專利名稱：一種海洋珍珠貝氨基甙及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的氨基甙，具體來說是涉及一種以海洋珍珠貝為原料得到的氨基甙，另外還涉及這種氨基甙的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
氨基甙是由氨基酸分子和糖元部分組成的一類化合物。氨基甙被廣泛用于抗生素、抗菌素、抗癌藥、保健品中。目前為止人們主要是以動物、植物、真菌、細(xì)菌為原料，并采用特定的酶將原料水解，從而得到氨基甙。但是至今為止還沒有從海洋珍珠貝中制得氨基甙的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于以海洋珍珠貝為原料，得到一種新的氨基甙。另一目的是開發(fā)出這種氨基甙的制備方法。又一目的是開發(fā)出這種氨基甙的應(yīng)用。
本發(fā)明以海洋珍珠貝為原料，通過超聲波或液氮破細(xì)胞膜，酸解，仿胃液酶解，仿腸液酶解，溶劑萃取，離心分離等步驟，得到了一種相對分子質(zhì)量范圍為1300～33000的氨基甙，這種氨基甙具有抗病毒、抗動脈粥樣硬化的作用，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的海洋珍珠貝氨基甙，其特征是其相對分子質(zhì)量范圍為1300～33000，并由下述的重復(fù)結(jié)構(gòu)片段構(gòu)成，所述的重復(fù)結(jié)構(gòu)片段由氨基酸序列為—GASRERCAKLSG—的小肽和硫酸軟骨素B組成，其中硫酸軟骨素B與氨基酸序列中的谷氨酸聯(lián)結(jié)。
所述的硫酸軟骨素B的結(jié)構(gòu)見式(1)。
式(1)本發(fā)明的海洋珍珠貝氨基甙的制備方法，其特征是包括以下的步驟(1)將海洋珍珠貝粉碎后，破細(xì)胞膜，加入氟汰酸或乳酸，調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.5，混合均勻后得酸解液；(2)酸解液經(jīng)過仿胃液酶解，再經(jīng)仿腸液酶解后，冷凍干燥得到可溶性粉末；
(3)將步驟(2)得到的粉末用水溶解，加入乙醇至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達55％～60％，然后取上清液，向上清液中加入乙醇至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達70％～75％，離心分離，取沉淀部分冷凍干燥得到產(chǎn)物。
步驟(1)所述的破細(xì)胞膜可以采用現(xiàn)有技術(shù)，例如采用超聲波或液氮，超聲波的頻率是22～24KHz，步驟(2)所述的仿胃液酶解，是在每1000mL步驟(1)得到的酸解液中加入2.8～3.5g木瓜蛋白酶，然后調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.5，酶解溫度是45～50℃，酶解時間是6～8h。所述的仿腸液酶解是把胰蛋白酶，磷酸二氫鉀，氯化鉀，?；悄懰徕c和磷酯酸膽堿與步驟(2)仿胃液酶解后的液體混合，使其中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％～5％的胰蛋白酶，0.025～0.032mol/L磷酸二氫鉀，0.01～0.03mol/L氯化鉀，4～6mmol/L牛磺膽酸鈉，1～2mmol/L磷酯酸膽堿；調(diào)節(jié)溶液的pH值到8.0～8.5，酶解溫度是45～50℃，酶解時間是2～4h。
步驟(3)所述的離心分離為4000～6000r/min。
將上述制備方法得到的產(chǎn)物進行分子質(zhì)量測定，利用高效液相凝膠滲透色譜法，以標(biāo)準(zhǔn)肽和硫酸軟骨素為標(biāo)準(zhǔn)品。測試條件Waters Ultrahydrogel型凝膠柱，流動相0.1mol/LNaNO3。得出的相對分子質(zhì)量分布范圍為1324～32060。
本發(fā)明的的海洋珍珠貝氨基甙的小肽的氨基酸序列測定將衍生化的小肽溶于0.1％TFA(三氟乙酸)中，以CCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)為基質(zhì)。結(jié)晶后，采用脈沖氮激光(337nm)作為離子解析電離源，以線性—延時引出模式，在BruckerBiflex III型MALDI-TOF質(zhì)譜儀上進行分析，結(jié)果顯示本產(chǎn)物的純度完全滿足測序要求。然后在Applied Biosystems Procise model 491N-端氨基酸測序儀上進行序列分析，循環(huán)終止于第12個氨基酸殘基，并且小肽的氨基酸序列為GASRERCAKLSG。根據(jù)測序結(jié)果，計算小肽的分子質(zhì)量為1432.56u。
本發(fā)明的的海洋珍珠貝氨基甙的糖基的結(jié)構(gòu)分析紅外光譜測定取1mg本發(fā)明產(chǎn)物，采用溴化鉀壓片法進行紅外光譜測定。在1738.6cm-1處有一個強吸收峰，是羰基的伸縮振動，表明含有糖醛酸結(jié)構(gòu)。
全水解及GC分析取6mg本發(fā)明產(chǎn)物，放入試管中，加入4mL的TFA(三氟乙酸)，用酒精噴燈高溫封管。在110℃水解2小時，在40℃以下減壓除去TFA，然后加入5mL甲醇蒸干，重復(fù)三次，盡量除去殘留TFA。加入1mL水溶解得到的產(chǎn)物，用纖維素板層析。將薄層層析分析后溶出得到的樣品加水至3mL，加入10mg的NaBH4在室溫下還原2小時后用冰醋酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至4～5之間，減壓蒸干，重復(fù)三次，保證還原完全，真空干燥徹底除去水分得到固體粉末，然后加入2mL醋酐密封，在水浴中加熱反應(yīng)2小時，減壓出去過量的醋酐，加入1mL的甲苯，蒸干，重復(fù)操作三次。將乙?；蟮漠a(chǎn)物用氯仿5mL溶解，加入5mL水，洗滌三次，將氯仿層干燥后濃縮，進行GC分析。GC分析證明，本發(fā)明的的海洋珍珠貝氨基甙中含有氨基半乳糖。
TLC分析證明樣品含有糖醛酸，因此進行糖醛酸的還原反應(yīng)。取薄層層析分析后得到的樣品2mg進行糖殘基組成的GC分析，證明為艾杜糖醛酸。
因此本發(fā)明的的海洋珍珠貝氨基甙的糖元的片段為艾杜糖醛酸與乙酰氨基半乳糖，即硫酸軟骨素B。
本發(fā)明的海洋珍珠貝氨基甙具有抗病毒和抗動脈粥樣硬化的作用，因此可以應(yīng)用于抗病毒藥物、抗動脈粥樣硬化藥物、滴眼液、可溶性珍珠粉(層粉)、化妝品、功能食品、藥品和保健品等。
具體實施例方式
以下的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
實施例1將1000g海洋珍珠貝粉碎后，用22KHz超聲波破細(xì)胞膜，加蒸餾水2000mL混合均勻，使用1mol/L氟汰酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，后得酸解液，取1000mL酸解液加入2.8g木瓜蛋白酶，然后用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)的pH值為7.5，酶解溫度是50℃，酶解時間是6h，得到酶解液。取30g胰蛋白酶，0.025mol，磷酸二氫鉀，0.01mol氯化鉀，4mmol牛磺膽酸鈉和1mmol磷酯酸膽堿，用少量水溶解后，加入上述得到的酶解液混勻并定容到1000mL，用O.1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值到8.0，酶解溫度是45℃，酶解時間是2h，冷凍干燥得到可溶性粉末。
將上述得到的粉末用水溶解，加入純乙醇使其乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達60％，取上清液；向上清液中加入乙醇使其乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達75％，5000r/min離心取沉淀部分，冷凍干燥得到產(chǎn)物。根據(jù)上述的分子質(zhì)量測定，小肽的氨基酸序列測定和糖基的結(jié)構(gòu)分析，證實其相對分子質(zhì)量量范圍為1300～33000，并由氨基酸序列為—GASRERCAKLSG—的小肽和硫酸軟骨素B組成，其中硫酸軟骨素B與氨基酸序列中的谷氨酸聯(lián)結(jié)(由谷氨酸結(jié)構(gòu)推理得出，因為序列中唯有谷氨酸擁有兩個羧基，其中一個形成肽鍵后，另外一個易于形成甙健)。
實施例2將1000g海洋珍珠貝粉碎后，用24KHz超聲波破細(xì)胞膜，加蒸餾水2000mL混合均勻，使用1mol/L乳酸調(diào)節(jié)pH值至6.5，后得酸解液，取1000mL酸解液加入3.5g木瓜蛋白酶，然后用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)的pH值為7.0，酶解溫度是45℃，酶解時間是8小時，得到酶解液。取50g胰蛋白酶，0.032mol磷酸二氫鉀，0.03mol氯化鉀，6mmol?；悄懰徕c和2mmol磷酯酸膽堿，用少量水溶解后，加入上述得到的酶解液混勻并定容到1000mL，用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值到8.5，酶解溫度50℃，酶解時間4h，冷凍干燥得到可溶性粉末。
將上述得到的粉末首先加入純乙醇使其乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達65％，取上清液；向上清液中加入乙醇使其乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達75％，4500r/min離心取沉淀部分，冷凍干燥得到產(chǎn)物。根據(jù)上述的分子質(zhì)量測定，小肽的氨基酸序列測定和糖基的結(jié)構(gòu)分析，證實其相對分子質(zhì)量范圍為1300～33000，并由氨基酸序列為—GASRERCAKLSG—的小肽和硫酸軟骨素B組成，其中硫酸軟骨素B與氨基酸序列中的谷氨酸聯(lián)結(jié)。
實施例3海洋珍珠貝氨基甙抗單純皰疹病毒I型(HSV-I)的作用實驗材料珍珠貝氨基甙用二甲基亞砜(DMSO)溶解后用2％DMEM(一種細(xì)胞培養(yǎng)基)配成1mmol/L濃度；陽性對照藥物為無環(huán)鳥苷干粉(ACV)，批號0408012，由麗珠集團有限責(zé)任公司提供，稱量用蒸餾水制成含量為1.0g/L的溶液，過濾除菌置4℃保存?zhèn)溆?；?xì)胞為兔腎細(xì)胞，由本實驗室自制，取自2日齡乳兔(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供)；病毒株為I型皰疹病毒，由廣州市兒童醫(yī)院提供。
儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(NAPCO)；倒置微生物顯微鏡(OLYMPUS CK40)。
藥物毒性實驗用細(xì)胞維持液將藥液連續(xù)四倍稀釋四個濃度，常量分別加入細(xì)胞已長成單層的96孔培養(yǎng)板中，置37℃、5％ CO2溫箱培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)觀察4d。每個濃度加入4孔細(xì)胞，同時設(shè)立正常細(xì)胞對照。細(xì)胞以不出現(xiàn)病變?yōu)樗幬锏臒o毒濃度。
藥物抗病毒實驗對的抑制作用 細(xì)胞長成單層時加入不同濃度的藥物，每濃度4孔，同時接種100 TCID50I型皰疹病毒，37℃、5％ CO2培養(yǎng)4d。當(dāng)病毒對照病毒所致細(xì)胞病變(CPE)25％～75％時，判斷結(jié)果。實驗均設(shè)病毒對照組、藥物組、細(xì)胞對照、ACV組。
實驗結(jié)果(1)珍珠貝氨基甙在毒性濃度時，細(xì)胞萎縮、空泡或脫落；(2)珍珠貝氨基甙在0.129～0.515g/L能抑制病毒所致病變，其余藥對HSV-I均無抑制作用。陽性藥ACV組1.56mg/L時能完全抑制病毒所致病變(見表1)。
表1 海洋珍珠貝氨基甙對HSV-I的作用

實施例2海洋珍珠貝氨基甙對實驗性高脂血癥大鼠的血脂變化的影響實驗動物取取標(biāo)準(zhǔn)實驗SD大鼠，按規(guī)范投飼，按《新藥藥理研究指南》開展研究。
大鼠給藥劑量實驗藥小、中、大劑量分別為1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg，煙酸組為0.75g/kg。
方法取大鼠72只先在實驗環(huán)境下給普通飼料喂養(yǎng)，觀察7天，隨機分為6組，分別為正常組、模型組、陽性藥煙酸組、珍珠貝膠囊小、中、大劑量組，每組12只。分組后次日開始實驗，除正常組給普通飼料喂養(yǎng)外，其余動物均給予高脂飼料喂養(yǎng)。連續(xù)飼養(yǎng)五周暫不給藥。第七周開始開始灌胃給藥，正常組及模型組給蒸餾水，其它組給予相應(yīng)受試藥物，每日給藥一次，連續(xù)給藥4周，每周稱重一次。4周末大鼠禁食12小時后眼眶采血，離出血清，測定各項血脂指標(biāo)，包括總膽固醇CHOL、甘油三酯TG、高密度酯蛋白HDL-C、低密度酯蛋白LDL-C，進行統(tǒng)計學(xué)處理，比較各組間差異。并計算各給藥組血脂指標(biāo)降低(升高)百分率。
結(jié)果見表2。模型組與正常組比較p＜0.01；藥組與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
表2 海洋珍珠氨基甙對實驗性高脂血癥大鼠的血脂變化的影響

權(quán)利要求
1.一種氨基甙，其特征是其相對分子質(zhì)量范圍為1300～33000，并由下述的重復(fù)結(jié)構(gòu)片段構(gòu)成，所述的重復(fù)結(jié)構(gòu)片段由氨基酸序列為-GASRERCAKLSG-的小肽和硫酸軟骨素B組成，其中硫酸軟骨素B與氨基酸序列中的谷氨酸聯(lián)結(jié)。
2.一種氨基甙的制備方法，其特征是包括以下的步驟(1)將海洋珍珠貝粉碎后，破細(xì)胞膜，加入氟汰酸或乳酸調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.5，混合均勻后得酸解液；(2)酸解液經(jīng)過仿胃液酶解，再經(jīng)仿腸液酶解后，冷凍干燥得到可溶性粉末；(3)將步驟(2)得到的粉末用水溶解，加入乙醇至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達55％～60％，然后取上清液，向上清液中加入乙醇至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達70％～75％，離心分離，取沉淀部分冷凍干燥得到產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的一種氨基甙的制備方法，其特征是步驟(2)所述的仿胃液酶解是在每1000mL步驟(1)得到的酸解液中加入2.8～3.5g木瓜蛋白酶，然后調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.5，酶解溫度是45～50℃，酶解時間是6～8h；所述的仿腸液酶解是把胰蛋白酶，磷酸二氫鉀，氯化鉀，?；悄懰徕c和磷酯酸膽堿與步驟(2)仿胃液酶解后的液體混合，使其中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％～5％的胰蛋白酶，0.025～0.032mol/L磷酸二氫鉀，0.01～0.03mol/L氯化鉀，4～6mmol/L?；悄懰徕c，1～2mmol/L磷酯酸膽堿；調(diào)節(jié)溶液的pH值到8.0～8.5，酶解溫度是45～50℃，酶解時間是2～4h；步驟(3)所述的離心分離為4000～6000r/min。
4.權(quán)利要求1的氨基甙在制備抗病毒藥物和抗動脈粥樣硬化藥物和保健品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氨基甙及其制備方法和用途，其特征是其相對分子質(zhì)量范圍為1300～33000，并由下述的重復(fù)結(jié)構(gòu)片段構(gòu)成，所述的重復(fù)結(jié)構(gòu)片段由氨基酸序列為－GASRERCAKLSG－的小肽和硫酸軟骨素B組成，其中硫酸軟骨素B與氨基酸序列中的谷氨酸聯(lián)結(jié)。本發(fā)明氨基甙以海洋珍珠貝為原料，通過超聲波或液氮破細(xì)胞膜，酸解，仿胃液酶解，仿腸液酶解，溶劑萃取，離心分離等步驟得到。本發(fā)明的海洋珍珠貝氨基甙具有抗病毒和抗動脈粥樣硬化的作用，因此可以應(yīng)用于抗病毒藥物、抗動脈粥樣硬化藥物、滴眼液、可溶性珍珠粉(層粉)、化妝品、功能食品、藥品和保健品等。
文檔編號A61P9/00GK1916021SQ20061003727
公開日2007年2月21日 申請日期2006年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者張偲, 尹浩, 龍麗娟, 聞克威, 張士忠, 王世全, 王士奎 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所