或其同源序列的L1元件。優(yōu)選Ll元件內(nèi)的ORFs例子為對應(yīng)于引物序列SEQIDNos.2025的序列。因此，RNAi優(yōu)選識別這些SEQIDNOS或其對應(yīng)的序列。更特別地，對于ORFi為5，-AGAAATGAGCAAAGCCTCCA-3'(SEQIDNo.20)5，-GCCTGGTGGTGACAAAATCT-3'(SEQIDNo.21)5，-TAAGGGCAGCCAGAGAGAAA-3，(SEQIDNo.24)對于ORF2為5'-TCCAGCAGCACATCAAAAAG-3，(SEQIDNo.22)5，-CCAGTTTTTGCCCATTCAGT畫3'(SEQIDNo.23)5，-TGACAAACCCACAGCCAATA-3，(SEQIDNo.25)因此，這些序列的R^A等同物為，對于ORFl為5，-AGAAAUGAGCAAAGCCUCCA-3，(SEQIDNo.39)5，-GCCUGGUGGUGACAAAAUCU-3，(SEQIDNo.40)5，-UAAGGGCAGCCAGAGAGAAA-3，(SEQIDNo.41)對于ORF2為5'曙UCCAGCAGCACAUCAAAAAG-3,(SEQIDNo.42)5'-CCAGUUUUUGCCCAUUCAGU曙3，(SEQIDNo.43)5，-UGACAAACCCACAGCCAAUA-3，(SEQIDNo.44)。因此，特別優(yōu)選RNAi包括至少一個(gè)片段，優(yōu)選來自SEQIDNos.3944中任何一個(gè)的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選15個(gè)連續(xù)核苷酸，最優(yōu)選20個(gè)連續(xù)核苷酸。如上所述，也優(yōu)選使用所述序列較短的片段，由如發(fā)夾環(huán)這樣的特征散開。対于L1rp，對于ORFi的CDS存在于SEQIDNo.27的9071923位置上，編碼在SEQIDNo.45中給出的蛋白質(zhì)序列。存在于SEQIDNo.27的19875814的位置上的CDS，編碼ORF2，蛋白質(zhì)序列在SEQIDNo.46中給出。ORF2編碼的蛋白質(zhì)被認(rèn)為具有RT活性。因此，優(yōu)選RNAi靶向包括在SEQIDNo.27中9071923位置上和/或SEQIDNo.27中19875814位置上的DNA，優(yōu)選能抑制根據(jù)SEQIDNo.45的蛋白質(zhì)的表達(dá)，最優(yōu)選SEQIDNo.46。類似地，CDSs存在于SEQIDNo.32中1771718697和115033116161的位置上，但是這些描述為假基因，因此不優(yōu)選。因此，優(yōu)選RNAi包括對應(yīng)于編碼根據(jù)SEQIDNo.45的蛋白質(zhì)的RNA序列的RNA片段，最優(yōu)選為SEQIDNo.46。該片段可以包括發(fā)夾或別處討論的其他特征。優(yōu)選地，RNAi由對應(yīng)于編碼根據(jù)SEQIDNo.45的蛋白質(zhì)的RNA序列的20或21bp的RNA片段組成，最優(yōu)選SEQIDNo.46。優(yōu)選地，RNAi具有SEQIDNo.l9的序列，或其RNA等同物，耙向熱Lls中共有序列的SEQIDNo.47。另一方面，本發(fā)明提供了這種RNAi。如Brouha等人(2003)描述那樣，活性Lls優(yōu)選多形態(tài)，并優(yōu)選"年輕"或最近形成，由于U元件或序列的年齡確定其可能的轉(zhuǎn)換。如Brouha等人(2003)描述那樣，具有很少序列轉(zhuǎn)換的Lls通常在種群上具有多形態(tài)性，在培養(yǎng)的細(xì)胞種具有活性。相反，高度轉(zhuǎn)換的L1序列是最通常的固定和無活性，活性Ll通常長度為6kbp，表明沒有5'截?cái)唷Ｒ虼?，LINE-1元件優(yōu)選長度至少為6kbp。優(yōu)選在Brouha等人(2003)預(yù)測的在平均人類中為活性的80100個(gè)有逆轉(zhuǎn)錄能力(retrotransposition-competent)的Lls。這些有逆轉(zhuǎn)錄能力的Lls中的6個(gè)被發(fā)現(xiàn)是高度活性Lls(熱Lls(hotLls))。熱Lls優(yōu)選顯示至少l/3的LlRP活性。因此，特別優(yōu)選L1序列為"熱Lls"，其具有在人體中的高生物活性，并優(yōu)選顯示至少l/3的LlRp活性。LlRP為熱Ll，在Brouha等人(2003)和Hum.Mol.Genet8(8)，15571560(1990)中得到說明，上述可以從http://hmg.oxfordjoumals.Org/cgi/reprint/8/8/l557獲得，NCBI登陸號為AF148856，SEQIDNo.27。正如優(yōu)選耙向ORFs那樣，SEQIDNo.27的9071923(ORF1)和19875814(ORF2)核苷酸位置為RNAi特別優(yōu)選的靶標(biāo)。相對于LlRP的活性可以通過合適的化驗(yàn)來測量，例如通過將LINE-l元件連接用于表達(dá)的易于由熟練技術(shù)人員選擇的可探測標(biāo)記。優(yōu)選地，這可以包括用于Brouha等人(2003)中所使用的方法和EGFP檢測。EGFP表達(dá)盒的構(gòu)建和如何使用其來評價(jià)活性進(jìn)一步在參考號為23的Brouha等人(2003)、HaigH.KazazianJr等人在NucleicAcidsResearch,2000，Vol.28，No.6，14181423中進(jìn)一步說明。包括EGFP的Ll的合適實(shí)施例在SEQIDNo,26中給出，將在下面討論。無需理論上的界定，認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄從位于其5引物UTR的內(nèi)部啟動(dòng)區(qū)起始，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。Ll編碼的蛋白質(zhì)、ORFlp和ORF2p然后作用于編碼它們的mRNA，這種現(xiàn)象公知為順式優(yōu)選(cispreference)。然后，得到的核蛋白微粒再次進(jìn)入被認(rèn)為通過靶向處理(target-primed)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的L1整合的細(xì)胞核中。在這個(gè)過程中，Ll核酸內(nèi)切酶在基因組DNA中松散的共有序列5'-TTTTT/A-3'處產(chǎn)生單鏈缺口(nick)，暴露一個(gè)3，OH，其作為用于通過L1RT(逆轉(zhuǎn)錄)來逆轉(zhuǎn)錄L1RNA的引物。優(yōu)選地，LINE-1序列包括21個(gè)堿基對共有序列，SEQIDNo.19，其對應(yīng)的(反義)DNA序列或其RNA等同物。因此，也優(yōu)選本發(fā)明的RNAi包括該21個(gè)堿基對序列的RNA等同物，或?qū)?yīng)于SEQIDNo.l9的DNA的RNA等同物，或能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下如6xSSC下雜交的序列。也優(yōu)選，RNAi靶向的序列為SEQIDNos.35-38中的任一個(gè)，更優(yōu)選為SEQIDNo.37，最優(yōu)選為SEQIDNo.35。包括其中的是對應(yīng)的DNA序列或其RNA等同物。SEQIDNo.35為實(shí)施例2中耙向的60bp序列，同時(shí)，SEQIDNos.36-38為較長的共有序列，將在下面討論。被用于耙向的L1序列也可以與在此描述的任何一種序列享有一定程度的同源性，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99.5%，更優(yōu)選至少99.9%，更優(yōu)選至少99.95%，最優(yōu)選至少99.99%的同源性。因此，RNAi優(yōu)選靶向包括這些優(yōu)選序列或其對應(yīng)序列或其同源序列的L1元件。在對特定序列作出的參考中，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)該序列為DNA序列、其包括對應(yīng)的DNA序列(如雜交成前述序列的序列，特別是在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，如6xSSC)或其RNA等同物，即通過轉(zhuǎn)錄所述DNA序列獲得的RNA序列。LINE-1元件(Lis)可以選自可逆轉(zhuǎn)錄元件的大的群組中，假設(shè)該元件編碼RT。優(yōu)選Lls從Ll元件的"轉(zhuǎn)錄的組A"(Ta)子集或pre-Ta子集衍生得到。然而，特別優(yōu)選為Ta子集，特別是Ta-ld家族。然而，特別優(yōu)選Lls選自LRE3、L1RP(NCBI登陸號為AF148856)和登陸號分別為ac004200、ac002980、a1356438、a1512428、ac021017和al137845，SEQIDNos.2633。這些序列和其相關(guān)的特征數(shù)據(jù)可以從NCBI網(wǎng)址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi獲f導(dǎo)。關(guān)于SEQIDNo.26，給出的完整序列為LRE3-EGFP的合成構(gòu)建，即用EGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)和中斷的Dlgh2基因(部分序列)標(biāo)記LRE3。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，不必包括位于1155位置處的EGFP編碼區(qū)域或處于510910位置處的Dlgh2基因部分，這些可以用ORFl和ORF2代替，正如存在于提供的其他Lls中的那樣。其和進(jìn)一步信息可以從NCBI網(wǎng)站上獲得，SEQIDNo.26的登陸號為AY995186。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基因工程化L1，使其包括可探測標(biāo)記如EGFP，可以使用SEQIDNo,26作為起始點(diǎn)或模板。對于L1元件群體的共有序列提供在SEQIDNos.3638中。SEQID討0.36為丁&-1(1共有序列，SEQIDNo,37為熱元件共有序列，SEQIDNo.38為對于90活性Lls更大的共有序列。這些可以從Brouha等人(2003)的在線論文的"輔助信息(supportinginformation)"中獲得，該論文可以在www.pnas.org獲得。因此，優(yōu)選Ll序列選自SEQIDNos.36、37和38或其對應(yīng)序列或同源序列中的任一。同源序列優(yōu)選與所述SEQIDNo.或其對應(yīng)序列具有至少70%的同源性，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99.5%，更優(yōu)選至少99.95%，最優(yōu)選至少99.99%。由于其提高的活性，特別優(yōu)選為熱Ll共有序列SEQIDNo.37或其對應(yīng)序列或同源序列。與熱11共有序列的同源或相似性程度是對逆轉(zhuǎn)錄活性良好的預(yù)測因子。Brouha等人(2003)分析了L1活性和核苷酸序列之間的關(guān)系，構(gòu)造了具有8個(gè)熱Lls的共有序列(LRE3、L1RP、ac004200、ac002980、a1356438、a1512428、ac021027和a1137845)SEQIDNo.37。該序列除了在1033位置上的沉默ORF1改變夕卜，與Ta-ld共有序列(SEQIDNo.36)相同，除了12個(gè)多形態(tài)位置外與90個(gè)完整的Lls的共有序列(SEQIDNo.38)相同。Brouha等人(2003)比較了Lls，首先作為活性和非活性群組，然后與熱元件的共有序列配對。他們分析了整個(gè)中的Lls，然后按區(qū)域分析，最后按是否導(dǎo)致氨基酸改變的不同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒有單獨(dú)與活性或非活性Lls有關(guān)的核苷酸改變。正如預(yù)期的那樣，有一些例外，Ll越接近熱L1共有序列，其越容易變成活性?？紤]上述結(jié)果，他們的數(shù)據(jù)表明逆轉(zhuǎn)錄活性的降低作為時(shí)間函數(shù)產(chǎn)生的。Ll與"熱"共有序列越遠(yuǎn)，其越不容易變成活性。特別優(yōu)選LINE-l元件包括與上述給出序列特別是熱Lls具有非常高程度序列同源性。其原因是，如Brouha等人討論的那樣，Ll序列越接近熱L1序列，其越容易變得活性，盡管有一些例外。如上所述，優(yōu)選LINE-1元件或序列為熱L1，優(yōu)選具有LlRp活性的至少1/3，優(yōu)選至少2/3，更優(yōu)選100%，最優(yōu)選大于100%，優(yōu)選為150%或更大。在特別優(yōu)選的熱Lls中，所有的都是多形態(tài)的，且3個(gè)(ac002980、ac004200和a1356438)來自最年輕的Ta-ld群組。此外，一個(gè)在Ta-lnd群組(al512428)，另一個(gè)是較年輕的Ta-0亞群(al137845)的成員。這5個(gè)規(guī)范的熱Lls的序列與其各自的群組或亞群的共有序列非常相似，顯示出在人類中的進(jìn)化中，他們相對較近的逆轉(zhuǎn)錄。最后，一個(gè)熱L1(ac021017)為非規(guī)范的。21個(gè)核苷酸的序列，SEQIDNo.19，與90個(gè)左右(約80至100)活性L1逆轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)存在的對應(yīng)序列是互補(bǔ)的，這些活性L1逆轉(zhuǎn)錄因子是本發(fā)明的優(yōu)選目標(biāo)。因此，RNAi優(yōu)選耙向包括此序列或?qū)?yīng)序列或其同源序列的L1元件。同時(shí)，LINE-1和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)之間的鏈己經(jīng)公知約30年，當(dāng)在清楚RT是由LINE-l編碼的基因之一時(shí)，LINE-1逆轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)傳統(tǒng)上地歸類為沒有用處的DNA，通常被稱為"垃圾DNA"。同樣，這種垃圾DNA被普遍認(rèn)為沒有生物功能。盡管如此，本發(fā)明人還是驚奇地發(fā)現(xiàn)，RT抑制可以拮抗瘤生長。本發(fā)明人是首先認(rèn)識到特定耙向LINE-1序列的RNAi抑制了培養(yǎng)中的細(xì)胞增殖和動(dòng)物模型中瘤的生長。Mangiacasale等人的Oncogene2003，Vol.22,，PP27502761，關(guān)注于藥理學(xué)上的RT抑制劑.根本沒有注意到RNAi。本發(fā)明人之一的C.Spadafora的Cytogenet.GenomeRes.2004，Vol.105，PP346360，是將現(xiàn)有技術(shù)中的各種線索(strands)結(jié)合在一起的綜述性論文，但是并沒有披露有關(guān)RNAi的內(nèi)容。RNAi優(yōu)選為雙鏈。優(yōu)選地，雙鏈核寡核苷酸并不以自由形式用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，但是優(yōu)選由編碼該特定siRNA的DNA結(jié)構(gòu)來攜帶。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄的RNA形成雙鏈回文(palindromic)結(jié)構(gòu)，其由細(xì)胞"dicer"系統(tǒng)進(jìn)一步自發(fā)地進(jìn)行，由此形成siRNA分子，例如在Brummelkamp等人2002教導(dǎo)的那樣(注意DMI，將這篇參考文獻(xiàn)插入?yún)⒖剂斜淼哪┪蔡?。另一方面，優(yōu)選用于傳送RNAi的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序由適當(dāng)?shù)哪孓D(zhuǎn)錄病毒或腺病毒起源的適當(dāng)傳送系統(tǒng)來替代。這種病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選地，表達(dá)Ll靶向的RNAi的病毒載體或衣殼，優(yōu)選siRNA，能夠特定地靶向瘤細(xì)胞，且通過轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞導(dǎo)致RNAi表達(dá)，例如通過轉(zhuǎn)錄以提供siRNA，借此導(dǎo)致拮抗瘤生長及剌激瘤細(xì)胞的分化。盡管設(shè)想了任何瘤細(xì)胞的靶向或處理，但瘤細(xì)胞優(yōu)選地選自由乳腺癌腫瘤、肺癌腫瘤、黑素瘤和前列腺癌。事實(shí)上，特別優(yōu)選為黑素瘤和前列腺癌。因此，特別優(yōu)選RNAi直接傳送至癌組織，例如通過在合適位置上注射或由植入物釋放。如上所述，特別優(yōu)選使用病毒載體或衣殼，優(yōu)選包括編碼特定siRNA的DNA結(jié)構(gòu)。在本例中，優(yōu)選能夠在目標(biāo)組織即癌或瘤組織中表達(dá)DNA結(jié)構(gòu)的病毒載體或衣殼。這可以借助包括在DNA結(jié)構(gòu)中的適當(dāng)?shù)慕M織特定啟動(dòng)子和/或借助于特定用于特定組織的病毒衣殼或載體。上述還應(yīng)用于包括編碼特定siRNA的多核苷酸優(yōu)選為DNA的質(zhì)粒。特別地，優(yōu)選這種質(zhì)粒包括合適的組織特定啟動(dòng)子或其他用于siRNA組織特定表達(dá)的方式。在質(zhì)粒和載體或衣殼的兩個(gè)例子中，優(yōu)選質(zhì)粒、載體或衣殼僅耙向癌組織，優(yōu)選以組織特定的方式。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了治療患有癌癥或腫瘤的患者的方法，該方法優(yōu)選包括上述RNA干擾法。優(yōu)選該方法包括選擇具有癌組織的個(gè)體，如上所述使用RNA干擾法對抗至少一個(gè)L1元件。優(yōu)選，該方法包括對逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)在治療學(xué)上有效的抑制作用，足以導(dǎo)致對癌組織增殖的抑制或阻礙，及優(yōu)選剌激所述組織的分化。同時(shí)設(shè)想了僅靶向一個(gè)L1元件，也優(yōu)選靶向多個(gè)L1元件，或者在相同時(shí)間或者先后，作為計(jì)劃的療法的一部分。另一方面，本發(fā)明還提供了多核苷酸序列的用途，優(yōu)選為DNA序列，該多核苷酸序列編碼能夠靶向或識別至少一個(gè)LINE-1元件中一部分的siRNA，用于制造治療癌癥的藥物。優(yōu)選，這種藥物包括病毒衣殼或載體，其依次包括多核苷酸。本發(fā)明將通過下面非限制性的實(shí)施例得到進(jìn)一步闡述。實(shí)施例l方法細(xì)胞培養(yǎng)人類A-375黑素瘤細(xì)胞系(ATCC-CRL-1619)，TVM-A12原發(fā)性黑素瘤衍生的細(xì)胞系(TVM-A12primarymelanoma-derived)(20)，HT29腺癌細(xì)胞系(ATCCHTB-38)，H69小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(SCLC)(ATCCHTB119)和PC3前列腺癌(ATCCCRL-1435)細(xì)胞系接種在六孔板中，密度為l(^5xl(^細(xì)胞/孔，在具有10X的胎牛血清的DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從商業(yè)上可獲得的Viramune(Boehringer-Ingelheim)禾卩的Sustiva(Bristol-MyersSquibb)，如(18)描述的，純化奈韋拉平和依法韋侖。藥物分別在二甲亞砜(dimethylsulfoxide)(DMSO，Sigma-Aldrich)中制備350和15(iM，在接種5小時(shí)之后加入細(xì)胞；向?qū)φ罩屑尤胂嗤w積的DMSO(最終濃度的0.2。/0。每48小時(shí)更換新鮮的含有RT抑制劑的培養(yǎng)基。每96小時(shí)收集細(xì)胞，在Burker室(兩個(gè)計(jì)數(shù)/樣品)中計(jì)數(shù)并以相同密度再鋪盤。細(xì)胞周期和細(xì)胞死亡分析在收集前的最后30分鐘期間，向培養(yǎng)物中加入BrdU(20|iM)。然后，對收集的細(xì)胞進(jìn)行抗BrdU抗體和碘化丙啶(PI)處理，在FACStarPlus流式細(xì)胞測定器(Beckton-Dickinson)上進(jìn)行DNA含量和BrdU的雙參數(shù)分析。在用DAPI(細(xì)胞核形態(tài)學(xué))；PI(細(xì)胞滲透性)和3,3己二基-氧雜羰花青(oxacarbocyanine)[DiOC6(3)]，線粒體跨膜電位的熒光探針，聯(lián)合染色后，通過使用顯微鏡檢測細(xì)胞的死亡。間接熒光免疫檢驗(yàn)法和激光共聚焦掃描顯微鏡用4X的對-多聚甲醛固定A-375和TVM-A12IO分鐘，用以PBS為溶劑的0.2%Tritcm-X滲透5分鐘。小鼠單克隆抗牛a-微管蛋白抗體(MolecularProbes,A-11126)由AlexaFluor488耦聯(lián)的第二抗體(MolecularProbes，目錄號為A-11001)來顯示；細(xì)胞核在0.1mg/mi核糖核酸酶A存在的情況下用2iug/ml的PI染色。在LeicaTCS4D的激光共聚焦掃描顯微鏡下對樣品成像，該顯微鏡裝配有氬/氪激光(激發(fā)波長和發(fā)射波長為對于Alexa488為488nm和510nm，對于PI為568nm和590nm)。以0.5lpm的間隔截取激光共聚焦掃描的部分。掃描電子顯微鏡(SEM)在以0.1MMillonig的磷酸緩沖液為溶劑的2.5X的戊二醛溶液固定A-375和TVM-A12細(xì)胞。清洗之后，用以MPB為溶劑的1%的0804(lh，4°C)將細(xì)胞再次固定，使用增加的丙酮濃度進(jìn)行脫水。使用液態(tài)C02對樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，并在Stereoscan240掃描電子顯微鏡(CambridgeInstr.，Cambridge,UK)檢測之前用金噴涂樣品。半定量RT-PCR如(18)中所描述的，提取RNA并用無RNase的DNaseI進(jìn)行處理。使用300ngRNA、oligo(dT)和Thermoscript系統(tǒng)(Invitrogen)合成cDNAs。使用PlatinumTaqDNA聚合酶試劑盒(Invitrogen)和30pmol寡核苷酸(MWG-Biotech，Ebersberg，Germany)對l/25的反應(yīng)混合物進(jìn)行擴(kuò)增。使用的條件是在94。C:!分鐘的起始步驟，接著以94i:30秒、5862°C30秒及在72t:i分鐘，循環(huán)30次。在具有增加的循環(huán)數(shù)(2540)的連續(xù)的擴(kuò)增系列中，使用每個(gè)oligo對。PCR產(chǎn)品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，并在42X:用I^P]y-ATP末端標(biāo)記的內(nèi)部寡核苷酸雜交16小時(shí)。擴(kuò)增信號的強(qiáng)度由光密度法在對每個(gè)基因的至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行測量。賴7^定蘆尸Ci分祈'游寡拔芽麼d廚，F(xiàn);^瓶"鄉(xiāng)力微,"。C-mycPCR產(chǎn)品大小.633bp;F，5，-gtcacacccttctcccttcg-3，(SEQIDNO.1)R，5，-t魄ctgatgtgtggagacg-3,(SEQIDN0.2)INT，5，-agagaagctggcctcctacc-3，(SEQIDNO.3)Bcl2PCR產(chǎn)品大小，459bp:F，5，-ggtgccacctgtggtccacctg-3，(SEQIDN0.4)R,5，-cttcacttgtggcccagatagg-3，(SEQIDN0.5)INT,5，-ctgaagagctcctccaccac-3，(SEQIDN0.6)E-cadherinPCR產(chǎn)品大小，732bp:F，5，-ctcctctcctggcctcagaa-3，(SEQIDNO.7)R,5，-tactgctgcttggcctcaaa-3，(SEQIDNO.8)INT,5，-gaacgcattgccacatacac-3，(SEQIDN0.9)PSAPCR產(chǎn)品大小，584bp:F，5，-ttgtcttcctcaccctgtce-3，(SEQIDNO.10)R，5,-agcacacagcatgaacttgg-3，(SEQIDNO.11)INT，5，-ccacacccgctctacgatat-3'(SEQIDNO.12)CcndlPCR產(chǎn)品大小690bp:F，5，-ccctcggtgtcctacttcaa-3，(S￡QIDNO.13)R,5，-tcctcctcttcctcctcctc-3，(SEQIDNO.14)INT,5，-cgcacgatttcattgaacac-3，(SEQIDNO.15)GapdhPCR產(chǎn)品大小，590bp:F,5，-aggggtctacatggcaactg-3，(SEQIDNO.16)R,5，畫acccagaagactgtggatgg-3'(SEQIDNO.17)INT，5,國gtcagtggtggacctgacct-3，(SEQIDNO.18)對LINE-l的RNA干擾一個(gè)21-nt的雙鏈siRNA寡核苷酸(Ll-I)設(shè)計(jì)(5，-AAGAGCAACTCCAAGACACAT-3，，SEQIDNO.19)來靶向Bruha等人(21)描述的高活性LINE-l元件的共有序列。具體地，靶向以下的序列i)八個(gè)熱Lls(LRE3(SEQIDNO.26)、L1RP(SEQIDNO.27)、ac004200(SEQIDN0.28)、ac002980(SEQIDN0.29)、al356438(SEQIDNO.30)、al512428(SEQIDNO.31)、ac021017(SEQIDNO.32)、all378459(SEQIDNO.33));ii)Ta-ld家族；iii)90個(gè)全長L1元件。對于對照，細(xì)胞用非特異性siRNA(SEQIDN0.34)轉(zhuǎn)染，其是3'-熒光素修飾以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。siRNA寡核苷酸用QIAGENUSA合成。轉(zhuǎn)染是在A-375細(xì)胞中使用RNAiFect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN目錄號為301605)在24孔(well)的板中加入每孔1.5pg的siRNA來實(shí)施。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)計(jì)數(shù)細(xì)胞，在裝配有01ympusCAMEDIA數(shù)碼相機(jī)的01ympusCK30倒置顯微鏡下記錄細(xì)胞形態(tài)。約80%的細(xì)胞在24小時(shí)后被轉(zhuǎn)染，正如由熒光素顯微鏡確定的那樣。在使用了用于LINE-1ORF-l和ORF-2的特定引物對進(jìn)行轉(zhuǎn)染之后48小時(shí)，用RT-PCR來分析LINE-1表達(dá)。ORF-l:F，5，-AGAAATGAGCAAAGCCTCCA-3，(SEQIDNO.20)R，5，-GCCTGGTGGTGACAAAATCT-3，(SEQIDNO.21)ORF-2:F，5,-TCCAGCAGCACATCAAAAAG-3，(SEQIDNO.22)R,5，-CCAGTTTTTGCCCATTCAGT-3，(SEQIDN0.23)RNA提取物和RT-PCR條件如在此說明的那樣，除了退火溫度為54°C以及經(jīng)過23個(gè)循環(huán)執(zhí)行擴(kuò)增以外。用于Southem分析的內(nèi)部寡核苷酸為5'匿TAAGGGCAGCCAGAGAGAAA-3，(ORF-l，SEQIDN0.24)和5，-TGACAAACCCACAGCCAATA-3，(ORF-2,SEQIDNO.25)。瘤異種移植物和動(dòng)物的治療五周大的無胸腺裸鼠(Harlan,Italy)，根據(jù)歐洲聯(lián)盟指南進(jìn)行保存，用在100)ilPBS中含有A-375黑素瘤細(xì)胞(4xl06)、H69細(xì)胞(107)、PC3細(xì)胞(2xl06)和HT-29(106)細(xì)胞進(jìn)行皮下接種。小鼠每周五天地每天接受依法韋侖(20mg/kg)皮下注射，依法韋侖使用以DMSO為溶劑的4mg/ml的儲存液(stock)，用生理溶液以l:l稀釋，而新鮮配置。對照用50X的DMSO注射。在瘤植入后一天或一周開始治療，在一些實(shí)驗(yàn)中，在14天后停止。每隔一天用測徑器測量裝置監(jiān)測瘤生長；使用以下公式計(jì)算體積長度x寬度x高度x0.52(22)結(jié)果針對RT-編碼LINE-1家族靶向的RNA干擾(RNAi)降低了黑素瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的分化我們希望毫不含糊地確定，如下討論的、對藥用RT抑制劑響應(yīng)所觀察到的生長速率降低和對分化的誘導(dǎo)是否在事實(shí)上可歸于細(xì)胞RTs的特定抑制作用。為了證實(shí)這一點(diǎn)，設(shè)計(jì)RNAi實(shí)驗(yàn)來特異性地靶向LINE-1元件亞家族(subfamilies)，其公知在人體細(xì)胞中最大豐富度的表達(dá)(21，上述在方法的對應(yīng)部分中描述了耙向的序列)。與LINE-10RF1(圖4，板A)同源的雙鏈RNA寡核苷酸在A-375細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4872小時(shí)后誘導(dǎo)了典型的分化形態(tài)(板B)。伴隨地，與用非特異性寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，降低了約70X(板C)的增殖。這些結(jié)果與那些用藥用RT抑制作用獲得結(jié)果相當(dāng)。通過半量RT-PCR分析，ORFl和ORF2的表達(dá)與用非特異性寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比都降低了幾乎80%:板D)。此外，對LINE-l元件的RNAi誘導(dǎo)了^^和^￡^>7-07基因的表達(dá)下調(diào)，但是并不誘導(dǎo)G4戶Z)/7基因的表達(dá)下調(diào)，如對RT抑制劑藥物響應(yīng)中所見。RT抑制劑可逆地(reversibly)降低細(xì)胞增殖我們已經(jīng)調(diào)查了人類轉(zhuǎn)化細(xì)胞系對于向兩個(gè)廣泛使用的RT抑制劑即奈韋拉平和依法韋侖延長暴露(prolongedexposure)的反應(yīng)。來自A-375黑素瘤細(xì)胞、PC3前列腺癌細(xì)胞和TVM-A12原發(fā)性黑素瘤衍生的細(xì)胞系培養(yǎng)物每96小時(shí)進(jìn)行傳代、計(jì)數(shù)和再鋪盤，同時(shí)連續(xù)添加藥物至少20天(五個(gè)96小時(shí)的循環(huán))。如圖1所示，兩種抑制劑都有效地降低了所有細(xì)胞系中的細(xì)胞生長，并在延長的暴露時(shí)期具有穩(wěn)定的抑制效果。生長抑制作用是可逆的當(dāng)去除RT抑制劑，所有細(xì)胞系在一個(gè)或兩個(gè)96小時(shí)循環(huán)內(nèi)以與對照相當(dāng)?shù)乃俾驶謴?fù)增殖。藥物的再次添加再次抑制了所有細(xì)胞系中的增殖。因此，與RT抑制作用有關(guān)的細(xì)胞生長的減少并沒有作為整個(gè)細(xì)胞分裂中固定改變得到遺傳。為了說明降低增殖的基礎(chǔ)，我們調(diào)査了是否任一RT抑制劑都誘導(dǎo)了A-375或PC3細(xì)胞系中的細(xì)胞死亡。用PI的聯(lián)合染色顯示出可滲透的壞死細(xì)胞，用DAPI可視化凋亡(apoptotic)細(xì)胞核，用DiOC6(3)監(jiān)測線粒體跨膜電位的損失，說明通過任一RT抑制劑都沒有顯著誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；所記錄的低速率(暴露給任一藥物后72小時(shí)最大為15%)很大程度上由凋亡來說明(未顯示數(shù)據(jù))。因此，沒有藥物有顯著的非特異性毒性，顯示降低的細(xì)胞生長，更確切為反映了細(xì)胞周期延遲的誘發(fā)。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們使用了雙參數(shù)的FACS分析來測量暴露給RT抑制劑4個(gè)96小時(shí)循環(huán)之后的DNA含量(通過PI顯示)和DNA復(fù)制(通過BrdU滲入顯示)。細(xì)胞周期方式(profile)在抗RT治療的培養(yǎng)物中有了顯著改變，顯示了具有GO/Gl含量的BrdU陰性細(xì)胞的比例的增加，其在A-375細(xì)胞培養(yǎng)物中特別顯著(圖1B)。藥物的去除再次建立了初始的細(xì)胞周期方式并停止了G1延遲。在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中奈韋拉平誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)上的分化、分化和增殖基因的表達(dá)因?yàn)楹谒亓瞿痛蠖鄶?shù)治療，因此，這與確定是否RT抑制劑誘導(dǎo)伴隨著細(xì)胞生長降低的分化有關(guān)。我們首先檢査了A-37黑素瘤細(xì)胞，其能獲得對特定分化誘導(dǎo)劑(23)響應(yīng)的典型的樹突表現(xiàn)型。如圖2A所示，由細(xì)胞形狀顯示的形態(tài)學(xué)上的分化的呈樹突延伸，并具有增加的附著，與DMSO處理的對照(a)相比，在暴露給奈韋拉平(d)或依法韋侖(g)的45天中變得很明顯。通過掃描電子顯微鏡(SEM)，使用奈韋拉平(e)和依法韋侖(h)的A-375細(xì)胞培養(yǎng)物與未處理的對照(b)相比變平(flattened)，并顯示出伸長的樹突延伸，其緊密地依附于基底。在a-微管蛋白免疫染色后的激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步顯示出微管列(array)在受RT抑制的細(xì)胞(f-i)的向外生長樹突(dendrites)中的整個(gè)長度上重新排列，其與對照(c)不同，其中短的微管集中在成核中心的周圍。在由奈韋拉平處理后的黑素瘤衍生的原發(fā)性TVM-A12細(xì)胞中觀察到類似的反應(yīng)(圖2B):通過相差(phasecontrast)(a)和SEM(b)，未經(jīng)處理的細(xì)胞具有紡錘狀的形態(tài)；與未經(jīng)處理的細(xì)胞(c)相比，奈韋拉平處理的TVM-A12細(xì)胞形成了替代的典型分支樹突(d-e)，并顯示了良好的組織、伸長的微管列(f)。形態(tài)上分化的誘導(dǎo)表明關(guān)鍵性調(diào)控基因在對RT抑制處理做出響應(yīng)時(shí)被調(diào)節(jié)。這在僅用DMSO處理、或奈韋拉平或依法韋侖處理4個(gè)循環(huán)的培養(yǎng)物的半量RT-PCR分析中研究過。在A-375黑素瘤細(xì)胞中，我們關(guān)注一套4個(gè)基因五《a^^n'w基因，涉及細(xì)胞-細(xì)胞附著和在分化但非瘤細(xì)胞中的表達(dá)(24):c-wyc,6c/-2(25)和cydf"Z)/(26)基因，它們直接涉及黑素瘤細(xì)胞增殖和瘤生長。如圖3A所示，我們發(fā)現(xiàn)，五-a^e^基因與對照相比在受RT抑制的A-375培養(yǎng)物中得到顯著上調(diào)；相反，&/-2和^^//"^基因下調(diào)。記錄的一個(gè)例外是在依法韋侖中，其沒有使得cyd&D/表達(dá)下調(diào)。我們也分析了PC3前列腺癌細(xì)胞，并從分化的前列腺癌上皮細(xì)胞中選取兩個(gè)標(biāo)記基因，即前列腺特定抗原PSA(27)和雄激素受體(AR)(28)基因。這些基因沒有一個(gè)表達(dá)在未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中，但都在對RT抑制劑的響應(yīng)中被誘導(dǎo)(圖3B)。當(dāng)抑制劑去除時(shí)，所有基因的表達(dá)再次返回初始水平。因此，RT抑制藥物導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞中關(guān)鍵性基因表達(dá)的重新編排，與分化誘導(dǎo)相一致，然而這種重新編排是可逆的，當(dāng)RT抑制作用消除就停止了。RT抑制劑降低了無胸腺裸鼠中人類瘤異種移植體的生長因?yàn)檗D(zhuǎn)化細(xì)胞的關(guān)鍵性特征，包括增殖和分化，通過RT抑制作用得到調(diào)節(jié)，我們在活體中測試了RT抑制劑拮抗瘤生長的能力。選擇用于這些實(shí)驗(yàn)的致瘤細(xì)胞系包括A-375細(xì)胞系和PC3細(xì)胞系、以及HT29結(jié)腸細(xì)胞系和H69小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，它們都顯示出響應(yīng)RT抑制劑降低的細(xì)胞生長(19，數(shù)據(jù)未示出)。細(xì)胞皮下接種到無胸腺裸鼠的肢中。然后，對這些動(dòng)物進(jìn)行依法韋侖處理，因?yàn)樵诔跫墝?shí)驗(yàn)中與奈韋拉平相比，該藥物在活體中具有較高效率。最佳劑量(20mg/體重kg)在測試藥物440mg/kg的劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中確定。依法韋侖處理證實(shí)在所有動(dòng)物界中是安全的，沒有動(dòng)物死亡或任一群中有明顯的中毒現(xiàn)象，盡管用40mg/kg處理的群中顯示出在超過60%的動(dòng)物中體重顯著降低。圖5顯示了在接種瘤后未經(jīng)依法韋侖處理(紅色)或經(jīng)過依法韋侖處理開始l天(紫色)或l周(黃色)的小鼠體內(nèi)瘤生長的記錄曲線。對所有異種移植體類型而言，與未經(jīng)處理的動(dòng)物相比，瘤生長在得到處理的動(dòng)物體內(nèi)得到顯著降低，不管處理開始的時(shí)間如何，不管初始瘤大小的差異，進(jìn)行性腫瘤得到相當(dāng)有效的拮抗。接種l天開始處理但在15天后停止處理的動(dòng)物體內(nèi)PC3和HT29衍生的瘤生長曲線(綠色)說明活體中瘤生長的RT依賴的(RT"dependent)抑制作用是可逆的。依法韋侖處理的PC3細(xì)胞顯示活體中致腫瘤性的降低我們己經(jīng)研究了是否用依法韋侖預(yù)先處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞將緩和衍生異種移植體的致腫瘤性潛能。PC3前列腺癌細(xì)胞用20^iM的依法韋侖培養(yǎng)2個(gè)96小時(shí)循環(huán)，其時(shí)間足夠戶SJ和^及基因的響應(yīng)(圖3B)，隨后在裸鼠中接種。未處理的細(xì)胞在動(dòng)物的平行對照(parallelbatches)中接種。依法韋侖預(yù)處理或未處理的PC3細(xì)胞異種移植體然后或者連續(xù)用依法韋侖在活體中連續(xù)處理，或者留下來并不處理。如圖6A所示，未處理的PC3細(xì)胞在所有動(dòng)物中生成急性發(fā)展(aggressive)瘤。相反，依法韋侖預(yù)處理的PC3細(xì)胞顯示了活體中形成瘤能力的降低，異種移植體生長更為緩慢。如圖6B總結(jié)的那樣，依法韋侖預(yù)處理的PC3細(xì)胞在65X的接種動(dòng)物中發(fā)展了生長緩慢的異種移植體，而未處理細(xì)胞中的異種移植體為100%。此外，活體接種了預(yù)處理細(xì)胞并用依法韋侖進(jìn)一步處理的動(dòng)物僅有40%完全發(fā)展了瘤，在這種情況下，生長曲線是平的。因此，依法韋侖削弱了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的致腫瘤性潛能。討論這項(xiàng)工作突出顯示了人類基因組涉及癌的三個(gè)特征第一，LINE-1元件被鑒定為涉及細(xì)胞分化和增殖控制的機(jī)制中的活性成分；第二，LINE-l元件的RNAi依賴失活，或其編碼的內(nèi)源RT活性的藥理學(xué)抑制作用能夠恢復(fù)這些特性在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的控制；第三，RT的抑制劑降低了活體動(dòng)物模型中的瘤生長。用于這項(xiàng)工作的RT抑制劑藥物，奈韋拉平和依法韋侖，通過結(jié)合在RT酶的p66亞基中的疏水孔袋(hydrophobicpocket)而具有相同的活性機(jī)制(29，30)。盡管被設(shè)計(jì)成靶向HIV編碼的RT，兩者都在體外抑制了未傳染細(xì)胞中的內(nèi)源RT的酶活性(19)。我們已經(jīng)顯示出，兩種藥物都降低了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖，很大程度上獨(dú)立于細(xì)胞死亡，但是與G1延遲或停止有關(guān)。與此相隨，RT抑制劑誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的形態(tài)分化。分化誘導(dǎo)是快速的，這與由與端粒末端轉(zhuǎn)移酶相關(guān)RT抑制劑(TERT)引起的表型改變不同，其需要長的處理時(shí)間(120天)(31)。此外，我們沒有觀察衰老細(xì)胞典型的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維(stressfiber)或focaladhesionsites的重新組織。這種缺少衰老特定修飾、和分化的快速誘導(dǎo)表明用于此的RT抑制劑并沒有靶向TERT，并誘導(dǎo)表型的低增殖分化而不是衰老。特別令人驚奇的是，RT抑制作用的特異性在RNAi實(shí)驗(yàn)中得到證明，該實(shí)驗(yàn)中RT抑制作用靶向針對在人類細(xì)胞中高度表達(dá)的六個(gè)LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的亞群，其占整個(gè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能力的84X(21)。顯著地，我們發(fā)現(xiàn)，RNAi降低了LINE-l衍生的ORFl和ORF2在A-375細(xì)胞中約80%的表達(dá)，表明LINE-1亞群生物活性得到有效地下調(diào)。由RNAi向RT編碼LINE-l元件的誘導(dǎo)的改變與由藥理學(xué)RT抑制劑導(dǎo)致的無明顯差別，表明LINE-1在對照細(xì)胞中增殖和分化。使用獨(dú)立途徑觀察到的表型相似性指出，UNE-1表達(dá)的抑制、或RT活性的抑制足夠延遲增殖并促進(jìn)分化。這些觀察結(jié)果指出，藥物的任何未知副作用并不歸于以非特定方式觀察到的表型。與降低生長和分化形態(tài)的誘導(dǎo)相一致，我們發(fā)現(xiàn)，所選基因小組(panel)在RT抑制作用的表達(dá)響應(yīng)中進(jìn)行重排。這顯示，RT活性能有效調(diào)控基因表達(dá)，這些基因促使從高增殖、轉(zhuǎn)化的表型向低增殖、分化的表型轉(zhuǎn)化，表明基因組功能是藥物或RT依賴的RT活性的抑制作用的最終靶標(biāo)。然而，基因表達(dá)中的改變并不通過細(xì)胞分裂來遺傳，而是當(dāng)RT抑制作用削除后可逆。檢測特征的可逆性及其對抑制藥物存在的依附性與以下概念-一致，即LINE-1編碼的RT是調(diào)控基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制(epigeneticmechanism)的一部分，并對主要的細(xì)胞增殖和分化的分子機(jī)制起作用。該研究的一方面是，RT抑制藥物降低接種有四個(gè)人類異種移植物模型的活體裸鼠體內(nèi)瘤生長的能力。瘤生長得到抑制，只要向動(dòng)物供給RT抑制劑，然而，一旦停止治療就會恢復(fù)，正如在細(xì)胞系中觀察的那樣。雖然這些數(shù)據(jù)說明了RT抑制劑在治療癌癥中有前途的細(xì)胞生長抑制的能力，其證實(shí)了內(nèi)源RT在瘤生長中的表觀遺傳學(xué)作用。此外，依法韋侖對PC3前列腺細(xì)胞的體外預(yù)處理削弱了其活體內(nèi)致腫瘤性。因此，分化標(biāo)記的活性和與RT抑制作用有關(guān)的降低增殖都是能削弱活體內(nèi)轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性表型的大范圍程序重排(reprogramming)的一部分。生長數(shù)據(jù)指出，表觀遺傳學(xué)改變能夠程序重排瘤細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化表型轉(zhuǎn)化成"正常"非病態(tài)狀態(tài)(32，33)。表觀遺傳學(xué)程序重排能繞過在多種瘤中最初導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化的基因變更(32)。因此，表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)因素認(rèn)為是瘤治療中有價(jià)值的、值得挑戰(zhàn)的目標(biāo)(34)。然而，許多受試化合物通常被證明是毒性和/或化學(xué)性不穩(wěn)定。奈韋拉平和依法韋侖用于AIDS治療已經(jīng)多年；在癌癥治療中使用這些RT抑制劑的前景將具有明顯的優(yōu)勢，對于連續(xù)給藥通常具有好的耐藥性(tolerance)的流行病學(xué)記錄。此外，流行病學(xué)證據(jù)表明卡波濟(jì)(氏)肉瘤(35)和其他AIDS有關(guān)的癌(36)在用高活性抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒治療(HAART)處理的患者中具有降低的發(fā)生頻率雖然通常認(rèn)為是在受處理患者體內(nèi)提高了免疫反應(yīng)的一種反映，它也能表明對于瘤細(xì)胞中內(nèi)源RT活性的HAART的直接抑制效果。在這一階段，通過RT活性能指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制仍然不清楚。逆轉(zhuǎn)錄能在裂殖酵母中有助于異染色質(zhì)形成(37)。盡管這種機(jī)制沒有在較高級的真核細(xì)胞中得到驗(yàn)證，我們實(shí)驗(yàn)室的工作表明，LINE-1編碼的RT涉及DNA甲基化作用(methylation)的重新分配中，和基因表達(dá)的染色質(zhì)再塑依賴(remodeling-dependent)的調(diào)節(jié)。總的來說，內(nèi)源RT的形成作為高增殖和損失分化有關(guān)的細(xì)胞機(jī)制的"功能性"標(biāo)記，能被認(rèn)為是癌治療中的新型潛在靶標(biāo)。數(shù)據(jù)能特別地支持前列腺癌，其中AR表達(dá)的損失是激素治療失敗的主要原因。因?yàn)镽T抑制劑對AR和PSA進(jìn)行上調(diào)，這些分化誘導(dǎo)化合物可能對于恢復(fù)前列腺癌細(xì)胞中雄性激素靈敏性有幫助。實(shí)施例2A)LINE-l耙向的siRNA表達(dá)DNA結(jié)構(gòu)的克隆siRNA靶向序列是由己知在人類細(xì)胞中高度活性的LINE-1元件衍生得到的(Brouha等，2003，supplementarymaterial)。該耙向序列為60bp長(從14921552)，在SEQIDN0.35中列出，作為雙鏈DNA而人工合成。然后，將DNA寡核苷酸克隆入商業(yè)可獲得的載體pSuper.retro.neo+GFP中(OligoEngine，USA，目錄號K五C-i^r-0W6)。B)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體的裝配然后，該結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的Phi-NX細(xì)胞(由ATCC獲得)中被，包裝在新近合成的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中，再自發(fā)地從細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用離心法收集逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(稱為pS-Lli)，通過0.45微米的微孔過濾器過濾，再用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。該方法根據(jù)制造商的說明來執(zhí)行(OligoEngine)。C)人類瘤基因細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染通過將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液與細(xì)胞培養(yǎng)物簡單混合并培育24小時(shí)，而用PS-Lli轉(zhuǎn)染A375(黑素瘤)和PC3(前列腺癌)的人類細(xì)胞系。然后，在新霉素存在的情況下選取被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞7天。所有抗新霉素的細(xì)胞都是GFP報(bào)告基因表達(dá)為陽性。作為對照，來自相同細(xì)胞系的平行培養(yǎng)物用包含空DNA載體(pS)(沒有siRNA編碼序列)的逆轉(zhuǎn)錄病菌顆粒轉(zhuǎn)染。如圖7所示，受pS-Ll感染的細(xì)胞顯示了增殖的急劇降低，其保持恒定至少39天。未感染細(xì)胞維持高的增殖速率，受pS感染的細(xì)胞顯示出在轉(zhuǎn)染后最初幾天里增殖的溫和降低，但隨后快速恢復(fù)到與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相當(dāng)?shù)母咴鲋?。與這些數(shù)據(jù)良好相關(guān)的是，LINE-1(ORFl和ORF2)表達(dá)在感染pS-Ll的細(xì)胞中強(qiáng)烈下調(diào)，但在pS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有下調(diào)，在RNA和蛋白質(zhì)水平上都下調(diào)，正如使用特定抗體的westemblot分析(數(shù)據(jù)未示出)所顯示的那樣。D)受pS-Ll感染的A375細(xì)胞具有降低的致腫瘤性，正如通過在裸鼠中接種作出的活體內(nèi)檢測所確定的那樣。為了評價(jià)pS-Lli細(xì)胞的致瘤潛能是否受到影響，用pS載體或用LINE-l敲除的pS-Lli結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染的5xl(fA375細(xì)胞，在兩組無胸腺裸鼠中皮內(nèi)接種(感染后15天).然后，監(jiān)測兩組小鼠體內(nèi)的瘤進(jìn)程圖8中板A示出了接種A375pS和A375pS-Ll逾胞的小鼠體內(nèi)瘤生長的進(jìn)程。板B中實(shí)施例顯示與接種對照細(xì)胞的小鼠相比，接種LINE1干擾的細(xì)胞的小鼠體內(nèi)瘤生長有顯著降低。這些結(jié)果一起支持以下結(jié)論LINE1基因活性有助于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖，并能認(rèn)為是基因癌治療中的新型潛在靶標(biāo)。因此，為了通過基因治療提高本發(fā)明的利用，將以下兩個(gè)改進(jìn)引入到所說明的方法中i)雙鏈ribo寡核苷酸并不以自由形式用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，而是由編碼特定siRNA的DNA結(jié)構(gòu)攜帶。轉(zhuǎn)錄的RNA形成雙鏈回文結(jié)構(gòu)，其通過細(xì)胞"dicer"系統(tǒng)進(jìn)一步自發(fā)進(jìn)行，由此形成siRNA分子(Brummelkamp等，2002，參考文獻(xiàn)38)ii)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序必須通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒來源的適當(dāng)傳輸系統(tǒng)來替代。換句話說，本方法的改進(jìn)在于表達(dá)LINE-l耙向的siRNA的病毒載體的發(fā)展，siRNA將用于感染瘤。LINE-l靶向的siRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)通過病毒載體在致瘤細(xì)胞中傳遞，由此，抑制內(nèi)源LINE-1表達(dá)。基于我們之前的實(shí)驗(yàn)，用這種方式獲得的組成性功能敲除的LINE-1將強(qiáng)烈拮抗瘤進(jìn)程。參考文獻(xiàn)1.Deininger，P.-L.，Moran，J.-V.,Batzer，M.-A.&Kazazian，H.-H.(2003)CurrOpGenDev;〗3，651-8.2.Kiessling,A,A.，Crowell，R.&Fox,C.Proc.(1989)Acad.Natl.Sci.USA86,51009-51133.Giordano,R.,Magnano，A.-R.,Zaccagnini,G.,Pittoggi,C,Moscufo，N.,Lorenzini,R.&Spadafora,C.(2000)J.CellBiol.148,1107-11134.Poznanski，A,A,&Calarco，P.-G.(1991)DevBiol.143，271-81.5.Packer,A,L,Ma雨a，K.&Bacharova，R,F.(1993)DevBiol.157281-3.6.Mwenda,J,M.(1993)CellMolBiol.39,317-28.7.Deragon，J.-M.,Sinnett，D.&Labuda,D.(1990)EMBOJ.9,3363-8.8.Martin,S,L.(1991)MolCellBiol.11，4804-7.9.Martin，S,L.&Branciforte,D.(1993)MolCellBiol.13,5383-2.10.Hagan，C-R;，She伍eld，R,F.&Rudin,C-M.(2003)NatGenet.35219-20.11.U，T,H.&Schmid，C-W.(2001)Gene.276，135-41.12.Hagan，C-R.&Rudin,C-M.(2002)AmJPharmacogenomics.2，25-36.13.Khan，A,S.,Muller,J.&Sears，J.-F.(2001)VirusRes.79，39-45.14.Friedlander，A.&Patarca,R.(1999)CritRevOncogenesis.10,129-5915.Ostertag,E.-M.&ICazazian,H.-H.Jr.(2001)AnnuHevGenet.35，501-38.16.Kuo，K,W.，Sheu，H,M.，Huang,Y.-S.&Leung,W,C(1998)BiochemBiophysResComm.253,566-70.17.Crone,T,M.，Schalles，S,L,Benedict,C-M.,Pan,W.，Ren，L,Loy，S,E.，Isom,H.&Clawson,G.曙A.(1999)H印athology.29,1114-23.18.Pittoggi，C,Sciamanna,L，Mattei,E.,Beraldi，R.,Lobascio，A.醫(yī)M"Mai,A.,Quaglia，M,G.，Lorenzini,R.&Spadafora,C(2003)Mol.Reprod.Dev.66:，225-36.19.Mangiacasale,R.，Pittoggi，C，Sciamanna,I.,Careddu,A.,Mattei，E.,Lorenzini,R.,Travagiini,L.,Landriscina,M.，Barone，C,Nervi，C,Lavia，P.&Spadafora，C(2003)Oncogene.22，2750-61.20.Melino，G.，SinibaldiVallebona，P.，D'Atri,S.，Annichiarico-Petruzzelli,M"Rasi，G.，Catani,M.V.,Tartaglia,M.I.，Vemole,P.,Spagnoli,L.G-,Finazzi-Agr[omicron]，A.&Garaci，E.(1993)ClinChemEnzymComms.6，105-19.21.Brouha,B.,Schustak，J.,Badge,R.-M.,Lutz-Prigge，S.,Farley,A,H.,Moran，J,V.&Kazazian,H,H.,Jr.(2003)ProcNatlAcadSclUSA100，5280-5285，availableat:http:〃www.pnas.Org/cgi/content/rull/100/9/5280.Supportinginformationisavailableat:http:〃www.pnas.org/cgi/content/fiill/0831042100/DC122.Umekita,Y.,Hiipakka，R.-A.，Koknotis，J.-M.&Shutsung，L.(1996)ProcNatlAcadScLUSA93,11802-7.23.Sauane,M.,Gopalkrishnan，R.-V.,Sarkar，D.,Su，Z,-Z.,Lebedeva,I,V.,Dent,P.,Pestka,S.,&Fisher,P,B.(2003)CytGrowthFacRev.14,35-51.24.Hsu，M,Y"Meier,F,E"Nesbit,M"Hsu,J,Y"VanBelle,P.,Elder,D,E.,&Herlyn，M.(2000)AmJPathol.156,1515-25.25.Utikal，J"Leiter,U"Udart，M.，Kaskel，P.,Peter，R.-U.&Krahn，G,M.(2002)CancerInvest.20,914-21.26.Sauter，E.-R.，Yeo，U.-C，VonSte腿，A.,Zhu，W.,Iitwin,S.，Tichansky,D,S.，Pistritto,G.,Nesbit，M.，Pinkel，D.,Heri,M.&Bastian,B.-C.(2002)CancerRes.62，3200-6.27.Lilja,H.(2003)Urology.62(5,Suppl1)，27-33.28.Linja,M.-J.,Savmainem，K.-J.，Saramaki，0.-R.,Tammela，T.-L.,Vessella，R.-L.&Visakorpi,T.(2001)CancerRes.61,3550-5.29.DiMarzoVeronese,F.,Copeland,T.-D.，DeVico，A.-L,Rahman,R.，Oroszlan，S.,Gallo,R,C.&Samgadharan,M,G.(1986)Science.231，1289-91.30.Ren，J.，Nichols,C，Bird,L.，Chamberlain,P.,Weaver,K.，Short,S"Stuart,D,I.&Stammers,D,K.(2001)飾/Biol;312，795-805.31.Damm，K.,Hemmann，U.,Garin-Chesa,P.，Hauel，N.，Kaufftnann，L,Priepke，H.，Niestroj,C,Daiber，C,Enekel,B.,Guilliard,B.，一Lauritsch,L,Muller,E.，Pascolo，E.,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元件的一部分。文檔編號A61P35/00GK101151371SQ200580048836公開日2008年3月26日申請日期2005年12月30日優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日發(fā)明者C·斯帕達(dá)福拉,C·梅亞雷列,C·皮托吉,E·加拉奇,I·夏曼納,P·西尼巴爾迪申請人:高等健康研究院;E·加拉奇;P·西尼巴爾迪