專利名稱：：可植入生物材料和制造它的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可植入生物材料和制造它的方法。具體地，本發(fā)明涉及處理含膠原的生物材料以降低和/或減輕4丐化并改善生物材料壽命的方法，以及制造該生物材料的方法，該生物材料可在可植入裝置上使用或者與該裝置一起使用。
背景技術(shù)：
：存在許多在化學(xué)上改變和/或固定生物組織的膠原基質(zhì)以使這些組織能被植入到活的哺乳動物體內(nèi)的方法。改變和固定的可植入生物組織的例子包括心瓣膜、血管、心包膜、皮膚、硬膜、腱和韌帶。這些生物組織主要由膠原和彈性蛋白組成。大多數(shù)生物組織的剛性/彈性很大程度上由組織中的相對膠原和彈性蛋白含量和/或結(jié)締組織框架的物理構(gòu)造來確定。每個膠原分子由相互纏繞形成巻曲三鏈螺旋的三個多肽鏈組成。用于保存生物組織的化學(xué)試劑通常在位于膠原分子內(nèi)的多肽鏈上的氨基之間(分子內(nèi))以及在相鄰膠原分子之間(分子間)形成交聯(lián)。當(dāng)在不同的受體物種中用作可植入裝置時，膠原基生物材料易于超急性排斥(hyperacuterejection)。這種超急性排斥是一種天然的免疫反應(yīng)，由膠原基生物材料結(jié)構(gòu)中存在的抗原觸發(fā)。超急性排斥為一種快速退化(degenerative)過程，其影響這種可植入裝置的功能和耐久性。交聯(lián)方法如紫外輻射或熱脫水導(dǎo)致低密度交聯(lián)?；瘜W(xué)試劑如曱醛、戊二醛、二醛淀粉和某些聚環(huán)氧化合物已用作膠原基生物材料中的化學(xué)交聯(lián)劑。使膠原交聯(lián)涉及交聯(lián)劑與不同多肽鏈上的賴氨酸或羥基賴氨酸殘基的胺基反應(yīng)。使膠原交聯(lián)的另一種已知方法是激活多肽鏈中的谷氨酸和天冬氨酸殘基的羧基與另一多肽鏈的胺基反應(yīng)形成酰胺鍵。還可通過用二異氰酸酯橋接(bridging)相鄰多肽鏈的胺基來進(jìn)行交聯(lián)，這導(dǎo)致脲鍵的形成。由于大多數(shù)二異氰酸酯的毒性和低溶解性，這種方法較不常用。最近，戊二醛已成為優(yōu)選的交聯(lián)劑。戊二醛因為在5個碳的脂肪鏈的兩端存在醛而被賦予雙重功能(bifunctional)。除了固定組織外，戊二醛還是用于制備植入用生物組織的優(yōu)秀滅菌劑。具體地，已用戊二醛固定的可永久植入的生物材料包括豬生物修復(fù)心瓣膜、牛心包瓣和牛心包補(bǔ)片。些材料中的膠原和彈性蛋白趨于鈣化。這些材料的鈣化可導(dǎo)致變硬，造成材料的降解和失效。已知外源性和內(nèi)源性鈣化都會造成交聯(lián)的生物材料的4丐化。不幸地是，已知戊二搭能促進(jìn)生物材料的鈣化。醛和生物材料中的伯胺反應(yīng)形成不穩(wěn)定的亞胺(希夫堿(Schiffbase)),其隨后從生物材料中釋放戊二醛。組織中存在的未結(jié)合的醛可導(dǎo)致植入后嚴(yán)重的組織刺激，如炎癥反應(yīng)。因此，需要除去或失活交聯(lián)劑如戊二醛的鈣化促進(jìn)效應(yīng)。還沒有完全理解交聯(lián)生物材料的鈣化機(jī)理。臨床數(shù)據(jù)顯示，因素如患者年齡、感染、宿主組織化學(xué)、脫水、畸變、飲食要素和不適當(dāng)?shù)某跏伎鼓委煏龠M(jìn)植入的生物材料的鈣化。已進(jìn)行了許多嘗試來尋找減輕交聯(lián)生物材料鈣化的方法。對減輕生物材料鈣化的研究主要集中在交聯(lián)生物材料的處理上，并描述在但不限于美國專利No.4553974(Dewanjee等)；美國專利No.4120649(Schechter);美國專利No.4648881(Nashef等);和美國專利No.4976733(Girardot),Vyavahare等，1997，C/腦/""o",95:479-488和Pathak等，2004，乂腸W.Maferi",69A:140-144。這些出版物一般描述了在植入前用醇處理固定組織的方法。換句話說，在被暴露到醇前就已經(jīng)使組織交聯(lián)。即使在醇存在下預(yù)培養(yǎng)組織的情況下，暴露期也經(jīng)常太短而沒有用或緩沖劑和其它試劑的存在反面影響交聯(lián)穩(wěn)定性(參見例如Vyavahare等，1997，同上)。還描述了利用非戊二醛試劑固定生物材料的替代方法，這些方法包括但不限于聚縮水甘油醚的使用(Imamura等，(1988)，和.J！顛/Og纖，17:1101-1103);光氧化(Moore等，(1994)，■/祝omW.i仏，28:611-618)。已證實用氨基-二-磷酸鹽和表面活性劑處理交聯(lián)的生物材料減少了植入后這些生物材料的鈣化。但是，這些試劑往往在植入后從生物材料中洗掉，并只是延緩鈣化過程。在生物材料處理中使用醇是眾所周知的，但它限于用作溶劑和/或滅菌原生物材料中的使用。美國專利No.5746775(Levy等)和國際專利No.WO84/01894。因此，仍然需要一種制造對鉤化具有長期抗性的生物材料的方法。發(fā)明概述^即方法。因此，在第一個方面中，本發(fā)明提供制造可植入生物材料的方法，其包括(a)將生物材料暴露于含醇溶液中至少24小時。生物材料的方法，其包括(a)將生物材料暴露于含醇溶液中至少24小時。在一些實施方案中，第一和第二方面的方法還包括步驟(b)將步驟(a)中的所述材料暴露于交聯(lián)劑；和(c)將步驟(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；其中步驟(b)和(c)與步驟(a)是連續(xù)的。盡管優(yōu)選進(jìn)行步驟(a)至少24小時，更優(yōu)選至少36小時，最優(yōu)選至少48小時，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識到，在一些情況下，步驟(a)可進(jìn)行專交短的時間。因此，在第三個方面中，本發(fā)明提供制造可植入生物材料的方法，其包括(a)將生物材料暴露于含醇溶液；(b)將步驟(a)中的所述材料暴露于交聯(lián)劑；和(c)將步驟(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；其中步驟(b)和(c)與步驟(a)是連續(xù)的。在第四個方面中，本發(fā)曰J生物材料的方法，其包括(a)將生物材料暴露于含醇溶液；(b)將步驟(a)中的所述材料暴露于交聯(lián)劑；和(c)將步驟(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；其中步驟(b)和(c)與步驟(a)是連續(xù)的。在一些實施方案中，在本發(fā)明的方法的步驟(a)和(b)之間和/或步驟(b)和(c)之間，沖洗生物材料或含膠原材料以除去殘留的醇和/或交聯(lián)劑。優(yōu)選地，在步驟(c)后進(jìn)一步?jīng)_洗生物材料或含膠原材料以除去殘留的酸性)容液。本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識到，本文公開的方法可用于處理任何生物材料。優(yōu)選地，該生物材料包括膠原。在一些實施方案中，生物材料為培養(yǎng)的組織、包含從動物得到的細(xì)胞外基質(zhì)的假體(prosthesis)、重建的(reconstituted)組織(例如膠原基質(zhì))等。還應(yīng)認(rèn)識到，生物材料可包括由合成聚合物、生物聚合物或兩者形成的合成類似物，包括通常存在于自然組織基質(zhì)中的那些。合適的合成聚合物包括例如聚酰胺和聚砜。生物聚合物可天然存在或通過例如發(fā)酵等在體外產(chǎn)生。在一些實施方案中，生物材料天然存在并已從動物中分離?？蓮娜魏蝿游镏蟹蛛x生物材料，不管是從與受體相同的物種還是從與受體不同物種的動物。優(yōu)選地，動物為哺乳動物的目即偶蹄目04W/o^c(y/a)、兔形目(丄ago附o'7/")、-齒齒目(W<%/ew//fl)、奇5帝目(尸en.ssoc/ac(y/a)、食肉目(GarwVona)和有袋目(M"^7^/"/ifl)中的一種。更優(yōu)選地，動物選自綿羊、牛、山羊、馬、豬、有袋動物和人。生物材料可為任何類型的細(xì)胞組織。優(yōu)選地，細(xì)胞組織選自心血管組織、心J生組織、心瓣力莫、主動"永4艮、主動脈壁、主動力永小葉、心包組織、結(jié)締組織、硬膜、皮膚組織、血管組織、軟骨組織、心包膜、韌帶、腱、血管、臍帶組織、骨組織、筋膜(fasciae)和粘膜下(submucosal)組織以及皮膚。在一些實施方案中，生物材料是和/或包括離散的(discrete)，即分離的膠原而不是天然存在的含膠原組織。離散膠原可以以其分離狀態(tài)使用或被形成為本領(lǐng)域中已知的任何醫(yī)療裝置或用品。步驟(a)中使用的生物材料未被預(yù)先交聯(lián)。步驟(a)中使用的含醇溶液優(yōu)選為液體，并且是水基的，即為大于約50%醇，并優(yōu)選60%-80%醇(以體積計)的水溶液?？墒褂镁彌_或非緩沖的含醇溶液；但是，優(yōu)選使用非緩沖的含醇溶液，因為發(fā)現(xiàn)緩沖的含醇溶液對隨后的交聯(lián)過程有負(fù)面影響，產(chǎn)生發(fā)黃的生物材料。本發(fā)明的方法可在含醇溶液中使用本領(lǐng)域中已知的任何醇。優(yōu)選地，醇為在無緩沖劑的溶液中的C!-C6低級醇。甚至更優(yōu)選地，醇選自下組甲醇、乙醇、環(huán)己醇、異丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、異丁醇、仲丁醇和叔丁醇。在一些實施方案中，含醇溶液包括兩種或多種醇的混合物，條件是醇的總體積大于50%。例如，約70%的乙醇和約10%的異丁醇的混合物是有效的?？蓪⒉襟E(a)中的生物材料暴露于含醇溶液任意時間長度，只要能足以賦予生物材料對體內(nèi)病原性4丐化的抗性即可。優(yōu)選地，生物材料保持與含醇溶液接觸足夠的時間，以能使醇擴(kuò)散和滲透到生物材料內(nèi)。更優(yōu)選地，生物材料暴露于含醇溶液至少24小時，甚至更優(yōu)選至少36小時，和最優(yōu)選至少48小時。在一些實施方案中，例如已將生物材料暴露于含醇溶液大于24小時的在一些實施方案中，生物材料在暴露于含醇溶液后被取出并暴露于一種或多種交聯(lián)劑。可使用本領(lǐng)域中已知的任何形式的交聯(lián)劑或其組合，只要它能使膠原交聯(lián)即可。因此，應(yīng)認(rèn)識到，交聯(lián)劑包括但不限于二乙烯砜(DVS)、聚乙二醇二乙烯砜(VS-PEG-VS)、曱基丙烯酸羥乙酯二乙烯砜(HEMA-DIS-HEMA)、曱醛、戊二醛、醛、異氰酸酯、烷基和芳基鹵、亞胺酸酯、N-取代馬來酰亞胺、酰化化合物、石友二亞胺、羥基氯化物、N-羥基琥珀酰亞胺、光(即藍(lán)光和UV光)、pH、溫度和它們的組合。優(yōu)選地，交聯(lián)劑為選自下組的化學(xué)交聯(lián)劑碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVS)、多醛和疊氮化磷酸二苯酯(DPPA)。在一些實施方案中，多醛為雙-、三-或二-醛。戊二醛是尤其優(yōu)選的。在一些實施方案中，交聯(lián)步驟(b)后是步驟(c)，有或沒有中間洗滌步驟。步驟(c)中使用的酸性溶液包含能將步驟(b)后生物材料中存在的固定和/或非固定交聯(lián)劑部分滅活和/或改變以除去或減少可用的鈣結(jié)合部位的任何酸。可選地，或除此之外，步驟(c)中使用的酸性溶液包含能進(jìn)一步使膠原上活化的羧基與活化的胺基交聯(lián)形成酰胺鍵的任何酸。優(yōu)選地，酸性溶液中的酸包括氨基羧酸。優(yōu)選地，氨基羧酸為具有至少一個氨基和至少一個羧酸取代基的酸。更優(yōu)選地，氨基羧酸選自下組L-精氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸或L-天冬氨酸。在一些實施方案中，公開方法的步驟(c)被抑制生物材料中存在的彈性蛋白分子上的金屬蛋白酶形成的方法所代替或補(bǔ)充。具體地說，在組織如主動脈組織中，存在比在其它組織中更高百分比的彈性蛋白。這些彈性蛋白分子可提供形成金屬蛋白酶的位點，因而這些位點需要減少、除去或失活。如下文中實施例1所示，可使用包含多價陽離子如鎂、鐵和鋁鹽的無緩沖劑的溶液來減少金屬蛋白酶的形成。使用無磷酸鹽的0.9%鹽水溶液進(jìn)行沖洗生物材料的步驟。在一種優(yōu)選實施方案中，在步驟(c)后將生物材料進(jìn)一步滅菌。更優(yōu)選地，在沖洗后將生物材料滅菌。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識到進(jìn)行本發(fā)明的每個步驟的溫度不是關(guān)鍵性的，但能理解到，溫度優(yōu)選為2°C-40°C,更優(yōu)選為4°C-30°C，最優(yōu)選為5°C-25°C。在一種實施方案中，醇、交聯(lián)劑和酸性溶液、沖洗溶液和滅菌溶液都是無緩沖劑的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識到，本文公開的方法能產(chǎn)生抗鈣化的生物材料，在體內(nèi)植入后，其保持小于50(ig4丐/mg組織超過200天。換句話說，本發(fā)明的抗鈣化生物材料能被植入多于200天而生物材料不會增加其鈣含量超過50jig/mg組織。因此，在第五個方面中，本發(fā)明提供包括交聯(lián)膠原的抗鈣化生物材料，其中所述生物材料的鈣含量小于約50|ig/mg生物材料，和其中所述生物材料能被植入至少200天而生物材料不會增加其鈣含量超過50(ig/mg生物材料。不希望受任何理論或假設(shè)的約束，認(rèn)為觀察到的抗鈣化是部分由于本因此，在第六個方面中，本發(fā)明提供可植入的生物裝置，其包括含有交聯(lián)膠原的抗4丐化生物材料，其中所述膠原包括仲胺。在一些實施方案中，將抗鈣化生物材料涂覆到醫(yī)療裝置的表面上。在另一實施方案中，裝置還包括至少第二涂層。本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識到，所述至少第二涂層可包括試劑如抗微生物劑、抗病毒劑、生長因子、抗脫水劑或防腐劑。優(yōu)選地，抗微生物劑選自下組異煙肼、乙胺丁醇、吡。秦酰胺、鏈霉素、氯法齊明、利福布汀(rifabutin)、氟喹諾酮、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯砜、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、氨芐西林、兩性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、林可霉素、戊烷脒、阿托伐醌、巴龍霉素、地克珠利(diclazaril)、無環(huán)鳥苷、三氟尿苷、膦曱酸、青霉素、慶大霉素、更昔洛韋、伊曲康唑(iatroconazole)、咪康唑、吡石克鋅、重金屬包括但不限于金、柏、銀、鋅和銅、以及它們的組合形式，包括鹽，如氯化物、溴化物、石典化物和高》典酸鹽，以及與載體的復(fù)合物，和其它形式。優(yōu)選地，生長因子劑選自下組羥基磷灰石、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素-樣生長因子(insulin-likegrowthfactor)I和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生的生長因子(plateletderivedgrowthfactor)(PDGF)、腫瘤血管生成因子(TAF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、轉(zhuǎn)化生長因子a和卩(TGF-a和TGF-卩)、白細(xì)胞介素-8(IL-8);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);白細(xì)胞介素，和干擾素。在一些實施方案中，本發(fā)明的裝置還包括選自下組的生物可吸收材料聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，聚二氧雜環(huán)己酮(polydioxanone),聚己內(nèi)酯，多肽，聚碳酸酯，聚羥基丁酸酯，聚(亞烷基草酸酯)，醋酸乙烯酯與不飽和羧酸的共聚物，水溶性或可分散性纖維素衍生物，氧化乙烯聚合物，聚丙烯酰胺，膠原，明膠，聚(原酸酯)，氨基酸的聚酰胺，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚醚醚酮，磷酸三鈣，和其混合物。應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明的裝置可為需要抗4丐化的任何裝置。優(yōu)選地，裝置選自下組人造心臟、心外壓縮裝置、血管內(nèi)或血管外壓縮裝置、心瓣膜假體、瓣環(huán)(annuloplastyring)、皮膚移植物(graft)、血管移植物、血管支撐架(stent)、結(jié)構(gòu)支撐架、血管分流器、心臟血管分流器、硬膜移植物、軟骨移植物、軟骨植入物(implant)、心包膜移植物、韌帶假體、腱假體、膀胱々支體、小拭子、縫合線、永久留置經(jīng)皮裝置、外科補(bǔ)片、心血管支撐架、涂層支撐架和涂層導(dǎo)管。更優(yōu)選地，裝置為心瓣膜々支體。在一些實施方案中，裝置進(jìn)一步包括從動物上收獲的組織碎片(tissuefragment)或組織的合成類4以物。優(yōu)選地，組織碎片包括大量細(xì)胞，當(dāng)在手術(shù)部位植入時，所述細(xì)胞將增殖并結(jié)合到周圍組織內(nèi)。在第七個方面中，本發(fā)明提供一種生物相容的植入物，包括生物相容的支架(scaffold),該支架包括含有交聯(lián)膠原的抗鈣化生物材料，其中所述生物材料的鈣含量小于約50昭/mg生物材料，和其中所述生物材料能被植入至少200天而生物材料不會增加其鉤含量超過50昭/mg生物材料。在第八個方面中，本發(fā)明提供一種生物相容的植入物，包括生物相容的支架，該支架包括含有交聯(lián)膠原的抗鈣化生物材料，其中所述膠原包括仲胺。優(yōu)選地，本發(fā)明的植入物還包括合成聚合物、天然聚合物、可注射凝膠、陶瓷材料、同體組織、同種異體組織、異種組織和它們的組合。在第九個方面中，本發(fā)明提供用于修復(fù)組織損傷的試劑盒，其包括(a)具有一種或多種含有交聯(lián)膠原的抗鈣化生物材料的無菌容器，其中所述月交原包"fe仲胺；和(b)針對損傷受試者的說明書。在第十個方面中，本發(fā)明提供一種處理活組織的方法，包括U)提供含有交聯(lián)膠原的抗鈣化生物材料，其中所述膠原包括仲胺；和(b)在需要處理的受試者中或其上植入生物材料。處理方法可為任何處理，包括預(yù)防和治療處理。優(yōu)選地，處理方法選自下組組織修復(fù)、深組織保護(hù)、組織填充(tissuebulking)、美容處理、治療處理、組織增大和組織封口。在第十一個方面中，本發(fā)明提供一種傷口敷料，其包括含有交聯(lián)膠原的抗4丐化生物材料，其中所述膠原包括仲胺。優(yōu)選地，生物材料中的膠原選自下組綿羊膠原、牛膠原、山羊膠原、馬膠原、豬膠原、有袋動物膠原和人膠原。在一些實施方案中，傷口敷料還包括選自下組的硫酸化多糖肝素、硫酸軟骨素、硫酸葡聚糖、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素、硫酸己糖醛酸基己糖氨基聚糖(hexuronylhexosaminoglycansulfate)、六石克酸肌醇和八^琉酸蔗糖。優(yōu)選地，傷口敷料還包括抗微生物劑、抗病毒劑、生長因子、抗脫水劑或防腐劑。優(yōu)選地，生物材料含有至少50%的膠原，更優(yōu)選至少70°/。的膠原，甚至更優(yōu)選至少90°/。的膠原，和最優(yōu)選基本上由月交原組成。附圖簡述圖1顯示了用醇預(yù)處理然后戊二醛固定的袋鼠心包膜組織和戊二醛固定的組織(即沒有醇預(yù)處理)和"新鮮"組織的比較。圖2顯示了用醇預(yù)處理然后戊二醛固定的袋鼠主動脈組織和戊二醛固定的組織(即沒有醇預(yù)處理)和"新鮮"組織的比較。圖3顯示了(A)豬前尖(porcinecusp)和(B)主動脈壁組織對酶降解的抗性。圖4顯示了皮下大鼠模型中八周后(A)外植的豬瓣膜前尖和(B)豬主動脈壁組織的定量的鈣水平。優(yōu)選實施方案詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)認(rèn)識到本發(fā)明不限制于具體舉例的制備方法，其當(dāng)然是可變化的。還應(yīng)認(rèn)識到，本文使用的術(shù)語僅僅用于描述本發(fā)明的具體實施方案，而不意欲限制本發(fā)明，本發(fā)明僅受限于所附權(quán)利要求書。本文(不管是上文還是下文)引用的所有出版物、專利和專利申請都全文引入作為參考。但是，引用本文提到的出版物用于描述和公開出版物中記載并可與本發(fā)明結(jié)合使用的實驗規(guī)程(protocol)和試劑。本文中任何內(nèi)容都不能被解釋為，承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)依靠發(fā)明在先而在時間上先于這些公開。此外，除非另外指明，本發(fā)明的實施利用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)免疫技術(shù)、化學(xué)和藥理學(xué)。這些技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的，并在文獻(xiàn)中有充分i兌明。參見例如Coligan,Dunn,Ploegh,Speicher和Winfield"CurrentprotocolsinProteinScience，，(1999),第I和II巻(JohnWiley&SonsInc.);以及Bailey,J.E.禾口Ollis，D.R,BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986;ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker,eds.，AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentallmmunology，I-IV巻(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)。必須注意，本文及所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式"一種"和"所述"包括復(fù)數(shù)指代，除非文中另外明確指明。因此，例如，提到的"一種交聯(lián)劑"包括這些試劑的復(fù)數(shù)，提到的"一種醇"是指一種或多種醇，等等。除非另外限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。盡管可使用類似或等價于本文所述的任何材料和方法來實施或試驗本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的材料和方法。在最寬方面的一個方面中，本發(fā)明涉及一種制造可植入生物材料的方法。本文使用的術(shù)語"生物材料"是指可能具有生物用途的任何材料，其中該材料包括一些膠原。膠原可為來自任何來源的任何類型的膠原，并可單獨存在或與其它材料組合。因此，膠原可占生物材料總重量的少至l%w/w或多達(dá)100%。本文使用的術(shù)語"膠原，，是指以其剛性三鏈螺旋結(jié)構(gòu)為特征的纖維蛋白的細(xì)胞外家族。三個膠原多肽鏈("a-鏈")彼此環(huán)繞形成這種螺旋分子。該術(shù)語還意指包括各種類型的膠原。膠原螺旋部分的主要部分在哺乳動物物種之間差異很小。事實上，大量膠原類型具有高度核苷酸和氨基酸序列同源性。例如，當(dāng)比較人、馬和鼠科動物時，膠原al型II的核苷酸序列同源性為至少88%。人和馬在核苷酸水平上具有93%的序列同源性，而小鼠和馬具有89%的序列同源性。人和小鼠的核香酸序列同源性為88%(參見，NCBI登錄號U62528(馬)、NM033150(人)和畫031163(小鼠)，http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)。其它類型的膠原具有類似的氨基酸同源性水平。例如，豬膠原al型I和綿羊膠原aI型I之間的核苷酸序列同源性為90%(參見，NCBI登錄號AF29287(綿羊)和AF201723(豬)，http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)?？紤]上述動物中大多數(shù)的常見譜系和生物學(xué)水平，大量物種如牛、羊、小鼠和豬上的膠原的高度氨基酸和核苷酸序列同源性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員的膠原材料。因此，在一些實施方案中，從哺乳動物的目即偶蹄目、兔形目、嚙齒目、奇蹄目、食肉目和有袋目之一的動物中分離或收獲生物材料。動物優(yōu)選為綿羊、牛、山羊、馬、豬、有袋動物或人。盡管優(yōu)選從與受體相同的動物物種中分離生物材料，但可預(yù)料到，也可從與受體不同的物種中分離生物材料?；蛘撸谝恍嵤┓桨钢?，生物材料包括培養(yǎng)的組織、重建的組織等。生物材料可為任4可類型的細(xì)胞組織。例如，該細(xì)胞組織可為心血管組織、骨盆底組織、心臟組織、心瓣膜(heartvalve)、主動脈才艮、主動脈壁、主動脈小葉、心包組織、結(jié)締組織、軟或?qū)嵸|(zhì)器官的基質(zhì)、硬膜、皮膚組織、血管組織、硬膜、軟骨、心包膜、韌帶、腱、血管、臍帶組織、骨組織、筋膜和粘膜下組織或皮膚，因為這些全部都包括一些膠原。還應(yīng)認(rèn)識到，生物材料還可包括由合成聚合物、純化生物聚合物或兩者形成的合成類似物，包括天然組織基質(zhì)中通常存在的那些。合適的合成聚合物包括例如聚酰胺和聚砜。生物聚合物可為天然存在的或通過例如發(fā)酵等在體外產(chǎn)生?？赏ㄟ^技術(shù)如編織、針織、澆鑄、模塑、擠出、細(xì)胞排列和磁性排列將純化的生物聚合物適當(dāng)?shù)匦纬蔀榈孜?。合適的生物聚合物包括而不限于膠原、彈性蛋白、絲、角蛋白、明膠、聚氨基酸、多糖(例如纖維素和淀粉)以及這些中任意的共聚物。例如，可通過各種技術(shù)(如編織和模塑)中的任何一種將膠原和彈性蛋白聚合物形成為合成的可植入材料。合成的組織類似物模擬天然組織基質(zhì)?；蛘?，合成底物可用于單獨或與天然存在的底物一起形成組織類似物。非限制性例子包括聚丙烯、聚乳酸、聚酯、尼龍、有機(jī)硅等。應(yīng)認(rèn)識到，盡管本文公開的方法可能對先前交聯(lián)的生物材料有一定作用，但本文公開的方法意欲用在未交聯(lián)的即"天然的"或"未加工的"材料上。一旦獲得生物材料，就準(zhǔn)備用于植入。術(shù)語"植入"、"可植入的"和"植入物"在本文中可互換使用，并全部指本發(fā)明的生物材料、裝置等被放置在動物活組織內(nèi)或上而不會導(dǎo)致排斥、感染或毒性問題的能力。應(yīng)認(rèn)識到，術(shù)語"可植入的"可包括生物材料或裝置的部分，還包括部分植入的裝置等如隱形眼鏡等。在本發(fā)明的方法的初始步驟中，生物材料被暴露于含醇溶液。本文使用的術(shù)語"被暴露于(exposed)""暴露(exposing)"是指使生物材料或含膠原材料接觸這里或下文中所描述的含醇溶液的活性步驟，隨后使生物材料與交聯(lián)劑、酸性溶液或其它物質(zhì)接觸(containing)足夠時間以產(chǎn)生所需的結(jié)果。將生物材料暴露于例如含醇溶液的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，通常，可通過在包含醇的溶液中噴涂、浸涂或浸沒生物材料而將生物材料"暴露"于醇。本文使用的術(shù)語"醇"是指本領(lǐng)域中已知的能除去或減少甘油三酸酯的量并且至少部分酯化膠原上存在的羧基的任何醇。優(yōu)選地，醇為水溶性醇。更優(yōu)選地，醇為在無緩沖劑的溶液中的CrC6低級醇。甚至更優(yōu)選地，醇選自下組甲醇、乙醇、環(huán)己醇、異丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、異丁醇、仲丁醇和7k丁醇。不希望受任何特定理論或假設(shè)的約束，本發(fā)明人認(rèn)為含醇溶液有助于松散膠原三螺旋并因此暴露疏水部位(參見Karube&Nishida,1979，BiochimBiophysActa.，23;581(1);106-13)。我們還認(rèn)為膠原中存在的羧基和胺基在含醇溶液存在下被酯化，從而它們可在后面的步驟中用于交聯(lián)。因而，優(yōu)選的醇溶液為包括至少50%v/v、更優(yōu)選至少約70%v/v和最優(yōu)選至少約80。/。v/v醇的無緩沖劑水溶液。在一種實施方案中，醇溶液為0.9°/。鹽水中的70%v/v乙醇(包含0.5mMPMSF)。在一種實施方案中，本發(fā)明的方法提供一種制造可植入生物材料的方法，其包括將生物材料暴露于含有少于100%醇的含醇無緩沖劑的溶液中至少24小時。在一些實施方案中，含醇溶液以及其它溶液和試劑都是"無緩沖劑"的，因為假定包含醛的交聯(lián)劑在固定過程中與緩沖劑反應(yīng)，導(dǎo)致醛的解聚。暴露生物材料到含醇溶液的步驟可進(jìn)行任意時間長度，只要它足以賦羧基和胺基酯化即可。優(yōu)選地，生物材料保持與含醇溶液接觸足夠的時間以能使醇擴(kuò)散和滲透到生物材料中。更優(yōu)選地，將生物材料暴露于含醇溶液至少24小時，甚至更優(yōu)選至少36小時，最優(yōu)選至少48小時。一旦將生物材料暴露于醇后，就除去醇。在一些實施方案中，在暴露于醇后在包括無磷酸鹽的0.9%鹽水溶液的沖洗溶液中沖洗生物材料。但是，可使用任何非緩沖的生理上可接受的溶液作為沖洗溶液。沖洗溶液的用途主要是除去多余的醇，因而不是關(guān)鍵性的。在將生物材料或含膠原材料暴露于醇大于24小時后，可直接將它用于植入。盡管以前其它人也使用了醇預(yù)固定，但傳統(tǒng)上將它用于組織滅菌，而不是酯化膠原中存在的羧基和胺基。因而，暴露于醇的時間相對較短，例如，少于24小時，并且不足以能使組織被醇完全滲透。因此，在本發(fā)明前，沒有認(rèn)識到，抗鈣化生物材料(見下文定義)可通過長時間即大于24小時將生物材料暴露于含醇溶液來產(chǎn)生。這意味著在暴露于含醇溶液大于本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識到，可通過步驟(a)后使生物材料交聯(lián)來產(chǎn)生抗釣化生物材料的更好形式。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，暴露于醇后將生物材料或含膠原材料暴露于一種或多種雙官能交聯(lián)劑中。本文使用的術(shù)語"雙官能"是指在5碳鏈的兩端處存在的雙官能醛基?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)利用任何形式的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，只要能使膠原交聯(lián)即可。交聯(lián)劑包括但不限于酰化化合物、己二酰氯、醛、烷基和芳基卣、雙亞胺酸酯(bisimidate)、碳二亞胺、二乙烯砜(DVS)、曱醛、戊二醛、乙二酪、己二異氰酸酯、羥基氯化物、甲基丙烯酸羥乙酯二乙烯砜(HEMA-DIS-HEMA)、亞胺酸酯、異氰酸酯、光(如藍(lán)光和UV光)、N-羥基琥珀酰亞胺、N-取代馬來酰亞胺、pH、多醛、疊氮化磷酸二苯酯(DPPA)、包括17-25個碳的主鏈和4-5個環(huán)氧基的聚環(huán)氧化合物、聚環(huán)氧醚、聚乙二醇二乙烯砜(VS-PEG-VS)、聚甘油聚縮水甘油醚和溫度以及它們的組合。在一些實施方案中，交聯(lián)劑為化學(xué)交聯(lián)劑，如碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平(genipin)、戊二醛、甲醛和疊氮化磷酸二苯酯(DPPA)。還證實，包括17-25個碳的主鏈和4-5個環(huán)氧基的聚環(huán)氧化合物表現(xiàn)出使膠原交聯(lián)的高效率(參見例如美國專利申請No.20040059430(S/N10/618447)。還表明，聚環(huán)氧化合物的毒性低于戊二醛的毒性，在與螺旋多肽分子如膠原反應(yīng)的情況下，組織的抗原性或免疫響應(yīng)誘導(dǎo)與反應(yīng)時間成比例降低。自然地，它表現(xiàn)出相對好的生物相容性(參見例如Lohre等，(1992),Artif.Organs,16:630-633;Uematsu等，(1998)，Artif.Organs,22:909-913)。因此，所述的聚環(huán)氧化合物為一種優(yōu)選的交聯(lián)劑。在一些實施方案中，交聯(lián)劑包括約1%的戊二醛，暴露時間為至少約24小時。應(yīng)認(rèn)識到，生物材料暴露于交聯(lián)劑的時間長度取決于所用的試劑、濃度和溫度。通常，暴露時間為24小時-28天。生物材料于交聯(lián)劑的暴露時間精確量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。同樣，不希望受任何特定理論或假設(shè)約束，本發(fā)明人認(rèn)為，通過使已暴露于醇的生物材料暴露于交聯(lián)劑，可使生物材料中存在的膠原上的酯化的羧基和胺基交聯(lián)。盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認(rèn)識到進(jìn)行本發(fā)明的每個步驟的溫度不是關(guān)鍵性的，但應(yīng)認(rèn)識到，溫度優(yōu)選在2。C和40。C之間，更優(yōu)選在4。C和30°C之間，最優(yōu)選在5°C和25°C之間。同樣，在交聯(lián)步驟后，優(yōu)選在沖洗溶液如醇暴露步驟(a)后使用的沖洗溶液中沖洗生物材料。但是，同樣認(rèn)識到，沖洗步驟僅僅是優(yōu)選。在交聯(lián)步驟后，或交聯(lián)步驟后采用沖洗步驟之后，可將生物材料暴露于包含能滅活和/或改變步驟(b)后生物材料中存在的固定和/或非固定交聯(lián)劑部分的任何酸的酸性溶液，以除去或減少可用的鈣結(jié)合部位?？蛇x地，或除此之外，步驟(c)中使用的酸性溶液包含能進(jìn)一步使膠原上的活化的羧基與活化的胺基交聯(lián)形成酰胺鍵的任何酸。優(yōu)選地，酸性溶液包括至少一種氨基羧酸。本文使用的術(shù)語"氨基羧酸"為具有至少一個氨基和至少一個羧酸取代基的任何酸。本發(fā)明中使用的氨基羧酸的代表性例子包括但不限于L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸。酸性溶液的目的有兩個方面首先，氨基J^酸有助于固定和非固定交聯(lián)劑部分的滅活和/或改性，從而減少或減弱任何負(fù)面生物影響。其次，氨基羧酸進(jìn)一步使膠原上活化的羧基與活化的胺基交聯(lián)形成酰胺鍵。氨基羧酸的濃度將取決于實際的所用酸和其它參數(shù)如所用生物材料的總質(zhì)量等。另外，氨基羧酸對生物材料的最小濕重量比(wetweightratio)將為約1:4。酸性溶液的最重要方面是pH。PH必須低于pH7，優(yōu)選低于pH6,更優(yōu)選低于pH5，最優(yōu)選低于約pH4.6。在一種實施方案中，酸性溶液為8mg氨基羧酸每毫升去離子水，其不含磷酸鹽且為約pH4。使生物材料暴露于氨基羧酸至少6小時，更優(yōu)選至少24小時，甚至更優(yōu)選超過48小時。盡管培育溫度不是關(guān)鍵性的，但優(yōu)選在5。C和55。C之間，更優(yōu)選在l(TC和45。C之間，最優(yōu)選約45°C。在一些實施方案中，公開方法的步驟(C)被抑制生物材料中存在的彈性蛋白分子上的金屬蛋白酶形成的方法所代替或補(bǔ)充。具體地說，在組織如主動脈組織中，存在比在其它組織中更高百分比的彈性蛋白。這些彈性蛋白分子可提供形成金屬蛋白酶的部位，因而這些部位需要減少、除去或失活。如下文中實施例1所示，可使用包含多價陽離子如鎂、鐵和鋁鹽的無緩沖劑的溶液以減少金屬蛋白酶的形成。在將生物材料或含膠原材料暴露于酸性溶液和/或包含多價陽離子的無緩沖劑的溶液的步驟后，同樣優(yōu)選將生物材料在沖洗溶液中沖洗。在一些實施方案中，還對生物材料進(jìn)行滅菌。對生物材料滅菌的步驟可通過本領(lǐng)域中已知的用于含膠原材料的任何滅菌方法。例如，可〗吏生物材津牛經(jīng)受滅菌劑(例如，液體滅菌劑，如0.2-2.0wt%的戊二醛溶液)一段滅菌時間?？蓪?.625%戊二醛溶液與熱(即升溫超過室溫，但低于導(dǎo)致生物材料損壞的溫度)組合使用作為滅菌劑?；蛘?，合適的滅菌劑溶液可包括單獨的滲透平衡水溶液或與滅菌的非接觸源(例如輻射、電子束、UV或其它類似手段)組合，或包括戊二醛的水溶液連同磷酸鹽緩沖的鹽水。在使用0.625。/。戊二醛溶液作為滅菌劑的情況下，滅菌時間在37。C下可為1-6天，或在50。C下為1-2天。這種最終的滅菌步驟可在將生物材料包裝到其最終容器后進(jìn)行，從而消除了在直到植入時間時對生物材料的任何后續(xù)處理的需要。在一種優(yōu)選實施方案中，通過將生物材料暴露于在包含9.07g/l磷酸二氬鉀緩沖劑的去離子水中的0.25%戊二醛來對生物材料進(jìn)行滅菌。滅菌步驟可進(jìn)行任意時間長度，并可包括貯存。滅菌溫度優(yōu)選40-50°C，并進(jìn)行超過60分鐘。用本文公開的方法處理后的生物材料具有高的抗4丐化水平，即它是"抗鈣化生物材料"。本文使用的術(shù)語"鈣化"是指與傳統(tǒng)產(chǎn)生的包括結(jié)締組織蛋白(即膠原和彈性蛋白)的生物材料有關(guān)的主要病理問題之一。以前表明，這些材料在植入到體內(nèi)后可變?yōu)殁}化的。這種鈣化可導(dǎo)致生物材料不合需要的變硬或降解。已知在固定膠原生物材料中發(fā)生兩種(2)型的鉤化內(nèi)源性(intrinsic)和外源性(extrinsic)，但這種4丐化發(fā)生的確切機(jī)理是未知的。內(nèi)源性釣化特征在于將固定生物修復(fù)組織(bioprosthetictissue)包括膠原基質(zhì)和殘余細(xì)胞內(nèi)的輛和磷酸鹽離子沉淀。外源性鉤化特征在于將粘附血栓包括粘附細(xì)胞(例如血小板)內(nèi)的鉀和磷酸鹽離子沉淀到生物材料上并在生物材料上形成包含磷酸4丐的表面斑塊。因此，當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明的生物材料時，短語"高的抗4丐化水平"或"抗鉤化"是指生物材料在體內(nèi)植入至少200天后表現(xiàn)出小于50嗎、優(yōu)選小于20嗎和甚至更優(yōu)選小于10(ig鈣每mg除去生物材料后的干組織。優(yōu)選地，本發(fā)明的生物材料還抗酶降解。本文使用的術(shù)語"抗酶降解"是指本發(fā)明的生物材料承受酶降解至與傳統(tǒng)固定組織相當(dāng)水平的能力。病癥和/或疾病。通常，術(shù)語"治療"等在本文中用于指對個體或動物、它們的組織或細(xì)胞施加影響以獲得所需的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。該效果在病癥和/或疾病的部分或完全治愈方面尤其有治療作用(therapeutic)。本文使用的"治療"覆蓋了脊推動物、哺乳動物尤其是人中的病癥和/或疾病的任何治療，并包括(a)抑制病癥和/或疾病，即阻止它的發(fā)展；或(b)減輕或改善病癥和/或疾病的癥狀，即引起酶降解/病癥和/或疾病的癥狀消退。術(shù)語"病癥"和/或"疾病"在本文中可互換使用，并指影響動物包括人的異常狀況(condition)，其可使用本發(fā)明的生物材料來治療。因此，傷口、損傷、組織降解、微生物感染、燒傷、潰瘍、皮膚病的治療都包括在本發(fā)明內(nèi)。此外，還包括心瓣膜、主動脈根、主動脈壁、主動脈小葉、心包組織、結(jié)締組織、硬膜、皮膚組織、血管組織、軟骨組織、心包膜、韌帶、腱、血管、臍帶組織、骨組織、筋膜和粘膜下組織的置換。本發(fā)明的抗鈣化生物材料還可應(yīng)用于各種醫(yī)療裝置接觸表面中的任何一種。接觸表面包括但不限于意欲接觸動物尤其包括人的血液、細(xì)胞或其它體液或組織的表面。合適的接觸表面包括意欲接觸血液或其它組織的醫(yī)療裝置的一個或多個表面。醫(yī)療裝置包括動脈瘤巻曲(aneurysmcoil)、人造血管、人造心臟、人造瓣膜、人造腎、人造腱和韌帶、血袋、血充氧器、骨和心血管置換物、骨修復(fù)物、骨蠟、心血管移植物、軟骨置換裝置、導(dǎo)管、隱形眼鏡、用于細(xì)胞和組織培養(yǎng)和再生的容器、栓塞顆粒、過濾系統(tǒng)、移植物、導(dǎo)向槽(guidechannel)、內(nèi)置導(dǎo)管、實驗室儀器、微珠、神經(jīng)生長導(dǎo)向裝置、眼植入物、整形植入物、起搏器導(dǎo)聯(lián)、探針、修復(fù)材料、分流器、支撐架、用于肽的載體、手術(shù)器械、縫合線、注射器、尿道置換物、傷口覆蓋物、傷口敷料、傷口愈合裝置和本領(lǐng)域中已知的其它醫(yī)療裝置。能從本發(fā)明的應(yīng)用中受益的醫(yī)療裝置的其它例子對于手術(shù)和醫(yī)療過程領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來說是顯而易見的，并因此被本發(fā)明所包括。接觸表面可包括網(wǎng)眼、巻曲、導(dǎo)線(wire)、充氣氣球或能在目標(biāo)位置被植入的任何其它結(jié)構(gòu)，目標(biāo)位置包括血管內(nèi)位置、內(nèi)腔內(nèi)位置、實質(zhì)組織內(nèi)的位置等?？芍踩胙b置可用于永久或臨時植入。這些裝置可被輸送或結(jié)合到血管內(nèi)的導(dǎo)管和其它醫(yī)療導(dǎo)管內(nèi)?？赏ㄟ^等離子f余;ii支術(shù)(plasmacoatingtechnique)進(jìn)4亍這些裝置的表面涂覆過程，如國際專利申請W096/24392中所述。在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的生物材料直接用作傷口敷料。例如，如上文所述，可將生物材料干燥并直接用作傷口敷料。本發(fā)明的傷口敷料優(yōu)選為連續(xù)片狀形式，類似于本領(lǐng)域中已知的傷口敷料。但是，本發(fā)明也可采取其它特定的構(gòu)造。例如，可通過由上述生物材料的備料片(stocksheet)切割所需的設(shè)計圖案來制造本發(fā)明的傷口敷料。例如，可由生物材料的備料片壓膜切割(die-cut)所述的片。使用時，本發(fā)明的傷口敷料優(yōu)選用作直接接觸傷口基層(woundbed)的主敷料，或近到實際緊靠傷口基層。敷料可用作填充材料，如果需要，可用任何合適的第二傷口敷料或裝置如包裹材料、帶、紗布、墊、縫合線或夾子緊固(secure)到位置內(nèi)。敷料可為臨時性或永久性的，并可被永久結(jié)合到愈合的組織內(nèi)。必要時，通過首先除去任何過度敷裹的材料(over-dressingmaterial)然后除去敷料來更換傷口敷料，從而移開任何積聚的壞死組織和滲出物。本發(fā)明的臨時傷口敷料可被新敷料或其它合適傷口覆蓋物置換。敷料可以其整體放置到傷口內(nèi)?？蓪⒈景l(fā)明的敷料切割、成型和改變，以適應(yīng)大量用途和應(yīng)用。本發(fā)明的生物材料的另一用途在于輸送上述應(yīng)用中任何一種中包括的治療活性劑。治療活性劑可參與并改進(jìn)傷口愈合過程，并可包括抗微生物劑，包括但不限于抗真菌劑、抗細(xì)菌劑、抗病毒劑和抗寄生物劑，生長因子，血管生成因子，抗炎劑，抗血栓形成劑，麻醉劑，粘多糖，金屬和其它傷口愈合劑。吡。秦酰胺、鏈霉素、氯法齊明、利福布汀、氟喹諾酮、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯砜、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、氨千西林、兩性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、林可霉素、戊烷脒、阿托伐醌、巴龍霉素、地克珠利(diclazaril)、無環(huán)鳥苷、三氟尿苷、膦甲酸、青霉素、慶大霉素、更昔洛韋、伊曲康唑(iatroconazole)、咪康唑、吡石克鋅、重金屬包括^旦不限于金、柏、4艮、鋅和銅、以及它們的組合形式，包括鹽，如氯化物、溴化物、硤化物和高石典酸鹽，以及與載體的復(fù)合物，和其它形式。可被結(jié)合到本發(fā)明的傷口敷料裝置內(nèi)的生長因子劑包括但不限于堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素-樣生長因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、肺瘤血管生成因子(TAF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、轉(zhuǎn)化生長因子a和(3(TGF-a和TGF-(3)、白細(xì)胞介素-8(IL-8);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);白細(xì)胞介素，和干擾素?？杀唤Y(jié)合到本發(fā)明的傷口敷料內(nèi)的其它藥劑為酸性粘多糖，包括但不限于肝素、^L酸肝素、類肝素、^L酸皮膚素、多碌^酸戊聚醣、纖維素、瓊脂糖、殼多糖、葡聚糖、角叉膠、亞油酸和尿嚢素。抗炎藥和抗血栓形成劑的例子包括endomethycin、肝素、消炎痛、布洛芬、阿司匹林、水楊酸膽i成、二氟尼柳、水楊酸4美、水楊酸膽堿4美、雙水楊酯、氟比洛芬、非諾洛芬、酮洛芬、萘普生、曱氧萘丙酸鈉、奧沙普秦、雙氯酚酸鈉、雙氯酚酸米索前列醇、依托度酸、吲i，朵美辛、酮咯酸、natumetone、舒林酸、托美丁、磺吡酮、雙嘧達(dá)莫、噻氯匹定、伐地考昔、羅非考昔、吡羅昔康、美洛昔康、曱氧胺苯酸鈉、曱芬那酸、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、micromulsion、苯丁酸氮芥、阿那格雷、氯吡格雷和西洛他唑；抗血栓形成劑可為選自下組的抗凝血劑肝素、阿地肝素、依諾肝素、亭扎肝素、達(dá)那肝素、elpiruden和水蛭素。可通過本領(lǐng)域中眾所周知的方法將治療活性劑以物理或化學(xué)方式結(jié)合于本發(fā)明的生物材料。"包含"指包括但不限于，措詞"包含"后面所跟隨的任何事物。因此，使用術(shù)語"包含，，表示列舉的要素是必需的或強(qiáng)制性的，而其它要素是任選的，且可以存在或可以不存在。術(shù)語"由...組成"指包括但限于，短語"由...組成"后面所跟隨的事物。因此短語"由...組成"表示列舉的要素是必需的或強(qiáng)制性的，并且不存在其它要素。"基本由...組成"指包括短語后列舉的任何要素，并限于對列舉的要素沒有干擾或有助于公開中詳明的活性或作用的其它要素。因此，術(shù)語"基本由...組成，，表示列舉的要素是必需的或強(qiáng)制性的，但其它要素是任選的，并可依據(jù)它們是否影響所列舉要素的活性或作用可以存在或不存在?，F(xiàn)在僅通過參考以下非限制性實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是，應(yīng)認(rèn)識到，下面的實施例僅僅是說明性的，不應(yīng)以任何方式一見為對上述發(fā)明一般性的限制。特別地，盡管本發(fā)明詳細(xì)描述有關(guān)來自牛、豬和有袋動物來源的心包膜、帶瓣主動脈根、瓣膜小葉和主動力永壁組織的處理，^旦應(yīng)清楚認(rèn)識到，本文的發(fā)現(xiàn)不限于這些具體的組織或動物來源。實施例1生物材料的基本加工在西澳大利亞通過職業(yè)袋鼠射手收獲來自成年西部灰袋鼠的袋鼠心臟，并在死亡4-6小時內(nèi)在冰袋上運(yùn)送到實驗室。在水冷的0.9%鹽水溶液中洗滌心臟兩次。取下心包膜，并從粘連脂肪和松散結(jié)締組織上仔細(xì)清洗。將帶有主動脈瓣的主動脈根從心臟上切開，并放在包含0.5mM苯基-甲基-磺?；?氟化物(PMSF)的冰冷0.9%鹽水中。將心包膜在包含0.5mMPMSF的冰冷0.9%鹽水中在4。C存放過夜，并將帶瓣主動脈根在包含PMSF的0.9%鹽水溶液中洗滌20分鐘。制備60-80%v/v乙醇的水溶性含醇溶液。將心包膜在fC下存放過夜后浸沒到醇溶液中。將帶瓣主動脈根在水冷0.9%鹽水(包含0.5mMPMSF)中最終洗滌后，立即浸沒在相同的醇溶液中。將心包膜和帶瓣主動脈根在醇溶液中在約5'C保持最少24小時。從醇溶液中取出心包膜和帶瓣主動脈根，并用0.9%鹽水沖洗約10分鐘。在沖洗期間，保持沖洗溶液的溫度在大約10°C。將心包膜和帶瓣主動脈根浸沒在于無菌去離子水中包含9.07g/l磷酸二氫鉀緩沖劑的0.625%戊二醛溶液中。用氫氧化鈉將戊二醛溶液的pH調(diào)節(jié)到7.4。在戊二醛溶液中在l-5。C將心包膜和帶瓣主動脈根固定最少24小時以使組織膠原中存在的蛋白質(zhì)交聯(lián)。從戊二醛溶液中取出心包膜和帶瓣主動脈根，并在無菌0.9%氯化鈉中沖洗約15分鐘。在沖洗期間，保持沖洗溶液的溫度在大約10°C。然后通過兩種交替的過程處理心包膜和帶瓣主動脈才艮。在第一個過程中，將心包膜和帶瓣主動脈根浸沒在每lml去離子水體積包含8mg二羧酸的無緩沖劑的溶液中。用一定體積的稀鹽酸將溶液的pH調(diào)節(jié)到pH4.5。在約45。C的溫度下將心包膜和帶瓣主動脈根在溶液中浸沒約48小時。在第二個過程中，將心包膜和帶瓣主動脈根在包含溶解在去離子水中的多價陽離子如鎂、鐵和鋁鹽的在pH3.5的無緩沖劑的溶液中浸沒大約60分鐘。然后通過將組織浸入在無菌去離子水包含9.07g/l磷酸二氫鉀緩沖劑的0.25%戊二醛溶液中來對生物材料進(jìn)行滅菌。用氫氧化鈉將醛溶液的pH調(diào)節(jié)到7.4。滅菌過程在大約45。C的溫度下進(jìn)行約120分鐘。或者，將生物材料在37。C在包括2wt。/。環(huán)氧丙烷連同20wt。/。乙醇的水溶液中滅菌約24小時。然后將滅菌的組織存放在含0.2%緩沖的戊二醛加15%異丙醇中。實施例2溫度對生物材料的影響變性溫度是交聯(lián)穩(wěn)定性的重要量度，它反映材料強(qiáng)度、耐久性和完整性。從西澳大利亞的當(dāng)?shù)赝涝讏?abattoir)得到牛心包膜，并在冰上運(yùn)送到實驗室。按實施例1所述清洗心包膜。將根據(jù)實施例i所述方法制備的牛心包膜的交聯(lián)程度和在0.625%緩沖的戊二醛中固定的牛心包膜(對照心包膜)進(jìn)行比較。將每組中的代表性心包樣品條(5x10mm)連接到等長測力傳感器(isometricforcetransducer)(MLT0500,ADInstruments,澳大利亞)上，傳感器與PowerLab數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)和臺式個人計算機(jī)連接。用90±5g的負(fù)荷將樣品保持恒定的伸展，并浸沒到開口的控溫的裝有0.9%鹽水的水浴中。以大約1.5°C/min將水浴的溫度從25。C逐漸升高到95°C。當(dāng)膠原材料變性時，在恒定伸展?fàn)顟B(tài)的尖拐點(reflectionpoint)處指示收縮溫度。結(jié)果(以攝氏溫度表示的收縮溫度)總結(jié)在表I中。表I組織類型數(shù)目收縮溫度對照心包膜1084.10士0.17處理的心包膜1085.54±0.15實施例3生物材料的酶法降解將按照實施例1所述方法制備的牛心包膜(處理的心包膜)的抗酶降解水平和在0.625%緩沖的戊二醛中固定的牛心包膜(對照心包膜)進(jìn)行比較。通過在包含0.1M甘氨酸的200mlHEPES緩沖溶液(O.OIM，pH7.4)中溶解100mg鏈霉蛋白酶(灰色鏈霉菌(5^eptomycasgn'"w力)和lOOmg氯化鈣來制備鏈霉蛋白酶溶液。將固定的組織樣品在去離子水中沖洗3分鐘，進(jìn)行印跡，在7(TC下干燥過夜并稱重。將這些樣品在50。C的鏈霉蛋白酶溶液中溫育24小時。將剩余的組織樣品在去離子水中沖洗，在7(TC下干燥過夜并稱重。通過剩余組織的質(zhì)量確定對鏈霉蛋白酶消化的抗性，表示為消化前(pre-digested)組織質(zhì)量的百分比。結(jié)果總結(jié)在表II中。表II組織類型數(shù)目剩余組織％對照心包膜1081.98±1.97處理的心包膜1089.13±0.39實施例4生物才才津+的j立伸強(qiáng)度(tensilestrength)拉伸強(qiáng)度為材料強(qiáng)度的重要量度，反映交聯(lián)組織的耐久性。將按照實施例1所述方法制備的牛心包膜(處理的心包膜)的拉伸強(qiáng)度和在0.625%緩沖的戊二醛中固定的牛心包膜(對照心包膜)進(jìn)行比較。用裝備有10千牛頓測力傳感器(load-cell)的液壓Zwick/Roe11(2010型)拉伸試驗機(jī)在50mm/min的恒定拉伸速度下測量兩組組織的代表性心包條(8x80mm)的拉伸強(qiáng)度。由記錄的負(fù)荷/伸長率(load/elongation)曲線評價拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率(elongationatbreak)。結(jié)果總結(jié)在表III中。表m_組織類型承幾拉伸強(qiáng)度(N/mm2)伸長率對照心包膜1036.59±1.3314.18±1.67處理的心包膜1071.82±3.3315.99±0.61實施例5生物才才4牛的鉤<匕曲線(calcificationprofile)在小動物和大動物模型中進(jìn)行實驗研究以評價上述方法對減輕處理的含膠原生物材料鈣化的效力(effectiveness)。在第一個動物研究中，將通過僅在0.625%緩沖的戊二醛中標(biāo)準(zhǔn)固定而制備的袋鼠瓣膜小葉和袋鼠主動脈壁組織(未處理組織)和根據(jù)實施例1中所述方法處理的袋鼠瓣膜小葉和袋鼠主動脈壁組織(處理過的組織)進(jìn)行比較。將兩組的主動脈壁組織樣品(10x5mm大小)和主動脈瓣膜小葉在0.9%鹽水中沖洗5分鐘。在生長的(6周齡)雄性Wistar大鼠的中央背壁區(qū)域(centraldorsalwallarea)中產(chǎn)生的皮下袋(subcutaneouspocket)中通過手術(shù)植入沖洗的組織(每個大鼠每組一個樣品)。60天后，將外植的組織從周圍的宿主組織中剖出，并在Biotherm溫育器(SelbyScientific,Perth,WA)中在9(TC干燥48小時。稱量干燥的樣品，在75。C的5.0ml6N超純鹽酸(Merck，Perth,WA)中提取4丐含量24小時。然后使用原子吸收分光光度計(VarianAA1275)測量可提取的鈣含量，并表示為昭鈣/mg組織(干重)。這些數(shù)據(jù)總結(jié)在表IV中。表IV<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>減輕鈣化的新方法的效力在表IV中是顯而易見的。處理過的組織中的4丐水平可與正常存在于未固定組織中的水平相比較，由此表明新方法與僅僅標(biāo)準(zhǔn)戊二醛固定相比具有優(yōu)越性。實施例6在羊(sheep)中的進(jìn)一步鈣化研究在另一動物研究中，將根據(jù)實施例1中所述在0.625%緩沖的戊二醛中固定的袋鼠帶瓣主動脈管道(處理過的組織)和實施例1中4是取的帶瓣主動脈根(未處理的組織)進(jìn)行比較。將主動脈根在0.9%鹽水中沖洗5分鐘，并通過手術(shù)植入到幼年(4月齡)Merino-Dorset雜交羊的肺動脈位置處。200天后取出這些帶瓣的植入物，并如上所述通過原子吸收分光光度法測定瓣膜小葉和主動脈壁組織的4丐含量。結(jié)果(|ig鈣/mg干組織)總結(jié)在表V中。表V<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例7利用得自豬的組織的進(jìn)一步鈣化研究在另一動物研究中，將在緩沖的0.625%戊二醛中固定的未處理的豬主動脈帶瓣管道(未處理的組織)和按照實施例1中所述方法制備的豬帶瓣管道(處理的組織)進(jìn)行比較。將豬帶瓣管道在0.9%鹽水中沖洗5分鐘，并通過手術(shù)植入到幼年(4月齡)Merino-Dorset雜交羊的肺動脈位置處。200天后取出這些帶瓣的植入物，并如上文所述通過原子吸收分光光度法測定瓣膜小葉和主動脈壁組織的4丐含量。結(jié)果(嗎釣/mg干組織)總結(jié)在表VI中。表VI<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例8牛心包膜的鈣化在另一動物研究中，將在0.625%緩沖的戊二醛中固定的牛心包膜(對照心包膜)的鈣化潛力(calcificationpotential)與按照實施例1所述方法制備的牛心包膜(處理的心包膜)的鈣化潛力進(jìn)行比較。將每組的代表性樣品修剪至lxlcm大小，并在0.9%鹽水中沖洗5分鐘。在生長的(6周齡)雄性Wistar大鼠的中央背壁區(qū)域中產(chǎn)生的皮下袋中通過手術(shù)植入這些樣品。60天后，取出這些組織，除去宿主組織，并通過原子吸收分光光度法測定鈣含量。結(jié)果(昭鈣/mg干組織)總結(jié)在表VII中。表vn<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例9去細(xì)胞化的〖decellularized)袋鼠心包膜的4丐化在另一動物研究中，將在0.625%緩沖的戊二醛中固定的袋鼠心包膜(對照心包膜)的鈣化潛力與已經(jīng)去細(xì)胞并按照實施例1所述方法制備的袋鼠心包膜(處理的心包膜)的鈣化潛力進(jìn)行比較。將每組的代表性樣品修剪至lxlcm大小，并在0.9%鹽水中沖洗5分鐘。在生長的(6周齡)雄性Wistar大鼠的中腹部背壁區(qū)域中產(chǎn)生的皮下袋中通過手術(shù)4直入這些樣品。60天后，取出這些組織，除去宿主組織，并通過標(biāo)準(zhǔn)步驟利用原子吸收分光光度法測定鈣含量。結(jié)果(嗎4丐/mg干組織)總結(jié)在表VIII中。表vin組織類型數(shù)目鈣含量對照心包膜2.440±0.600處理的心包膜70.406±0.029實施例10去細(xì)胞化的袋鼠心包膜的重新細(xì)胞化(recellularization)在第六個動物研究中，將在0.625%緩沖的戊二醛中固定的去細(xì)胞化的袋鼠心包膜(對照心包膜)的重新細(xì)胞化潛力和按照實施例1中所述方法制備的去細(xì)胞化的袋鼠心包膜(處理的心包膜)的重新細(xì)胞化潛力進(jìn)行比較。將袋鼠心包膜在0.25%Tritonx-100和0.25%十二烷基硫酸鈉中在室溫下脫細(xì)胞24小時，并在培養(yǎng)基中沖洗20分鐘。將每組心包膜的代表性樣品(n=5)修剪至2x2cm大小，并在0.9%鹽水中沖洗5分鐘。在無菌條件下用/人人隱靜脈(saphenousvein)收獲的3.0x105人成纖維細(xì)胞/cm2接種這些樣品。在37。C在標(biāo)準(zhǔn)靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)條件下將接種的心包膜培育21天。每7天用顯微鏡評價細(xì)胞生長，并按照下面的視覺等級分類1)基質(zhì)表面上不存在活的成纖維細(xì)胞；2)小于50%的基質(zhì)表面被成纖維細(xì)胞覆蓋(+);3)超過50%的基質(zhì)表面被成纖維細(xì)胞覆蓋(++);4)基質(zhì)被多層成纖維細(xì)胞完全覆蓋(+++)。在21天時利用快速比色分析MTT(3-[4，5-二曱基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四p坐;臭(3隱[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltertra陽zoliumbromide"式馬全確認(rèn)在對照心包膜上不存在活的成纖維細(xì)胞而在處理過的心包膜上存在活的成纖維細(xì)胞(對于MTT方法，參見例如，Zund等，1999，五wr/Cara^f/zoracSw^.,5(4):519-24)。結(jié)杲總結(jié)在表IX中。表IX_<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例11袋鼠組織的交聯(lián)穩(wěn)定性使用實施例1中直到并包括步驟(b)所列出的過程，即醇溶液預(yù)處理然后戊二醛交聯(lián)來處理兩類袋鼠組織一主動脈壁組織和袋鼠心包膜。然后將這些處理過的組織與戊二醛固定的組織即沒有醇預(yù)處理的和"新鮮"的組織進(jìn)行比較。圖1和圖2顯示了心包膜(圖l)和主動脈壁組織(圖2)的交聯(lián)穩(wěn)定性?？梢钥闯?，利用乙醇的預(yù)處理對于在85。C-86。C的交聯(lián)穩(wěn)定性有明顯影這些數(shù)據(jù)還可在表x中看到。表x交聯(lián)穩(wěn)定性一袋鼠心包膜收縮溫度(。C):n=5新鮮的66.55±1.200戊二醛固定的80.74±1.047醇+戊二醛固定84.62士0.465P=0.016(戊二醛固定相對于醇+戊二醛固定)交聯(lián)穩(wěn)定性一袋鼠DESC主動脈壁收縮溫度(。C):n=5新鮮的65.00±1.423戊二醛固定的80.11±1.281醇+戊二醛固定86.21±0.449P=0.002(戊二醛固定相對于醇+戊二醛固定)實施例12皮下大鼠模型中的交聯(lián)穩(wěn)定性和鈣化行為這個研究旨在比較用實施例1公開的方法處理的豬組織(前尖(cusp)和壁)與戊二醛固定的組織對照物和商業(yè)制備的？^631乂^@和？1^11^1113@生物修復(fù)組織相比的交聯(lián)穩(wěn)定性和鈣化行為。收獲新鮮的豬帶瓣主動脈根并在4。C在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS;O.IM，pH7.4)中運(yùn)送。從主動脈根取下代表性主動脈瓣前尖(11=30)和主動脈壁樣品(n=30;10mmxl5mm)并分成兩組。組I包括存放在0.25%緩沖的戊二酪中的瓣前尖(11=15)和代表性主動脈壁樣品(11=15;10mmxl5mm)。組II包括暴露于實施例1公開的方法并存放在0.25%緩沖的戊二醛中的瓣前尖(>1=15)和代表性主動脈壁樣品(11=15;10mmxl5mm)。為了比較，第三組(III)由來自Freestyle②生物修復(fù)物的瓣前尖(11=10)和主動脈壁樣品(n=10;10mmx15mm)組成，而組IV由來自？1111^1113@生物修復(fù)物的瓣前尖(11=10)和主動脈壁組織(n二10;10mmxl5mm)組成。收縮溫度測量用于評價組織的膠原交聯(lián)的穩(wěn)定性(Levy等，1986，乂尸af/zo/.,122:71-82)。將每組中的前尖和主動脈壁樣品組織條(5xl0mm;n二10)連接到等長測力傳感器(MLT0500,ADInstruments，澳大利亞)上，傳感器與PowerLab數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)和臺式個人計算機(jī)連接。用90±5g的負(fù)荷將樣品保持恒定伸展，并浸沒到開口的控溫的裝有0.9。/。鹽水的水浴中。以大約1.5°C/min逐漸將水浴的溫度/人25。C升高到95°C。當(dāng)膠原材料變性時，恒定伸展中的尖拐點指示收縮溫度。瓣前尖和主動脈壁組織的收縮溫度列在表XI中。在對照、實施例1的試驗過程("試驗")、？化631^6@和Prima11^@前尖之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。與對照、？^651^6@和Prima11^@壁組織相比，試-險過程-處理的主動力永壁組織表現(xiàn)出顯著(p<0.05)較高的收縮溫度。表XI瓣前尖和主動脈壁組織的收縮溫度(°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>(『10/組)值為平均值iSE。*p<0.05(試驗相對于對照、F訓(xùn)tyle、PrimaPlus)。對于蛋白水解酶消化的抗性基于Girardot&Girardot的方法(■/i/eflrf&/ve1996，122:71-82)。通過在包含0.1M甘氨酸的200mlHEPES緩沖溶液(O.OIM,pH7.4)中溶解lOmg鏈霉蛋白酶E(來自灰色鏈霉菌的XIV型；Sigma)和lOOmg氯化鈣來制備鏈霉蛋白酶溶液。將固定的組織樣品在去離子水中沖洗3分鐘，進(jìn)行印跡，在7(TC下干燥過夜并稱重。然后在50°C的鏈霉蛋白酶溶液中將這些樣品培育24小時。將剩余的組織樣品在去離子水中沖洗，在7(TC下干燥過夜并稱重。通過剩余組織的質(zhì)量確定對于鏈霉蛋白酶消化的抗性，表示為消化前組織質(zhì)量的百分比。對酶降解的抗性在圖3中圖示。與對照相比，試—瞼過^f呈、？^631^6@和PrimaPlus前尖組織顯示對蛋白水解消化的抗性顯著(p<0.0001)增加(圖3A)。在試驗過程、？化631^6@和Prima1113@前尖組織之間沒有觀察到顯著差異試驗過程-處理的主動脈壁組織顯示與對照組織相同的對蛋白水解消化的抗性(p=NS),和比Freestyle和Prima1115@壁組織顯著^<0.01)較高的抗性(圖3B)。將年幼雄性Wistar大鼠(體重150-200g)分成兩組；一組(n=10)接受前尖植入物，第二組(n=10)接受主動脈壁植入物。每個動物都4妻受四組組織中每組的一個樣品，總計80個才直入物。用戊巴比妥(pentobarbital)(Nembutal;45mg/kg,腹膜內(nèi))麻醉大鼠。刮凈背肌區(qū)域，并用15。/。稀釋的葡萄糖酸洗必泰(chlorhexidinegluconate)(ICIPharmaceuticals,Perth,WA)和乙酉孚(MerckChemicals,Perth,WA)消毒。將植入物在去離子水中充分沖洗2分鐘以消除殘余固定劑，然后通過背肌壁內(nèi)的2.5cm切口植入到皮下袋(subcutaneouspouches)內(nèi)。用5-0聚丙烯紡織纖維lt合線(Prolenesuture)封閉切口。8周后用過劑量的巴比妥酸鹽(barbiturate)(￡11化6皿56@)宰殺大鼠，取出包含皮下植入物的背肌壁用于定量和定性組織鈣分析。將每個收回的樣品分成兩個解剖學(xué)上對稱的二等份(halve)。一半用于原子吸收分光光度法分析，另一半被固定在10%緩沖的曱醛中并進(jìn)行處理用于組織學(xué)分析(histology)。將固定樣品嵌入石蠟中，在3pm處切開，并用VonKossa染色劑處理用于定性鈣分析。使用OlympusBHS光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)檢查。將來自所有組的外植組織樣品剖離而不含周圍的宿主組織，在Biotherm培育器(SelbyScientific,Perth,WA)中在90。C干燥48小時。稱量干燥的樣品，在75。C在5.0ml6N超純鹽酸(Merck,Perth,WA)中提取鈣含量24小時。然后使用原子吸收分光光度計(VarianAA1275)測量可提取的鈣含量，并表示為(ig鈣/mg組織(干重)。組織學(xué)檢查表明在外植的對照前尖樣品中存在嚴(yán)重的內(nèi)源性鈣化(數(shù)據(jù)未示出)。在ADAPT、Freestyle或PrimaPlus瓣前尖中沒有表現(xiàn)出可見的4丐化(數(shù)據(jù)未示出)。在對照樣品中外植的主動脈壁組織顯示介質(zhì)的幾種鈣化(數(shù)據(jù)未示出)。在外植的試驗主動脈壁組織中沒有表現(xiàn)出可見的4丐化(數(shù)據(jù)未示出)。在外植的Freestyle(數(shù)據(jù)未示出)和PrimaPlus(數(shù)據(jù)未示出)主動脈壁組織中表現(xiàn)出介質(zhì)的中度鈣化。外植的前尖的定量組織鈣水平在圖4A中圖示。僅僅在戊二醛中固定的對照樣品在這種模型中顯示出最高的鈣水平(92.37士7.9昭/mg)。通過用實施例1的方法處理的組織的4丐水平為2.09±0.22)ig/mg組織，而Freestyle⑧為2.03±0.29|xg/mg和PrimaPlus⑧為1.54±0.17(ig/mg。這意味著經(jīng)過處理的前尖與對照樣品相比顯著降低了鈣水平(p〈0.001)。在八周后的實施例1、Freestyle⑧和Prima11^@前尖的組織鈣水平之間沒有顯著的差異。外植的主動脈壁樣品的定量組織鈣水平在圖4B中圖示。實施例1處理的主動脈壁樣品的鈣含量(4.86士0.12嗎/mg組織)比對照樣品的鈣含量(120.11士7.48|ig/mg組織)顯著(p0.001)降低(95.9o/o)。Freestyle⑧和PrimaPlus主動脈壁樣品分別表現(xiàn)出47.8%和51.95%的鈣化降低。這些數(shù)據(jù)表明，實施例1中公開的方法在減少皮下大鼠模型中豬前尖和壁組織兩者中的4丐化方面是有效的。這些數(shù)據(jù)還表明，增強(qiáng)的交聯(lián)在減少主動脈壁4丐化方面起了重要作用。權(quán)利要求1.一種制造可植入生物材料的方法，其包括(a)將生物材料暴露于含醇溶液中至少24小時。2.3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，還包括如下步驟(b)將步驟(a)中的所述材料暴露于交聯(lián)劑；和(c)將步驟(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；其中步驟(b)和(c)與步驟(a)是連續(xù)的。4.一種制造可植入生物材料的方法，其包括(a)暴露生物材料到含醇溶液；(b)將步驟(a)中的所述材料暴露于交聯(lián)劑；和(c)將步驟(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；其中步驟(b)和(c)與步驟(a)是連續(xù)的。(a)暴露生物材料到含醇溶液；(b)將步驟(a)中的所述材料暴露于交聯(lián)劑；和(c)將步驟(b)中的所述材料暴露于酸性溶液；其中步驟(b)和(c)與步驟(a)是連續(xù)的。5.6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任何一項的方法，在步驟(a)和(b)之間和/或步驟(b)和(c)之間還包括沖洗步驟。7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任何一項的方法，還包括在步驟(c)后的沖洗步驟。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中沖洗生物材料的步驟是使用不含磷酸鹽的0.9%鹽水溶液進(jìn)行的。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項的方法，其中生物材料包括膠原。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項的方法，其中生物材料是從動物分離的。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中動物選自綿羊、牛、山羊、馬、豬、有袋動物和人。12.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項的方法，其中生物材料為培養(yǎng)的組織、包含從動物得到的細(xì)胞外基質(zhì)的假體或再生的組織。13.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項的方法，其中生物材料為選自以下的細(xì)胞組織心血管組織、骨盆底組織、心臟組織、心瓣膜、主動爿永才艮、主動脈壁、主動脈小葉、心包組織、結(jié)締組織、軟或?qū)嵸|(zhì)器官的基質(zhì)、硬膜、皮膚組織、血管組織、硬膜、軟骨組織、心包膜、韌帶、腱、血管、臍帶組織、骨組織、筋膜和粘膜下組織或皮膚。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何一項的方法，其中步驟(a)中使用的含醇溶液包括一種或多種水溶性醇。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中水溶性醇為CrQs低級醇。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中C,-C6低級醇選自曱醇、乙醇、環(huán)己醇、異丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、異丁醇、仲丁醇和叔丁醇或它們的組合。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任何一項的方法，其中含醇溶液在非緩沖含水溶劑中包括小于100%的醇。18.根據(jù)權(quán)利要求3-17中任何一項的方法，其中進(jìn)行步驟(a)至少24小時。19.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任何一項的方法，其中進(jìn)行步驟(a)至少36小時。20.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任何一項的方法，其中進(jìn)行步驟(a)至少48小時。21.根據(jù)權(quán)利要求3-20中任何一項的方法，其中交聯(lián)劑選自碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯石風(fēng)(DVS)、京尼平、多醛和疊氮化磷酸二苯酯(DPPA)或它們的組合。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中多醛為戊二醛。23.根據(jù)權(quán)利要求3-22中任何一項的方法，還包括在步驟(c)后的滅菌步驟。24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任何一項的方法，其中在2。C和40。C之間的溫度下進(jìn)行每個步驟。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中溫度在4。C和30。C之間。26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中溫度在5。C和25。C之間。27.根據(jù)權(quán)利要求3-26中任何一項的方法，其中酸性溶液包含能滅活和/或改變步驟(b)后生物材料中存在的固定和/或非固定交聯(lián)劑部分的酸。28.根據(jù)權(quán)利要求3-26中任何一項的方法，其中酸性溶液包含能使膠原上的活性羧基和胺基交聯(lián)形成酰胺鍵的酸。29.根據(jù)權(quán)利要求3-28中任何一項的方法，其中步驟(c)中使用的酸性溶液包含氨基羧酸。30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中氨基羧酸選自L-組氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸和L-天冬氨酸。31.根據(jù)權(quán)利要求1-30中任何一項的方法，其中含醇溶液、交聯(lián)劑和酸性溶液都是不含緩沖劑的。32.根據(jù)權(quán)利要求3-31中任何一項的方法，其中步驟(c)被步驟(d)替換或被步驟(d)補(bǔ)充，所述步驟(d)包括將步驟(b)中的所述材料暴露于包含一種或多種多價陽離子的無緩沖劑的溶液。33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中多價陽離子選自鎂、鐵和鋁鹽。34.通過根據(jù)權(quán)利要求1-33中任何一項的方法制造的抗鈣化生物材料。35.—種抗輛化生物材料，其包括交聯(lián)的膠原，其中所述生物材料的鈣含量小于約50嗎/mg生物材料，和其中所述生物材料能被植入至少200天而該生物材料不會增加其鈣含量超過50嗎/mg生物材料。36.根據(jù)權(quán)利要求35的抗鈣化生物材料，其中植入前的所述生物材料的鈣含量小于約20叱/mg生物材料。37.根據(jù)權(quán)利要求35的抗鉤化生物材料，其中植入前的所述生物材料的鈣含量小于約10嗎/mg生物材料。38.—種可植入生物裝置，其包括根據(jù)權(quán)利要求34-37中任何一項的抗釣化生物材料。39.根據(jù)權(quán)利要求38的裝置，其中所述生物材料被涂布到所述裝置的表面上。40.根據(jù)權(quán)利要求38或權(quán)利要求39的裝置，還包括至少第二涂層。41.根據(jù)權(quán)利要求40的裝置，其中所述至少第二涂層包括抗微生物劑、抗病毒劑、抗真菌劑、生長因子、抗脫水劑或防腐劑。42.根據(jù)權(quán)利要求41的裝置，其中抗微生物劑選自異煙肼、乙胺丁醇、吡。秦酰胺、鏈霉素、氯法齊明、利福布汀、氟喹諾酮、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯砜、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、氨節(jié)西林、兩性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧咬、磺胺嘧。定、克林霉素、林可霉素、戊烷脒、阿托伐醌、巴龍霉素、diclazaril、無環(huán)鳥苷、三氟尿苷、膦曱酸、青霉素、慶大霉素、更昔洛韋、iatroconazole、咪康唑、吡石克鋅、重金屬包括但不限于金、鉑、《艮、鋅和銅、以及它們的組合形式，包括鹽，如氯化物、溴化物、^典化物和高碘酸鹽，以及與載體的復(fù)合物，和其它形式。43.根據(jù)權(quán)利要求41的裝置，其中生長因子劑選自羥基磷灰石、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子UFGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素-樣生長因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、肺瘤血管生成因子(TAF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、轉(zhuǎn)化生長因子a和p(TGF-a和TGF-卩)、白細(xì)胞介素-8(IL-8);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);白細(xì)胞介素，和干擾素。44.根據(jù)權(quán)利要求40的裝置，其中所述至少第二涂層還包括選自以下的生物可吸收材料聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，聚二氧雜環(huán)己酮，聚己內(nèi)酯，多肽，聚碳酸酯，聚羥基丁酸酯，聚(亞烷基草酸酯)，醋酸乙烯酯與不飽和羧酸的共聚物，水溶性或可分散性纖維素衍生物，氧化乙烯聚合物，聚丙烯酰胺，膠原，明膠，聚(原酸酯)，氨基酸的聚酰胺，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚醚醚酮，磷酸三鈣，和它們的混合物。45.根據(jù)權(quán)利要求38-44中任何一項的裝置，其中所述裝置選自人造心臟、內(nèi)部或外部心臟輔助裝置、心瓣膜假體、瓣環(huán)、皮膚移植物、血管移植物、血管支撐架、結(jié)構(gòu)支撐架、血管分流器、心臟血管分流器、硬膜移植物、軟骨移植物、軟骨植入物、心包膜移植物、韌帶假體、腱假體、膀胱假體、小拭子、縫合線、永久留置經(jīng)皮裝置、外科補(bǔ)片、心血管支撐架、涂層支撐架和涂層導(dǎo)管。46.根據(jù)權(quán)利要求45的裝置，其中裝置為心瓣膜假體。47.根據(jù)權(quán)利要求38-46中任何一項的裝置，其中裝置還包括組織碎片。48.根據(jù)權(quán)利要求47的裝置，其中組織碎片是從動物收獲的。49.根據(jù)權(quán)利要求48的裝置，其中動物選自人、牛、豬、狗、鹿和袋鼠。50.根據(jù)權(quán)利要求38-49中任何一項的裝置，其中裝置還包括組織的合成類似物。51.根據(jù)權(quán)利要求48-50中任何一項的裝置，其中組織碎片包括大量細(xì)胞，當(dāng)在手術(shù)部位植入時，大量細(xì)胞中的至少一部分能遷移出組織^年片，增殖并在植入部位處與周圍組織結(jié)合。52.—種生物相容植入物，包括生物相容的支架，該支架包括含有交聯(lián)膠原的抗釣化生物材料，其中所述生物材料的鈣含量小于約50昭/mg生物材料，和其中所述生物材料能被植入至少200天而生物材料不會增加其4丐含量超過50|ig/mg生物材料。53.根據(jù)權(quán)利要求52的生物相容植入物，其中植入前的所述生物材料的鈣含量小于約20嗎/mg生物材料。54.根據(jù)權(quán)利要求52的生物相容植入物，其中植入前的所述生物材料的鈣含量小于約10嗎/mg生物材料。55.—種生物相容植入物，包括生物相容的支架，該支架包括含有交聯(lián)膠原的抗鈣化生物材料，其中所述膠原包括仲胺。56.根據(jù)權(quán)利要求55的植入物，其中支架還包括合成聚合物、天然聚合物、可注射凝膠、陶瓷材料、同體組織、同種異體組織、異種組織和它們的組合。57.—種用于修復(fù)組織損傷的試劑盒，包括(a)具有一種或多種根據(jù)權(quán)利要求38-51中任何一項的裝置或根據(jù)權(quán)利要求52-56中任何一項的植入物的無菌容器；和(b)針對損傷受試者的說明書。58.根據(jù)權(quán)利要求57的試劑盒，還包括(c)用于從損傷受試者收集至少一種活組織樣品的收獲工具。59.根據(jù)權(quán)利要求58的試劑盒，還包括至少一種用于維持至少一種組織樣品生存力的試劑。60.權(quán)利要求58的試劑盒，其中收獲工具還包括用于將組織樣品在無菌條件下分成至少一個組織碎片的加工工具。61.—種處理活組織的方法，包括(a)提供根據(jù)權(quán)利要求34的抗鈣化生物材料；和(b)在需要處理的受試者中植入生物材料。62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中將所述抗鈣化生物材料結(jié)合到醫(yī)療裝置內(nèi)部或上面。63.根據(jù)權(quán)利要求61或權(quán)利要求62的方法，還包括在正被處理的受試者內(nèi)部的所需位置上固定抗鈣化生物材料的步驟。64.根據(jù)權(quán)利要求61-63中任何一項的方法，其中處理組織的方法為選自以下的組織處理方法組織^修復(fù)、組織填充、美容處理、治療處理、纟且織增大和纟且織封口。65.—種傷口敷料，其包括含有交聯(lián)膠原的抗鈣化生物材料，其中所述膠原包括仲胺。66.根據(jù)權(quán)利要求65的傷口敷料，其中將所述抗鈣化生物材料在交聯(lián)前暴露于醇。67.根據(jù)權(quán)利要求66的傷口敷料，其中所述醇為Q-C6低級醇。68.根據(jù)權(quán)利要求67的傷口敷料，其中d-C6低級醇選自曱醇、乙醇、環(huán)己醇、異丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、異丁醇、仲丁醇和叔丁醇。69.根據(jù)權(quán)利要求65-68中任何一項的傷口敷料，其中交聯(lián)劑選自碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平、多醛和疊氮化磷酸二苯酯(DPPA)。70.根據(jù)權(quán)利要求69的傷口敷料，其中多醛為戊二醛。71.根據(jù)權(quán)利要求65-70中任何一項的傷口敷料，其中生物材料選自綿羊膠原、牛膠原、山羊膠原、馬膠原、豬膠原、有袋動物膠原和人膠原。72.根據(jù)權(quán)利要求71的傷口敷料，還包括選自以下的硫酸化多糖肝素、硫酸軟骨素、硫酸葡聚糖、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素、硫酸己糖醛酸基己糖氨基聚糖、六硫酸肌醇和八硫酸蔗糖。73.根據(jù)權(quán)利要求65-72中任何一項的傷口敷料，還包括抗微生物劑、抗病毒劑、抗真菌劑、生長因子、抗脫水劑或防腐劑。74.根據(jù)權(quán)利要求73的傷口敷料，其中抗^f敖生物劑選自異煙肼、乙胺丁醇、吡溱酰胺、鏈霉素、氯法齊明、利福布汀、氟喹諾酮、氧氟沙星、司帕沙星、利福平、阿奇霉素、克拉霉素、氨苯^U四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、氨芐西林、兩性霉素B、酮康唑、氟康唑、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、林可霉素、戊烷脒、阿托伐醌、巴龍霉素、diclazaril、無環(huán)鳥苷、三氟尿苷、膦曱酸、青霉素、慶大霉素、更昔洛韋、iatroconazole、咪康唑、吡硫鋅、重金屬包括但不限于金、鉬、銀、鋅和銅、以及它們的組合形式，包括鹽，如氯化物、溴化物、碘化物和高碘酸鹽，以及與載體的復(fù)合物，和其它形式。75.根據(jù)權(quán)利要求73的傷口敷料，其中生長因子劑選自堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素-樣生長因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、腫瘤血管生成因子(TAF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、轉(zhuǎn)化生長因子a和卩(TGF-a和TGF-(3)、白細(xì)胞介素-8(IL-8);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);白細(xì)月包介素，和干擾素。76.—種抗4丐化生物材料，包括交聯(lián)的膠原，其中所述交聯(lián)的膠原包括仲胺。77.根據(jù)權(quán)利要求76的抗4丐化生物材料，其中生物材料包括至少50%的膠原。78.根據(jù)權(quán)利要求77的抗釣化生物材料，其中生物材料包括至少70%的膠原。79.根據(jù)權(quán)利要求78的抗鈣化生物材料，其中生物材料包括至少90%的膠原。80.根據(jù)權(quán)利要求79的抗釣化生物材料，其中生物材料基本由膠原組成。全文摘要本發(fā)明涉及可植入生物材料和制造它的方法。具體地，本發(fā)明涉及制造可植入生物材料的方法，該方法包括(a)將生物材料暴露于含醇溶液至少24小時。文檔編號A61L27/38GK101128225SQ200580048694公開日2008年2月20日申請日期2005年12月20日優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日發(fā)明者威廉·M·L·尼西林,安德魯·J·霍奇申請人:塞爾克斯塞爾有限公司