專利名稱：調(diào)整菌群預(yù)防或治療細(xì)菌性陰道病的益生菌制劑及工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)整菌群預(yù)防或治療細(xì)菌性陰道病的益生菌制劑，用于改善陰道微生態(tài)平衡、增強免疫力，并涉及制備這種制劑的工藝。
背景技術(shù)：
細(xì)菌性陰道炎(BV)、非特異性陰道炎(NSV)或菌群失調(diào)性陰道炎(DV)是婦女常見病、多發(fā)病，臨床上常以抗生素治療，但效果不理想。抗生素的應(yīng)用本身亦可引起菌群失調(diào)，致使此病遷延不愈，給患者帶來巨大痛苦。其他婦科感染性疾病如各種性病、滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎在使用大量抗生素治療后，也可導(dǎo)致陰道菌群失調(diào)，引發(fā)菌群失調(diào)性陰道炎，再使用抗生素進(jìn)行治療多數(shù)無效。已有的益生菌的研究也只限于對單個菌種的研究，沒有針對益生菌群相互促進(jìn)、共生，協(xié)調(diào)促進(jìn)調(diào)整菌群預(yù)防或治療細(xì)菌性陰道病的益生菌，也沒有協(xié)調(diào)促進(jìn)調(diào)整菌群預(yù)防或治療細(xì)菌性陰道病的益生菌制劑及工藝。

發(fā)明內(nèi)容
從微生態(tài)學(xué)的角度出發(fā)，通過生態(tài)制劑調(diào)整療法，扶正和保護(hù)陰道內(nèi)的正常菌群的組成和比例，恢復(fù)其自然的抵抗外來菌侵?jǐn)_的能力，促進(jìn)其本身的自凈作用是治療此類疾病的一種必然趨勢。本發(fā)明一種利用有益菌群并促進(jìn)其它有益菌生長和發(fā)揮效能的陰道保健或預(yù)防和治療細(xì)菌性陰道病的益生菌制劑。菌種德氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus debrueckii subsp.lactis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。功能具有調(diào)節(jié)陰道菌群失調(diào)作用，抑制外襲菌和過盛繁殖的陰道菌群中的少數(shù)種群。預(yù)防或治療細(xì)菌性陰道病。本發(fā)明的陰道保健或預(yù)防和治療細(xì)菌性陰道病的益生菌制劑，含有按重量配比的德氏乳桿菌5-15份，嗜酸乳桿菌5-15份，乳糖500-700份，水蘇糖100-300份，充分混合后含有益生菌活菌數(shù)5-15億/g，分裝膠囊、壓制片劑。
本發(fā)明涉及對兩株菌株的微生物學(xué)實驗、微生態(tài)學(xué)實驗及生產(chǎn)工藝研究實驗。微生物實驗包括菌種分離、鑒定、生物特性、代謝產(chǎn)物、耐藥性、代謝物、H2O2產(chǎn)生及質(zhì)粒檢測等。生態(tài)效應(yīng)試驗包括正常值調(diào)查、粘附、定植、生物拮抗、模型試驗、安全試驗、穩(wěn)定試驗和刺激試驗等。生產(chǎn)工藝研究包括種子、發(fā)酵凍干和制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性及工藝穩(wěn)定性等方面的研究?；A(chǔ)研究還包括作用機制的研究。
該項研究對健康陰道的微群落及微生態(tài)系進(jìn)行了比較全面和系統(tǒng)的研究。研究結(jié)果證明，乳桿菌是陰道優(yōu)勢微種群，其他微種群如腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、酵母菌及支原體均為劣勢種群。在妊娠的早期、中期及晚期，陰道內(nèi)的乳桿菌逐漸增加。細(xì)菌性陰道炎(BV)、非特異性陰道炎(NSV)或菌群失調(diào)性陰道炎(DV)都出現(xiàn)一定的陰道菌群失調(diào)現(xiàn)象，其主要表現(xiàn)是乳桿菌減少或消失，其它種增多或比例失調(diào)。陰道乳桿菌是妊娠過程中重要生理指標(biāo)之一，并且是防御感染一個手段。
本發(fā)明涉及到的兩株菌既嗜酸乳桿菌和德氏乳桿菌經(jīng)研究表明兩菌株都可通過粘附占位、粘附抑制、產(chǎn)生乳酸、H2O2發(fā)揮其作用機制。通過藥代動力學(xué)、藥效學(xué)、安全性及生產(chǎn)工藝研究研究表明，兩菌株都是無毒、無害、安全、有效的，將兩者制成微生態(tài)制劑可以應(yīng)用于細(xì)菌性陰道病的治療。
經(jīng)臨床研究證明，嗜酸乳桿菌和德氏乳桿菌制劑對細(xì)菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎的療效優(yōu)于或不亞于滅滴靈(對照組)，而且復(fù)發(fā)率低，無抗生素耐藥性、引起菌群失調(diào)及毒性反應(yīng)等副作用。其中對細(xì)菌性陰道炎的總有效率達(dá)92.0％；而滅滴靈為83.7％，該制劑對滴蟲性陰道炎的總有效率達(dá)96.7％本發(fā)明的益生菌制造工藝。德氏乳桿菌5-15份，嗜酸乳桿菌5-15份，乳糖500-700份，水蘇糖100-300份，充分混合后含有益生菌活菌數(shù)5-15億/g，分裝膠囊、壓制片劑。單一菌粉制備工藝如下(1)德氏乳桿菌菌粉的制備將德氏乳桿菌菌株種子液按重量1-5％接種量接入已經(jīng)滅菌后的含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏、0.2-0.5％乙酸鈉、0.2-0.5％檸檬酸銨培養(yǎng)基中，經(jīng)36℃-39℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量25-40％的菌體加入含有重量3-5％的谷氨酸鈉和5-15％多脂奶粉凍干保護(hù)液中混合冷凍干燥后即可得到德氏乳桿菌菌粉。
(2)嗜酸乳桿菌菌粉的制備將嗜酸乳桿菌菌株種子液按重量1-5％接種量接入含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏培養(yǎng)基中經(jīng)32℃-36℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量30-45％的菌體加入100-200mM海藻糖及酸中和物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)等的凍干保護(hù)液中，混合，放置2-4小時，冷凍干燥后即可得到嗜酸乳桿菌菌粉。
由于不同人群陰道攜帶的乳桿菌的種類不同，采用單一乳桿菌，在陰道中的定植幾率較小，本發(fā)明采用兩種已經(jīng)證明有調(diào)節(jié)陰道菌群失調(diào)作用的乳桿菌作為本制劑的生產(chǎn)菌種，可以使不同患有細(xì)菌性陰道病的患者增加乳桿菌的定植幾率。大大提高療效。同時，所添加的乳糖和海藻糖對提高菌種的存活率和在陰道中快速繁殖起到提高和促進(jìn)作用。
本發(fā)明相關(guān)研究如下1、健康婦女陰道乳桿菌的定性與定量研究(表1)
表1 各種乳酸桿菌得分離率及平均活菌數(shù)(log10n/ml)

注本試驗共采集年齡在20-25歲、無陰道疾患的非妊娠育齡婦女標(biāo)本57份，其中43份分離到乳桿菌，分離率為75.44％.
3、不同pH條件下細(xì)菌對陰道上皮細(xì)胞的黏附作用將陰道分離出的幾種常見正常菌群與乳桿菌在不同pH條件下考察它們對陰道上皮細(xì)胞的黏附能力，結(jié)果見表2，在pH3.5時，乳桿菌對陰道上皮細(xì)胞的黏附能力最強，葡萄球菌、腸桿菌、念珠菌在pH7.2時黏附陰道上皮細(xì)胞能力最強。
表2 不同細(xì)菌對陰道上皮的黏附能力(x±s)

*與pH7.2相比，P＜0.05。
隨pH值的增加，乳桿菌對上皮細(xì)胞的黏附能力減弱，葡萄球菌、腸桿菌、念珠菌對上皮細(xì)胞的黏附能力增強。
3、乳桿菌制劑對非特異性陰道炎的治療機制的研究采用本制劑治療非特異性陰道炎結(jié)果表明，陰道炎治療前pH、清潔度明顯高于對照組及治療組，治療后陰道pH明顯低于對照組，見表3。
表2 陰道pH、清潔度、G+桿菌百分率比較

注正常對照組32例，年齡24-38歲，排出婦科疾病，近期無抗生素應(yīng)用史；治療組32例，年齡28-41歲，臨床確診為非特異性陰道炎的患者。
4、采用本制劑治療前后各組陰道微生物陽性檢出的平均對數(shù)值的比較治療后陰道乳桿菌明顯高于對照組，葡萄球菌明顯低于對照組。見表4表4 各菌陽性平均對數(shù)值比較(X±SD)

5、使用本制劑對非特異性陰道炎的治療效果.表5結(jié)果說明接種本制劑后接種后病人癥狀得到改善表4 使用本制劑對非特異性陰道炎的治療效果

6、適用本制劑治療細(xì)菌性陰道病治療前后陰道指標(biāo)變化情況見表6、表7、表8、表9。結(jié)果表明用藥前后陰道pH值明顯低于用藥前，有顯著性差異。陰道滴蟲、分泌物、白帶多、瘙癢癥狀用藥前后有顯著性差異，用藥后明顯好于用藥前。
表6 陰道pH值變化比較

*P值有顯著性差異表7 陰道滴蟲變化比較

***P值有極顯著差異表8 陰道癢變化比較

***P值有極顯著差異表9 陰道分泌物白帶變化比較

***P值有極顯著差異
具體實施例方式實施例1德氏乳桿菌5g，嗜酸乳桿菌10g，乳糖700g，水蘇糖100g，充分混合后含有益生菌活菌數(shù)5-15億/g，分裝膠囊，包裝。陰道外用，每日一次，每次一粒。德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌菌粉制備工藝如下(1)德氏乳桿菌菌粉的制備將德氏乳桿菌菌株種子液按重量1％接種量接入已經(jīng)滅菌后的含有重量2％葡萄糖、1.5％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％乙酸鈉、0.5％檸檬酸銨培養(yǎng)基中，經(jīng)36℃-39℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量40％的菌體加入含有重量4％的谷氨酸鈉和5％多脂奶粉凍干保護(hù)液中混合冷凍干燥后即可得到德氏乳桿菌菌粉。
(2)嗜酸乳桿菌菌粉的制備將嗜酸乳桿菌菌株種子液按重量1％接種量接入含有重量2％葡萄糖、1.5％蛋白胨、1％酵母浸膏培養(yǎng)基中經(jīng)32℃-36℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量45％的菌體加入150mM海藻糖及酸中和物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)等的凍干保護(hù)液中，混合，放置2小時，冷凍干燥后即可得到嗜酸乳桿菌菌粉。
實施例2德氏乳桿菌10g，嗜酸乳桿菌15g，乳糖500g，海藻糖300g，充分混合后含有益生菌活菌數(shù)5-15億/g，分裝膠囊，包裝?？诜?，每日3次，每次2-4粒。德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌菌粉制備工藝如下(1)德氏乳桿菌菌粉的制備將德氏乳桿菌菌株種子液按重量3％接種量接入已經(jīng)滅菌后的含有重量3％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.8％酵母浸膏、0.35％乙酸鈉、0.35％檸檬酸銨培養(yǎng)基中，經(jīng)36℃-39℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量32％的菌體加入含有重量3％的谷氨酸鈉和10％多脂奶粉凍干保護(hù)液中混合冷凍干燥后即可得到德氏乳桿菌菌粉。
(2)嗜酸乳桿菌菌粉的制備將嗜酸乳桿菌菌株種子液按重量3％接種量接入含有重量3％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.5％酵母浸膏培養(yǎng)基中經(jīng)32℃-36℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量38％的菌體加入200mM海藻糖及酸中和物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)等的凍干保護(hù)液中，混合，放置小3時，冷凍干燥后即可得到嗜酸乳桿菌菌粉。
實施例3德氏乳桿菌15g，嗜酸乳桿菌5g，乳糖600g，海藻糖200g，加入500g的泡騰粉，充分混合后含有益生菌活菌數(shù)5-15億/g，壓制片劑，包裝。陰道外用，每日一次，每次一片。德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌菌粉制備工藝如下(1)德氏乳桿菌菌粉的制備將德氏乳桿菌菌株種子液按重量5％接種量接入已經(jīng)滅菌后的含有重量1％葡萄糖、0.8％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.2％乙酸鈉、0.2％檸檬酸銨培養(yǎng)基中，經(jīng)36℃-39℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量25％的菌體加入含有重量5％的谷氨酸鈉和15％多脂奶粉凍干保護(hù)液中混合冷凍干燥后即可得到德氏乳桿菌菌粉。
(2)嗜酸乳桿菌菌粉的制備將嗜酸乳桿菌菌株種子液按重量5％接種量接入含有重量1％葡萄糖、0.8％蛋白胨、0.8％酵母浸膏培養(yǎng)基中經(jīng)32℃-36℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量30％的菌體加入100mM海藻糖及酸中和物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)等的凍干保護(hù)液中，混合，放置4小時，冷凍干燥后即可得到嗜酸乳桿菌菌粉。
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)整菌群預(yù)防或治療細(xì)菌性陰道病的益生菌制劑，其特征在于有按重量配比的德氏乳桿菌5-15份，嗜酸乳桿菌5-15份，乳糖500-700份，水蘇糖100-300份，
2.一種用于調(diào)整菌群預(yù)防或治療細(xì)菌性陰道病的益生菌制劑制備工藝，其特征在于按重量配比取德氏乳桿菌5-15份，嗜酸乳桿菌5-15份，乳糖500-700份，水蘇糖100-300份，混合后含有益生菌活菌數(shù)5-15億/g，分裝膠囊或壓制片劑，德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌菌粉制備工藝如下(1)德氏乳桿菌菌粉的制備將德氏乳桿菌菌株種子液按重量1-5％接種量接入已經(jīng)滅菌后的含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏、0.2-0.5％乙酸鈉、0.2-0.5％檸檬酸銨培養(yǎng)基中，經(jīng)36℃-39℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量25-40％的菌體加入含有重量3-5％的谷氨酸鈉和5-15％多脂奶粉凍干保護(hù)液中混合冷凍干燥后即可得到德氏乳桿菌菌粉。(2)嗜酸乳桿菌菌粉的制備將嗜酸乳桿菌菌株種子液按重量1-5％接種量接入含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏培養(yǎng)基中經(jīng)32℃-36℃厭氧發(fā)酵后，離心分離出菌體，將占保護(hù)液重量30-45％的菌體加入100-200mM海藻糖及酸中和物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)等的凍干保護(hù)液中，混合，放置2-4小時，冷凍干燥后即可得到嗜酸乳桿菌菌粉。
全文摘要
調(diào)整菌群預(yù)防或治療細(xì)菌性陰道病的益生菌制劑及工藝，按重量配比取德氏乳桿菌5－15份，嗜酸乳桿菌5－15份，乳糖500－700份，水蘇糖100－300份，混合后含有益生菌活菌數(shù)5－15億/g，菌株經(jīng)30－45℃分別發(fā)酵，24hr－36hr，離心分離菌體，50℃下干燥或冷凍干燥獲得干燥菌粉，添加到乳糖和水蘇糖再制備成陰道外用或口服益生菌膠囊劑及外用泡騰片。具有調(diào)節(jié)陰道菌群失調(diào)作用，有效抑制外襲菌和過盛繁殖的陰道菌群中的少數(shù)種群。
文檔編號A61P15/00GK101028289SQ20061004595
公開日2007年9月5日 申請日期2006年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月1日
發(fā)明者康白, 袁杰利 申請人:大連森佰澳科技有限公司