專利名稱：Glp－1及其類似物與人溶菌酶融合的重組蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白及其在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其涉及GLP-1及其類似物等降血糖肽與人溶菌酶在基因水平融合后表達的重組蛋白，以及該類融合蛋白在非胰島素依賴型糖尿病及其并發(fā)癥治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胰高血糖素樣肽I(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是人體自身分泌的一種腸道激素，它是由胰高血糖素原(Proglucagon)分子經(jīng)腸道蛋白水解酶作用后產(chǎn)生的一種30個氨基酸的短肽。該肽通過與胰島β細胞表面的特異受體結(jié)合而刺激胰島素分泌。人體內(nèi)的GLP-1有兩種形式，一種為GLP-1(7-36)NH2，是由30個氨基酸殘基組成的多肽，其C端是酰胺化了的；另一種為GLP-1(7-37)，是由31個氨基酸殘基組成的多肽，GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)有相同的促胰島素分泌作用。
GLP-1是一種非常理想的糖尿病治療藥物。能明顯降低病人在用餐后的血糖，刺激胰島素的產(chǎn)生，同時還能起到一定的減肥效應(yīng)，并且不會引起低血糖癥(Drucker DJ，Diabetes.1998 Feb；47(2)159-69)，此外，GLP-1還有一定的促胰腺再生功能(Drucker DJ，Endocrinology.2003 Dec；144(12)5145-8)然而，各國學者在研究中也發(fā)現(xiàn)，由于GLP-1能很快被體內(nèi)的二肽基肽酶(DPP IV)降解，以及從腎臟中被排出體外，以至于它在體內(nèi)的半衰期非常短，只有90至120秒，很大程度上限制了該肽作為糖尿病治療藥物的開發(fā)。因此，活性更強、穩(wěn)定性更高的GLP-1類似物的研究是目前各國學者研究的重點。在解決半衰期短的問題上，短肽與其它分子量相對較大的蛋白融合后重組表達，以增加短肽在體內(nèi)的半衰期是一種行之有效的方法。如將GLP-1及其類似物與白蛋白或球蛋白融合后，GLP-1及其類似物在體內(nèi)的半衰期就能延長幾十倍(Chuang VT，Pharm Res.2002 19569-577；Baggio LL，Diabetes.2004 Sep；53(9)2492-500)。
在糖尿病并發(fā)癥方面，持續(xù)高血糖狀態(tài)下葡萄糖可以在非酶條件下與脂類以及蛋白結(jié)合，形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)，對腎臟和血管系統(tǒng)造成損害。AGEs的損害機制包括(1)使腎小球基底膜(GBM)成分交聯(lián)增多，導致GBM增厚及孔徑選擇性和電荷選擇性喪失，而產(chǎn)生蛋白尿；(2)糖化的血管基質(zhì)可通過AGEs捕獲滲出血管外的可溶性血漿蛋白如LDL，致富含膽固醇性LDL在局部堆積，促進動脈硬化；(3)使醛糖還原酶(AR)糖化，其活性增加，參與多元醇途徑的活化；LDL糖化后則清除減少，致血漿中LDL濃度升高，滲入血管壁，促進血管并發(fā)癥發(fā)生；(4)通過AGEs與細胞上特異性受體(RAGE)結(jié)合激活細胞，尤其是巨噬細胞，隨后分泌大量的細胞因子和細胞介質(zhì)如IL-1、TNF1、TGFb、PDGF等，引起組織損傷。此外，AGEs與RAGE結(jié)合后還會導致細胞氧化增加，產(chǎn)生大量氧自由基，而激活NFkB，后者可誘導ET-1及血管細胞粘附因子-1(VCAM-1)等表達。此外，在體外培養(yǎng)的系膜上Amadori修飾的白蛋白不僅能誘導TGFb1基因和蛋白表達，亦能上調(diào)TGFbII型受體功能，因而促進細胞外基質(zhì)蛋白的表達。
溶菌酶是人體內(nèi)非特異防御的重要組成部分，多數(shù)II型糖尿病患者體內(nèi)的溶菌酶水平較低，這可能是糖尿病患者易發(fā)生感染的重要原因。人溶菌酶分子上一個包含18個氨基酸的結(jié)構(gòu)域可以和AGEs結(jié)合，減輕AGEs對糖尿病患者的腎損害和血管損害。其作用機理是(1)與AGEs結(jié)合后加速AGEs從體內(nèi)排出；(2)抑制巨噬細胞與mesangial細胞釋放炎癥因子；(3)改善糖尿病患者的蛋白尿；(4)促進巨噬細胞對AGEs的清除。(Zheng F，Mol Med.2001Nov；7(11)737-47.)基于上述的理論與實踐可以推測，將GLP-1與人溶菌酶共建為融合蛋白，那么該融合蛋白將同時具有GLP-1與人溶菌酶的雙重生物學活性，可用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療；并能延長GLP-1在體內(nèi)的半衰期。
專利號為US 7045677的美國專利“Fusion proteins incorporating lysozyme”所公開的內(nèi)容中涉及到“人溶菌酶/GLP-1的融合蛋白”；但其目的是獲取GLP-1單體GLP-1短肽在生物體內(nèi)極易被降解，且無法通過正常乳汁分泌過程產(chǎn)生，與人溶菌酶形成融合蛋白后便可以由轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生，并通過乳汁分泌；同時，乳汁中所含的蛋白質(zhì)大部分為酸性，這使得堿性的人溶菌酶融合蛋白很容易被分離出來，因此，該專利發(fā)明人將GLP-1/溶菌酶的融合蛋白基因轉(zhuǎn)入動物，使轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生融合蛋白，并隨著乳汁分泌，然后從乳汁中提取這種融合蛋白，繼而再將GLP-1與溶菌酶裂解開，最后提取獲得GLP-1短肽。該專利發(fā)明人并沒有預(yù)見到人溶菌酶/GLP-1融合蛋白本身的雙重生物活性，而所產(chǎn)生的“人溶菌酶/GLP-1的融合蛋白”除了包含人溶菌酶、GLP-1及連接肽序列外，至少還包含位于人溶菌酶及GLP-1之間的一個酶切位點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能克服GLP-1及其類似物等降血糖肽體內(nèi)半衰期短的不足，并同時具有降血糖肽及溶菌酶雙重生物學活性的融合蛋白。該融合蛋白既能有效地降低血糖，又能提高糖尿病患者的抗感染能力、減輕其腎臟與血管的損害。
在綜合現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過大量的實驗篩選，選定包括GLP-1及其類似物在內(nèi)的共5種具有降血糖活性的短肽，分別為降血糖肽1～5，將編碼這5種降血糖肽氨基酸序列的基因與人溶菌酶基因進行融合后進行表達，分離純化得到目標融合蛋白。
本發(fā)明所述的融合蛋白是由降血糖肽與人溶菌酶在基因水平融合后表達的重組蛋白；其中所述的降血糖肽為GLP-1(7-36)或其類似物，其氨基酸序列為SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的一種，它們的氨基酸序列分別為降血糖肽1His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val ArgLeu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser(SEQ ID NO.1)降血糖肽2His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysGlu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg(SEQ ID NO.2)降血糖肽3His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysGlu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg(SEQ ID NO.3)
降血糖肽4His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysGlu Phe Ile Ala Trp Leu(SEQ ID NO.4)降血糖肽5His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysGlu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Thr Ser(SEQ ID NO.5)所述的人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，即Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly Met Asp GlyTyr Arg Gly Met Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr AsnThr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln IleAsn SerArg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His LeuSer Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg ValVal Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn ArgAsp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys Gly Val(SEQ ID NO.6)降血糖肽與人溶菌酶通過以下四種方式中的一種連接①降血糖肽-連接肽-人溶菌酶，②降血糖肽-人溶菌酶，③人溶菌酶-連接肽-降血糖肽，④人溶菌酶-降血糖肽；連接肽是一個柔性連接子，用于連接需要進行融合的兩個蛋白，其作用是為了使兩個蛋白在折疊、形成空間構(gòu)型時不會相互影響，以保留各自的生物學活性。通常情況下，連續(xù)的甘氨酸(G)或甘氨酸與絲氨酸(S)的交替就會具備柔性連接子的功能。連接肽的氨基酸數(shù)一般在20個以內(nèi)，但G與S的組合方式目前并沒有一個固定的模式。本發(fā)明的實施例中所采用的連接肽是一個富含甘氨酸(G)與絲氨酸(S)的直鏈短肽GGSGGS，但毫無疑問，任何具有上述連接功能的短肽都可以作為本發(fā)明中的連接肽使用而不會影響本發(fā)明的實施。
本發(fā)明所述的GLP-1及其類似物與人溶菌酶的融合蛋白通過基因重組技術(shù)獲得，具體的技術(shù)方案根據(jù)目標融合蛋白中降血糖肽與人溶菌酶連接方式的不同而有所差異，本發(fā)明的具體實施例對5種不同的降血糖肽以4種不同的連接方式與人溶菌酶構(gòu)建融合蛋白的技術(shù)方案進行了詳細的描述。
本發(fā)明采用SDS-PAGE電泳和western-blot對上述20種融合蛋白進行了鑒定SDS-PAGE電泳采用15％濃度的丙烯酰胺凝膠，考馬斯亮藍R-250染色，經(jīng)凝膠成像儀掃描后得到結(jié)果，證明各融合蛋白的分子量均與預(yù)計的大小一致，約為18KD；在此基礎(chǔ)上，采用抗人溶菌酶單克隆抗體對轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的蛋白進行Western-blot，第一抗體用抗人溶菌酶單克隆抗體，二抗采用堿性磷酸酶標記的兔抗鼠抗體，熒光底物顯色，再經(jīng)X光片暴光顯影后得到結(jié)果，進一步證實了這些融合蛋白為溶菌酶的融合蛋白。
此外，本發(fā)明還對根據(jù)上述方法所獲得的共20種融合蛋白進行了生物學活性的檢驗，包括(1)以GLP-1為陽性對照、GK II型糖尿病大鼠為動物模型，檢測融合蛋白的降血糖活性及其持續(xù)時間；實驗結(jié)果證明融合蛋白具有與GLP-1相似降血糖活性，且其降血糖活性比GLP-1約延長3天。
(2)以GLP-1為陽性對照、體外培養(yǎng)的大鼠胰島β細胞為實驗?zāi)Ｐ?，檢測融合蛋白刺激大鼠胰島β細胞分泌胰島素和刺激胰島β細胞增生的情況；實驗結(jié)果證明融合蛋白和GLP-1一樣，具有刺激胰島β細胞分泌胰島素及刺激大鼠胰島β細胞增生的作用。
(3)以GLP-1為陽性對照、正常昆明種小鼠為實驗?zāi)Ｐ?，檢測融合蛋白對葡萄糖耐受作用；實驗結(jié)果證明融合蛋白具有比GLP-1更好的葡萄糖耐受能力。
(4)以人溶菌酶為陽性對照、金黃色葡球菌感染的NOD小鼠為模型，檢測融合蛋白的抗感染作用；實驗結(jié)果證明融合蛋白與陽性對照人溶菌酶一樣具有抗NOD小鼠感染的作用。
(5)以人溶菌酶為陽性對照、NOD小鼠為模型，通過測定血和尿AGEs值及白蛋白/肌酸酐比值來評價融合蛋白清除AGEs和改善尿蛋白作用；實驗結(jié)果證明融合蛋白與人溶菌酶陽性對照一樣具有降低NOD小鼠血中AGEs水平、促進尿中AGEs的排出、減輕蛋白尿的作用。
根據(jù)上述結(jié)果可知，GLP-1及其類似物與人溶菌酶的融合蛋白保留了GLP-1類降血糖肽的降血糖活性，解決了GLP-1及其類似物等短肽在體內(nèi)半衰期短的問題，還具有人溶菌酶的抗感染及降低AGEs水平、促進尿中AGEs的排出、減輕蛋白尿的作用，有利于緩解由于AGEs水平增高而帶來的諸多糖尿病并發(fā)癥癥狀，因此，本發(fā)明所述的融合蛋白可用于制備治療糖尿病及防治糖尿病并發(fā)癥的藥物。


本發(fā)明附圖2幅，它們分別是圖15種不同的降血糖肽以4種不同的連接方式與人溶菌酶構(gòu)建形成的20種融合蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；其中，樣品1為標準分子量Marks；樣品2～21分別為P1-L-hlz，P1-hlz，hlz-L-P1，hlz-P1，P4-L-hlz，P4-hlz，hlz-L-P4，hlz-P4，P2-L-hlz，P2-hlz，hlz-L-P2，hlz-P2，P3-L-hlz，P3-hlz，hlz-L-P3，hlz-P3，P5-L-hlz，P5-hlz，hlz-L-P5和hlz-P5；圖25種不同的降血糖肽以4種不同的連接方式與人溶菌酶構(gòu)建形成的20種融合蛋白的Western-blot結(jié)果圖；其中，樣品1為標準分子量Marks；樣品2～21分別為P4-L-hlz，P4-hlz，hlz-L-P4，hlz-P4，P2-L-hlz，P2-hlz，hlz-L-P2，hlz-P2，P3-L-hlz，P3-hlz，hlz-L-P3，hlz-P3，P5-L-hlz，P5-hlz，hlz-L-P5，hlz-P5，P1-L-hlz，P1-hlz，hlz-L-P1，hlz-P1。
圖1為本發(fā)明的摘要附圖。
需要說明的是本說明書中，以P1～P5分別依次代表降血糖肽1～5；L代表連接肽GGSGGS，hlz代表人溶菌酶。
例如P1-L-hlz即表示具有“降血糖肽1-GGSGGS-人溶菌酶”氨基酸序列的融合蛋白，亦即由SEQ ID NO.1所示序列、連接肽GGSGGS、SEQ ID NO.6所示序列三者順序連接而成的多肽。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步的說明。
以下實施例中所使用的連接肽為GGSGGS、載體為pPIC9k、表達的宿主菌為畢赤酵母。其中，pPIC9k載體為一種商品化的通用載體，購自Invitrogen公司；所述畢赤酵母菌是與pPIC9K載體配套的宿主菌，也是購自Invitrogen公司。對上述連接肽、載體及表達宿主的選定僅為了更清楚地闡明本發(fā)明的內(nèi)容，不應(yīng)當視為對本發(fā)明的任何形式的限制。
為了描述的方便，如無特別說明，本說明書中的“融合蛋白”指GLP-1及其類似物與人溶菌酶融合的重組蛋白；降血糖肽1～5依次分別指氨基酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的降血糖肽。
以下實施例中基因合成以及構(gòu)建載體所用的工具酶、DNA聚合酶、dNTP等分子生物學試劑均購自大連寶生物公司(TaKaRa)，擴增基因的引物也是由大連寶生物公司合成。
實施例1在畢赤酵母中表達“降血糖肽1-連接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，包括以下具體步驟(1)獲取編碼“降血糖肽1-GGSGGS”序列的基因①合成引物EX-F1和EX-R1EX-F15’tactcgagaaaagacatggtgaaggaacatttaccagtgacttgtcaaaacagatggaagaggaggcagtgcgg3’(SEQ ID NO.7)EX-R15’atggatccacctgagccacccgatggcggagggtgccccgctacttggtcctccgttcttaagccactcaataaataaccgcactgcctcctcttcc3’(SEQ ID NO.8)②上述兩種引物按照下述反應(yīng)條件退火、延伸后得到編碼“降血糖肽1-GGSGGS”序列的基因反應(yīng)體系總體積50μl，其中含dNTP 4μl(4種核苷酸濃度各為2.5mM)、25μM的上述兩種引物各1μl、Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反應(yīng)緩沖液5μl、水39μl。退火、延伸的循環(huán)條件為94℃3分鐘預(yù)變性后進入下述的循環(huán)94℃10秒→55℃ 10秒→72℃ 20秒，10個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后回收。
所得到的編碼“降血糖肽1-GGSGGS”序列的基因的5’端包含Xho I酶切位點以及α因子信號肽末端的堿基序列，即tactcgagaaaaga；3’端包含編碼接連肽GGSGGS和BamH I酶切位點的基因。
(2)獲得編碼人溶菌酶的基因①合成擴增人溶菌酶基因的引物hly pf1和hly pr1hly pf15’atgaattcggatccaaggtctttgaaaggtgtgag 3’；(SEQ ID NO.14)
hly pr15’atgcggccgcttacactccacaaccttgaacatactg 3’；(SEQ ID NO.15)上游引物hly pf1的5’端引入了EcoR I酶切位點和BamH I酶切位點。下游引物hly pr1 5’端引入Not I限制性內(nèi)切酶位點；②人溶菌酶基因的獲得用引物hly pf1和hly pr1使用PCR擴增人溶菌酶基因，人溶菌酶基因由本公司技術(shù)人員從人體淋巴細胞中采用RT-PCR方法獲得并克隆在T載體中(TaKaRa公司的pDM18 T載體)，并經(jīng)測序證實為人溶菌酶的cDNA。PCR的反應(yīng)條件為反應(yīng)總體積50μl，其中含dNTP 4μl(4種核苷酸濃度濃度各為2.5mM)、25μM的引物hly pf1和引物hly pr1各1μl、Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反應(yīng)緩沖液5μl、含人溶菌酶cDNA的T載體質(zhì)粒DNA1μl、水38μl。退火、延伸的循環(huán)條件為94℃3分鐘預(yù)變性后進入下述的循環(huán)，94℃ 20秒→55℃ 20秒→72℃ 30秒，25個循環(huán)。
擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖電泳后回收。這樣就獲得了5’端帶EcoR I酶切位點和BamH I酶切位點，3’端帶Not I酶切位點的人溶菌酶基因序列。
(3)降血糖肽1-GGSGGS-人溶菌酶融合基因載體的構(gòu)建①人溶菌酶基因克隆至pPIC9K載體將步驟(2)所得的人溶菌酶基因用EcoR I和Not I雙酶切后克隆至酵母表達載體多克隆位點中的EcoR I和Not I位點，該載體是在pPIC9K載體(一種商品化的通用載體，購自Invitrogen公司)的基礎(chǔ)上對載體原有的一個BamH I酶切位點以及載體原有的二個Xho I酶切位點中的一個(α因子信號肽以外的一個Xho I酶切位點)進行突變后的載體，即新的載體不含BamH I酶切位點，只含一個Xho I酶切位點(位于α因子信號肽)。初步確認的陽性克隆進行序列測定，確認人溶菌酶基因是克隆在載體α因子信號肽的下游。
②降血糖肽1-GGSGGS基因克隆至人溶菌酶-pPIC9K載體含人溶菌酶的pPIC9K載體用Xho I和BamH I雙酶切，與同樣雙酶切的降血糖肽1-GGSGGS基因連接，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，獲得了降血糖肽1-GGSGGS-人溶菌酶融合基因克隆于酵母表達載體的質(zhì)粒，序列測定予以確認。
(4)融合蛋白基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌確認的陽性克隆提取質(zhì)粒，Sal I酶切成線性后，采用電穿孔的方法轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌，具體操作過程參照Wu S等的報道(Wu S.Biotechniques.2004Jan；36152-4)，轉(zhuǎn)化菌在MD平板上初篩，然后再進行G418抗性篩選，從中篩選抗4mg/ml G418的酵母工程菌。
(5)發(fā)酵表達步驟(4)篩選得到的酵母工程菌采用常規(guī)方法在甲醇誘導下進行發(fā)酵表達。發(fā)酵在德國‘貝朗’30-L發(fā)酵罐中進行，發(fā)酵液經(jīng)蛋白電泳掃描推算，表達量約為1mg/ml(1000mg/l)。發(fā)酵中甘油流加和甲醇流加的方法參照Zhang W等的報道進行(Zhang W.J Ind Microbiol Biotechnol.2003 Apr；30(4)210-5.)。
(6)產(chǎn)物提取純化包括發(fā)酵液離心、超濾、離子交換柱層析。發(fā)酵液的濃縮采用超濾的方法，超濾膜為Millipore公司的5K膜；濃縮的發(fā)酵液經(jīng)G25凝膠過濾除鹽后，采用CMFF離子交換層析進行純化。G25和CMFF凝膠也均購自Millipore公司。
純化后的產(chǎn)物作為隨后生物活性檢測用融合蛋白。
實施例2在畢赤酵母中表達“降血糖肽2-連接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例1所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得編碼“降血糖肽2-GGSGGS”序列的基因所采用的引物為G-A-F1和G-R1G-A-F15’tactcgagaaaagacatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’；(SEQIDNO.9)G-R15’atggatccacctgagccacctcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’；(SEQIDNO.10)實施例3在畢赤酵母中表達“降血糖肽3-連接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例1所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得編碼“降血糖肽3-GGSGGS”序列的基因所采用的引物為G-G-F1和G-R1G-G-F15’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’；(SEQ ID NO.11)G-R15’atggatccacctgagccacctcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’；(SEQ ID NO.10)
實施例4在畢赤酵母中表達“降血糖肽4-連接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例1所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得編碼“降血糖肽4-GGSGGS”序列的基因所采用的引物為G-G-F1和G-26-R1G-G-F15’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.11)G-26-R15’atggatccacctgagccacccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.12)實施例5在畢赤酵母中表達“降血糖肽5-連接肽-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例1所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得編碼“降血糖肽5-GGSGGS”序列的基因所采用的引物為G-G-F1和G-TS-R1G-G-F15’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.11)G-TS-R15’atggatccacctgagccaccactagttcggcctttcaccagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc3’(SEQ ID NO.13)實施例6在畢赤酵母中表達“降血糖肽1-人溶菌酶”融合蛋白的方法，包括以下步驟(1)獲取降血糖肽1的基因①合成引物EX-F1和EX-R2EX-F15’tactcgagaaaagacatggtgaaggaacatttaccagtgacttgtcaaaacagatggaagaggaggcagtgcgg3’(SEQ ID NO.7)EX-R25’ctcacacctttcaaagaccttcgatggcggaggtgccccgctacttggtcctccgttcttaagccactcaataaataaccgcactgcctcctcttcc3’(SEQ ID NO.16)②上述兩種引物退火延伸，獲得了3’端包含人溶菌酶基因的前21個堿基的降血糖肽1的基因。
退火延伸的反應(yīng)條件為總體積50μl，其中含dNTP 4μl(濃度各為2.5mM)、25μM的上述兩種引物各1μl、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反應(yīng)緩沖液5μl、水39μl。退火、延伸的循環(huán)條件為94℃3分鐘預(yù)變性后進入下述的循環(huán)，94℃ 10秒→55℃ 10秒→72℃ 20秒，10個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后回收。
(2)獲取人溶菌酶基因以hly pf25’aaggtctttgaaagttgtgag3’(SEQ ID NO.17)和hly pr15’atgcggccgcttacactccacaaccttgaacatactg3’(SEQ ID NO.15)為引物，以人溶菌酶基因為模板，擴增人溶菌酶基因。PCR的條件為總體積50μl，其中含dNTP 4μl(濃度各為2.5mM)、25μM的hly pf2引物和hly pr1引物各1μl、Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反應(yīng)緩沖液5μl、含人溶菌酶cDNA的T載體質(zhì)粒DNA1μl、水38μl。擴增的循環(huán)條件為94℃3分鐘預(yù)變性后進入下述的循環(huán)，94℃ 20秒→55℃ 20秒→72℃ 50秒，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物(人溶菌基因)經(jīng)1.0％瓊脂糖電泳后回收。
(3)獲取降血糖肽1-人溶菌酶的融合基因以上述步驟(1)、(2)制得的降血糖肽基因和人溶菌酶基因混合后為模板，以EX-F1和hly pr1為引物，采用融合PCR方法，擴增獲得目標融合基因?；虻?’端包含Xho I酶切位點以及α因子信號肽末端序列，3’端含Not I酶切位點。融合PCR的方法為總體積50μl，其中含dNTP 4μl(濃度各為2.5mM)、25μM的EX-F1引物和hly pr1引物各1μl、Ex Taq DNA聚合酶0.3μl(含1.5U)、10x反應(yīng)緩沖液5μl、上述的降血糖肽基因1μl、人溶菌酶基因1μl、水37μl。擴增的循環(huán)條件為94℃3分鐘預(yù)變性后進入下述的循環(huán)，94℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 50秒，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物(降血糖肽-人溶菌融合基因)經(jīng)1.0％瓊脂糖電泳后回收。
(4)融合基因克隆至酵母表達載體及發(fā)酵表達與純化將步驟(3)所獲得的目標融合基因用Xho I和Not I雙酶切后克隆至酵母表達載體。初步確認的陽性克隆進行序列測定，確認目標融合基因是克隆在載體α因子信號肽的下游，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序確認的陽性克隆提取質(zhì)粒，Sal I酶切成線性后，轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌，再做G418抗性篩選，獲得抗4mg/ml G418的酵母工程菌。隨后進行酵母工程菌的發(fā)酵表達。酵母工程菌采用常規(guī)方法在甲醇誘導下進行發(fā)酵表達。發(fā)酵在德國‘貝朗’30-L發(fā)酵罐中進行，發(fā)酵液經(jīng)蛋白電泳掃描推算，表達量約為1mg/ml(1000mg/l)。發(fā)酵液經(jīng)離心、超濾、離子交換層析柱純化后，作為治療藥物用于隨后的糖尿病模型動物的治療實驗。
上述載體與宿主菌特征、轉(zhuǎn)化方法、發(fā)酵與純化步驟與實施例1所述相同。
實施例7在畢赤酵母中表達“降血糖肽2-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例6所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽2基因所采用的引物為G-A-F1和G-R2G-A-F15’tactcgagaaaagacatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’；(SEQ ID NO.9)G-R25’ctcacacctttcaaagacctttcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’；(SEQ ID NO.18)相應(yīng)的，步驟(3)中為獲取融合基因所使用的引物是G-A-F1和hly pr1。
實施例8在畢赤酵母中表達“降血糖肽3-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例6所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽3基因所采用的引物為G-G-F1和G-R2G-G-F15’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.11)；G-R25’ctcacacctttcaaagacctttcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag 3’(SEQ ID NO.18)；相應(yīng)的，步驟(3)中為獲取融合基因所使用的引物是G-G-F1和hly pr1。
實施例9在畢赤酵母中表達“降血糖肽4-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例6所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽4基因所采用的引物為G-G-F1和G-26-R2G-G-F15’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.11)；
G-26-R25’ctcacacctttcaaagaccttcagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.19)；相應(yīng)的，步驟(3)中為獲取融合基因所使用的引物是G-G-F1和hly pr1。
實施例10在畢赤酵母中表達“降血糖肽5-人溶菌酶”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例6所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽5基因所采用的引物為G-G-F1和G-TS-R2G-G-F15’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagct gcc3’(SEQ ID NO.11)；G-TS-R25’ctcacacctttcaaagacctt actagttcggcctttcaccagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc3’(SEQ ID NO.20)；相應(yīng)的，步驟(3)中為獲取融合基因所使用的引物是G-G-F1和hly pr1。
實施例11在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-連接肽-降血糖肽1”融合蛋白的方法，包括以下步驟(1)獲取降血糖肽1的基因，包括①合成引物EX-F2和EX-R3EX-F25’taggatcccatggtgaaggaacatttaccagtgacttgtcaaaacagatggaagaggaggcagtgcgg3’(SEQ ID NO.21)；EX-R35’atgcggccgcttacgatggcggaggtgccccgctacttggtcctccgttcttaagccactcaataaataaccgcactgcctcctcttcc3’(SEQ ID NO.22)；②EX-F2引物和EX-R3引物退火、延伸后獲得了降血糖肽1的基因，基因的5’端包含BamH I酶切位點，3’端包含Not I酶切位點。
退火、延伸的條件方法同實施例1中步驟(1)所述。
(2)構(gòu)建“人溶菌酶-GGSGGS”基因，包括①合成引物hly pf3和hly pr2hly pf35’tactcgagaaaagaaaggtctttgaaaggtgtgag3’(SEQ ID NO.28)；hly pr25’atgcggccgcatcggatccacctgagccacccactccacaaccttgaacatac3’(SEQ ID NO.29)；
②上游引物hly pf3的5’端引入了Xho I酶切位點；下游引物hly pr2的5’端引入BamH I和Not I限制性內(nèi)切酶位點以及GGSGGS連接肽序列；用這一對引物擴增人溶菌酶基因，獲得了5’端帶Xho I酶切位點，3’端帶GGSGGS以及BamH I和Not I酶切位點的人溶菌酶基因序列。
(3)“人溶菌酶-GGSGGS-降血糖肽1”融合基因的獲取及轉(zhuǎn)化；將上述步驟(2)中獲得的人溶菌酶-GGSGGS基因用Xho I和Not I雙酶切后克隆至酵母表達載體，確認人溶菌酶基因是克隆在載體α因子信號肽的下游。含人溶菌酶基因的載體用BamH I和Not I雙酶切，與同樣雙酶切步驟(1)中獲得的降糖肽基因分別連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了目標融合基因克隆于酵母表達載體的質(zhì)粒，序列測定予以確認，確認的陽性克隆提取質(zhì)粒，Sal I酶切成線性后，轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌，再做G418抗性篩選，獲得抗4mg/ml G418的酵母工程菌。
(4)發(fā)酵表達及產(chǎn)物提取純化酵母工程菌采用常規(guī)方法在甲醇誘導下進行發(fā)酵表達。發(fā)酵在德國‘貝朗’30-L發(fā)酵罐中進行，發(fā)酵液經(jīng)蛋白電泳掃描推算，表達量約為1mg/ml(1000mg/l)。發(fā)酵液經(jīng)離心、超濾、離子交換層析柱純化后，用作隨后的生物活性檢測實驗。
本實施例中所涉及到的載體與宿主菌特征、轉(zhuǎn)化方法、發(fā)酵與純化步驟與實施例12在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-連接肽-降血糖肽2”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例11所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽2基因所采用的引物為G-A-F2和G-R3G-A-F25’taggatcccatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ ID NO.23)；G-R35’atgcggccgcttatcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.24)；實施例13在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-連接肽-降血糖肽3”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例11所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽3基因所采用的引物為G-G-F2和G-R3G-G-F25’taggatcccatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc 3’(SEQ ID NO.25)；G-R35’atgcggccgcttatcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.24)；實施例14在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-連接肽-降血糖肽4”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例11所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽4基因所采用的引物為G-G-F2和G-26-R3G-G-F25’taggatcccatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.25)；G-26-R35’atgcggccgcttacagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.26)；實施例15在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-連接肽-降血糖肽5”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例11所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽5基因所采用的引物為G-G-F2和G-TS-R3G-G-F25’taggatcccatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.25)；G-TS-R35’atgcggccgcttaactagttcggcctttcaccagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc3’(SEQ ID NO.27)；實施例16在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-降血糖肽1”融合蛋白的方法，包括以下具體步驟(1)獲取降血糖肽的基因，包括①合成引物EX-F3和EX-R3EX-F35’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatggtgaaggaacatttaccagtgacttgtcaaaacagatggaagaggaggcagtgcgg3’(SEQ ID NO.30)；
EX-R35’atgcggccgcttacgatggcggaggtgccccgctacttggtcctccgttcttaagccactcaataaataaccgcactgcctcctcttcc3’(SEQ ID NO.22)；②上述兩種引物退火、延伸后，獲得了降血糖肽1的基因，且基因的5’端包含人溶菌酶基因的后24個堿基。
退火、延伸的條件方法同實施例1中步驟(1)所述。
(2)獲取人溶菌酶基因，包括①合成引物hly pf3和hly pr3hly pf35’tactcgagaaaagaaaggtctttgaaaggtgtgag3’(SEQ ID NO.28)；hly pr35’cactccacaaccttgaacatac3’(SEQ ID NO.31)；②以上hly pf3和hly pr3為引物，人溶菌酶基因為模板，PCR擴增人溶菌酶基因。PCR的反應(yīng)條件同實施例1步驟(2)中所述。
(3)融合基因的獲得步驟(1)所獲得的降血糖肽基因和步驟(2)所獲得的人溶菌酶基因混合后為模板，以hly pf3和EX-R3為引物，擴增獲得人溶菌酶-降血糖肽1的融合基因?；虻?’端包含Xho I酶切位點以及α因子信號肽末端序列，3’端含Not I酶切位點。PCR擴增條件同實施例6步驟(3)所述。
(4)融合基因轉(zhuǎn)化將步驟(3)中獲得的融合基因用Xho I和Not I雙酶切后克隆至酵母表達載體，初步確認的陽性克隆進行序列測定，確認人溶菌酶-降血糖肽基因是克隆在載體α因子信號肽的下游，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序確認的陽性克隆提取質(zhì)粒，SalI酶切成線性后，轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌，再做G418抗性篩選，獲得抗4mg/mlG418的酵母工程菌。
(5)轉(zhuǎn)化體的發(fā)酵表達及目標融合蛋白的提取純化酵母工程菌采用常規(guī)方法在甲醇誘導下進行發(fā)酵表達。發(fā)酵在德國‘貝朗’30-L發(fā)酵罐中進行，發(fā)酵液經(jīng)蛋白電泳掃描推算，表達量約為1mg/ml(1000mg/l)。發(fā)酵液經(jīng)離心、超濾、離子交換層析柱純化后，用作隨后的生物活性檢測實驗。
本實施例中所涉及到的載體與宿主菌特征、轉(zhuǎn)化方法、發(fā)酵與純化步驟與實施例17在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-降血糖肽2”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例16所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽2基因所采用的引物為G-A-F3和G-R3G-A-F35’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatgctgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.32)；G-R35’atgcggccgcttatcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.24)；相應(yīng)的，步驟(3)中為獲取融合基因所使用的引物是hly pf3和G-R3。
實施例18在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-降血糖肽3”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例16所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽3基因所采用的引物為G-G-F3和G-R3G-G-F35’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.33)；G-R35’atgcggccgcttatcggcctttcaccagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.24)；相應(yīng)的，步驟(3)中為獲取融合基因所使用的引物是hly pf3和G-R3。
實施例19在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-降血糖肽4”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例16所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽4基因所采用的引物為G-G-F3和G-26-R3G-G-F35’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.33)；G-26-R35’atgcggccgcttacagccaagcaatgaattccttggcagcttggccttccaaataag3’(SEQ ID NO.26)；相應(yīng)的，步驟(3)中為獲取融合基因所使用的引物是hly pf3和G-26-R3。
實施例20在畢赤酵母中表達“人溶菌酶-降血糖肽5”融合蛋白的方法，除步驟(1)中所使用的引物外，其余步驟與實施例16所述的技術(shù)方案步驟均相同。
本實施例中為了獲得降血糖肽5基因所采用的引物為G-G-F3和G-TS-R3G-G-F35’cagtatgttcaaggttgtggagtgcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgcc3’(SEQ ID NO.33)；G-TS-R35’atgcggccgcttaactagttcggcctttcaccagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc3’(SEQ ID NO.27)；相應(yīng)的，步驟(3)中為獲取融合基因所使用的引物是hly pf3和G-TS-R3。
實施例21對上述實施例1～20所得到的GLP及其類似物與人溶菌酶融合的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測采用15％濃度的丙烯酰胺凝膠，考馬斯亮藍R-250染色，經(jīng)凝膠成像儀掃描后結(jié)果如附圖1所示，可以看出這20種融合蛋白的分子量是一致，都在約18KD大小的位置。
實施例22在SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用抗人溶菌酶單克隆抗體對轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的上述融合蛋白進行western-blot檢測，第一抗體用抗人溶菌酶單克隆抗體，二抗采用堿性磷酸酶標記的兔抗鼠抗體，熒光底物顯色，再經(jīng)X光片暴光顯影后結(jié)果如附圖2所示，可以看出在約18KD位置的蛋白可以與抗人溶菌酶單克隆抗體起特異的免疫結(jié)合，證實了這些融合蛋白為溶菌酶的融合蛋白，此結(jié)果對前面的SDS-PAGE結(jié)果給予了進一步的支持和確認。
實施例23GLP-1及其類似物與人溶菌酶融合的重組蛋白生物活性檢測。
一、降血糖肽與人溶菌酶融合的重組蛋白作為治療藥物用于GK II型糖尿病大鼠模型的治療實驗GK II型糖尿病大鼠220只(每只體重在230g±10g)，分為22組，每組10只；第一組為GLP-1陽性對照組，第二組為生理鹽水對照組，第三至第二十二組分別為實施例1～20所述的20種融合蛋白的實驗組。
220只GK大鼠實驗前都抽取血液，分離血清，冰凍保存待測。融合蛋白各實驗組每只大鼠腹腔接種15μg的融合蛋白在融合蛋白中，降血糖肽只占整個融合蛋白分子量的約1/5，所以15μg的融合蛋白中也只相當于3μg的GLP-1；GLP-1陽性對照組每只大鼠腹腔接種3μg的GLP-1；對照組每只大鼠腹腔接種0.5ml的生理鹽水；每天注射一次，連續(xù)注射10天后，立即抽血，分離血清，冰凍保存待測。停藥3天后，再分別采血，分離血清，連同前面冰凍保存待測的血清一起，檢測血糖的濃度，結(jié)果見表1。
表1 融合蛋白治療GKII型糖尿病大鼠實驗結(jié)果

從表1可以看出降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白實驗組和GLP-1陽性對照組在連續(xù)給藥10天后血糖值都降到了正常值的水平(正常大鼠血糖值4.9-6.2)，降血糖肽-人溶菌酶融合蛋白和GLP-1的活性是相同的。但是停藥3天后GLP-1陽性對照組的血糖值又回復到了異常值，而降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白實驗組的血糖值仍在正常值，說明降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白的活性能維持更長的時間即在體內(nèi)的活性比GLP-1約延長3天。
二、降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白刺激大鼠胰島β細胞分泌胰島素和刺激胰島β細胞增生作用體外進行原代細胞培養(yǎng)取大鼠胰島β細胞，胰蛋白酶消化成單個細胞后計數(shù)。24孔板中每孔加入105個細胞，每組4孔。‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’組(分22組，每組4孔)每孔加入相應(yīng)的‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’的終濃度為5μg/ml，GLP-1組每孔加入GLP-1的終濃度為1μg/ml，陰性對照組每孔加入牛血清白蛋白的終濃度為20μg/ml。細胞置37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含低糖的DMEM/F2培養(yǎng)液。培養(yǎng)4小時后，每孔取出少量上清后繼續(xù)培養(yǎng)。
4小時上清中的胰島素檢測結(jié)果見表2，可以看出‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’各組和GLP-1陽性對照組上清中胰島素的量明顯要高于陰性對照組，說明‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’和GLP-1一樣，具有刺激胰島β細胞分泌胰島素的功能。培養(yǎng)7天后將孔中的細胞消化并計數(shù)，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’和GLP-1具有刺激大鼠胰島β細胞增生的作用。
三、降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白葡萄糖耐受作用正常昆明種小白鼠220只，(每只體重在22g±2g)，分為22組，每組10只；一組為GLP-1對照組，另一組為生理鹽水對照組；其余20組為‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’組；220只小鼠實驗前饑餓16小時，并尾部采集血液，分離血清?！笛请呐c人溶菌酶融合蛋白’各組每只小鼠腹腔接種0.5ml，含25μg的‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’；GLP-1對照組每只腹腔接種0.5ml，含5μg的GLP-1；陰性對照組每只腹腔接種0.5ml的生理鹽水；于注射后2小時每只腹腔注射40％的葡萄糖0.2ml，30分鐘后測定血糖。血糖測定結(jié)果如表3，從表中可以看出，小鼠注射GLP-1和‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’，均有較好的糖耐量反應(yīng)，而且‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’效果要優(yōu)于GLP-1陽性對照組。
表2 融合蛋白刺激大鼠胰島β細胞分泌胰島素和刺激胰島β細胞增生實驗結(jié)果

表3 融合蛋白葡萄糖耐受作用實驗結(jié)果

四、降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白的抗感染作用挑取一定量的金黃色葡球菌菌苔接種于2ml M-H液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)6小時后，取出用滅菌干酵母液進行適應(yīng)稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4)，再取NOD小鼠，隨機分組，每組5只鼠，分別腹腔感染不同菌量的受試菌液，測定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(Minimal Lethed dose，MLD)。用該菌量作為體內(nèi)感染菌量。于感染后即刻靜脈注射受試藥液，陽性對照用人溶菌酶(Human Lysozyme，活性單位30000單位/mg)，劑量50mg/kg，溶解在0.5ml生理鹽水中。降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白的劑量也是按50mg/kg給藥，溶解在0.5ml生理鹽水中。陰性對照每只小鼠靜脈注射0.5ml生理鹽水。觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，連續(xù)觀察7-14天。結(jié)果見表4；從表中可以看出重組降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白與陽性對照人溶菌酶一樣具有抗NOD小鼠感染的作用。
表4 融合蛋白對NOD小鼠腹腔感染細菌所致敗血癥模型的治療結(jié)果

五、降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白清除AGEs和改善尿蛋白的作用NOD小鼠220只，(每只體重在22g±2g)，分為22組，每組10只；一組為人溶菌酶對照組，另一組為生理鹽水對照組；其余20組為‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’組；220只小鼠實驗前采血和尿測定AGEs值和白蛋白/肌酸酐比值。檢測用的AGEs抗體的制備按照文獻報道的方法進行，即RNase與葡萄糖作用后形成的AGE-RNase作為免疫原，免疫兔子后獲得的抗血清，然后采用競爭抑制法測定AGEs量。‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’各組每只小鼠腹腔接種0.5ml，含25μg的‘降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白’；人溶菌酶對照組每只腹腔接種0.5ml，含25μg的人溶菌酶；陰性對照組每只腹腔接種0.5ml的生理鹽水；每天注射連續(xù)注射20天后采血和尿測定AGEs值和白蛋白/肌酸酐比值。結(jié)果如表5，從表中可以看出，降血糖肽與人溶菌酶融合重組蛋白與單純?nèi)巳芫敢粯泳哂袦p輕NOD小鼠血中AGEs水平、促進尿中AGEs的排出、減輕蛋白尿的作用。
表5 降血糖肽與人溶菌酶融合蛋白清除AGE和改善尿蛋白結(jié)果

序列表<110>大連帝恩生物工程有限公司<120>GLP-1及其類似物與人溶菌酶融合的重組蛋白及其用途<160>33<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>39<212>PRT<213>人工序列<400>1His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 1015Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>2<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>2HisAla Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>3<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>4<211>26<212>PRT<213>人工序列<400>4His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 510 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu20 25<210>5<211>32<212>PRT<213>人工序列<400>5His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 510 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Thr Ser20 25 30<210>6<211>130<212>PRT<213>人溶菌酶<400>6Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly1 5 10 15Met Asp Gly Tyr Arg Gly Met Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala20 25 30Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly35 40 45
Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp50 55 60Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser65 70 75 80Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala85 90 95Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp100 105 110Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys115 120 125Gly Val130<210>7<211>74<212>DNA<213>人工序列<400>7tactcgagaa aagacatggt gaaggaacat ttaccagtga cttgtcaaaa cagatggaag 60aggaggcagt gcgg 74<210>8<211>96<212>DNA<213>人工序列<400>8atggatccac ctgagccacc cgatggcgga ggtgccccgc tacttggtcc tccgttctta 60agccactcaa taaataaccg cactgcctcc tcttcc 96<210>9<211>71<212>DNA<213>人工序列<400>9
tactcgagaa aagacatgct gaagggacct ttaccagtga tgtaagttct tatttggaag60gccaagctgc c 71<210>10<211>76<212>DNA<213>人工序列<400>10atggatccac ctgagccacc tcggcctttc accagccaag caatgaattc cttggcagct60tggccttcca aataag76<210>11<211>71<212>DNA<213>人工序列<400>11tactcgagaa aagacatggt gaagggacct ttaccagtga tgtaagttct tatttggaag60gccaagctgc c 71<210>12<211>64<212>DNA<213>人工序列<400>12atggatccac ctgagccacc cagccaagca atgaattcct tggcagcttg gccttccaaa60taag 64<210>13<211>71<212>DNA<213>人工序列<400>13
atggatccac ctgagccacc actagttcgg cctttcacca gccaagcaat gaactccttg60gcagcttggc c 71<210>14<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>14atgaattcgg atccaaggtc tttgaaaggt gtgag 35<210>15<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>15atgcggccgc ttacactcca caaccttgaa catactg 37<210>16<211>97<212>DNA<213>人工序列<400>16ctcacacctt tcaaagacct tcgatggcgg aggtgccccg ctacttggtc ctccgttctt60aagccactca ataaataacc gcactgcctc ctcttcc 97<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>17aaggtctttg aaaggtgtga g 21
<210>18<211>77<212>DNA<213>人工序列<400>18ctcacacctt tcaaagacct ttcggccttt caccagccaa gcaatgaatt ccttggcagc60ttggccttcc aaataag 77<210>19<211>65<212>DNA<213>人工序列<400>19ctcacacctt tcaaagacct tcagccaagc aatgaattcc ttggcagctt ggccttccaa60ataag65<210>20<211>72<212>DNA<213>人工序列<400>20ctcacacctt tcaaagacct tactagttcg gcctttcacc agccaagcaa tgaactcctt60ggcagcttgg cc72<210>21<211>68<212>DNA<213>人工序列<400>21taggatccca tggtgaagga acatttacca gtgacttgtc aaaacagatg gaagaggagg60cagtgcgg 68
<210>22<211>89<212>DNA<213>人工序列<400>22atgcggccgc ttacgatggc ggaggtgccc cgctacttgg tcctccgttc ttaagccact60caataaataa ccgcactgcc tcctcttcc 89<210>23<211>65<212>DNA<213>人工序列<400>23taggatccca tgctgaaggg acctttacca gtgatgtaag ttcttatttg gaaggccaag60ctgcc65<210>24<211>69<212>DNA<213>人工序列<400>24atgcggccgc ttatcggcct ttcaccagcc aagcaatgaa ttccttggca gcttggcctt60ccaaataag69<210>25<211>65<212>DNA<213>人工序列<400>25taggatccca tggtgaaggg acctttacca gtgatgtaag ttcttatttg gaaggccaag60ctgcc65
<210>26<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>26atgcggccgc ttacagccaa gcaatgaatt ccttggcagc ttggccttcc aaataag 57<210>27<211>64<212>DNA<213>人工序列<400>27atgcggccgc ttaactagtt cggcctttca ccagccaagc aatgaactcc ttggcagctt60ggcc 64<210>28<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>28tactcgagaa aagaaaggtc tttgaaaggt gtgag 35<210>29<211>53<212>DNA<213>人工序列<400>29atgcggccgc atcggatcca cctgagccac ccactccaca accttgaaca tac 53<210>30<211>84<212>DNA<213>人工序列<400>30
cagtatgttc aaggttgtgg agtgcatggt gaaggaacat ttaccagtga cttgtcaaaa60cagatggaag aggaggcagt gcgg 84<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>31cactccacaa ccttgaacat ac 22<210>32<211>81<212>DNA<213>人工序列<400>32cagtatgttc aaggttgtgg agtgcatgct gaagggacct ttaccagtga tgtaagttct60tatttggaag gccaagctgc c 81<210>33<211>81<212>DNA<213>人工序列<400>33cagtatgttc aaggttgtgg agtgcatggt gaagggacct ttaccagtga tgtaagttct60tatttggaag gccaagctgc c 8權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于它是由降血糖肽與人溶菌酶在基因水平融合后表達的重組蛋白；所述的降血糖肽為GLP-1(7-36)或其類似物，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的一種；所述的人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；降血糖肽與人溶菌酶通過以下四種方式中的一種連接①降血糖肽-連接肽-人溶菌酶，②降血糖肽-人溶菌酶，③人溶菌酶-連接肽-降血糖肽，④人溶菌酶-降血糖肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于該融合蛋白是由畢赤酵母菌表達系統(tǒng)重組表達產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備治療糖尿病并發(fā)癥的藥物中的應(yīng)用，所述的糖尿病并發(fā)癥包括感染、由晚期糖基化終末產(chǎn)物引發(fā)的腎臟和血管并發(fā)癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及降血糖肽與人溶菌酶的重組蛋白及其用途。該融合蛋白中的降血糖肽是指GLP－1或其類似物，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的一種；所述的人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；降血糖肽與人溶菌酶通過以下四種方式中的一種連接①降血糖肽－連接肽－人溶菌酶；②降血糖肽－人溶菌酶；③人溶菌酶－連接肽－降血糖肽；④人溶菌酶－降血糖肽。該融合蛋白保留了GLP－1的降血糖活性，并延長了其在體內(nèi)的半衰期，此外還具有人溶菌酶的抗感染及降低AGE水平、促進尿中AGE的排出、減輕蛋白尿的活性，有利于緩解諸多糖尿病并發(fā)癥癥狀，可用于制備治療糖尿病及防治糖尿病并發(fā)癥的藥物。
文檔編號A61P3/10GK1927888SQ20061004796
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月30日
發(fā)明者黃慶生, 李元, 李別虎, 薛小平, 張明杰 申請人:大連帝恩生物工程有限公司