專利名稱：一種修復(fù)潰瘍的生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因真核表達(dá)載體、將該載體轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌形成的工程菌株、以及利用該工程菌株生產(chǎn)的工程菌制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
潰瘍是一類常見病，包括胃潰瘍、十二指腸潰瘍、口腔潰瘍、燒燙傷或外傷感染或糖尿病性或局部放療引起的皮膚難愈合性潰瘍等，給患者造成巨大痛苦，也給醫(yī)療工作帶來巨大負(fù)擔(dān)。胃潰瘍流行病學(xué)調(diào)查表明，人口中約有10％在其一生中患過本病，而且隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步，各種壓力增加，生活習(xí)慣、神經(jīng)精神因素等導(dǎo)致的胃潰瘍的發(fā)病率越來越高，胃潰瘍由于病情延綿，病情復(fù)雜，病情加重或治療不及時(shí)，還會(huì)導(dǎo)致出血、穿孔、幽門梗阻和癌變等后果，嚴(yán)重危害人民健康，所以應(yīng)予以高度的重視?？谇粷兪强谇徽衬ぜ膊≈凶畛Ｒ姷臐冃該p害，可單發(fā)或多發(fā)于口腔粘膜的任何部位，臨床以口腔潰瘍反復(fù)發(fā)作，伴有劇烈自發(fā)性灼痛為特點(diǎn)，發(fā)病年齡以青壯年為多，而且女性多發(fā)于男性?？谇粷兣R床多見于患者唇內(nèi)側(cè)、舌頭、舌腹、頰粘膜、前庭溝及軟腭等部位，由于這些地方的粘膜缺乏角化層或角化較差，缺乏對(duì)刺激的防護(hù)功能，所以咀嚼食物和刷牙等都可以引起創(chuàng)傷而導(dǎo)致潰瘍。大多數(shù)患者在沒有得到有效治療的情況下，口腔潰瘍發(fā)病多年以后病情呈逐漸加重趨勢(shì)，表現(xiàn)為口腔潰瘍的發(fā)作越來越頻繁，潰瘍面越來越多，潰瘍發(fā)作的時(shí)間延長，甚至發(fā)展到持續(xù)不愈的狀況。皮膚潰瘍是真皮或真皮以下的限局性皮膚缺損，其表面常覆蓋有膿液、壞死組織或痂皮，愈后遺有瘢痕，可由感染、外傷、結(jié)節(jié)、腫瘤的破潰或糖尿病等所致，其大小、形態(tài)、深淺、發(fā)展過程等也不一致。目前還沒有非常有效的方法來促進(jìn)這些潰瘍的快速愈合。
人肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)最初作為一種肝細(xì)胞有絲分裂原是從肝部分切除大鼠的血清中分離得到的(Nakamura T，et al.Biochem Biophys Res Commun，1984；1221450)。隨后相繼從大鼠血小板、人血漿、人血清、大鼠肝等中分離純化，分子量為87-105kD(Nakamura T，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1986；836489；Gohda E，et al.J Clin Invest，1988；81414；Zarnegar R，et al.Cancer Res，1989；493314；Asami O，et al.J Biochem；1991；1098)。其前體是由728個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈，經(jīng)蛋白酶水解作用產(chǎn)生具有生物活性的異二聚體，成熟的HGF蛋白分子由分子量為55-65kD的重鏈(α鏈)和分子量為32-36kD的輕鏈(β鏈)通過二硫鍵相連接。其中重鏈結(jié)構(gòu)中包含4個(gè)Krigle結(jié)構(gòu)，Krigle結(jié)構(gòu)是由三個(gè)二硫鍵連成的雙環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)。HGF中的Krigle結(jié)構(gòu)與纖溶酶原具有38％的同源性，但其與HGF功能的關(guān)系目前不是十分清楚。HGF的輕鏈結(jié)構(gòu)與絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)相似，然而其與HGF功能的關(guān)系還不太了解，但其輕鏈蛋白序列與HGF的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)作用有關(guān)(Nakamura T，et al.Nature，1989；342440；Mizuno K，et al.Biochem Biophy Res Commun，1994；1981161；Miyazawa K，et al.JBiol Chem，1993；26810024)。HGF主要由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在鼠、兔、人的各種組織中表達(dá)，是體內(nèi)廣泛分布的一種細(xì)胞因子。人HGF基因大約70kb，含有8個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子，HGF基因定位于第7號(hào)染色體上(7q21.1)，人和鼠HGF cDNA序列高度保守(＞90％)，其生物學(xué)活性無明顯種屬差異(Nakamura T，et al.Nature，1989；342440)。HGF是一多功能生長因子，通過與其特異性膜受體c-met結(jié)合而發(fā)揮其多樣生物學(xué)作用，是間質(zhì)和上皮/內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用的重要信息分子，對(duì)胚胎發(fā)育、組織器官再生、傷口愈合和血管發(fā)生起重要的調(diào)節(jié)作用(Sonnenberg E，et al.J Cell Biol，1993；123223；Jennische E，et al.Am J Physiol.1993；265C122；Igawa T，et al.Am J Physiol，1993；265F61；Boccacci C，et al.Nature，1998；391285；GiordanosS，et al.Nature，1989；339155；Bottaro DP，et al.Science，1991；251802；Naldini L，et al.Oncogene，1991；6501)。HGF及其受體分布于多種器官及組織(Wolff H，et al.Hepatol，1991；14488)，其廣泛分布表明，HGF對(duì)多種組織器官有營養(yǎng)作用。
HGF最初被認(rèn)為是一種肝細(xì)胞有絲分裂原，后來發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種組織細(xì)胞的分裂、擴(kuò)散和形態(tài)發(fā)生起重要的調(diào)節(jié)作用。尤其在肝臟的發(fā)育和再生中，HGF起著至關(guān)重要的作用，HGF可治療重癥肝炎、急性肝炎，防治肝纖維化、肝硬化和肝癌。HGF對(duì)腎臟疾患也有非常重要的治療作用，可防治腎纖維化、急慢性腎功能不全等。研究表明在生理狀況下HGF可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的發(fā)生、支氣管系統(tǒng)的管腔形成及肺支氣管上皮細(xì)胞的增生，從而為HGF治療肺纖維化、肺炎等疾患奠定了基礎(chǔ)。HGF以其促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用使其極有可能用于臨床治療血管外傷和外周血管病、防止冠狀動(dòng)脈血管術(shù)后狹窄、防治動(dòng)脈硬化，并可以其抗纖維化作用而用于治療心肌炎和心肌梗死。HGF還可促進(jìn)神經(jīng)的發(fā)生、生存和再生，對(duì)神經(jīng)有營養(yǎng)作用，可用于預(yù)防和治療神經(jīng)損傷。由此可見，HGF是一生物活性極為廣泛的細(xì)胞因子，HGF將以其多種藥理作用滲透于臨床治療的各個(gè)領(lǐng)域(劉克辛.《肝細(xì)胞增殖因子(HGF)分子醫(yī)學(xué)研究最新進(jìn)展》，天津科學(xué)技術(shù)出版社.2001，1-140)。
HGF在理論上可從多方面促進(jìn)潰瘍的有效、高質(zhì)量愈合。首先，HGF可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖，形成新生血管(Bussolino F，et al.J Cell Biol，1992；119629；Morimoto A，etal.Biochem Biophys Res Commun，1991；1791042；Sato Y，et al.Exp Cell Res，1993；204223)，促進(jìn)局部血液循環(huán)從而加速潰瘍愈合；有報(bào)道HGF可濃度依存性地促進(jìn)原代培養(yǎng)家兔胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖，明顯加速家兔胃黏膜上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)(Watanabe S，et al.Biochem Biophys ResCommun 1994，1991453)。除了動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屯?，Takahashi等還建立了人胃黏膜上皮細(xì)胞潰瘍模型，發(fā)現(xiàn)前列腺素E1的抗?jié)冏饔檬峭ㄟ^促進(jìn)胃的成纖維細(xì)胞釋放HGF來發(fā)揮的(Takahashi M，et al.J Clin Invest 1996；982604)。Hori K等檢測(cè)了20名胃潰瘍病人潰瘍病灶中HGF mRNA的水平，發(fā)現(xiàn)HGF mRNA明顯升高(Hori et al.Scand J Gastroenterol 2000，35FGH)，這提示胃潰瘍時(shí)潰瘍病灶中HGF的補(bǔ)充對(duì)胃潰瘍的修復(fù)有重要的臨床意義。HGF可刺激皮膚角質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖，促使傷口的再表皮化(Matsumoto K，et al.Exp Cell Res，1992；196114)；HGF可顯著抑制TGF-β的產(chǎn)生(Ueki T，et al.Nature Med，1999，5226)，而TGF-β是迄今了解最多、與瘢痕形成最密切的細(xì)胞因子，HGF由于對(duì)抗TGF-β的產(chǎn)生而可減少瘢痕的形成；另外HGF可增強(qiáng)膠原酶的活性(Ueki T，et al.Nature Med，1999，5226)，促使多余形成的膠原有效地降解。
減毒沙門氏菌是一類重要的人獸共患病原菌，目前對(duì)它的研究已很詳盡，遺傳背景清楚，易于操作和控制，利用它作為載體原核表達(dá)各種外源抗原已得到廣泛的研究并取得良好的免疫效果(Darji A，et al.Cell 1997，91766；Sizemore DR，et al.Vaccine ElsevierScience，1997，15(8)804；張曉明，等.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2002，30(4)54)。本研究中我們沒有直接應(yīng)用HGF蛋白而是采用HGF基因治療的方法，并利用減毒沙門氏菌作為細(xì)胞載體，目的一是解決HGF蛋白直接應(yīng)用存在的缺陷細(xì)胞因子蛋白制劑存在半衰期較短，需要大劑量、反復(fù)給藥才能夠維持局部較高的濃度。有時(shí)即使重復(fù)應(yīng)用也難以達(dá)到有效濃度，應(yīng)用蛋白制劑花費(fèi)較高，另外目前的純化工藝對(duì)于人藥用級(jí)生長因子蛋白的純化還不是非常成熟，給臨床治療帶來很大不便，不適合大規(guī)模的應(yīng)用。利用基因治療的方法可以克服以上缺點(diǎn)，提高HGF的生物利用度。二是減少用藥次數(shù)及時(shí)間?；蛑委熓侵笇⒒驍y帶在一真核表達(dá)載體上，并將其轉(zhuǎn)移至損傷器官組織部位，使組織成為“微型的藥物工廠”，持續(xù)分泌一定時(shí)間的重組蛋白，以達(dá)到治療疾病的目的。三是利用減毒沙門氏菌可以口服及提高機(jī)體免疫力的優(yōu)勢(shì)(張曉明，等.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2002，30(4)54)，減毒沙門氏菌可侵入到宿主的Peyer氏集結(jié)、腸淋巴結(jié)、肝、脾等組織，由于已減毒，最終被宿主清除。
綜上所述，如何有效、快速且高質(zhì)量地修復(fù)潰瘍?nèi)匀皇桥R床醫(yī)學(xué)中的一大難題。而HGF這一對(duì)多器官具有營養(yǎng)、修復(fù)功能的多功能細(xì)胞因子卻尚未應(yīng)用于臨床，為此，我們利用減毒沙門氏菌為細(xì)胞載體，以口服方式將HGF基因轉(zhuǎn)移至損傷部位，證實(shí)其可促進(jìn)創(chuàng)口愈合、修復(fù)胃潰瘍的療效。從而構(gòu)成一種修復(fù)潰瘍的生物制劑，顯示出潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是構(gòu)建攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的真核表達(dá)載體pcKH，包含有人肝細(xì)胞生長因子基因、卡那霉素抗性基因序列；人肝細(xì)胞生長因子基因受巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、牛生長激素基因的聚腺苷酸信號(hào)調(diào)控。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的真核表達(dá)載體pcKH轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌株中，形成攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的減毒沙門氏菌工程菌株。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是將攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的減毒沙門氏菌工程菌株經(jīng)過大規(guī)模發(fā)酵后，收集菌體凍干后與分散劑和輔料制成分散片或膠囊制劑。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是將減毒沙門氏菌工程菌株作為制備治療修復(fù)胃潰瘍、十二指腸潰瘍、口腔潰瘍、皮膚潰瘍或其它潰瘍藥物的應(yīng)用。將攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的減毒沙門氏菌工程菌株制成的制劑以口服或外用的方式修復(fù)潰瘍，并通過治療哺乳動(dòng)物胃潰瘍模型，觀察其防治胃潰瘍的效果及初步的毒副作用。
本發(fā)明首先從人胎盤cDNA文庫得到的人肝細(xì)胞生長因子基因克隆至自行構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcK上，獲得人肝細(xì)胞生長因子基因的真核表達(dá)載體pcKH，并將其轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌Ty-21a菌株，構(gòu)成攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的減毒沙門氏菌工程菌株，并制成生物制劑。本發(fā)明的特點(diǎn)是將人肝細(xì)胞生長因子可快速修復(fù)潰瘍的功能及減毒沙門氏菌作為細(xì)胞載體和提高機(jī)體免疫的功能相結(jié)合，以治療各種潰瘍。胃潰瘍動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的減毒沙門氏菌工程菌株制劑后，目的基因在胃組織表達(dá)較高，潰瘍病變縮小，肉芽組織形成，毛細(xì)血管增生較明顯，部分見腺體增生和神經(jīng)纖維增生；對(duì)照組動(dòng)物胃體變小，黏膜面有顯著出血及潰瘍，鏡下潰瘍明顯，未見明顯增生現(xiàn)象。本發(fā)明提供的治療潰瘍的新的基因治療制劑，口服后使?jié)兠婵焖購氐椎匦迯?fù)，打破了以抗酸、抑酸的基礎(chǔ)上保護(hù)胃腸粘膜的傳統(tǒng)治療方法的思路，以完全修復(fù)潰瘍面而達(dá)到根治胃潰瘍?yōu)槟康?。國?nèi)外未見類似報(bào)道。


圖1從人胎盤cDNA克隆的HGF cDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果lane 1lambda DNA/Eco RI+Hind III Marker；lane 2HGF cDNA PCR；lane 3negative control圖2攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的真核表達(dá)載體pcKH示意圖
HGF人肝細(xì)胞生長因子基因；kana卡那霉素抗性基因；pCMV巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；BGHpA牛生長激素基因的聚腺苷酸；ORI復(fù)制子圖3質(zhì)粒pcKH轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌Ty-21a菌株的菌落生長圖4利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV及目的基因HGFlane 1真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV；lane 2HGF cDNA；lane 3negative control圖5 BamHI和ApaI酶切質(zhì)粒pcKH結(jié)果Lane 1pcK用Bam HI酶切；Lane 2pcKH用Bam HI和Apa I雙酶切；Lane 3pcKH用Bam HI酶切；Lane 4lambda DNA/Eco RI+Hind III Marker圖6 pcK-GFP的減毒沙門氏菌菌株的篩選(挑取菌落在熒光顯微鏡下觀察見綠色熒光)圖7重組沙門氏菌(pcK-GFP)有效轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞(熒光顯微鏡下觀察)圖8重組沙門氏菌(pcKH)感染小鼠巨噬細(xì)胞檢測(cè)目的蛋白表達(dá)圖9大鼠胃潰瘍模型圖10灌胃后目的基因在胃組織高效轉(zhuǎn)染圖11對(duì)大鼠胃潰瘍模型的治療效果(a)對(duì)照組 (b)實(shí)驗(yàn)組具體實(shí)施方式
實(shí)施例1從人胎盤cDNA克隆人肝細(xì)胞生長因子(HGF)cDNA按文獻(xiàn)報(bào)道(Miyazawa K，et al.BBRC，1989，163967-973；Nakamura T，et al.Progressin Growth Factor Research 1991，367-85)的人肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，并在正向引物中引入BamHI酶切位點(diǎn)，反向引物中引入SalI酶切位點(diǎn)。正向引物的寡核苷酸序列為5’-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3’，反向引物的寡核苷酸序列為5’-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3’，從人胎盤cDNA文庫(購自Clontech)克隆人肝細(xì)胞生長因子基因。PCR參數(shù)為94℃ 60sec，55℃ 60sec，72℃ 90sec，循環(huán)數(shù)為30，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物(圖1)克隆至pBluescript SK(pSK)載體(購自Clontech)的BamHI(購自Promega)和SalI酶(購自Promega)酶切位點(diǎn)中，命名為pSK-HGF。
用XhoI酶(購自Promega)酶切pSK-HGF，0.8％瓊脂糖(西班牙原裝)凝膠電泳分離后，分別回收(凝膠回收試劑盒，購自Promega)大小約3.5kb、1.1kb、0.6kb的DNA片段，將3.5kb片段用T4DNA連接酶(購自BioLabs)自連得到pSK-HGF1，再將1.1kb和0.6kb片段分別插入pSK載體的XhoI酶切位點(diǎn)中，分別命名為pSK-HGF2和pSK-HGF3。測(cè)序反應(yīng)策略是pSK-HGF1用T3引物作一反應(yīng)；pSK-HGF2用T3和T7引物分別作一反應(yīng)；pSK-HGF3用T7引物作一反應(yīng)。用Sanger雙脫氧終止法測(cè)定人HGF cDNA序列(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)。對(duì)pSK-HGF1、pSK-HGF2、pSK-HGF3分別用T3、T7引物作四個(gè)反應(yīng)后測(cè)序并進(jìn)行綜合分析，將測(cè)得的人HGF全長cDNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的人HGF全長cDNA序列進(jìn)行比較分析表明，我們克隆的人HGFcDNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的人HGF全長cDNA序列完全一致。
1 ggggggctca gagccgactg gctcttttag gcactgactc cgaacaggat tctttcaccc61 aggcatctcc tccagaggga tccgccagcc cgtccagcag caccatgtgg gtgaccaaac121 tcctgccagc cctgctgctg cagcatgtcc tcctgcatct cctcctgctc cccatcgcca181 tcccctatgc agagggacaa aggaaaagaa gaaatacaat tcatgaattc aaaaaatcag241 caaagactac cctaatcaaa atagatccag cactgaagat aaaaaccaaa aaagtgaata301 ctgcagacca atgtgctaat agatgtacta ggaataaagg acttccattc acttgcaagg361 cttttgtttt tgataaagca agaaaacaat gcctctggtt ccccttcaat agcatgtcaa421 gtggagtgaa aaaagaattt ggccatgaat ttgacctcta tgaaaacaaa gactacatta481 gaaactgcat cattggtaaa ggacgcagct acaagggaac agtatctatc actaagagtg541 gcatcaaatg tcagccctgg agttccatga taccacacga acacagcttt ttgccttcga601 gctatcgggg taaagaccta caggaaaact actgtcgaaa tcctcgaggg gaagaagggg661 gaccctggtg tttcacaagc aatccagagg tacgctacga agtctgtgac attcctcagt721 gttcagaagt tgaatgcatg acctgcaatg gggagagtta tcgaggtctc atggatcata781 cagaatcagg caagatttgt cagcgctggg atcatcagac accacaccgg cacaaattct841 tgcctgaaag atatcccgac aagggctttg atgataatta ttgccgcaat cccgatggcc901 agccgaggcc atggtgctat actcttgacc ctcacacccg ctgggagtac tgtgcaatta961 aaacatgcgc tgacaatact atgaatgaca ctgatgttcc tttggaaaca actgaatgca1021 tccaaggtca aggagaaggc tacaggggca ctgtcaatac catttggaat ggaattccat1081 gtcagcgttg ggattctcag tatcctcacg agcatgacat gactcctgaa aatttcaagt1141 gcaaggacct acgagaaaat tactgccgaa atccagatgg gtctgaatca ccctggtgtt
1201 ttaccactga tccaaacatc cgagttggct actgctccca aattccaaac tgtgatatgt1261 cacatggaca agattgttat cgtgggaatg gcaaaaatta tatgggcaac ttatcccaaa1321 caagatctgg actaacatgt tcaatgtggg acaagaacat ggaagactta catcgtcata1381 tcttctggga accagatgca agtaagctga atgagaatta ctgccgaaat ccagatgatg1441 atgctcatgg accctggtgc tacacgggaa atccactcat tccttgggat tattgcccta1501 tttctcgttg tgaaggtgat accacaccta caatagtcaa tttagaccat cccgtaatat1561 cttgtgccaa aacgaaacaa ttgcgagttg taaatgggat tccaacacga acaaacatag1621 gatggatggt tagtttgaga tacagaaata aacatatctg cggaggatca ttgataaagg1681 agagttgggt tcttactgca cgacagtgtt tcccttctcg agacttgaaa gattatgaag1741 cttggcttgg aattcatgat gtccacggaa gaggagatga gaaatgcaaa caggttctca1801 atgtttccca gctggtatat ggccctgaag gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca1861 ggcctgctgt cctggatgat tttgttagta cgattgattt acctaattat ggatgcacaa1921 ttcctgaaaa gaccagttgc agtgtttatg gctggggcta cactggattg atcaactatg1981 atggcctatt acgagtggca catctctata taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc2041 atcgagggaa ggtgactctg aatgagtctg aaatatgtgc tggggctgaa aagattggat2101 caggaccatg tgagggggat tatggtggcc cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa2161 tggttcttgg tgtcattgtt cctggtcgtg gatgtgccat tccaaatcgt cctggtattt2221 ttgtccgagt agcatattat gcaaaatgga tacacaaaat tattttaaca tataaggtac2281 cacagtcata gctgaagtaa gtgtgtctga agcacccacc aatacaactg tcttttacat2341 gaagatttca gagaatgtgg aatttaaaat gtcacttaca acaatcctaa gac實(shí)施例2攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的真核表達(dá)載體pcKH構(gòu)建將pcDNA3載體(購自Clontech)用SspI(購自Promega)及AvrII(購自Promega)雙酶切，切去氨芐基因(約0.6kb)，pEGFP-N1(購自Invitrogen)用AvrII酶切，分別回收大片段(約4.8kb)及小片段(1.1kb的DNA片段，該片段含有完整的卡那霉素基因)用T4 DNA連接酶(購自BioLabs)連接，獲得卡那霉素抗性的pcDNA3載體，命名為pcK。分別用BamHI(購自Promega)和ApaI(購自Promega)雙酶切pcK及pSK-HGF，分別回收大片段及小片段(2.2kb的DNA片段，該片段含有完整的人HGF基因)用T4 DNA連接酶連接，獲得攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的真核表達(dá)載體，含卡那霉素抗性基因，命名為pcKH(圖2)。
實(shí)施例3攜帶HGF基因的減毒沙門氏菌菌株的制備1.減毒沙門氏菌的電穿孔轉(zhuǎn)化將減毒沙門氏菌Ty21a凍存菌液50μL接種于5ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期(菌液A值約0.4)，4℃條件下，4000r.min-1離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌去離子水洗滌細(xì)胞2次，洗滌后的細(xì)菌懸于1ml冰預(yù)冷的無菌去離子水。用電穿孔法(Multiporator 4308 Eppendorf電轉(zhuǎn)儀)將pcKH、pcK和pcK-GFP(攜帶綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體，用于示蹤觀察轉(zhuǎn)染效率，本室保存)質(zhì)粒各0.2μg轉(zhuǎn)化200μL預(yù)處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2.5kV，電容25μF，電阻200Ω，放電時(shí)間0.5s。加入SOC培養(yǎng)基1ml，37℃輕柔震蕩培養(yǎng)45min，涂布于含卡那霉素(100mg.L-1)固體LB培養(yǎng)基平皿，37℃培養(yǎng)16h后各挑取2個(gè)菌落進(jìn)行鑒定。
2.陽性工程菌的篩選從培養(yǎng)板(圖3)各挑取2個(gè)單菌落，分別接種于3mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃震搖培養(yǎng)。轉(zhuǎn)入pcKH的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性、PCR(利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV及目的基因HGF(圖4))及提取質(zhì)粒后BamHI/ApaI雙酶切鑒定(圖5)；轉(zhuǎn)入pcK的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR篩選(利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV)；轉(zhuǎn)入pcK-GFP的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR篩選(利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV及在熒光顯微鏡下觀察GFP(圖6))。擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV的引物為上游5’-ccc agt aca tga cct tat ggg-3’，下游5’-gga gac ttg gaa ate ccc gt-3’，PCR參數(shù)為94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，循環(huán)數(shù)為30，72℃延伸5min。擴(kuò)增HGF的引物為上游5’-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3’下游5’-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3’PCR參數(shù)為94℃60sec，55℃60sec，72℃90sec，循環(huán)數(shù)為30，72℃延伸7min。
實(shí)施例4重組沙門氏菌感染小鼠巨噬細(xì)胞檢測(cè)目的蛋白表達(dá)取2只BALB/C小鼠，脫頸處死。無菌條件下，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基灌洗小鼠腹腔，灌洗液分別收集于50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶。37℃孵育2h，使之貼壁。然后用無抗生素RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，洗去非貼壁細(xì)胞，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，所地貼壁細(xì)胞即為小鼠腹腔灌洗巨噬細(xì)胞。將腹腔巨噬細(xì)胞接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，80％融合后以PBS洗4遍，再分別加入重組沙門氏菌Ty-21a-HGF、Ty-21a-GFP(1×105/ml細(xì)菌)，室溫放置1h后以含50μg/ml慶大霉素的DMEM洗2遍，再加同樣培養(yǎng)基放置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4h后改用含50μg/ml慶大霉素和10μg/ml四環(huán)素的DMEM培養(yǎng)，48h后觀測(cè)轉(zhuǎn)染效率(圖7)及目的蛋白表達(dá)(圖8)。
實(shí)施例5治療效果觀察1.胃潰瘍大鼠動(dòng)物模型的制備大鼠術(shù)前禁食不禁水24小時(shí)，3％戊巴比妥鈉溶液40mg/kg體重腹腔注射麻醉，劍突下0.5cm縱向切開腹壁約2cm，自肝后找出胃，輕輕移出腹腔，用微量注射器在胃前壁胃竇部漿膜下近肌層處注射0.05ml乙酸，覆蓋網(wǎng)膜并間斷縫合腹膜、腹壁各層組織、皮膚，其后單籠飼養(yǎng)。
2.模型組大鼠分組及基因藥物轉(zhuǎn)移將模型組大鼠(圖9)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組20只。將攜帶HGF基因的減毒沙門氏菌菌株、不攜帶目的基因的減毒沙門氏菌株及攜帶GFP基因的減毒沙門氏菌菌株分別接種于2ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，震蕩過夜，次日取50μL加入50ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，2小時(shí)后收集菌體，PBS清洗后，用10％的NaHCO3懸浮，調(diào)整細(xì)菌數(shù)為1×109個(gè)/ml，每只灌胃0.2ml。隔日一次，共3次。
3.效果觀察灌胃后第3天和第5天將灌攜帶GFP基因的減毒沙門氏菌菌株的大鼠處死，取胃、腸、肝、脾、腎組織制備成冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，結(jié)果在胃腸觀察到較強(qiáng)的熒光(見圖10)，在肝、脾、腎組織也觀察到微弱的熒光。體內(nèi)結(jié)果可見實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物(灌攜帶HGF基因的減毒沙門氏菌菌株組)潰瘍病變縮小，肉芽組織形成，毛細(xì)血管增生較明顯，部分見腺體增生和神經(jīng)纖維增生(見圖11b)；對(duì)照組動(dòng)物(灌不攜帶HGF基因的減毒沙門氏菌菌株組)胃體變小，黏膜面有顯著出血及潰瘍，鏡下潰瘍明顯，未見明顯增生現(xiàn)象(見圖11a)。
權(quán)利要求
1.一種攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的真核表達(dá)載體pcKH。
2.一種將權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體pcKH轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌形成的攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的減毒沙門氏菌工程菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌株，其特征是所述減毒沙門氏菌為Ty-21a菌株。
4.一種將權(quán)利要求3所述的減毒沙門氏菌工程菌株經(jīng)過大規(guī)模發(fā)酵后，收集菌體凍干后，與分散劑和輔料制成分散片或膠囊制劑。
5.一種將權(quán)利要求3所述的減毒沙門氏菌工程菌株的醫(yī)療用途，作為制備治療修復(fù)胃潰瘍、十二指腸潰瘍、口腔潰瘍、皮膚潰瘍或其它潰瘍藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種修復(fù)潰瘍的生物制劑，屬于基因工程制藥技術(shù)領(lǐng)域。即將從人胎盤cDNA文庫得到的人肝細(xì)胞生長因子基因克隆至自行構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcK上，獲得人肝細(xì)胞生長因子基因的真核表達(dá)載體pcKH，并將其轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌Ty－21a菌株，構(gòu)成攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的減毒沙門氏菌工程菌株，將減毒沙門氏菌工程菌株經(jīng)過大規(guī)模發(fā)酵后，收集菌體凍干后，與分散劑和輔料制成分散片或膠囊或噴涂劑等內(nèi)外用制劑。發(fā)明的特點(diǎn)是將人肝細(xì)胞生長因子可快速修復(fù)潰瘍的功能及減毒沙門氏菌作為細(xì)胞載體和提高機(jī)體免疫的功能相結(jié)合，作為制備治療修復(fù)胃潰瘍、十二指腸潰瘍、口腔潰瘍、皮膚潰瘍或其它潰瘍藥物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1869238SQ20061004305
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月24日
發(fā)明者哈小琴, 樊俊杰, 吳祖澤, 呂同德, 賀冠憲, 趙治華, 尹強(qiáng), 牛廷獻(xiàn), 李富軍, 唐瑜, 王曉輝 申請(qǐng)人:中國人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院