專利名稱：白喉毒素的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備白喉毒素的細菌生長培養(yǎng)基以及白喉毒素的制備方法。
背景技術(shù)：
白喉是由白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)感染引起的一種危及生命的疾病，白喉棒桿菌是革蘭氏陽性、需氧、棒狀的細菌。疾病是由白喉棒桿菌的產(chǎn)毒素菌株對鼻咽組織局部侵襲引起的。生物在覆蓋疼痛、出血和壞死病灶的粗糙的纖維蛋白膜內(nèi)生長，所述膜可能位于扁桃體或鼻咽區(qū)域內(nèi)。在以往的典型流行期間，疾病的傳播是通過飛沫傳染。除非用抗生素進行強有力的治療，否則恢復的白喉病人在其喉部和鼻咽可能攜帶產(chǎn)毒細菌數(shù)周或數(shù)月。
白喉的多數(shù)臨床癥狀是由攜帶tox基因的棒桿菌原噬菌體產(chǎn)生的強白喉毒素引起的。在原噬菌體感染白喉棒桿菌后，發(fā)生溶原化，菌株變成毒性菌株。由白喉毒素的非毒性形式(類毒素)的活性免疫誘導產(chǎn)生的毒素中和抗體(抗毒素)能預防白喉。目前的免疫策略是利用白喉疫苗，白喉疫苗是通過用甲醛處理將白喉毒素轉(zhuǎn)換成非毒性、但具有抗原性的類毒素形式制備的。在世界范圍內(nèi)，白喉類毒素用于與其他疫苗組分的各種組合來進行大規(guī)模免疫。世界衛(wèi)生組織(WorldHealth Organization)(WHO)最近估計，世界范圍內(nèi)每年大約有100,000病例和最多8,000例死亡是由于嬰兒免疫的減少、成人對白喉免疫的降低以及疫苗的供應不足。
白喉棒桿菌的Parke Williams 8(PW8)株變體常被用來產(chǎn)生外毒素，由此通過化學修飾來制備類毒素。通常，含有氨基酸、痕量維生素、無機鹽以及碳水化合物源如麥芽糖的培養(yǎng)基制劑促進細菌的良好生長。不同的培養(yǎng)基，如酪蛋白的酸消化產(chǎn)物以及牛肌肉的酶消化產(chǎn)物(胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)是毒素制備的合適培養(yǎng)基。在常規(guī)的方法中，細菌培養(yǎng)在含有動物來源的蛋白性物質(zhì)的培養(yǎng)基中。白喉生產(chǎn)的常用培養(yǎng)基是NZ-Amine Type A培養(yǎng)基，其含有酪蛋白消化產(chǎn)物。在合適的條件下，使用絮凝限量方法，用NZ-Amine Type A培養(yǎng)基制備的毒素量是180Lf/mL。(參考文獻1-3，在本申請中，各參考文獻均在括號中引用來更充分描述本發(fā)明所屬的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)。各參考文獻的全部著錄信息列于本說明書之后權(quán)利要求之前。各參考文獻的公開內(nèi)容均以引用的形式并入本公開內(nèi)容)。
動物來源的蛋白性材料的使用導致在用培養(yǎng)基制備的白喉毒素中引入不希望的污染物。
El Kholy等1967(Ref.4)將從黃羽扇豆(Lupinus luteus)的發(fā)芽種子制備的營養(yǎng)培養(yǎng)基(大豆提取物)用于白喉棒桿菌生長的培養(yǎng)基。盡管細菌在其中生長良好，但是白喉類毒素的產(chǎn)生卻是最小限度的。El Kholy和Karamya(1979)(Ref.5)得出結(jié)論，大豆提取物中的皂苷會抑制毒素的產(chǎn)生。Taha和Kholy(1985)(Ref.6)對大豆先高壓滅菌，再用沸水連續(xù)提取，以得到產(chǎn)生毒素的水性提取物，所得毒素的Lf值與對照(肉湯)相當，推測原因可能是蒸汽高壓滅菌破壞了三種胰蛋白酶抑制劑以及連續(xù)的煮沸降低了提取物中的皂苷含量。大豆食品在pH4.6的酸提取導致產(chǎn)生具有與對照(肉湯)的Lf值比得上的Lf值的提取物，因為在此pH皂苷和胰蛋白酶抑制劑的提取量均有限。
Wolfe等的2000年8月31日公布，并轉(zhuǎn)讓給NYCOMEDIMAGING AS的國際專利申請WO00/50449中描述了制備白喉毒素的培養(yǎng)基和方法。WO00/50449中所述的所有培養(yǎng)基均含有酪蛋白氨基酸，其通過乳蛋白酪蛋白的酸水解得到。因此，WO00/50449中所述的所有培養(yǎng)基均含有動物來源的蛋白性材料。
Oliveri等的1998年12月3日公布，并轉(zhuǎn)讓給Chiron S.P.A.的國際專利申請WO98/541296中描述了制備白喉毒素的含有Soytone的培養(yǎng)基。
已描述了無毒，且常被稱作CRM(交叉反應材料)的白喉毒素的類似物(參見例如Ref7)。實例有CRM-197、CRM-9、CRM-45、CRM-102、CRM-103和CRM-107。
仍然需要基本上不含或完全不含動物成分的細菌生長培養(yǎng)基用于白喉棒桿菌的培養(yǎng)以及白喉毒素及其類似物的制備。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及制備白喉毒素及其類似物的生長培養(yǎng)基及其方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了制備白喉毒素或其類似物的培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基基本不含有動物來源的產(chǎn)物并含有水、碳水化合物源以及氮源，還含有起始濃度的大量游離氨基酸，其中每種游離氨基酸的起始濃度不會限制白喉毒素或其類似物的產(chǎn)生水平。培養(yǎng)基可含有所有天然存在的氨基酸，碳水化合物源可包含麥芽糖，且培養(yǎng)基可不含有葡萄糖。氮源可含有酵母提取物。培養(yǎng)基可完全不含有動物源性產(chǎn)物。
在本發(fā)明的第二方面，提供了白喉棒桿菌的培養(yǎng)基，其含有碳水化合物源、氮源以及含有至少四種游離氨基酸的添加劑系統(tǒng)，其每一種的量足以促進白喉棒桿菌產(chǎn)生一定水平的白喉毒素或其類似物，其中所述培養(yǎng)基基本不含有動物來源的產(chǎn)物。培養(yǎng)基可含有所有天然存在的氨基酸，碳水化合物源可以是麥芽糖。氮源可以是酵母提取物。合適的氨基酸濃度范圍是每升培養(yǎng)基約0.5g-約1g。培養(yǎng)基可完全不含有動物源性產(chǎn)物。
在本發(fā)明的第三方面，提供了制備白喉毒素或其類似物的方法，其包括在本文所提供的任何培養(yǎng)基中培養(yǎng)白喉棒桿菌的步驟。白喉棒桿菌菌株生長直至穩(wěn)定期，且可獲得至少100Lf/mL白喉毒素或其類似物的生產(chǎn)?；厥瞻缀矶舅鼗蚱漕愃莆?，將其純化并去毒以得到白喉類毒素，后者可制備成疫苗用于免疫宿主，以免于其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病。
在另一方面，本發(fā)明延伸到免疫宿主以免于其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的方法，其包括給宿主施用此處描述的疫苗。從而，此處提供的疫苗可用于免疫宿主以免于其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病，此處提供的白喉類毒素可用于制備免疫宿主以免于其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的制劑。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其含有此處提供的白喉棒桿菌菌株及培養(yǎng)基。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種制備白喉毒素或其類似物的方法，其包括在培養(yǎng)基中生長白喉棒桿菌培養(yǎng)物并給培養(yǎng)物提供至少一種被選氨基酸以防止被選氨基酸的濃度限制毒素(或其類似物)的產(chǎn)生，其中所述培養(yǎng)基基本不含有動物來源的產(chǎn)物。培養(yǎng)基可進一步含有酵母提取物，其濃度為例如約3g/L。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種對在培養(yǎng)基中培養(yǎng)白喉棒桿菌的培養(yǎng)方法的改進，所述培養(yǎng)基含有用于制備一定生產(chǎn)水平的白喉毒素或其類似物的氨基酸，并且在培養(yǎng)過程中其中至少一種被選氨基酸被耗盡并限制白喉毒素或其類似物的生產(chǎn)水平，所述改進包括在所述培養(yǎng)過程中外源添加額外量的至少一種被選氨基酸，并且其中至少一種被選氨基酸不限制白喉毒素或其類似物的生產(chǎn)水平。至少一種被選氨基酸選自Glu、Asn、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp和異亮氨酸。
附圖簡述本發(fā)明通過參考附圖的如下說明將得到進一步闡釋，其中

圖1是顯示通過酵母提取物氨基酸互作效應導致的毒素產(chǎn)量中的變量互作效應；圖2是用含有動物成分及不含動物成分的培養(yǎng)基制備的白喉毒素及類毒素的SDS-PAGE分析；圖3是用含有動物成分及不含動物成分的培養(yǎng)基制備的白喉毒素及類毒素的蛋白印跡分析；圖4是用含有動物成分及不含動物成分的培養(yǎng)基制備的白喉毒素及類毒素的等電凝膠分析；圖5是用含有動物成分及不含動物成分的培養(yǎng)基制備的白喉毒素的圓二色性分析；圖6是用含有動物成分及不含動物成分的培養(yǎng)基制備的白喉類毒素的圓二色性分析；以及圖7是用含有動物成分及不含動物成分的培養(yǎng)基在200L規(guī)模制備的白喉類毒素的圓二色性分析。
發(fā)明詳述不含勸物成分的氨基酸培養(yǎng)基的配制NZ Amine是氨基酸和肽的來源，其由酶消化酪蛋白制備。它是氨基氮(游離氨基酸)和有機氮(肽)兩者的良好來源。制備白喉類毒素的白喉棒桿菌培養(yǎng)基中的氨基酸和肽的另一個來源是動物來源的Toxiprotone-D。這些培養(yǎng)基的組成在表和如下顯示含有NZ Amine的培養(yǎng)基的組成表1.含有NZ Amine的培養(yǎng)基的組成
表2.生長因子溶液的組成
表3.含有Toxiprotone的培養(yǎng)基的組成
不含動物成分的氨基酸培養(yǎng)基的配制在氨基酸培養(yǎng)基制備中，方法是在含有Toxiprotone-D和NZ-Amine動物成分的培養(yǎng)基中選擇更高濃度(nM)的每種氨基酸以制備能支持白喉棒桿菌生長和毒素產(chǎn)生的培養(yǎng)基。
白喉棒桿菌生長在含有NZ-Amine的培養(yǎng)基中。在發(fā)酵過程中在不同的時間間隔(24、30和41小時)鑒定幾種消耗的氨基酸(表4)。
表4通過HPLC確定的在含有Toxiprotone-D動物成分(Toxiprotone-D)和NZ-Amine動物成分的培養(yǎng)基中氨基酸的組成以及使用NZ Amine培養(yǎng)基發(fā)酵過程中氨基酸的消耗。
氨基酸濃度以mM表示。
通過使氨基酸消耗和毒素產(chǎn)生之間相互關(guān)聯(lián)，發(fā)酵實驗用以下含有氨基酸Asn、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp、Iso和Leu的培養(yǎng)基進行。
表5.含有氨基酸Asn、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp、Iso和Leu的生長培養(yǎng)基的組成
然而，僅用這些少量氨基酸不會引起細胞生長或毒素產(chǎn)生。
設計一種含有所有天然存在的氨基酸的培養(yǎng)基(CDM)。所有這些氨基酸都是非動物來源的。該培養(yǎng)基的組成如下表6所示。
表6不含動物成分的培養(yǎng)基CDM的組成
使用含有NZ amine或Toxiprotone的培養(yǎng)基以20L規(guī)模進行的白喉棒桿菌菌株的發(fā)酵批次的對比分析使用含有NZ amine的培養(yǎng)基的發(fā)酵在第一次預培養(yǎng)中，將親液種子從親液種子繁殖到Loefflers斜面，培養(yǎng)物在所述斜面在36±2℃生長22±2小時。在第二次預培養(yǎng)中，22±2小時的培養(yǎng)后，將細胞從斜面轉(zhuǎn)移到100mL的NZ amine培養(yǎng)基的原代燒瓶中并在36±2℃于180rpm下培養(yǎng)22小時。燒瓶還包含1mL的1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和0.5mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))。在第三次預培養(yǎng)中，將約5mL的原代培養(yǎng)物從100mL的原代搖瓶中取出并接種到250mL的NZ Amine培養(yǎng)基，然后在36±2℃于180rpm下培養(yǎng)22小時。培養(yǎng)物中還包含2.5mL的1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和1.25mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))。在發(fā)酵中，將15mL的第三次預培養(yǎng)物接種至發(fā)酵罐中15 L NZ Amine培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物還包括100.7mL的0.32％(w/v)磷酸鹽溶液以及125mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))和23.44mL的七水合硫酸亞鐵溶液(0.1％(w/v))。發(fā)酵在36±2℃的控制溫度下、在有1個Rushton渦輪高速攪拌機的Braun Fermentor中、用600rpm的攪動、通過液面上空間進行1.57vvm的通氣下進行。經(jīng)過25小時的發(fā)酵后，攪動加快至800rpm并將發(fā)酵罐加壓至0.4巴。發(fā)酵再繼續(xù)進行另外16小時。
使用含有Toxiprotone的培養(yǎng)基的發(fā)酵3.1.1在第一次預培養(yǎng)中，將親液種子從親液種子繁殖到含有5％羊血的細菌中胰蛋白瓊脂平板，并在36±2℃生長24±2小時。在第二次預培養(yǎng)中，將細胞從血液瓊脂平板轉(zhuǎn)移到90mL培養(yǎng)基的原代燒瓶中并在室溫靜止培養(yǎng)48小時，然后在36±2℃于180rpm下培養(yǎng)24小時。將約1.6mL的原代培養(yǎng)物從90mL的原代搖瓶中取出并接種到800mL的培養(yǎng)基中，在36±2℃于180rpm下培養(yǎng)22小時。然后將800mL的培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐中的10L培養(yǎng)基。發(fā)酵在具有2個Rushton渦輪高速攪拌機、1個噴霧器和4個擋板的New BrunswickScientific Fermentor中進行。培養(yǎng)在220rpm攪動、在36±2℃以0.2vvm的通氣下進行。從發(fā)酵8小時往上直至32小時的發(fā)酵結(jié)束，用葡萄糖氨基酸溶液將pH控制在7.5-7.6。所產(chǎn)生的Lf/mL是80-90Lf/mL。
使用CDM培養(yǎng)基的發(fā)酵第一次預培養(yǎng)將濕的的冷凍種子(甘油原種)繁殖至CDM+5g/LYE瓊脂培養(yǎng)基并在36℃培養(yǎng)24小時。
第二次預培養(yǎng)將平板上的培養(yǎng)物重懸于5mL的CDM+3g/LYE培養(yǎng)基并將其中的2.5mL用于接種90mL的CDM+3g/LYE培養(yǎng)基的原代燒瓶。將燒瓶在200rpm的持續(xù)振蕩下，在36℃溫育24小時。原代燒瓶中還含有0.9mL的1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和0.45mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))。
發(fā)酵將約800mL第三次預培養(yǎng)物用于接種發(fā)酵罐中的10LCDM+3g/L YE培養(yǎng)基。向發(fā)酵中加入100mL的1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和50mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))以及3.4mL的七水合硫酸亞鐵溶液(0.1％(w/v)。發(fā)酵在NewBrunswick Scientific或B.Braun發(fā)酵罐中，在受控的溫度36℃下進行。過程參數(shù)是250rpm的攪動、0.45vvm的通氣。在發(fā)酵過程中，用5N氫氧化鈉和2.5M磷酸將pH控制在6.5-7.6。
通過絮凝方法(Lf試驗)和ELISA定量的毒素量(表7)
表7CDM中白喉棒桿菌的發(fā)酵
用CDM培養(yǎng)基與麥芽糖、鐵和磷酸鹽濃度的不同組合以240L的規(guī)模進行發(fā)酵。結(jié)果總結(jié)于如下的表8中表8用不含動物成分的CDM的發(fā)酵
盡管達到OD600為15-20的生長，但是所產(chǎn)生的毒素水平為90-100Lf/mL，該值低于使用含有動物來源的蛋白性材料如NZ amine或Phytone的培養(yǎng)基所得到的值。
氨基酸消耗的時間進程研究表明氨基酸如(Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、Gly和Thr)在發(fā)酵的12小時內(nèi)消耗，如20L批次所示(表9)，且在毒素表達階段則不可利用。
表9CDM培養(yǎng)基中氨基酸消耗的時間進程研究
這些結(jié)果表明培養(yǎng)基應該富含有機或無機氮。
有機和無機氮補充物的篩選發(fā)酵過程中氨基酸消耗的時間進程研究表明關(guān)鍵的氨基酸在生長的前12-18小時消耗，且在發(fā)酵的后期當毒素產(chǎn)生時則不可利用。培養(yǎng)基應當補充氮來支持生長以及將培養(yǎng)基中的氨基酸用作毒素合成的前體。如下所述，將酵母提取物和硫酸銨加至CDM用于白喉棒桿菌生長以及白喉毒素制備的不同培養(yǎng)基a)CDM+5g/L酵母提取物；b)CDM+5g/L硫酸銨；和c)含有培養(yǎng)基中一半濃度的氨基酸+5g/L酵母提取物和5g/L硫酸銨的改進的CDM。
在這些發(fā)酵中白喉毒素的生產(chǎn)如下表10所示表10補充有機和無機氮的CDM培養(yǎng)基中的白喉毒素生產(chǎn)
使用統(tǒng)計學設計對培養(yǎng)基中的不同組分進行最優(yōu)化以得到更高的毒素產(chǎn)量使用計算機統(tǒng)計學設計(FusionPro)來最優(yōu)化培養(yǎng)基組成。在設計中，三種組分(酵母提取物，氨基酸混合物和鐵)的三個不同濃度被用作統(tǒng)計學設計中的輸入項。選擇分數(shù)的因子設計(參見表11)，如下表11試驗設計改變酵母提取物、氨基酸和鐵濃度的量來最優(yōu)化白喉棒桿菌的毒素生產(chǎn)
磷酸鹽和氯化鈣溶液保持為常量。
在不同條件下進行試驗，并通過ELISA對所制備的毒素的量進行定量。盡管毒素的濃度是大約150Lf/mL，但是所產(chǎn)生的毒素比在發(fā)酵過程中使用動物組分所得毒素要純。在鐵濃度為0.34mL/L下，酵母提取物和氨基酸量的反應圖被外推為使氨基酸混合物的濃度加倍，如圖1所示。在這種酵母提取物濃度(3g/L)和氨基酸濃度(2x)條件下，根據(jù)等值線作圖分析，毒素的量加倍。但是，在實踐中，這個并不容易實施，因為它將會提高成本以及培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度，導致細胞死亡。
統(tǒng)計學設計表明，在毒素產(chǎn)量中有重要的變量互作效應。最重要的影響(如圖1所示)是酵母提取物-氨基酸互作效應(A*B)。酵母提取物和氨基酸對毒素產(chǎn)量有負效應。如果酵母提取物濃度太高(即，5g/L)，那么該條件將支持細菌生長，但不支持毒素產(chǎn)生。而且，如果氨基酸濃度提高至兩倍，就可能會由于滲透壓不平衡而出現(xiàn)對生長不利的環(huán)境。因此，需對酵母提取物和氨基酸濃度進行最優(yōu)化以制備高毒素濃度。圖5的一般回歸統(tǒng)計學表明R方值是0.92。這意味著所觀察到的毒素產(chǎn)量數(shù)據(jù)非常接近由FusionPro設計預期的毒素產(chǎn)量數(shù)據(jù)。
毒素的最佳量在酵母提取物濃度3g/L、1倍氨基酸濃度以及鐵濃度0.34mL/L條件下產(chǎn)生。
基于早期的發(fā)酵試驗以及在生長和毒素產(chǎn)生階段氨基酸消耗狀況，發(fā)現(xiàn)氨基酸Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、Gly和Thr消耗較快，且在毒素表達階段不可利用。這些氨基酸而非所有19種氨基酸是由FusionPro外推反應曲線推定的獲得更高產(chǎn)量的毒素以2x濃度所需要的關(guān)鍵氨基酸。從而進行了2x濃度關(guān)鍵氨基酸(改進的CDM1+3g/L YE)對毒素合成的影響的搖瓶研究。將上述關(guān)鍵氨基酸的濃度加倍會使毒素水平(289μg/mL)與1x濃度的(157μg/mL)相比加倍，這一點支持如下假定這些氨基酸在生長期完全消耗，是毒素合成所需要的。將這些氨基酸的2x濃度條件按比例擴大至20L發(fā)酵罐，發(fā)現(xiàn)細胞生長很差。最優(yōu)化的不含動物成分的培養(yǎng)基是CDM+3g/L酵母提取物，如表12所示。
表12CDM+3g/L酵母提取物的培養(yǎng)基組成
白喉類毒素的純化和去毒將10L發(fā)酵培養(yǎng)物在12,500×g，4℃下離心20分鐘，收集上清液。然后，將上清液通過0.22μm薄膜濾器過濾以除去殘余的細菌。在4℃，持續(xù)攪拌下，將27％(w/v)的硫酸銨加入過濾后的上清液中，然后在12,500g，4℃下離心20分鐘。收集上清液用于進一步加工。持續(xù)攪拌下，將13％(w/v)的硫酸銨加入上清液。將混合物進一步在4℃攪動過夜，然后在12,500g，4℃下離心20分鐘。所得沉淀溶解在約1000mL的0.9％(w/v)的鹽水中。
將上述毒素溶液用具有10kDa盒子(cassette)的超濾單元對0.9％(w/v)鹽水進行滲濾以除去硫酸銨。存留物用0.22μm的薄膜濾器過濾，然后保存在4-8℃。在去毒之前，將存留物用0.9％(w/v)的鹽水稀釋至500 Lf/mL。白喉毒素的純度為至少75％。在室溫持續(xù)攪動下在20分鐘內(nèi)將0.5％(v/v)甲醛和0.5％(w/v)碳酸氫鈉加至稀釋的毒素溶液。20分鐘后，加入溶于0.9％(w/v)鹽水中的0.913％(w/v)L-賴氨酸溶液，接著將混合物通過0.22μm的薄膜濾器過濾，然后在37℃持續(xù)振蕩下溫育6周以去毒。將類毒素保存在4-8℃。
用含有動物成分和不含動物成分的培養(yǎng)基制備的白喉毒素和類毒素的表征將用含有動物成分和不含動物成分的培養(yǎng)基制備的白喉毒素和類毒素通過SDS-PAGE、蛋白印跡、圓二色性譜確定以及N-末端測序進行分析。結(jié)果表明用含有動物成分和不含動物成分的培養(yǎng)基制備的白喉毒素和類毒素基本不能區(qū)分。
總蛋白的濃度通過用二辛可寧酸(bicinchoninic acid)(BCA)進行微量培養(yǎng)板BCA測定及通過與濃度已知的參考標準蛋白對比而進行。
SDS PAGE進行SDS-PAGE以確定白喉毒素和類毒素的相對分子量(Mr)，從而評價毒素和類毒素的純度；以及評估蛋白帶的分布模式。蛋白通過在還原條件下在12.5％聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE進行分析。凝膠用考馬斯藍染色，接著進行光密度分析。參考圖2，顯示了為確定白喉毒素和類毒素的相對分子量(Mr)而進行的SDS-PAGE，以評價毒素和類毒素的純度以及蛋白帶的分布模式。蛋白在還原條件下在12.5％的聚丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE進行分析。凝膠用考馬斯藍染色，接著進行光密度分析。泳道是1.MW標記物(kDa)，250，150，100，75，50，37，25，15，10kDa；2.白喉毒素，CO3105(含動物成分的培養(yǎng)基)；3.白喉毒素Diph-20L-40F(含動物成分的培養(yǎng)基)；3.白喉毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；4.白喉毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；5.白喉毒素Diph-20L-55F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；6.白喉類毒素CO3152；7.白喉類毒素Diph-20L-40F(含動物成分的培養(yǎng)基)；8.白喉類毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；9.白喉類毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)蛋白印跡分析參考圖3，顯示了用白喉毒素特異性抗體進行的蛋白印跡分析。樣品在12.5％ SDS-PAGE凝膠上進行分辨，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用DT特異性抗體進行印跡。泳道是1.相對分子量標記物(kDa)，250，150，100，75，50，37，25，15，10kDa；BioRad MW標記物；2.白喉毒素CO3105；3.白喉毒素Diph-20L-40F(含動物成分的培養(yǎng)基)；4.白喉毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；5.白喉毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；6.白喉毒素Diph-20L-55F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；7.白喉類毒素CO3152；8.白喉類毒素Diph-20L-40F(含動物成分的培養(yǎng)基)；9.白喉類毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；10.白喉類毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)。
N-末端測序N-末端測序分析用于監(jiān)控導致N-末端變化的任何蛋白修飾。將蛋白在12.5％SDS-PAGE凝膠上進行分辨，然后轉(zhuǎn)移到固體支持物如PVDF。通過傳統(tǒng)的Edman降解方法將N-末端氨基酸釋放并衍生化，然后通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行鑒定。對于加工的對照白喉毒素和類毒素以及“不含動物”的毒素/類毒素均觀察到期望的N-末端序列。
表13白喉毒素的N-末端序列
表14白喉類毒素的N-末端序列
-缺失的序列循環(huán)是由于儀器問題等電聚焦(IEF)用參考蛋白估計白喉毒素的等電點。參考圖3，顯示等電聚焦凝膠。泳道是1.IEF stds-pI＝7.80，7.50，7.10，7.00，6.50，6.00，5.10，4.65；2.白喉毒素CO3105(含動物成分的培養(yǎng)基)；3.白喉毒素Diph-20L-11(含NZ Amine的培養(yǎng)基)；4.白喉毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；5.白喉毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；6.白喉類毒素CO3152(含動物成分的培養(yǎng)基)；7.白喉類毒素Diph-20L-11(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；8.白喉類毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)；9.白喉類毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培養(yǎng)基)。
圓二色性譜圓二色性(CD)分析用于確定各批次構(gòu)象或二級結(jié)構(gòu)的不一致性。通過軟件程序分析樣品對圓偏振光的吸收光譜，得到α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對百分比組成。用Jasco CD旋光分光計在22℃分析白喉毒素和類毒素。(參見圖5-7)。
N-末端測序。將蛋白在12.5％SDS-PAGE凝膠上進行分辨，然后轉(zhuǎn)移到固體支持物如PVDF。通過傳統(tǒng)的Edman降解方法將N-末端氨基酸釋放并衍生化，然后通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行鑒定。
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權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)白喉棒桿菌菌株以制備一定水平的白喉毒素或其類似物的培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基基本不含有動物來源的產(chǎn)物，并含有a.水；b.碳水化合物源和氮源；c.起始濃度的大量游離氨基酸，其中每種游離氨基酸的起始濃度不會限制白喉毒素或其類似物的生產(chǎn)水平。
2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其含有所有天然存在的氨基酸。
3.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述碳水化合物源包含麥芽糖。
4.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其基本不含有葡萄糖。
5.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述氮源包含酵母提取物。
6.權(quán)利要求1或2或3或4或5的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基不含有動物來源的產(chǎn)物。
7.一種白喉棒桿菌的培養(yǎng)基，其含有碳水化合物源和氮源及含有至少四種游離氨基酸的添加劑系統(tǒng)，其每一種的量足以促進白喉棒桿菌產(chǎn)生一定水平的白喉毒素或其類似物，其中所述培養(yǎng)基基本不含動物來源的產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求7的培養(yǎng)基，其含有所有天然存在的氨基酸。
9.權(quán)利要求7的培養(yǎng)基，其中所述碳水化合物源是麥芽糖。
10.權(quán)利要求7的培養(yǎng)基，其中所述氮源是酵母提取物。
11.權(quán)利要求7或8或9的培養(yǎng)基，其中所述氨基酸的濃度范圍是每升培養(yǎng)基大約0.5g-大約1g。
12.權(quán)利要求7或8或9或10或11的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基不含動物來源的產(chǎn)物。
13.一種制備白喉毒素或其類似物的方法，其包含步驟在允許白喉毒素生產(chǎn)的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)白喉棒桿菌菌株，其中所述培養(yǎng)基基本不含動物來源的產(chǎn)物并含有含有水；a.碳水化合物源及氮源；b.起始濃度的大量游離氨基酸，其中每種游離氨基酸的起始濃度不會限制白喉毒素或其類似物的生產(chǎn)水平。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述培養(yǎng)基含有所有天然存在的氨基酸。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述碳水化合物源包含麥芽糖。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述培養(yǎng)基基本不含有葡萄糖。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述氮源包含酵母提取物。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述白喉棒桿菌生長直至穩(wěn)定期。
19.權(quán)利要求13的方法，其中獲得至少100Lf/mL的白喉毒素或其類似物生產(chǎn)。
20.權(quán)利要求10的方法，其進一步包括回收白喉毒素或其類似物以提供回收的白喉毒素或其類似物的步驟。
21.權(quán)利要求17的方法，其進一步包括純化回收的白喉毒素或其類似物以提供純化的白喉毒素或其類似物的步驟。
22.權(quán)利要求17或18的方法，其進一步包括使回收或純化的白喉毒素或其類似物去毒以提供白喉類毒素或其類似物的步驟。
23.權(quán)利要求19的方法，其進一步包括將白喉類毒素或其類似物配制成疫苗以免疫宿主以免于其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病。
24.權(quán)利要求13-23任一項的方法，其中所述培養(yǎng)基不含動物來源的產(chǎn)物。
25.一種免疫宿主以免于其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的方法，其包括給宿主施用權(quán)利要求23的疫苗。
26.權(quán)利要求23的疫苗在免疫宿主以免于其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的用途。
27.權(quán)利要求22的白喉類毒素或其類似物在制備免疫宿主以免于其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的藥物中的用途。
28.一種組合物，其含有白喉棒桿菌菌株和用于制備白喉毒素或其類似物的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基基本不含有動物來源的產(chǎn)物并含有其中所述培養(yǎng)基基本不含有動物來源的產(chǎn)物并含有含有a.水；b.碳水化合物源和氮源；c.起始濃度的大量游離氨基酸，其中每種游離氨基酸的起始濃度不會限制白喉毒素或其類似物的生產(chǎn)水平。
29.權(quán)利要求24的方法的組合物，其中所述培養(yǎng)基含有所有天然存在的氨基酸。
30.權(quán)利要求24的方法的組合物，其中所述碳水化合物源包含麥芽糖。
31.權(quán)利要求24的組合物，其中所述培養(yǎng)基基本不含葡萄糖。
32.權(quán)利要求24的方法的組合物，其中所述氮源包含酵母提取物。
33.權(quán)利要求21或22或23或24或25的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基不含有動物來源的產(chǎn)物。
34.一種制備白喉毒素或其類似物的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)白喉棒桿菌，以及給培養(yǎng)物提供至少一種被選的氨基酸，以防止被選氨基酸的濃度限制毒素的生產(chǎn)，其中培養(yǎng)基基本不含動物來源的產(chǎn)物。
35.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基進一步包含酵母提取物。
36.權(quán)利要求4的方法，其中所述酵母提取物的濃度大約是3g/L。氨基酸的濃度。
37.在培養(yǎng)基中培養(yǎng)白喉棒桿菌的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)基含有用于制備一定生產(chǎn)水平的白喉毒素或其類似物的氨基酸，并且在培養(yǎng)過程中其中至少一種被選氨基酸被耗盡并限制白喉毒素或其類似物的生產(chǎn)水平，所述改進包括在所述培養(yǎng)過程中外源添加額外量的至少一種被選氨基酸，并且其中所述至少一種被選氨基酸不限制白喉毒素或其類似物的生產(chǎn)水平。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述至少一種被選氨基酸選自Glu、Asn、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp和異亮氨酸。
39.權(quán)利要求33的方法，其中所述培養(yǎng)基含有酵母提取物。
40.權(quán)利要求35的方法，其中所述酵母提取物的濃度大約為3g/L。
全文摘要
提供了用于制備白喉毒素的白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)培養(yǎng)基以及制備毒素的方法。培養(yǎng)基基本不含有動物來源的產(chǎn)物并含有水、碳水化合物源、氮源以及起始濃度的大量游離氨基酸，其中每種游離氨基酸的起始濃度不會限制毒素的生產(chǎn)。
文檔編號A61P31/00GK1894399SQ200480037069
公開日2007年1月10日 申請日期2004年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
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