專利名稱：以白喉毒素突變體crm197為載體的免疫原及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以白喉毒素突變體CRM197為載體的免疫原G17CRM197及其制備方法，以及此免疫原在消化道腫瘤治療中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
CRM197(cross-reacting materials 197)是白喉毒素喪失了毒性的一種突變體，參見烏其達等人，白喉毒素和相關(guān)蛋白I.分離并描述白喉毒素血清型相關(guān)突變體菌株，生物化學(xué)，1973.2483838-3844.(Uchida，T.，A.M.Pappenheimer，Jr.and R.Gregory.al.，Diphtheria toxin and related proteins I.Isolation and properties of mutantproteins serologically related to diphtheria toxin.J.Biol.Chem.1973.2483838-3844.)，它是由野生型白喉毒素的堿基序列中由一個堿基G突變?yōu)锳，從而導(dǎo)致了第52位氨基酸GLY突變?yōu)镚LU，參見簡尼尼等人，兩種白喉毒素?zé)o毒性突變體CRM45和CRM197的氨基酸序列，核酸研究，1984.Vol.12 No.10，P4063-4070(G.Giannini，R.Rappuoli and G.Ratti al.，The amino-acid sequence of two non-toxic mutants ofdiphtheria toixnCRM45 and CRM197..Nucleic Acids Research.1984.Vol.12 No.10，P4063-4070)。從結(jié)構(gòu)上看，CRM197具有完整的白喉毒素功能結(jié)構(gòu)，但實驗表明，白喉毒素的A片斷能與NAD結(jié)合而CRM197不能，這表明NAD結(jié)合位點的變化影響了白喉毒素的酶活性及毒性。后來研究證明CRM197與白喉毒素的差異在于52位的GLY突變?yōu)镚LU，這就證明了52位的GLY在白喉毒素NAD結(jié)合位點起著重要作用，這就導(dǎo)致白喉毒素酶活性位點——同NADEF2 ADP核糖轉(zhuǎn)移酶結(jié)合區(qū)發(fā)生改變，導(dǎo)致CRM197片斷A不能EF2結(jié)合，不能對細胞起到毒性作用，參見摩依那，克麗思天森.采用凝膠過濾和飽和硫酸氨沉淀法純化白喉毒素和白喉類毒素方法的比較.病原微生物及免疫治療年會.1984，9217-23(K.Moyner，G.Christiansen，Comparison of gel filtration and ammonium sulphateprecipitation in the purification of diphtheria toxin and toxoid，Acta pathmicrobiol immunol scand sect C，1984，9217-23)。CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有白喉毒素的免疫原性，因此CRM197也常被用作一種免疫蛋白載體交聯(lián)其它半抗原一起作為疫苗。早在1985年美國科學(xué)家就利用CRM197的免疫原性，將嗜血流感菌表面的多糖交聯(lián)到白喉類毒素及CRM197的蛋白載體上制作疫苗防治呼吸道感染，從防治效果上看，兩種交聯(lián)疫苗在效果上沒有顯著差異，但都能使小孩產(chǎn)生較強的免疫記憶，參見彼得.安德森，米切而，皮其切羅，瑞卡德.采用白喉類毒素或白喉毒素蛋白CRM197交聯(lián)嗜血流感菌b亞型表面的多糖制備流感免疫原.臨床調(diào)研雜志.198552-59(Porter Anderson，Micheal E.Pichichero，and Richard A.Insel.Immunogens Consisting ofOligosaccharides from the Capsule of Haemophilus influenzae Type b Coupled toDiphtheria Toxiod or the Toxin protein CRM197.J.Clin.Invest.198552-59)。美國科學(xué)家針對小兒在2歲前對于肺炎球菌疫苗(球菌表面多糖，PnPs)不能產(chǎn)生免疫記憶，因此將球菌表面七價多糖交聯(lián)于多種蛋白載體以便在小兒2歲前能對肺炎球菌產(chǎn)生抗體，經(jīng)過多種蛋白載體交聯(lián)后的動物及臨床效果比較，發(fā)現(xiàn)PnPs-CRM197能產(chǎn)生較好的免疫效果，而且安全無毒負作用，參見布萊克，謝里蜚德，伐而曼，路易斯，瑞，漢森，艾而紋，恩塞而，哈克而，斯博而，曼李羅斯克，馬奪，常儀，科白格，沃克，奧斯廷，愛德沃德.2000，交聯(lián)七價肺炎球菌表面多糖疫苗在兒童體內(nèi)的有效性、安全性和免疫原性.傳染病學(xué)報.9187-195(Black，S.，H.Shinefield，B.Fireman，E.Lewis，P.Ray，J.R.Hansen，L.Elvin，K.M.Ensor，J.Hackell，G.Siber，F(xiàn).Malinoski，D.Madore，I.Chang，R.Kohberger，W.Watson，R.Austrian，K.Edwards，et al.2000.Efficacy，safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine inchildren.Pediatr.Infect.Dis.J.9187-195)。目前該產(chǎn)品也通過美國FDA批準(zhǔn)上市，商品名為Prevnar[BIOPHARMABiopharmaceutical Products in the U.S.Market]。意大利科學(xué)家Francesco針對流行性腦膜炎也采用了利用其病菌表面多糖交聯(lián)CRM197制作疫苗，他們從CRM197的結(jié)構(gòu)上分析了交聯(lián)的可行性，其中CRM197帶有39個Lysin氨基酸殘基和16個Arg殘基，能提供較多的交聯(lián)用的游離氨基。從實驗結(jié)果來看，雖然化學(xué)交聯(lián)率較高，但都沒有達到理論交聯(lián)率，而且，不同的糖其交聯(lián)率也存在差異，這說明交聯(lián)率也與交聯(lián)物相關(guān)，參見弗朗西斯科.貝體，保羅.克斯壇替，麥克.弗萊該，克羅的奧.魯奇拉滋.多糖-蛋白交聯(lián)疫苗的水溶性、沉積性和動力學(xué)特點。(Francesco Berti，Paolo Costantino，Marco Fragai，y and Claudio Luchinatz。Water Accessibility，Aggregation，and Motional Features of Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines.Biophysical Journal Volume 86 January 2004 3-9)。
針對現(xiàn)有CRM197的不足，海南天源康澤醫(yī)藥科技有限公司對原有CRM197的基因序列進行了改進，構(gòu)建了表達CRM197的重組表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達宿主中以包涵體形式表達。結(jié)果目的產(chǎn)物CRM197表達量高，在全菌蛋白中占24％以上，且目的產(chǎn)物的回收率高易于純化，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。參見中國專利CN200610042194.7。
胃泌素(gastrin)是一種肽類激素，按照分子結(jié)構(gòu)可分為大胃泌素(big gastrin G34)，小胃泌素(little gastrin G17)，小小胃泌素(minigastrin G14)，大大胃泌素(big big gastrin)和成分I(component I)，是由位于胃腸道的G細胞分泌的。其傳統(tǒng)作用是刺激胃酸和蛋白酶原的分泌以及對消化道細胞的營養(yǎng)作用，參見鄒繼紅，李金瑞，張忠平 胃泌素研究的新進展.放射免疫學(xué)雜志1995年第8卷第4期。近年來胃泌素和膽囊收縮素(CCK)作為單純消化道激素的概念發(fā)生了較大的變化，其對胃腸道腫瘤的調(diào)控作用逐漸成為人們關(guān)注的焦點，參見柔譖哥特E，沃爾石J.H.胃泌素、膽囊收縮素，信號傳導(dǎo)和腫瘤。(Rozengurt E，Walsh JH.Gastrin，CCK，signaling，and cancer.Annu Rev Physiol，2001，6349-76)。大多數(shù)消化道腫瘤細胞能合成和分泌胃泌素，并表達相應(yīng)的受體，其分泌的胃泌素通過自身的受體后途徑發(fā)揮對腫瘤的調(diào)節(jié)作用，此即消化道腫瘤的Gastrin/CCK自分泌調(diào)節(jié)環(huán)路(autocrine loop)，這可能是消化道腫瘤細胞最重要的生物學(xué)特性和自主性調(diào)節(jié)機制之一，參見巴爾德文GS，胃泌素和膽囊收縮素在正常癌變胃腸道生長中的作用。(Baldwin GS.The role of gastrin andcholecystokinin in normaland neoplastic gastrointestinal growth.J Gastroenterol Hepatol，1995，10(2)581-584)。近年來的研究表明，除了成熟的酰胺化分子形式外，消化道腫瘤細胞尚能分泌有調(diào)節(jié)作用的胃泌素前體和甘氨酸延伸型中間產(chǎn)物。已經(jīng)證實在胃癌、大腸癌、胰腺癌及膽管癌中均存在完整的胃泌素自分泌調(diào)節(jié)環(huán)路，這一環(huán)路對消化道腫瘤的發(fā)生、生長及浸潤轉(zhuǎn)移過程均有調(diào)控作用，參見張豐深，何振平，馬寬生消化道腫瘤細胞Gastrin/CCK自分泌調(diào)節(jié)環(huán)路的研究進展.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2002，1992-94)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以白喉毒素突變體CRM197為載體的免疫原及其制備方法。
本發(fā)明的另一任務(wù)是通過體外及體內(nèi)實驗評價了免疫原對消化道腫瘤的抗腫瘤活性。
本發(fā)明的免疫原，是以白喉毒素突變體CRM197為載體蛋白，通過異型雙功能交聯(lián)劑ε-馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS)與胃泌素G17分子相交聯(lián)而得的G17CRM197，其中，所述的G17分子的氨基酸序列如下(a)序列特征長度16個氨基酸類型氨基酸(b)分子類型多肽(c)序列描述pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys所述的白喉毒素突變體CRM197，具有如下序列(a)序列特征*長度536氨基酸*類型氨基酸(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser1 5 10 15 20Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys21 25 30 35 40Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys41 45 50 55 60Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly61 65 70 75 80Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala81 85 90 95 100Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly101 105 110 115 120Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro121 125 130 135 140Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu141 145 150 155 160Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr161 165 170 175 180
Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu181 185 190 195 200Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser201 205 210 215 220Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser221 225 230 235 240Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu241 245 250 255 260Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala261 265 270 275 280Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys281 285 290 295 300Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly301 305 310 315 320Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met321 325 330 335 340Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn341 345 350 355 360Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala361 365 370 375 380Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn381 385 390 395 400Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys401 405 410 415 420Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly421 425 430 435 440Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met441 445 450 455 460Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val461 465 470 475 480Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile481 485 490 495 500His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp501 505 510 515 520His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser521 525 530 535本發(fā)明的免疫原G17CRM197的制備方法如下以白喉毒素突變體CRM197為載體蛋白，選用異型雙功能交聯(lián)劑ε-馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS)，通過交聯(lián)反應(yīng)，將胃泌素G17分子與CRM197相交聯(lián)，測定交聯(lián)率，每個CRM197分子上交聯(lián)15-20個G17分子。
上述G17的自由巰基的數(shù)量應(yīng)不低于60％。因此需要預(yù)先測定G17中自由巰基的數(shù)量，如巰基含量少于60％，則需要對其進行還原。具體還原方法可使用Ellman試劑(Ellman’s Reagent)按照使用說明書中的操作指南進行。
上述的CRM197中游離氨基的數(shù)量應(yīng)不低于5摩爾/每摩爾CRM197。優(yōu)選的游離氨基數(shù)量范圍為每摩爾CRM197中含有10-30摩爾游離氨基。因此需要預(yù)先采用熒光胺法測定CRM197中游離氨基的數(shù)量。若每摩爾CRM197中的游離氨基低于5摩爾則不能制備出具有較高活性的免疫原。
至于具體地交聯(lián)反應(yīng)可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法進行，如G.L.瓊斯、H.M.愛德蒙德森、L.斯本德、J.蓋爾、A.紹爾等在利用馬來酰亞胺基己酸琥珀酸亞胺基酯來制備馬來酰多肽載體免疫原中所報道的方法(G.L.Jones，H.M.Edmundson，L.Spender.J.Gale，A.Saul.The use of maleimidocaproyloxysuccinimide to prepare malarial peptide carrier immunogens.Journal of immunological methods，123(1989)211-216)。交聯(lián)率的測定方法可選用本領(lǐng)域人員所熟悉的方法，如SDS-PAGE法、化學(xué)定量法或氨基酸分析法等。
本發(fā)明提供以下具體操作步驟，但不限于此(1)首先使G17與交聯(lián)劑EMCS反應(yīng)，反應(yīng)時間為2小時，得到活化的G17；(2)通過G10脫鹽柱對活化的G17進行純化；(3)活化純化后的G17再與CRM197進行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時間為2小時；(4)對交聯(lián)產(chǎn)物進行純化。
步驟(4)所述的純化，可采用透析法(透析袋截留量為8000-10000道爾頓)、超濾法以及凝膠柱脫鹽的方法進行純化。具體優(yōu)選G25脫鹽柱進行純化。
測定所制備的交聯(lián)產(chǎn)物的免疫原性。采用免疫動物的方法來測定所制備的交聯(lián)產(chǎn)物刺激動物產(chǎn)生抗體的情況，按照常規(guī)的方法進行免疫，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測產(chǎn)生的抗體效價。
用所制備的G17CRM197免疫原免疫動物，第三次免疫后兩周將動物處死并采集血清。對所采集的血清進行純化得到抗G17CRM197抗體，并將所得到的抗體進行體外、體內(nèi)藥效評價。體外實驗所采用的腫瘤細胞為胃癌細胞MKN45、BGC823和大腸癌細胞LOVO、SW480；體內(nèi)實驗用裸鼠進行。通過體外腫瘤細胞培養(yǎng)及裸鼠體內(nèi)抑瘤實驗證明本發(fā)明的免疫原性抗體對胃癌及大腸癌有明顯的治療作用。具體內(nèi)容將在實施例中進一步詳細說明。
以白喉毒素突變體CRM197為載體的免疫原的制藥用途，用于制備治療腫瘤的藥物。以本發(fā)明的免疫原作為治療性疫苗的有效成分，以適宜的免疫佐劑作為輔料制成的藥物制劑可直接用于人體注射。此免疫原在人體內(nèi)能夠刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗胃泌素抗體，此抗體可中和消化道腫瘤患者體內(nèi)過多的胃泌素，從而達到治療腫瘤的目的。
與現(xiàn)有的技術(shù)相比較，本發(fā)明的優(yōu)良效果主要表現(xiàn)在以下幾個方面1.本發(fā)明所使用的蛋白載體為白喉毒素突變體CRM197，具有回收率高，易于純化，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點；2.使用的白喉毒素突變體CRM197物質(zhì)單一、制備工藝簡單、質(zhì)量易于控制；3.本發(fā)明的制備方法整個制備過程僅需6小時，比現(xiàn)有技術(shù)大為縮短，極大的降低了生產(chǎn)成本；
4.所制備的交聯(lián)產(chǎn)物交聯(lián)率大大高于現(xiàn)有技術(shù)，也就是說每個CRM197分子所交聯(lián)上的G17分子明顯多于現(xiàn)有技術(shù)；本發(fā)明的交聯(lián)率介于15-20個G17分子/CRM197分子之間，而現(xiàn)有技術(shù)只能達到7-15個G17分子/CRMl97分子。
5.動物實驗結(jié)果表明，與現(xiàn)有技術(shù)相比較，G17CRM197的免疫原性更強，所產(chǎn)生的抗體滴度最高可達到1∶500000，根據(jù)文獻報道現(xiàn)有技術(shù)所能達到的抗體滴度為1∶64000。
6.體外及裸鼠體內(nèi)抑瘤實驗表明此交聯(lián)產(chǎn)物具有較好的抗腫瘤效果。


圖1是本發(fā)明的免疫原性組合物的SDS-PAGE圖，其中1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為CRM197，3為活化后的CRM197，4為交聯(lián)產(chǎn)物。
圖2是用本發(fā)明所制備的免疫原性組合物免疫動物后分別在14、35和56天所測得的抗體滴度。其中橫坐標(biāo)表示實驗天數(shù)，縱坐標(biāo)表示抗體滴度。
圖3是采用ELISA法檢測抗血清抗體滴度照片。其中1為用現(xiàn)有技術(shù)G17DT免疫動物所得到的抗血清的檢測結(jié)果，2為用本發(fā)明所制備的免疫原免疫動物所得到的抗血清的檢測結(jié)果，3為陽性對照，4為陰性對照，橫向數(shù)字為抗血清的稀釋倍數(shù)。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例詳細說明本發(fā)明免疫原性組合物G17CRM197的制備方法。
實施例11.所用材料1.1主要試劑單水合半胱氨酸鹽酸鹽(Cysteine Hydrochloride Monohydrate)，巰基測定試劑Ellman試劑，交聯(lián)劑EMCS皮爾斯(Pierce)公司產(chǎn)品；熒光胺西咖瑪(Sigma)公司產(chǎn)品；其它為國產(chǎn)試劑。
1.2主要儀器設(shè)備TGL-16型高速臺式離心機上海醫(yī)療器械六廠產(chǎn)品。
微量移液器德國愛本道夫Eppendof公司產(chǎn)品。
HD95-1蛋白檢測儀及3057型記錄儀(上?？等A生化儀器制造廠)。蠕動泵蘭格泵，YZ1515，保定蘭格恒流泵有限公司。BHW-IV電熱恒溫水溫箱北京市醫(yī)療設(shè)備廠。J2-MC高速低溫離心機Beckman公司產(chǎn)品。制冰機(GRANT)、1-15離心機(Sigma)，Spectrumlad54紫外可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)、FR-200凝膠呈像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)、DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)、DYY-12型電腦三恒多用電泳儀(北京市六一儀器廠)、MS2迷你振蕩器(IKA，廣州公司)、PHS-3C型精密PH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、MILLEXTMGP 0.22um微孔濾器(Millipore)、超凈工作臺、電子天平。
1.3抗體及二抗、佐劑辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔二抗(北京華美生物工程公司)，白喉類毒素抗體(Sigma公司)，弗氏佐劑(BBI公司)。
2.免疫原性組合物的制備方法2.1巰基及氨基的測定以單水合半胱氨酸鹽酸鹽(Cysteine Hydrochloride Monohydrate)為對照，采用Ellman試劑測定的方法作出標(biāo)注曲線。精確配制0.1mM的G17溶液，同樣采用Ellman試劑進行測定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出自由巰基的數(shù)量。本發(fā)明中所使用的G17經(jīng)測定，其中巰基含量為97％，無需進行處理。若巰基含量較低，則需要對G17進行還原，可以采用二硫蘇糖醇進行處理。
采用熒光胺試劑測定CRM197中游離氨基的數(shù)量。以甘氨酸為對照作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確配置0.1M的CRM197溶液，同樣用熒光胺進行測定，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比計算出游離氨基的數(shù)量。本發(fā)明中所使用的CRM197中游離氨基的數(shù)量為30mol氨基/molCRM197。
2.2交聯(lián)物的制備方法一稱取20mgG17，溶于1ml氮氣飽和的磷酸鈉緩沖液(pH6.5-7.0)中；稱取6mgEMCS溶于100ul二甲基甲酰胺中，待其充分溶解后在15分鐘內(nèi)緩慢、分次加入至G17溶液中，振蕩反應(yīng)2小時。此步反應(yīng)要求EMCS在分子數(shù)量絕對高于G17的分子數(shù)量。
將上述反應(yīng)產(chǎn)物進行純化以除去未反應(yīng)的EMCS。純化方法有多種，可以采用G10脫鹽柱法，也可以采用透析的方法。
稱取10mgCRM197，緩慢加入至上述純化過的G17中，振蕩反應(yīng)過夜。除去未反應(yīng)的G17后即得到交聯(lián)產(chǎn)物。同樣可以采用透析或G25脫鹽柱來除去未反應(yīng)的G17。
方法二稱取20mgCRM197溶于磷酸鈉緩沖液中；稱取6mgEMCS溶于100ul二甲基甲酰胺中，待其充分溶解后在15分鐘內(nèi)緩慢、分次加入至CRM197溶液中，振蕩反應(yīng)2小時。
將上述反應(yīng)產(chǎn)物進行純化以除去未反應(yīng)的EMCS。純化方法有多種，可以采用G10脫鹽柱法，也可以采用透析的方法。
稱取10mgG17，緩慢加入至上述純化過的CRM197中，振蕩反應(yīng)過夜，同時采用氮氣保護。除去未反應(yīng)的G17后即得到交聯(lián)產(chǎn)物。同樣可以采用透析或G25脫鹽柱來除去未反應(yīng)的G17。
2.3交聯(lián)率的測定本發(fā)明所指的交聯(lián)率是指每一分子的CRM197上所結(jié)合的G17分子的個數(shù)，其測定方法多樣?？赏ㄟ^肽含量特征分析，肽含量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員抑制的許多方法比如重量增加和氨基酸分析等來測定。也可以通過SDS-PAGE電泳的方法進行，通過對比反應(yīng)前后CRM197在分子量上的變化來計算交聯(lián)率。另外也可以通過計算CRM197上結(jié)合的EMCS數(shù)量的變化來間接計算交聯(lián)率。具體就是使與EMCS反應(yīng)后并經(jīng)過純化的CRM197與半胱氨酸鹽酸鹽一起培育，然后和10mM的Ellman試劑反應(yīng)，用Ellman試劑于412nm處的摩爾消光系數(shù)13600計算游離的半胱氨酸中的巰基。在反應(yīng)結(jié)束之后再通過同樣的方法計算一下EMCS的數(shù)量，兩次測定數(shù)值之差即為交聯(lián)G17分子的數(shù)量。其中蛋白濃度采用Lowry法或Bradford法來測定。
3.免疫原性的測定3.1動物的免疫將所制備的交聯(lián)物G17CRM197溶于生理鹽水，并與等量弗氏佐劑混合，使得交聯(lián)物的最終濃度為1mg/ml。免疫時間為0、21、42天；免疫方法采用家兔后腿肌肉注射，第一次注射右腿，第二次注射左腿，第三次注射右腿，注射點略高于第一次注射點。第一次注射采用弗氏完全佐劑處理樣品，后兩次采用弗氏不完全佐劑處理，并且第一次免疫劑量為1mg，后兩次的免疫劑量為0.5mg。
分別在第14、35、56天采集兔血進行抗體效價檢測。其中前兩次為家兔耳緣靜脈采血，第三次為頸動脈采血，采集的血清室溫下放置1小時，凝固后置4℃過夜，析出血清，2000rpm離心，分離血清。血清保存于-4℃，2周內(nèi)備用。
3.2抗體滴度的檢測抗血清效價檢測最為常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。本發(fā)明所使用的檢測方法即為ELISA法。具體為將免疫原G17BSA用包被液(Na2CO3-NaHCO3，pH9.6)稀釋至0.1ug/ml，包被聚苯乙烯96孔板，50ul/孔，4℃培育過夜。洗板三次后用封閉液(2％BSA-PBS)封閉，50ul/孔，37℃，2小時。加抗血清，將采集的抗血清做如下倍數(shù)稀釋2000、8000、16000、32000、64000、128000、256000、512000，每孔50ul，37℃培育2小時。以注射生理鹽水的兔血清為陰性對照，以商品抗白喉毒素抗體為陽性對照，同時與以注射G17DT的兔子產(chǎn)生的抗血清進行比較。洗滌三次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，1∶4000稀釋，37℃孵育1小時。洗板10次后加底物顯色，37℃孵育40分鐘后終止反應(yīng)，測定A491值。
結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出用本發(fā)明所制備的免疫原免疫動物三次后產(chǎn)生了高滴度的抗胃泌素抗體，最高效價達到1∶512000，而用現(xiàn)有技術(shù)G17DT免疫動物三次后產(chǎn)生的抗體滴度為1∶64000。實驗結(jié)果充分證明本發(fā)明所制備的免疫原性組合物能夠刺激機體產(chǎn)生高滴度抗胃泌素抗體，且其免疫原性要明顯高于現(xiàn)有技術(shù)中的G17DT。
實施例21.體外抑瘤實驗1.1腫瘤細胞培養(yǎng)過程中所產(chǎn)生的胃泌素的檢測本發(fā)明采用胃泌素檢測試劑盒(ELISA法)測定腫瘤細胞培養(yǎng)過程中胃泌素的產(chǎn)生情況。
取培養(yǎng)好的腫瘤細胞株，倒置顯微鏡下觀察細胞呈單層鋪滿整個生長面，表明生長良好。在無菌室內(nèi)消化并制成單細胞懸液。取細胞懸液在血球計數(shù)板上計數(shù)，調(diào)整RPMI1640液的量，使最終細胞數(shù)為1×109個/L，用移液管取1ml細胞懸液接種在T25培養(yǎng)瓶中，另加RPMI1640液約4ml。每天換液1次，將更換的RPMI 1640液5ml收集起來，留作ELISA測定。換液時隨機取2瓶，按上述步驟制成單細胞懸液，取細胞懸液在血球計數(shù)板上計數(shù)，取其均數(shù)，代表此時每瓶中的細胞數(shù)。凡已計數(shù)過的該瓶細胞，不再包括在實驗之內(nèi)。連續(xù)3次，共培養(yǎng)72小時。
將結(jié)果進行統(tǒng)計，見下表。
表1a胃癌細胞MKN45培養(yǎng)過程中胃泌素的產(chǎn)生情況
表1b胃癌細胞BCG823培養(yǎng)過程中胃泌素的產(chǎn)生情況
表1c大腸癌細胞LOVO培養(yǎng)過程中胃泌素的產(chǎn)生情況
表1d大腸癌細胞SW480培養(yǎng)過程中胃泌素的產(chǎn)生情況
以上結(jié)果表明，胃癌細胞MKN45、BCG823和大腸癌細胞LOVO、SW480在培養(yǎng)過程中能分泌胃泌素，且隨著細胞不斷增殖，其分泌的胃泌素數(shù)量也增加，兩者呈正相關(guān)。
1.2用本發(fā)明所制備的免疫原所制備的抗G17CRM197抗體對腫瘤細胞的生長抑制實驗向生長良好的腫瘤細胞中加入實施例1中所制備的抗體，通過MTT法測定不同處理組(加胃泌素17組、加抗體組、空白對照組)的細胞活力，以確定抗體對腫瘤細胞的抑制作用。所選用的腫瘤細胞為胃癌細胞MKN45和大腸癌細胞SW480。
腫瘤細胞株體外細胞培養(yǎng)，10％小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中分別加入無菌的胃泌素17和胃泌素抗體，分成三組空白對照組、胃泌素17組(25ug/ml)抗體組(30ug/ml)。
細胞活力的測定應(yīng)用噻氮唑藍(MTT)比色分析法測定細胞活力，取100ul含細胞的培養(yǎng)液(細胞濃度為105/ml)，接種于96孔培養(yǎng)板，細胞貼璧后吸去培養(yǎng)液；按上述分組分別加入培養(yǎng)液、胃泌素17和抗體，各組均設(shè)8個復(fù)孔，培養(yǎng)66小時后每孔加MTT(5mg/ml)20ul，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，離心棄上清，每孔加20％SDS100ul，震蕩5分鐘，置室溫半小時后在酶標(biāo)儀上測定570nm波長處的吸光度。
各組A570值間接反映活細胞數(shù)量，結(jié)果表明不論是胃癌細胞MKN45還是大腸癌細胞SW480，胃泌素組活細胞數(shù)明顯高于對照組(P＜0.01)，抗體組細胞數(shù)明顯下降(P＜0.01)。
表2抗G17CRM197抗體對腫瘤細胞的生長抑制情況
2.裸鼠體內(nèi)抑瘤實驗?zāi)[瘤動物模型的建立取含有MKN45細胞和SW480細胞的培養(yǎng)液70ul(細胞數(shù)107)，接種于裸鼠右腋背交界處皮下層內(nèi)成瘤，瘤塊反復(fù)接種2次，形成腫瘤動物模型，取雄性裸鼠隨機分成三組，每組六只；傳代的腫瘤在放大鏡下剪成大小一致的立方體狀瘤塊，約8mm3大小，以套管針分別接種于裸鼠右前腋背交界處皮下。
各組均自瘤塊接種后第1天開始用藥。對照組每只裸鼠腹腔內(nèi)注射羧甲基纖維素助懸劑200ul，每日2次，共治療28天；抗體組每只裸鼠靜脈注射抗體500mg/kg，每日2次，共治療28天。
療效觀察第5天時腫瘤開始形成，用游標(biāo)卡尺測量每只裸鼠荷瘤的最長徑及垂直徑，隔天測量1次；第28天時裸鼠全部存活，取出腫瘤并稱重。計算抑瘤率。各組差別用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果接種第5天時已有腫瘤生長，測量各組腫瘤面積，大小相近，無顯著性差異(P＞0.05)，表明腫瘤生長的均一性好，從第16天開始抗體組腫瘤面積較對照組明顯縮小，差異有顯著性(P＜0.05)；第28天時抗體組腫瘤面積較對照組更小。
根據(jù)腫瘤的重量變化計算，用本發(fā)明所制備的抗體的抑瘤率對于兩種腫瘤的抑瘤率分別達到28％和26％。腫瘤重量變化情況如下表所示。
表3體內(nèi)腫瘤重量變化表
序列表<110>海南天源康澤醫(yī)藥科技有限公司<120>以白喉毒素突變體CRM197為載體的免疫原及其制備方法與應(yīng)用<140>
<141>
<160>2<170>Patent In3.1<210>1<211>16<212>多肽<400>1pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys5 10 15<210>2<211>536<212>蛋白質(zhì)<213>白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)<400>2Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser1 5 10 15 20Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys21 25 30 35 40Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys41 45 50 55 60Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly61 65 70 75 80Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala81 85 90 95 100Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly101 105 110 115 120Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro121 125 130 135 140Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu141 145 150 155 160Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr161 165 170 175 180Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu181 185 190 195 200Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser201 205 210 215 220
Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser221 225 230 235 240Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu241 245 250 255 260Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala261 265 270 275 280Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys281 285 290 295 300Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly301 305 310 315 320Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met321 325 330 335 340Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn341 345 350 355 360Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala361 365 370 375 380Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn381 385 390 395 400Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys401 405 410 415 420Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly421 425 430 435 440Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met441 445 450 455 460Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val461 465 470 475 480Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile481 485 490 495 500His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp501 505 510 515 520His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser521 525 530 53權(quán)利要求
1.一種免疫原，其特征是以白喉毒素突變體CRM197為載體蛋白，通過異型雙功能交聯(lián)劑ε-馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS)與胃泌素G17分子相交聯(lián)而得的G17CRM197，其中，所述的G17分子的氨基酸序列如下pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys所述的白喉毒素突變體CRM197的氨基酸序列如下Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser1 5 10 15 20Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys21 25 30 35 40Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys41 45 50 55 60Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly61 65 70 75 80Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala81 85 90 95 100Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly101 105 110 115 120Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro121 125 130 135 140Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu141 145 150 155 160Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr161 165 170 175 180Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu181 185 190 195 200Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser201 205 210 215 220Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser221 225 230 235 240Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu241 245 250 255 260Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala261 265 270 275 280Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys281 285 290 295 300Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly301 305 310 315 320Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met321 325 330 335 340Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn341 345 350 355 360Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala361 365 370 375 380Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn381 385 390 395 400Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys401 405 410 415 420Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly421 425 430 435 440Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met441 445 450 455 460Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val461 465 470 475 480Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile481 485 490 495 500His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp501 505 510 515 520His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser521 525 530 535。
2.權(quán)利要求1的免疫原G17CRM197的制備方法，以白喉毒素突變體CRM197為載體蛋白，選用異型雙功能交聯(lián)劑ε-馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯，通過交聯(lián)反應(yīng)，將胃泌素G17分子與CRM197相交聯(lián)，每個CRM197分子上交聯(lián)15-20個G17分子，得到一種具有強免疫原性的免疫原。
3.如權(quán)利要求2所述的免疫原G17CRM197的制備方法，其特征在于具體步驟為(1)首先使G17與交聯(lián)劑ε-馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，反應(yīng)時間為2小時，得到活化的G17；(2)通過G10脫鹽柱對活化的G17進行純化；(3)活化純化后的G17再與CRM197進行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時間為2小時；(4)對交聯(lián)產(chǎn)物進行純化。
4.如權(quán)利要求2所述的免疫原G17CRM197的制備方法，其特征在于所述G17中自由巰基的數(shù)量不少于60％。
5.如權(quán)利要求2所述的免疫原G17CRM197的制備方法，其特征在于所述的CRM197中游離氨基的數(shù)量不低于5摩爾/摩爾CRM197。
6.如權(quán)利要求2所述的免疫原G17CRM197的制備方法，其特征在于所述的CRM197中游離氨基數(shù)量范圍為每摩爾CRM197中含有10-30摩爾游離氨基。
7.權(quán)利要求1所述免疫原的制藥用途，用于制備治療腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫原及其制備方法，是以白喉毒素突變體CRM197為載體蛋白，通過異型雙功能交聯(lián)劑ε－馬來酰亞胺基己酸N－羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS)與胃泌素G17分子相交聯(lián)而得的G17CRM197。本發(fā)明所使用的載體蛋白具有回收率高，易于純化，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點，同時交聯(lián)產(chǎn)物交聯(lián)率高，制備時間短，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明也涉及用此方法制備的免疫原作為治療性疫苗的有效成分，以適宜的免疫佐劑作為輔料制成的藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/22GK101050236SQ20061004344
公開日2007年10月10日 申請日期2006年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月6日
發(fā)明者王晶翼, 王棟海, 李模孝, 張薛, 王慶民, 劉祿娟, 衛(wèi)立辛 申請人:海南天源康澤醫(yī)藥科技有限公司