專利名稱：表達人cd20和/或cd16的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法
本申請已于2003年12月11日以如下名義申報PCT國際專利申請健泰科公司，該公司是一家美國國家公司和居民(除美國之外所有國家的申請人)；安德魯.C-Y.陳，美國公民與居民(僅對美國的申請人)；龔謙，中國公民與美國居民(僅對美國的申請人)；與弗萊維厄斯·馬丁，羅馬尼亞公民與美國居民(僅對美國的申請人)；本申請指定所有國家，并要求如下優(yōu)先權(quán)美國臨時申請序列號60/434,115，于2002年12月16日提交；與美國臨時申請序列號60/476,481，于2003年6月5日提交。
背景技術：
T與B細胞兩者包含可以被用作分化與識別標志的細胞表面蛋白。一種這樣的人B細胞標志是人B淋巴細胞限制的分化抗原Bp35，又名″CD20″。CD20在早期前B細胞發(fā)育期間表達，并且保持直到漿細胞分化。人們相信CD20分子調(diào)節(jié)激活過程中對細胞周期起始和分化所必需的一個步驟，并且通常在腫瘤B細胞上以非常高水平表達。
CD20存在于正常的B細胞以及惡性的B細胞兩者上，惡性B細胞的強勁增殖可以導致B細胞淋巴瘤。因此，CD20表面抗原有作為用特異于該抗原的抗體導向B細胞的候選物的可能性。這些抗CD20抗體特定地與正常和惡性的B細胞的CD20細胞表面抗原結(jié)合，導致B細胞的破壞與消減。具有破壞腫瘤的潛力的化學試劑或者放射性標記可以被偶聯(lián)到抗CD20抗體上，以致于該藥物被特異地遞送給腫瘤B細胞。
通過利用單克隆抗體導向CD20已經(jīng)被描述(參見，例如Weiner，Semin.Oncol.，26，43-51(1999)；Gopal與Press，J.Lab.Clin.Med.，134，445-450(1999)；White et al.，Pharm.Sci.Technol.Today，2，95-101(1999))。RituxanTM是一嵌合的抗CD20單克隆抗體，已經(jīng)被廣泛地作為單個的藥劑和與化學療法一起用于具有新診斷的和復發(fā)的淋巴瘤的病人(Davis et al，J.Clin.Oncol.，1851-1857(1999)；Solal-Celigny et al.，Blood，94，摘要，2802(1999)；Foran et al.，J.Clin.Oncol.，18，317-324(2000)。利用放射性同位素標記的抗體偶聯(lián)物也已經(jīng)被描述(例如，BexxarTM；Zelenetz et al.，Blood，94，摘要2806(1999))。
抗體抗原復合物與免疫系統(tǒng)細胞的交互作用導致多種反應，從效應子功能例如抗體依賴的細胞毒性、肥大細胞脫顆粒與噬菌作用，到免疫調(diào)節(jié)信號例如調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖與抗體分泌。所有這些交互作用是通過抗體的Fc結(jié)構(gòu)域或者免疫復合物與造血細胞上的特異的細胞表面受體結(jié)合而起始的?，F(xiàn)在非常明確地確認，由抗體與免疫復合物觸發(fā)的細胞反應的多樣性是Fc受體(FcRs)結(jié)構(gòu)的不均一性(heterogeneity)造成的。
這些受體中的一組，F(xiàn)cγRs，被發(fā)現(xiàn)存在于造血譜系的大多數(shù)細胞上，并且介導與IgG的高親合力和低親合力結(jié)合(參見，例如，美國專利號5,877,396，在此引入作為參考)。高親合力受體，F(xiàn)cγRI，結(jié)合單體IgG，并僅僅在巨噬細胞與嗜中性白細胞上表達。它能夠響應與抗體交聯(lián)而介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)與噬菌作用。IgG的低親合力受體，F(xiàn)cγRII與FcγRIII(CD16)，負責效應細胞對免疫復合物的反應，并且代表主要涉及體內(nèi)炎性反應的FcγRs。FcγRII在造血細胞上廣泛地表達，并在B細胞上作為抑制性的受體起作用，而在髓樣譜系細胞上及在血小板上，當被免疫復合物交聯(lián)時，F(xiàn)cγRII觸發(fā)ADCC、吞噬作用與炎癥介質(zhì)的釋放。FcγRIII在各式各樣的白細胞上表達，包括自然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞、嗜中性白細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性白細胞與肥大細胞，并且當被免疫復合物交聯(lián)時介導效應器反應。介導那些細胞上的所有的抗體依賴的反應的是自然殺傷細胞上唯一的FcR。自然殺傷細胞是具有自發(fā)性的細胞毒的淋巴細胞的亞群，該細胞溶解性破壞腫瘤細胞，而無明顯的抗原特異性或者由組織相容性分子導致的限制。除這些已明確表征的效應細胞通路之外，F(xiàn)cγRIII已在未成熟的胸腺細胞上被發(fā)現(xiàn)，在這一細胞中其被假定在早期胸腺細胞發(fā)育中起作用。
CD16與免疫球蛋白Fc部分的其它受體一起(例如FcγFcyRI、FcγRII、FcγRI)，在介導自體免疫與炎性反應中發(fā)揮重要作用。利用抗CD16單克隆抗體的研究已經(jīng)確定這個受體在將免疫復合物從循環(huán)中去除與在介導ADCC中的作用(參見例如Van de Winkel et al.，Immunol.Today，14，215-221(1993))。IgG與CD16的結(jié)合引發(fā)NK/LGL細胞活化，并觸發(fā)ADCC。在高水平可溶性CD16存在時ADCC可以暫停。
已發(fā)現(xiàn)(參見Mathiot et al.，J.Clin.Immunol.，13，41-8(1993))，可溶性CD16的水平在患有多發(fā)性骨髓瘤的病人中與健康志愿者相比較顯著地減少。另外，觀察到可溶性CD16階段依賴性減少，在階段I與階段II+III骨髓瘤病人中具有高度顯著的差異。因此，血清中可溶性CD16的測量既是骨髓瘤的診斷標志也是預后標志，可以對確定和指導疾病的新的免疫調(diào)節(jié)治療有用處。
已經(jīng)更進一步地發(fā)現(xiàn)，CD16存在于人血清及其它體液中，并且在炎癥位點是升高的(參見Fleit et al.，Blood，79，2721-8(1992))。似乎有至少兩種形式的人CD16，類型A與類型B。CD16-A主要地在巨噬細胞、自然殺傷細胞與大的顆粒淋巴細胞(NK/LGL)表面上表達，而CD16-B主要地在嗜中性白細胞與單核細胞表面上表達。
盡管CD20和CD16在人淋巴瘤與重要免疫反應誘導上具有顯著的作用，缺乏共表達人標志物的動物模型。因此，需要有關的動物模型以進行疾病研究與藥物研發(fā)。
發(fā)明概述本發(fā)明通常地涉及表達人細胞標志物—特別地是CD16與CD20的—非自然發(fā)生的非人轉(zhuǎn)基因動物。一方面，轉(zhuǎn)基因動物提供鑒定與測試對于與CD20有關的疾病或者病癥，例如癌癥的新治療劑的系統(tǒng)。在一個實施方式中，轉(zhuǎn)基因動物對測試針對CD20的治療的效力與毒性是有用處的。
本發(fā)明提供非自然發(fā)生的轉(zhuǎn)基因動物，其基因組包含編碼異源的CD20，優(yōu)選人CD20的核苷酸序列。核苷酸序列優(yōu)選地與人內(nèi)源啟動子可操作地連接，其中人CD20在B淋巴細胞表面上表達。在一個實施方式中，人CD20轉(zhuǎn)基因鼠特征為人CD20在細胞上的表達水平足以使與表達細胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細胞的殺傷，引起至少大約75％、和更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的和/或循環(huán)B細胞的B細胞消減。
在本發(fā)明的一個具體實施例中，該非自然發(fā)生的非人轉(zhuǎn)基因動物的基因組更進一步地包含編碼異源FcγIII受體，優(yōu)選人CD16，和優(yōu)選人CD16α鏈的核苷酸序列。該核苷酸序列優(yōu)選與人內(nèi)源的啟動子可操作地連接，其中異源的受體在白細胞表面上表達，所述白細胞包括一個或多個下列細胞自然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞、嗜中性白細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性白細胞、胸腺細胞與肥大細胞。
根據(jù)一個優(yōu)選實施方式，當動物基因組包含同源內(nèi)源基因(CD20或CD16，或者其兩者)，該基因被破壞或者剔除，以致內(nèi)源的分子在細胞表面上不表達。
本發(fā)明更進一步地提供鑒定能治療B細胞淋巴瘤的藥劑的方法，其中該方法包含給予在B淋巴細胞上表達人CD20的轉(zhuǎn)基因動物一種藥劑，并且確定B淋巴細胞數(shù)目是否有減少。發(fā)明也提供鑒定能消減或者殺死表達人CD20的細胞的方法，包含給予表達人CD20的轉(zhuǎn)基因動物一種藥劑，并且確定像這樣的細胞的數(shù)目是否有減少。更進一步提供根據(jù)這樣的方法鑒定的藥劑。
本發(fā)明的動物模型也可以被用于鑒別能誘導效應細胞反應，例如ADCC或者NK細胞介導的免疫反應的藥劑。在給予該藥劑之后，可以通過例如確定細胞因子水平的增減監(jiān)視該動物的免疫反應。在給予該藥劑之后細胞因子水平增加鑒定出該藥劑誘導Fc-介導的效應細胞反應。也可利用合適的標記或者標志評估推定的藥劑與CD16的結(jié)合。此外，通過在給藥一種藥劑后比較在CD20+轉(zhuǎn)基因動物與CD16+CD20+轉(zhuǎn)基因動物中B細胞消減，可以篩選該藥劑經(jīng)由CD16介導的免疫反應影響表達人CD20的B細胞(包括惡性細胞)消減的能力。本發(fā)明的動物也通過對目前描述的轉(zhuǎn)基因動物給藥，而對評估抗-CD20治療的毒性有用。
治療特異性，毒性與效力還可以通過將該藥劑的效果與在野生型動物或者未處理過的轉(zhuǎn)基因動物中的效果比較而確定。本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物可以更進一步提供向人給藥的特定的藥劑的安全性指示。例如，可以將人源化的抗體或者其它的藥劑給予該轉(zhuǎn)基因動物，并且作為該人源化抗體或者藥劑的人體內(nèi)利用的安全性與耐受性的指示、監(jiān)視作為將該藥劑投藥給該動物的結(jié)果的任何毒性或者副作用。那些可以在短期基礎上出現(xiàn)的不利情況包括頭痛、感染、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疼痛、惡心、無力、咽炎、腹瀉、鼻炎、灌輸反應、與肌痛。短期不利情況是處理后數(shù)天內(nèi)計量的。長期的副作用包括某些細胞類型的細胞毒、血小板減少導致的出血、由于炎性和/或變態(tài)反應導致的介質(zhì)釋放、對免疫系統(tǒng)的抑制和/或抗治療劑抗體的激發(fā)、終端器官毒性、與感染或者惡性腫瘤發(fā)生率增加。長期的不利情況是處理后數(shù)月內(nèi)計量的。
本發(fā)明另一個方面涉及確定抗-CD20藥劑效力的方法。通過向一組具有人CD20和/或人CD16α鏈的轉(zhuǎn)基因動物給予一系列劑量的該藥劑、確定導致攜帶人CD20細胞的減少的藥劑的至少一個劑量而確定效力。


圖1顯示來源于無轉(zhuǎn)基因(Tg-)、轉(zhuǎn)基因雜合的(Tg+/-)和純合的(Tg+/+)小鼠的小鼠B220+細胞中人CD20的表達。
圖2提供在B細胞分化與成熟期間各種細胞表面標志物(CD43、IgM、IgD)表達的示意圖。在Tg+小鼠中，hCD20在前-B(pre-B)、未成熟的B細胞與成熟B細胞上表達。
圖3顯示根據(jù)骨髓B細胞上人CD20表達篩選Tg+小鼠的結(jié)果。細胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD43的存在門化(gate)該細胞允許劃分成B細胞的各種的群體。為進行門化，細胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗-CD43抗體(熒光，BD Pharmingen)染色。
圖4顯示篩選Tg+小鼠脾B細胞人CD20表達的結(jié)果。細胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD21門化該細胞允許劃分成B細胞的各種的群體。為進行門化，細胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗CD21抗體(熒光，BD Pharmingen)染色。在T1區(qū)、邊緣區(qū)與T2/濾泡區(qū)發(fā)現(xiàn)帶有人CD20的B細胞。
圖5顯示篩選Tg+小鼠腸系膜淋巴結(jié)B細胞人CD20表達的結(jié)果。細胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD21門化該細胞允許劃分成B細胞的各種的群體。為進行門化，細胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗CD21抗體(熒光，BD Pharmingen)染色。
圖6顯示篩選Tg+小鼠派伊爾斑B細胞人CD20表達的結(jié)果。細胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD38門化該細胞允許劃分成B細胞的各種的群體。為進行門化，細胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗CD38抗體(熒光，BDPharmingen)染色。帶有人CD20的B細胞是成熟B細胞與生發(fā)中心的細胞。
圖7是一示意圖，示意將抗-人CD20單克隆抗體給藥給Tg+小鼠，并且分析具有人CD20細胞的存在或者缺少。在第0天給予單一劑量1毫克的抗-人CD20單克隆抗體。在第-1、1、2、3、4、7、14與21天從各種組織取樣品。如同以前描述經(jīng)過FACS分析來自不同組織例如外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑的樣品。也監(jiān)視抗-CD20單克隆抗體的血清水平。
圖8顯示在用抗-人CD20單克隆抗體m2H7(BD Pharmingen)處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中外周B細胞的消減。如同在圖7簡圖中的概括以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖9顯示用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理過的轉(zhuǎn)基因小鼠中成熟外周淋巴結(jié)B細胞的消減。如同在圖7簡圖中的概括以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖10顯示用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中脾T2與濾泡的B細胞的消減。如同在圖7簡圖中的概括以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖11顯示用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理過的轉(zhuǎn)基因小鼠中再循環(huán)成熟B細胞的消減。如同在圖7簡圖中的概括以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖12顯示在用抗人CD20單克隆抗體m2H7處理過的轉(zhuǎn)基因小鼠中成熟B細胞的消減與派伊爾斑生發(fā)中心B細胞對消減的抵抗。如同在圖7簡圖中的概括以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖13顯示用抗-CD20單克隆抗體給藥后B細胞的消減與恢復。在第1天給予小鼠抗體。在抗體處理后第6天，表達人CD20的B細胞在外周血液中檢測不到。在第6周，抗體剛一清除，hCD20+細胞開始被檢測到。到第14周，B細胞似乎已經(jīng)恢復到正常水平?；謴蛠碜郧绑wB細胞，該細胞不表達CD20而且然后隨后發(fā)展成為具有人CD20+的成熟B細胞。
圖14顯示FACS圖，指示脾生發(fā)中心B細胞對短期抗-CD20單克隆抗體治療的抵抗。小鼠在第1天由腹膜內(nèi)注射用綿羊紅細胞(SRBC)非免疫或者免疫以在脾中誘導生發(fā)中心。生發(fā)中心在第7天出現(xiàn)。在第8天，一組小鼠用抗-CD20抗體m2H7處理。對照組的小鼠用mIgG2a同種型對照抗體處理。在第12天對來自小鼠的脾細胞進行分析。使用對生發(fā)中心染色的PNA(花生凝集素)。在未用SRBC免疫的小鼠脾中沒有見到可檢測的生發(fā)中心細胞，而免疫小鼠脾顯示0.3％的PNA染色細胞。盡管T2/濾泡的B細胞被用抗-CD20抗體處理消減，脾中邊緣中心B細胞對抗體是有抗性的。
圖15顯示在用抗-CD20單克隆抗體處理過的小鼠與對照中不依賴T細胞的反應。小鼠用m2H7或者同種型對照抗體mIgG2a在第0天處理。在第3-7天，B細胞消減已經(jīng)發(fā)生。在第7天，小鼠用肺炎鏈球菌IV靜脈注射以誘導對多糖的反應。在第11天建立不依賴T細胞的反應。結(jié)果顯示，用抗-人CD20m2H7處理不影響來自邊緣區(qū)與B1細胞的B細胞反應，即非消減的邊緣區(qū)與B1B細胞給予對T-非依賴的抗原的保護。
圖16顯示BR3與2H7抗體處理在Tg+小鼠效應上的比較。表達編碼人CD20的細菌人工染色體的人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為hCD20+小鼠)用抗CD20單克隆抗體(在第9天以100微克單一劑注射)，BR3-Fc(從第1天至第12天，每隔一天100微克)，或者抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc的組合進行腹膜內(nèi)注射進行處理。每組包括4只小鼠。最后一次注射后兩天，將小鼠殺死，分析hCD20+B細胞。針對B細胞標志(CD21+CD23+)對脾、血、淋巴結(jié)與派伊爾斑進行FACS分析?？?CD20單克隆抗體治療消減T2與濾泡的B細胞，然而并非脾中的邊緣區(qū)B細胞，而BR3-Fc處理在脾中降低T2/濾泡的與邊緣區(qū)B細胞。
圖17顯示在派伊爾斑上抗-CD20單克隆抗體處理效應的缺乏。表達編碼人CD20的細菌人工染色體的人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為hCD20+小鼠)用抗CD20單克隆抗體(在第9天單一劑注射100微克)、BR3-Fc(從第1天至第12天、每隔一天100微克)、或者抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc的組合進行腹膜內(nèi)注射進行處理。每組包括4只小鼠。最后一次注射后兩天，將小鼠殺死，分析hCD20+B細胞。針對B細胞標志(CD21+CD23+)對脾、血、淋巴結(jié)與派伊爾斑進行FACS分析。BR3-Fc、2H7以及兩者的組合對派伊爾斑中的生發(fā)中心B細胞都沒有影響。
圖18顯示長期抗-CD20單克隆抗體處理后漿細胞未被消減。人CD20陽性的轉(zhuǎn)基因Tg+小鼠用抗-人CD20mH27抗體如同以前描述地進行處理。通過檢測骨髓與脾中對于syndican(CD-138漿細胞標志)陽性的細胞分析小鼠中漿細胞的存在或者缺乏。在抗-人CD20處理之后也監(jiān)視IgA或者IgM陽性的漿細胞的數(shù)目。結(jié)果表明在Tg+小鼠中漿細胞不受抗-人CD20抗體處理的影響，指示Tg+小鼠仍然具有產(chǎn)生抗體的能力。
圖19顯示用PK-136單克隆抗體在Tg+小鼠中消減自然殺傷細胞。產(chǎn)生PK-136單克隆抗體(特異針對小鼠NK1.1)的雜交瘤克隆從ATCC獲得。分別用對照單克隆抗體、PK-136、抗-CD20單克隆抗體與PK-136/抗-CD20的組合腹膜內(nèi)注射給四組人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。腹膜內(nèi)注射給予的劑量如下對照單克隆抗體200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20單克隆抗體10μg/ip，單一劑量用抗體處理后分析來自外周血，肝臟與脾的自然殺傷細胞。數(shù)據(jù)用平均數(shù)+/-標準誤差來表示，n＝8。
圖20表明自然殺傷細胞在Tg+小鼠的2H7介導的B細胞消減中起作用。產(chǎn)生PK-136單克隆抗體(特異針對小鼠NK1.1)的雜交瘤克隆從ATCC獲得。四組人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠腹膜內(nèi)分別注射對照單克隆抗體、PK-136、抗-CD20單克隆抗體與PK-136/抗-CD20的組合。腹膜內(nèi)注射給予的劑量如下對照單克隆抗體200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20單克隆抗體10μg/ip，單一劑量在抗-CD20單克隆抗體腹膜內(nèi)注射3天后分析來自外周血的、淋巴結(jié)與脾的淋巴細胞。數(shù)據(jù)用平均數(shù)+/-標準誤差來表示，n＝8。
圖21顯示在轉(zhuǎn)基因小鼠不同細胞群體中人CD20與人CD16的表達。來自CD20Tg-/Cd16Tg-(對照小鼠)、CD20Tg+/CD16Tg-、CD20Tg-/CD16Tg+、與CD20Tg+/CD16+小鼠的血細胞用標記有FITC的標記抗-人CD20抗體、偶聯(lián)至PerCP的抗-B220抗體與用PE標記的抗-人CD16抗體(BDPharmingen)染色，用FACS分析。結(jié)果表明在B細胞上發(fā)現(xiàn)人CD20，并且在缺乏B220標記、因而不是B細胞的細胞上發(fā)現(xiàn)人CD16。對于兩個標記均呈陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示兩種細胞群體。
圖22A顯示人CD16α鏈同種型A的代表性氨基酸序列(SEQ ID NO1)(GenBank登記號NM 000569)、的cDNA(SEQ ID NO2)(GenBank登記號NM 000569)(圖22B)與人CD16α鏈同種型A的基因組DNA序列(SEQ ID NO3)(GenBank登記號Z46222)(圖22C)。圖22D顯示小鼠CD16α鏈(GenBank登記號碼NM010188)代表性DNA序列(SEQ ID NO9)。圖22E顯示人CD16α鏈同種型B代表性氨基酸順序(SEQ ID NO10)和cDNA序列(SEQ ID NO11)(GenBank登記號碼NM 000570)。圖22F顯示編碼人CD16α鏈同種型B的代表性基因組序列(SEQ ID NO12)(GenBank登記號碼Z46223)。圖22G顯示編碼鼠CD16α鏈的cDNA序列(SEQ ID NO13)(GenBank登記號碼NM010188)。
圖23A顯示人CD20的氨基酸序列(SEQ ID NO4)(GenBank登記號碼BC 002807)、人CD20cDNA序列(圖23B)(SEQ ID NO5)(GenBank登記號碼BC002807)與人CD20的基因組序列(SEQ ID NO6)(GenBank登記號碼AH005353)(圖23C)。圖23D顯示鼠CD20的代表性cDNA序列(SEQ ID NO14)(GenBank登記號碼M62541)。
圖24顯示比較人CD16Tg-小鼠與人CD16Tg+小鼠中人CD16的表達。細胞用偶聯(lián)至PE的抗-人CD16(BD Pharmingen)染色，也用抗-DX5-FITC(BDPhanningen)染色以鑒定NK細胞，或用偶聯(lián)至APC(別藻藍蛋白)的抗-F4/80鑒別巨噬細胞。結(jié)果表明在人CD16Tg+小鼠NK與巨噬細胞中都表達人CD16轉(zhuǎn)基因。
圖25顯示人Fc受體γ鏈氨基酸(GenBank登記號碼P30273)(SEQ IDNO7)和cDNA序列(GenBank登記號碼M33915)(SEQ ID NO8)。
圖26顯示用FACS分析在巨噬細胞上小鼠CD16表達的存在或者缺少。來自缺乏鼠CD16(CD16-/-)小鼠與來自具有鼠CD16(CD16+/-)的對照小鼠的外周血細胞用抗-小鼠CD16抗體染色。利用抗-mac1抗體門化細胞對于巨噬細胞標志物mac-1的表達。
圖27顯示用FACS分析來自CD16-/-小鼠外周血細胞上小鼠CD64表達的存在或者缺乏。CD64是FcγRI，并且這個受體在小鼠細胞上的表達表明其它的Fc受體的表達不受FcγRIII(CD16)α鏈敲除的影向。來自缺乏鼠CD16小鼠(CD16-/-)與來自同種型對照小鼠的外周血細胞用抗-小鼠CD64抗體染色。利用抗-mac 1抗體門化細胞對于巨噬細胞標志物mac-1的表達。
圖28顯示與人外周血細胞上CD20表達比較，在來自人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血細胞上人CD20表達的表達水平的代表性比較。外周血細胞獲自人供體和來自hCD20Tg+小鼠，并且用標記的抗-人CD20抗體(mH27)染色。細胞用FACS分析，門化人CD19+和B220+群體。在圖上的數(shù)字表示平均熒光強度。
發(fā)明詳述以下術語除非另外規(guī)定具有在下面對其所賦予的含義。
術語″構(gòu)建物″或者″導向構(gòu)建物″指包含導向區(qū)的多核苷酸分子。導向區(qū)包含基本上與靶組織、細胞或者動物中的內(nèi)源序列同源的序列，使得該導向構(gòu)建物能向靶組織基因組整合。典型的，導向構(gòu)建物也包括特別感興趣的基因或者核酸序列、標記基因與合適的控制序列。
術語″CD16″或者″FcγRIII″可互換使用，并且指IgG免疫球蛋白Fc部分的細胞表面受體蛋白。這個受體是對于IgG的低親合力受體，并且優(yōu)先地與免疫復合物中的IgG結(jié)合。FcγRIII由作為配體結(jié)合鏈的α鏈與同二聚體或者雜二聚物組成。當FcγRIII在巨噬細胞上表達時，α鏈與γ鏈的同二聚體相結(jié)合。當FcγRIII在NK細胞上表達時，a鏈通過δ鏈與γ鏈的雜二聚體相聯(lián)系。γ鏈參與FcγRIII的細胞表面表達?！白匀话l(fā)生的CD16″具有獲得自自然的細胞表面受體蛋白質(zhì)的氨基酸順序，并且包括自然發(fā)生的變體形式包括等位基因的變體、同種型與截短的形式。人CD16包括α鏈的所有的同種型包括CD16或FcγIII-A(GenBank登記號碼Z46222)和CD16或者FcγRIII-B(GenBank登記號碼Z46223)。FcγRIII的α鏈代表性氨基酸與核苷酸序列在圖22A/B/C/D/E中顯示。人γ鏈的代表性序列示于圖25(GenBank登記號碼P30273與M33195)。本發(fā)明也考慮CD16或者FcγRIII變體。與源序列比較起來，變體經(jīng)過普遍已知的技術加以改變，并且優(yōu)選保有自然發(fā)生的人CD16或者FcγRIII的生物活性。FcγRIII的一些變體為本領域技術人員所已知。
術語″CD20″指在免疫系統(tǒng)的某些細胞上表達的細胞表面蛋白，特定地是B淋巴細胞-限制的分化抗原Bp35?！遄匀话l(fā)生的CD20″具有獲得自自然的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并且包括自然發(fā)生的變體例如等位基因變體、同種型與截短的形式。更特別地，″CD20″包括人CD20(AH003353；GenBank登記號碼M27395，J03574)。代表性的人與鼠CD20的氨基酸序列、cDNA序列與基因組序列示于圖23。本發(fā)明也考慮CD20變體。與源序列比較起來，變體經(jīng)過普遍已知的技術加以改變，并且優(yōu)選保有自然發(fā)生的人CD20的生物活性。優(yōu)選該變體不是在自然發(fā)生的人CD20氨基酸位置170與172改變，因為這些位置已經(jīng)被證明是如Polyak et al.，Blood 993256(2002)中所描述的被幾個不同抗-人CD20單克隆抗體所識別的表位的一部分。
當一DNA片段定位于內(nèi)源同源序列并且與內(nèi)源的同源序列重組時發(fā)生基因的″破壞″。這些序列破壞或者修飾可以包括DNA序列的插入、錯義、移碼、缺失、或者取代或者替換，或者其任何組合。插入包括插入整個的基因，其可能是動物、植物、真菌的、昆蟲、原核的、或者病毒來源。破壞，例如，可以經(jīng)過部分地或者完全地抑制它的生產(chǎn)或者經(jīng)過增強正常的基因產(chǎn)物的活動改變正常的基因產(chǎn)物。在一優(yōu)選實施方式中，該破壞是一沒有該基因的顯著表達的無效破壞(null discruption)。
術語″內(nèi)源的位點″意味著包括在將變成轉(zhuǎn)基因的宿主動物中發(fā)現(xiàn)的天然存在的基因位點。
術語″異源的″當與多肽或者基因聯(lián)合使用時指具有一氨基酸序列的多肽或編碼多肽的DNA，所述多肽或氨基酸序列在轉(zhuǎn)基因非人宿主動物中未找到的。因此，具有人CD20基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可以被描述為具有異源的CD20基因。可以利用種種的方法包括PCR、蛋白質(zhì)印跡、或者Southern印跡檢測轉(zhuǎn)基因。術語″人內(nèi)源的啟動子″指與編碼將被引入動物以形成轉(zhuǎn)基因動物的人蛋白質(zhì)的多核苷酸序列有自然聯(lián)系的啟動子。
“術語非人動物″意圖包括任何脊椎動物例如哺乳動物、鳥類、爬行動物、與兩棲動物。合適的哺乳動物包括嚙齒類動物、非人靈長類動物、羊、狗與母牛。合適的鳥類包括雞、鵝與火雞。優(yōu)選的非人動物是從嚙齒科包括大鼠和小鼠中選出來的，最優(yōu)選小鼠。
術語″自然發(fā)生″或者″自然相關的″如同在這里應用于一對象時所使用的指一對象可以在自然中被發(fā)現(xiàn)這一事實。例如，存在于一可以從自然來源分離的有機體(包括病毒)、并且沒有被人在實驗室中有意地修飾的一多肽或者多核苷酸序列是自然發(fā)生的。
對于核酸而言，術語″基本上同源″指兩個核酸或者其中指定的序列，當最佳地比對并且與合適的核苷酸插入或者刪除相比較時彼此具有至少大約80％序列同一性，更優(yōu)選大約81％序列同一性，更優(yōu)選大約82％序列同一性，更優(yōu)選大約83％序列同一性，更優(yōu)選大約84％序列同一性，更優(yōu)選大約85％序列同一性，更優(yōu)選大約86％序列同一性，更優(yōu)選大約87％序列同一性，更優(yōu)選大約88％序列同一性，更優(yōu)選大約89％序列同一性，更優(yōu)選大約90％序列同一性，更優(yōu)選大約91％序列同一性，更優(yōu)選大約92％序列同一性，更優(yōu)選大約93％序列同一性，更優(yōu)選大約94％序列同一性，更優(yōu)選大約95％序列同一性，更優(yōu)選大約96％序列同一性，更優(yōu)選大約97％序列同一性，更優(yōu)選大約98％序列同一性，以及更加優(yōu)選大約99％序列同一性?；蛘?，當該片段在選擇性雜交條件下與互補鏈雜交時存在基本的同源。比對兩序列并且鑒定同一性百分比的方法為本領域技術人員所熟知。已有幾種用于測定同一性百分比的計算機程序。為了確定核酸序列同一性百分比而進行的比對可以以本領域范圍內(nèi)的多種方式取得，例如，利用公眾可以得到的計算機軟件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或者Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以判定用來測量比對的合適的參數(shù)，包括任何對所比較的序列全長達最大比對所需要的算法。
″轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列″指多核苷酸序列，例如起始信號、增強子、與啟動子，其誘導或者控制與其可操作連接的蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選方案中，重組轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄在啟動子序列(或者其它的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列)的控制之下，所述啟動子在預期表達的細胞類型中控制重組基因表達。也應該理解，重組基因可以在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列控制之下，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與那些控制自然發(fā)生的形式的CD20或CD16轉(zhuǎn)錄的序列相同或者不同。
如同在這里使用的，術語″轉(zhuǎn)基因″指一個核酸序列(編碼，例如，CD20或者CD16)，該序列已經(jīng)經(jīng)由人的干預例如經(jīng)由在這里描述的方法被引入細胞。轉(zhuǎn)基因?qū)ζ鋵⒁灰氲霓D(zhuǎn)基因動物或者細胞而言可以是部分地或者完全異源的，即外來的。轉(zhuǎn)基因可以包括一或多個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與任何其它核酸，該核酸可能是對所選擇的核酸最佳表達所需的，例如內(nèi)含子。
轉(zhuǎn)基因動物″或″Tg+″可互換地使用，意圖包括任何非自然發(fā)生的非人動物，其中該動物的一個或多個細胞包含異源核酸，該異源核酸已經(jīng)經(jīng)由人的干預例如經(jīng)過本領域已熟知的轉(zhuǎn)基因技術被引入、并編碼人CD20和/或優(yōu)選人CD16。該核酸經(jīng)由有意的遺傳操縱，例如經(jīng)過顯微注射或者用重組病毒感染，被直接地或者間接地引入該細胞的前體而使核酸引入該細胞。術語遺傳操縱未包括經(jīng)典的雜交育種，而寧可說針對重組DNA分子的引入。這個分子可能被整合入染色體，或者其可以是染色體外復制的DNA。術語″Tg+″包括對于人CD20和/或人CD16而言雜合的和/或純合的動物。
″CD20相關的疾病″指疾病或者紊亂，該疾病或者紊亂已經(jīng)被與CD20在細胞上表達、B細胞的異常增殖或者活化聯(lián)系起來，或者已經(jīng)用抗-CD20抗體處理過。例如，嵌合的抗-CD20抗體已經(jīng)被用于治療淋巴瘤病人。已經(jīng)用抗-CD20治療處理過的其它的疾病或者癥狀包括例如類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、與強直性脊柱炎等自身免疫癥狀或者疾病。其它的病癥包括血或者骨髓移植后的EB病毒有關的疾病、卡波濟氏肉瘤相關的與皰疹病毒有關的多中心性Castlemen病(Karposi Sarcoma associated herpes virusrelated multicentric Castlemen disease)、丙型肝炎相關的冷球蛋白血癥血管炎、伴有自體免疫性溶血性貧血的淋巴組織增生性紊亂、及與ANCA相關的血管炎。
A.本發(fā)明的實施方式本發(fā)明提供表達異源的CD20標志物、異源CD16標志物或者兩者的轉(zhuǎn)基因動物。在一個實施方式中，本發(fā)明的人CD20轉(zhuǎn)基因動物在相同類型的B細胞上表達CD20。將抗-人CD20抗體給予該目前描述的轉(zhuǎn)基因動物導致表達人CD20B淋巴細胞的消減。由于無法將有效的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域摻入轉(zhuǎn)基因，先前制備表達人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的嘗試未能達成人CD20在合適的B細胞亞群中的表達。在另一個實施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠表達人CD20與人CD16。
本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物具有以類似于人受試者的方式反應的細胞。將抗-人CD20抗體給予該目前描述的轉(zhuǎn)基因動物導致表達人CD20B淋巴細胞的消減。在一個實施方式中，人CD20轉(zhuǎn)基因鼠特征為人CD20在細胞上的表達水平足以使與表達細胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細胞的殺傷，引起至少大約75％、和更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的和/或循環(huán)B細胞的消減。一個類似的反應在人中觀察到。這些動物模型能被用于篩選藥劑，所述藥劑包括然而不限于抗CD20標志物的單克隆抗體。另外，表達人CD16的轉(zhuǎn)基因小鼠提供一種模型，所述模型用于確定一種藥劑具有誘導效應細胞反應(例如，NK細胞介導的反應)的能力、或者該藥劑具有更進一步地消減表達CD20的B淋巴細胞(包括惡性的B細胞)的能力。另外，該轉(zhuǎn)基因動物可能用來測試抗-CD20所針對的治療的效力與毒性。
B.DNA構(gòu)建物典型的，編碼本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)的多核苷酸分子被插入載體中，優(yōu)選DNA載體，以在合適的宿主細胞中復制該多核苷酸分子。將會認識到，CD20和/或CD16轉(zhuǎn)基因可能被分別地制備與插入，或者制備在單一的構(gòu)建體中用于插入。DNA構(gòu)建物也可以對制備用于敲除動物的導向載體有用處。
為了分離克隆與轉(zhuǎn)移CD16和/或CD20位點，可以使用酵母人工染色體(YAC)。整個位點可以被克隆、并包含在一個或者幾個YAC克隆中。如果使用許多YAC克隆、并且包含重疊同源(overlapping homology)的區(qū)域，他們可以在酵母宿主株內(nèi)部重組，以產(chǎn)生代表整個位點的單一構(gòu)建物。YAC臂可以另外用哺乳動物選擇盒通過改型(retrofitting)來進行修飾，以幫助構(gòu)建物通過以前概括的方法引入胚胎干細胞或者胚胎。
由于其高穩(wěn)定性與相對大的插入物、操作容易以及鳥槍法測序，細菌人工染色體(BAC)文庫可以為目的基因提供人序列。BAC文庫可包含的平均插入物大小為100-150kb。BAC克隆能夠攜帶高達300,000bp的插入物。Shizuya，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 898794-8797；Kim，et al.，(1996)Genomics 34213-218；Swiatek，et al.，(1993)Genes andDevelopment 72071-2084。人與小鼠的基因組BAC文庫已經(jīng)被構(gòu)建，并且市場上可買到(Invitrogen，Carlsbad CA)?；蚪MBAC文庫還可以充當人與鼠CD20和/或CD16基因序列以及轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域的來源。
編碼人CD20的核酸為本領域技術人員所知。人與鼠CD20代表性的cDNA(SEQ ID NO5)、基因組(SEQ ID NO6)與氨基酸序列(SEQ ID NO4)在圖23中所示。其它的序列也可以在GenBank中找到，例如登記號碼AH003353。
編碼人CD16α鏈同種型的核酸為本領域技術人員所已知。人α鏈亞型A的代表性cDNA(SEQ ID NO2)、基因組(SEQ ID NO3)與氨基酸序列(SEQID NO1)示于圖22A、B與C(GenBank登記號數(shù)NM000569與Z46222)。人CD16α鏈同種型B代表性的氨基酸(SEQ ID NO10)與cDNA序列(SEQID NO11)在圖22E中顯示(GenBank登記號碼NM000570)。編碼人CD16α鏈同種型B的基因組序列示于圖22F(GenBank登記號碼Z46223)。編碼人Fc受體γ鏈的核酸序列也為本領域技術人員所已知。代表性氨基酸(SEQ IDNO7)(GenBank登記號碼P30273)和cDNA序列(GenBank登記號碼M33195)(SEQ ID NO8)示于圖25。
異源的轉(zhuǎn)基因優(yōu)選包含與將要在轉(zhuǎn)基因非人動物中表達的目的基因可操作連接的種系(germline)調(diào)節(jié)性DNA序列。術語″可操作連接″指遺傳片段操作上(即功能上)與核酸片段、或給定片段或者序列的上游(5′)或者下游(3′)序列連接。那些附近的序列經(jīng)常影響在所需的細胞類型中核酸片段或者序列的加工和/或表達。
優(yōu)選，這些調(diào)節(jié)性序列是基因組來源的，并且包括一個或者多個內(nèi)含子。例如，轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物可以包括位于編碼CD20和/或CD16的基因的5’-旁側(cè)區(qū)的調(diào)節(jié)區(qū)，該調(diào)節(jié)區(qū)以能在宿主細胞中復制與表達該基因的方式可操作地與編碼序列連接。在一個實施方式中，調(diào)節(jié)性序列包含與CD20與/或CD16有自然聯(lián)系的內(nèi)源的啟動子序列。在一些實施方式中，啟動子以與該序列所來源的動物中的表達水平類似的水平提供組織特定的表達。如果額外的旁側(cè)序列在優(yōu)化表達中有用，像這樣的序列可以利用現(xiàn)有的序列作為探針被克隆。使轉(zhuǎn)基因的加工或者表達達最大化所需的附加序列可以源自于基因組序列。
或者，啟動子可以是那些與轉(zhuǎn)基因宿主動物中相應的內(nèi)源基因有聯(lián)系的啟動子。例如，如果鼠基因CD20和/或CD16基因通過與相應的人基因整合而被破壞，該相應的人基因優(yōu)選是整合的，以使其分別與內(nèi)源的鼠CD20和/或CD16的鼠轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域可操作地連接。
優(yōu)選，調(diào)節(jié)性序列在合適的細胞中并以一定的水平提供該轉(zhuǎn)基因的表達，從而可以利用標準方法例如用抗體檢測來檢測表達。在一個實施方式中，調(diào)節(jié)序列以人細胞上CD20表達的至少40％的水平提供該人CD20轉(zhuǎn)基因的表達。
編碼轉(zhuǎn)基因的表達系統(tǒng)或者構(gòu)建物可以從構(gòu)建物表達，所述構(gòu)建物包括特異于CD20標志物和/或CD16受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，例如人內(nèi)源的啟動子(參見，例如，美國專利號5,877,396，在此引入作為參考)。
編碼如同在這里描述的轉(zhuǎn)基因的表達系統(tǒng)或者構(gòu)建物還可以包括DNA序列下游的3′非翻譯區(qū)。像這樣的區(qū)域可以使表達系統(tǒng)的RNA轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定，并因此增加從該表達系統(tǒng)中所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。對本發(fā)明的構(gòu)建物有用的3′非翻譯區(qū)是那些提供多聚腺苷酸化信號的序列。像這樣的序列可以源自，例如SV40小t抗原、CD20和/或CD16非翻譯區(qū)或者其它本領域熟知的3′非翻譯序列。
任選地，表達系統(tǒng)或者構(gòu)建物包括在啟動子與編碼信號序列的DNA序列之間的5′非翻譯區(qū)。像這樣的非翻譯區(qū)可以與啟動子來自相同的控制區(qū)域，或者可以來自于不同基因，例如他們可能是來源于其它人造、半-人造或者天然來源。
另外，可以利用與該轉(zhuǎn)基因不天然相關的其它啟動子或者其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。例如，異源的啟動子可以表達或者組織特異性表達水平增強。具有不同強度的各種啟動子可以被利用，只要該啟動子在該非人動物或者在所需組織類型中發(fā)揮作用。許多啟動子為本領域技術人員所已知。
表達系統(tǒng)可以利用本領域已知的方法制備。例如，表達系統(tǒng)可以作為較大質(zhì)粒的一部分被制備。像這樣的制備允許以本領域已知的有效方式克隆與選擇正確構(gòu)建物。表達系統(tǒng)可以位于質(zhì)粒上便利的限制性位點之間以致他們可以容易地從余下的質(zhì)粒序列中分離以摻入所需的哺乳動物。優(yōu)選，編碼人CD20和/或CD16的DNA構(gòu)建物包含細菌人工染色體，所述細菌人工染色體包括自然相關的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，以提供組織特異性的表達。
質(zhì)粒制備與宿主有機體轉(zhuǎn)化中使用的各種方法在本領域是已知的。用于原核與真核細胞的其它合適的表達系統(tǒng)，以及一般的重組操作，參見Molecular Cloning A Laboratory Manual，第二版，Sambrook、Fritsch與Maniatis編輯(冷泉港實驗室出版社1989)第16與17章。
C.轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的方法，包括敲除(knock-out)與“敲入”(knock-in)法，在本領域是熟知的(一般地，參見，“Gene TargetingAPractical Approach”，Joyner編輯.，牛津大學出版社有限公司(2000)))。轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生可以任選涉及鼠標志物基因位點的破壞與將編碼人標志物的基因引入鼠基因組，優(yōu)選與內(nèi)源基因在相同的位置。
根據(jù)本發(fā)明，當人CD20已經(jīng)被引入該鼠基因組時，生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因小鼠模型(huCD20+；或者稱為huCD20Tg+)。內(nèi)源的鼠CD20多肽存在于鼠淋巴細胞上，但是已知的抗-人CD20單克隆抗體不與鼠B細胞結(jié)合。因此，可以破壞內(nèi)源的鼠CD20基因但不是必須要破壞。當內(nèi)源的鼠CD20不被破壞時，則編碼人CD20的基因優(yōu)選插入在編碼鼠CD20的基因的位置之外的位置。
在一優(yōu)選實施方案中，該轉(zhuǎn)基因動物的基因組更進一步地包含編碼人CD16的序列，優(yōu)選，α鏈，以及更優(yōu)選亞型Aα鏈。當使用小鼠時，敲除系是優(yōu)選產(chǎn)生的，其中鼠CD16基因，優(yōu)選α鏈，已經(jīng)被破壞(mCD16-/-)。獨立地，當人CD16α鏈基因已經(jīng)被引入基因組時產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鼠系(huCD16+；或者被稱為huCD16Tg+)。mCD16-/-與huCD16+小鼠系然后雜交，產(chǎn)生表達人CD16α鏈但不表達內(nèi)源CD16的小鼠系(huCD16+mCD16-/-)?；蛘?，該人基因可以被引入來源于mCD16-/-系的ES細胞，或者被用于破壞鼠CD16基因。
內(nèi)源位點的滅活在一個優(yōu)選實施方案中，內(nèi)源位點的滅活是通過胚胎干細胞內(nèi)的同源重組造成的導向性破壞取得的。在一個實施方式中，DNA被引入宿主細胞并且在內(nèi)源位點重組以破壞內(nèi)源CD16的生產(chǎn)。類似地，在另一個實施方式中，DNA被引入宿主細胞并且在內(nèi)源CD20位點重組以破壞內(nèi)源CD20的生產(chǎn)。
利用本領域已知的標準方法可以生產(chǎn)導向構(gòu)建物，(參見，例如Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratoy Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork；E.N.Glover(eds.)，1985，DNA CloningA Practical Approach，Volumes I and II；M.J.Gait(ed.)，1984，Oligonucleotide Synthesis；B.D.Hames & S.J.Higgins(eds.)，1985，Nucleic Acid Hybridization；B.D.Hames& S.J.Higgins(eds.)，1984，Transcription and Translation；R.I.Freshney(ed.)，1986，Animal Cell Culture；Immobilized Cells and Enzymes，IRLPress，1986；B.Perbal，1984，A Practical Guide To Molecular Cloning；F.M.Ausubel et al.，1994，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，)。例如，該導向構(gòu)建體可以依照常規(guī)的方式制備，其中序列可以被合成、從天然來源分離、操縱、克隆、連接、進行體外誘變、引物修復、等等。在各個階段，所連接的序列可以被克隆，并通過限制性內(nèi)切酶酶切分析進行分析、測序等等。
導向DNA可以利用本領域熟知的技術獲得。例如，導向DNA可以通過寡核苷酸的化學合成、雙鏈DNA模板的切口翻譯、序列的聚合酶鏈式反應擴增(或者連接酶鏈式反應擴增)、攜帶目的序列的原核的或者靶克隆載體的純化(例如克隆的cDNA或者基因組DNA，合成DNA或者來自任何前面提到過的組合的DNA)而產(chǎn)生，所述原核或靶克隆載體例如質(zhì)粒、噬粒、YAC、粘粒、BAC、噬菌體DNA、其它的病毒DNA或者復制中間產(chǎn)品、或者其純化的限制性片段、以及具有所需核苷酸序列的單與雙鏈多核苷酸的其它來源。此外，可利用本領域已知方法選擇同源性的長度。例如，選擇可以以預先確定的內(nèi)源靶DNA序列的序列組成與復雜性為基礎。
在一個實施方式中，本發(fā)明的導向構(gòu)建物包含導向區(qū)，所述導向區(qū)包含與要被破壞的CD16基因和/或CD20的一部分或者區(qū)域同源的第一序列(或者臂)，和與該基因的第二部分或者區(qū)域同源的第二序列。該導向構(gòu)建物可以更進一步地包含正選擇標記，其優(yōu)選位于第一與第二DNA序列之間。該正選擇標記可可操作地與啟動子和聚腺苷酸化信號連接。
在另一個實施方式中，該導向構(gòu)建物可以包含超過一個可選擇標記基因，包括負的選擇性標記，例如單純皰疹病毒tk(HSV-tk)基因，其優(yōu)選位于該導向構(gòu)建物的一個或兩個同源臂的外面。負的可選擇標記可以與啟動子和聚腺苷酸化信號可操作地連接(參見，例如，美國專利號5,464,764；5,487,992；5,627,059及5,631,153)。
一旦合適的導向構(gòu)建物已經(jīng)被制備，該導向構(gòu)建物可能利用任何本領域已知方法被引入合適的宿主細胞。各種的技術可被用于本發(fā)明，包括，例如原核顯微注射；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因轉(zhuǎn)移入種系；在胚胎干細胞中的基因?qū)颍慌咛サ碾姶┛?；精液介導的基因轉(zhuǎn)移；與磷酸鈣/DNA共沉淀；顯微注射DNA入細胞核；細菌的原生質(zhì)體與完整細胞融合；轉(zhuǎn)染；聚陽離子例如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚烏氨酸等等。(參見例如，美國專利號4,873,191；Van der Putten et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152；Thompson et al.，1989，Cell56313-321；Lo，1983，Mol Cell.Biol.31803-1814；Lavitrano et al.，1989，Cell，57717-723)。轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞的各種技術在本領域是已知的。(參見，例如，Gordon，1989，Intl.Rev.Cytol.，115171-229；Keown et al.，1989，Methods in Enzymology；Keown et al.，1990，Methods andEnzymology，Vol.185，pp.527-537；Mansour et al.，1988，Nature，336348-352)。
能同源重組的任何細胞類型可被用于本發(fā)明的操作。像這樣的靶細胞的例子包括來源于脊椎動物的細胞包括哺乳動物例如人、牛的物種、羊的物種、鼠的物種、猿的物種、與其它真核生物例如絲狀真菌、與高等的多細胞有機體例如植物。
優(yōu)選的細胞類型包括胚胎干(ES)細胞，其典型的獲得自體外培養(yǎng)的移植前胚胎(參見，例如，Evans，M.J.et al.，1981，Nature 292154-156；Bradley，M.O.et al.，1984，Nature 309255-258；Gossler et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839065-9069；和Robertson et al.，1986，Nature322445-448)。利用本領域技術人員熟知的方法培養(yǎng)與制備ES細胞用于該導向構(gòu)建物的導入。(參見，例如，Robertson，E.J.ed.″Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells，a Practical Approach″，IRL Press，Washington D.C.，1987；Bradley et al.，1986，Current Topics in Devel.Biol.20357-371；Hogan et al.，在″Manipulating the Mouse Embryo”A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y，1986中；Thomas et al.，1987，Cell 51503；Koller et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810730；Dorin et al.，1992，Transgenic Res.1101；and Veis et al.，1993，Cell 75229)。將要用該導向構(gòu)建物插入的ES細胞源自于與他們將被引入的發(fā)育胚胎相同物種的胚胎或者胚泡。ES細胞典型的針對他們的整合入內(nèi)細胞群(inner cell mass)的能力被選擇，并且當在發(fā)育的胚泡階段被引入該哺乳動物胚胎時成為個體的種系的一部分。因此，任何具有這一能力的ES細胞系適于在本發(fā)明的操作中應用。
在該導向構(gòu)建物已經(jīng)被引入細胞之后，鑒別其中已經(jīng)發(fā)生成功基因?qū)虻募毎Ｔ搶驑?gòu)建物插入靶基因典型的是經(jīng)過鑒定表達該標記基因的細胞而檢測。在一優(yōu)選實施方案中，用本發(fā)明的導向構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的細胞用選擇未表達該選擇性標記的細胞的合適的藥劑處理。只有那些表達選擇性標記基因的細胞在一定條件下成活和/或生長。例如，那些表達引入的新霉素抗性基因的細胞抗化合物G418，而那些不表達neo基因標記的細胞被G418殺死。如果該導向構(gòu)建物也包含篩選標記例如GFP，同源重組可以通過在熒光下篩選細胞菌落而鑒別。那些已經(jīng)進行同源重組的細胞將已經(jīng)刪除該GFP基因，并且不會發(fā)熒光。
或者，正-負選擇技術可能用來選擇同源的重組體。這個技術涉及一種方法，其中第一藥物，例如新霉素樣藥物被加入該細胞群體，來選擇轉(zhuǎn)染細胞的生長，即正選擇。第二藥物，例如FIAU隨后被加入以殺死那些表達負選擇標記的細胞，即負選擇。那些包含與表達負選擇標記的細胞被選擇藥劑殺死，而那些沒有包含與表達該負選擇標記的細胞成活。例如，用構(gòu)建物非同源插入的細胞表達HSV胸苷激酶，并因此對皰疹藥物例如更昔洛韋(GANC)或者FIAU(1-(2-脫氧2-氟代-B-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘代尿嘧啶)敏感。(參見，例如，Mansour et al.，Nature 336348-352(1988)；Capecchi，Science 2441288-1292，(1989)；Capecchi，Trends in Genet.570-76(1989))。其它的方法包括受調(diào)節(jié)的正選擇(參見U.S.20030032175A1)，其中要求加入單一選擇劑。
可通過分析被選擇細胞的DNA來鑒別成功重組以印證同源重組。各種的技術在本領域已知，例如PCR和/或Southern分析可用來印證同源重組事件。
被選細胞然后被注射入動物(例如小鼠)的胚泡(或者其它的適于創(chuàng)造能生存的動物的用途的發(fā)育階段，例如，桑椹胚)，以形成嵌合體(參見，例如Bradley.A.，在“Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA PracticalApproach”中，J.Robertson編輯，IRL，Oxford，pp.113-152(1987))。或者，可以讓被選的ES細胞與離解的小鼠胚胎細胞聚集以形成集合體嵌合體。嵌合胚可隨后被移植入合適的假孕雌性代孕動物并且該胚胎被培育至足月。在其性細胞中攜帶同源重組DNA的嵌合后代可用于繁殖動物，其中該動物的所有的細胞包含同源重組的DNA。在一個實施方式中，嵌合后代小鼠被用來產(chǎn)生在CD16或者CD20基因具有雜合破壞的小鼠。雜合轉(zhuǎn)基因小鼠可隨后交配。本領域已熟知，典型的，這種交配的后代中1/4將在CD16或者CD20基因中有純合破壞。
除以上所述滅活內(nèi)源的位點的方法之外，有其它的優(yōu)選滅活方法，并且可以包括例如利用tet轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)來利用特異目的基因的時序控制(Proc.Natl.Acad.Sci.919302-9306(1994)或者引入脫氧細胞周期蛋白(deoxycycline)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制進行組織特定的控制(Proc.Natl.Acad.Sci.9310933-10938(1996)。
用于功能性滅活的另外優(yōu)選的方法包括使用cre-lox刪除、用于遺傳位點的導向敲除的位點特異性重組系統(tǒng)，其中l(wèi)oxP位點被插入目的基因的側(cè)翼，并且cre重組酶被激活以刪除基因(Curr.Opin.Biotechnol.521-527(1994))。
或者，反義或RNAi方法可能被利用以抑制該所需位點的轉(zhuǎn)錄，因此導致內(nèi)源位點的功能性破壞(knock-down方法)。在這樣的情形中，生產(chǎn)導向指定的目的位點的特定序列的寡核苷酸，其中成功導向?qū)е鹿δ艿鞍椎纳a(chǎn)抑制。
缺乏鼠FcγRIII受體的敲除小鼠株可從Taconic買到。這些小鼠缺乏鼠FcγRIIIγ鏈，從而也導致FcγRI與FcγRIII表達的喪失。另外，缺乏功能性γ鏈并且因此缺乏鼠FcγRIII受體的敲除小鼠可以如美國專利號5,877,396描述地加以制備，在此引入作為參考。
缺乏功能性的鼠FcγRIIIα鏈的小鼠可以利用類似方法生產(chǎn)。簡要地說，在一個實施方式中，可以利用如圖22G所示鼠CD16α鏈cDNA序列(GenBank登記號碼NM010188)制備導向載體。導向載體優(yōu)選包括編碼序列上游5′序列以及該編碼序列的至少300個核苷酸。該構(gòu)建物可以被克隆入編碼新霉素抗性基因的載體例如pMC1neo(Stratagene)。所得到的載體能隨后用電穿孔被引入ES細胞。ES細胞被鋪于neo抗性的胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上，然后在G418存在下被選擇。被選ES細胞被注射入胚泡。鼠CD 16a鏈的合適導向可以利用RT-PCR或者細胞上鼠CD16α鏈的表達的喪失測定。PCR引物可以利用鼠CD16α鏈cDNA序列加以設計。
對于內(nèi)源CD20的喪失純合的敲除小鼠可以如WO 02/062946中描述制備。簡要地，在一個實施方式中，CD20-缺陷的小鼠可以通過利用同源重組導向破壞胚胎干(ES)細胞中鼠CD20基因而生產(chǎn)。導向載體可以生產(chǎn)，其中用新霉素抗性基因替換編碼第二細胞外環(huán)的一部分的外顯子、第四跨膜結(jié)構(gòu)域、和鼠CD20的羧基末端大的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。鼠CD20的核苷酸序列為本領域技術人員所已知。(GenBank登記號碼M62541)。在一個實施方式中，合適的基因?qū)ぐ挟a(chǎn)生在氨基酸位置157截斷、并且與Neo基因序列編碼的88個氨基酸的蛋白質(zhì)融合的異常的CD20蛋白質(zhì)。
在DNA轉(zhuǎn)染之后，攜帶被導向的等位基因的neo-抗性的ES細胞克隆通過Southem印跡分析加以確定。一個ES細胞克隆的細胞可被注射入可被轉(zhuǎn)移入代孕母親的那些胚泡。高度嵌合的雄性后代(根據(jù)毛色80-100％)可以用C57BL/6(B6)雌性加以繁殖，以將突變傳遞給他們的后代。對于CD20基因的破壞純合的小鼠可以通過雜交雜合的后代以預期的孟德爾頻率獲得。
CD20的合適導向可以更進一步地通過來自純合后代的基因組DNA的PCR分析來證實。野生型CD20mRNA在CD20-/-小鼠中存在或者缺乏可以通過CD20-/-小鼠脾細胞產(chǎn)生的cDNA的PCR擴增來證實。CD20-/-小鼠中細胞表面CD20蛋白質(zhì)表達的缺乏可以更進一步地通過用鼠抗-CD20單克隆抗體染色B220+脾細胞證實。CD20基因的導向突變使細胞表面CD20蛋白質(zhì)不表達。
將轉(zhuǎn)基因引入非人動物本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物優(yōu)選通過將轉(zhuǎn)基因引入該動物的種系加以生產(chǎn)。在各種發(fā)育階段的胚胎靶細胞可用于引入轉(zhuǎn)基因。依賴于胚胎靶細胞的發(fā)育階段使用不同的方法。以一般健康、良好胚胎產(chǎn)量、胚胎中良好原核能見度與良好生殖適應度為標準，選擇任何被用來實施本發(fā)明的動物的特定的譜系。當將生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠時，株例如C57BL/6或者C57BL/6xDBA/2F1、或者FVB系是經(jīng)常使用的(商業(yè)上獲得自Charles RiverLabs，Boston，Mass，The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，或Taconic Labs.)。優(yōu)選的株是具有H-2b、H2d或者H-2q單倍體的株例如C57BL/6或者DBA/1。裸鼠可以被利用以允許人腫瘤細胞的引入。裸鼠的繁殖與維持更困難，因為其對感染與疾病敏感。用來實行本發(fā)明的系可以本身是轉(zhuǎn)基因的，和/或可以是敲除的。優(yōu)選相同的系被用來制備初始敲除哺乳動物與轉(zhuǎn)基因哺乳動物。這會使以后的繁殖與回交更有效。
轉(zhuǎn)基因引入胚胎可以通過任何本領域已知的方式完成，例如，顯微注射、電穿孔法、或者脂轉(zhuǎn)染。例如，該轉(zhuǎn)基因可以通過將構(gòu)建物顯微注射入已受精的哺乳動物卵的原核而被引入哺乳動物，使得一或多拷貝的該構(gòu)建物保留在發(fā)育哺乳動物的細胞中。轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物被引入受精卵后，該卵可以體外孵化一可變量的時間，或者再植入代理宿主內(nèi)，或者兩者都有。體外孵化至成熟是在本發(fā)明范圍之內(nèi)的。一個常見的方法是體外孵化該胚胎大約1-7天(取決于物種)然后將其再植入代理宿主內(nèi)。
再植入術利用標準方法完成。通常，代理宿主是被麻醉的，并且胚胎被插入輸卵管中。移植入特定宿主的胚胎數(shù)目將隨物種改變，但是通常與該物種自然生產(chǎn)的后代數(shù)目具有可比性。
還可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因引入非人動物。發(fā)育的非人胚胎可以體外培養(yǎng)至胚泡階段。在這一時期，可以針對卵裂球進行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Jaenich，R.(1976)PNAS 731260-1264)。通過酶處理除去透明帶以獲得卵裂球的有效感染((Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用來引入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)典型的是攜帶該轉(zhuǎn)基因的復制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner etal.(1985)PNAS 826927-6931；Van der Putten et al.(1985)PNAS 826148-6152)。通過在生成病毒的細胞單層上培養(yǎng)卵裂球容易與有效地獲得轉(zhuǎn)染(Van der Putten，見上；Stewart et al.(1987)EMBO J.6383-388)?；蛘?，感染可以在以后階段進行。病毒或者生產(chǎn)病毒的細胞可以被注射入囊胚腔(Jahner et al(1982)Nature 298623-628)。大多數(shù)建立者(founder)對于該轉(zhuǎn)基因是嵌合體，因為摻入僅僅發(fā)生在形成該轉(zhuǎn)基因非人動物的細胞亞群上。更進一步地，建立者可以在基因組不同位置包含轉(zhuǎn)基因的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒插入物，其通常將分散在后代中。另外，可能通過妊娠中期胚胎的子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染來將轉(zhuǎn)基因引入種系(Jahner et al.(1982)見上)。
轉(zhuǎn)基因引入的第三種類型的靶細胞是胚胎干細胞。轉(zhuǎn)基因可以通過DNA轉(zhuǎn)染或者通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的轉(zhuǎn)導有效地被引入ES細胞。這樣轉(zhuǎn)化的ES細胞可以此后與來自非人動物的胚泡結(jié)合。ES細胞此后移植入胚胎，并且構(gòu)成所得到的嵌合動物種系的一部分。
在一個實施方式中，編碼例如圖23所示人CD20的cDNA或者基因組克隆可以利用顯微注射或轉(zhuǎn)染被引入FVB小鼠受精卵或者ES細胞。胚胎體外孵化大約1-7天，然后移植入代理宿主。ES細胞與來自自然交配的宿主動物的胚泡結(jié)合，并且胚泡被再植入代理母親。
在另一個實施方式中，編碼例如圖22所示人CD16α鏈亞型A的cDNA或者基因組克隆可以使用轉(zhuǎn)染或者顯微注射被引入ES細胞或者已受精的胚胎。在可選的實施方式中，編碼人Fc受體γ鏈的cDNA或者基因組克隆也可以與人CD16α鏈一起被引入ES或者已受精的胚胎。受精卵體外孵化1-7天然后再植入代理宿主。ES細胞與來自自然交配的宿主動物的胚泡結(jié)合，并且胚泡被再植入代理母親。人CD16α鏈(FcγRIIIα鏈)在小鼠細胞中的表達將發(fā)生在小鼠γ鏈存在時，因為小鼠與人γ鏈在序列上相仿。
在本發(fā)明的一個實施方式中，在非人宿主中的內(nèi)源CD20或CD16通過異源的CD20或CD16α鏈基因的同源整合作用被功能上破壞，以致于異源CD20或CD16基因?qū)嵸|(zhì)上分別替換內(nèi)源CD20或CD16基因，并且優(yōu)選完全替換內(nèi)源CD20或者CD16基因的編碼序列。優(yōu)選，作為同源整合作用的結(jié)果，異源CD20或者CD16基因分別地連接于內(nèi)源CD20或CD16基因的調(diào)節(jié)性序列(例如增強子啟動子)，以致該異源基因在內(nèi)源CD20或CD16基因位點的調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄控制之下被表達。對于像這樣的替換等位基因純合的非人類的宿主可以根據(jù)在這里描述的方法生產(chǎn)。像這樣的純合的非人類宿主一般將表達異源CD20或CD16，或者兩者，但是不表達內(nèi)源CD20或CD16蛋白質(zhì)。通常，異源CD20或CD16基因的表達模式實質(zhì)上分別模仿在自然發(fā)生的(非轉(zhuǎn)基因)非人類宿主中內(nèi)源CD20或CD16基因的表達模式。
例如，可以生產(chǎn)人CD20基因序列已經(jīng)代替內(nèi)源的鼠CD20基因序列、并且轉(zhuǎn)錄上受內(nèi)源鼠調(diào)節(jié)序列控制的轉(zhuǎn)基因小鼠。人CD20一般地類似于在自然發(fā)生的非轉(zhuǎn)基因小鼠中鼠CD20的方式加以表達。
例如，可以生產(chǎn)具有人CD16α鏈序列并且轉(zhuǎn)錄上受內(nèi)源的鼠調(diào)節(jié)序列控制的轉(zhuǎn)基因小鼠。或者，該人CD16α鏈可以被引入小鼠，并且隨后與缺乏鼠CD16α鏈表達的小鼠雜交。人CD16α鏈的表達預計在鼠γ鏈存在時發(fā)生。
一般地，使用替換類型(replacement-type)的導向構(gòu)建物進行同源基因替換。在導向構(gòu)建物的內(nèi)源CD20或CD16α基因序列之間雙交叉同源重組導致異源CD20或CD16基因片段的靶向整合作用。通常，該轉(zhuǎn)基因的同源導向區(qū)域包含內(nèi)源的CD20和/或CD16α基因片段側(cè)翼的序列，以致同源重組導致內(nèi)源CD20和/或CD16基因片段各自伴隨性地刪除，以及異源基因片段的同源整合作用。實質(zhì)上整個內(nèi)源CD20和/或CD16基因可以通過單一導向事件或者通過多重導向事件(例如，單個外顯子的依序替換)用異源CD20和/或CD16基因替換。通常以正的或者負的選擇表達盒形式的一或多個選擇性標記可被置于導向構(gòu)建物中。通常優(yōu)選選擇性標記位于異源替換區(qū)域的內(nèi)含子區(qū)域。
轉(zhuǎn)基因小鼠的雜交包含轉(zhuǎn)基因人CD20的轉(zhuǎn)基因小鼠可以與包含轉(zhuǎn)基因人CD16和缺乏鼠CD16轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。優(yōu)選，該轉(zhuǎn)基因小鼠包含人CD16α鏈并缺乏鼠CD16α鏈。一種制備方法是產(chǎn)生一系列哺乳動物，每個包含該所需敲除構(gòu)建物或者轉(zhuǎn)基因中的一個。像這樣的哺乳動物通過一系列雜交、回交和選擇共同繁殖，最終產(chǎn)生包含所有所需敲除構(gòu)建物和/或轉(zhuǎn)基因的單一哺乳動物，其中該哺乳動物除了該敲除構(gòu)建物和/或轉(zhuǎn)基因的存在之外對野生型是同類系的(遺傳上同一的)。
典型的，取決于增殖過程中每個特定步驟的目標，通過交配同胞兄弟姐妹或者用后代交配親本株完成雜交與回交。在某些情況下，也許必需產(chǎn)生許多后代，以產(chǎn)生在適當?shù)娜旧w位置包含每一敲除構(gòu)建物和/或轉(zhuǎn)基因的單一后代。另外，也許必需雜交或者回交幾代，以最終獲得所需的基因型。
一旦該人位點已經(jīng)或者由同源重組或者由隨機整合作用被引入宿主基因組，并且宿主動物已經(jīng)被產(chǎn)生，在宿主動物中內(nèi)源CD16位點已經(jīng)通過各種轉(zhuǎn)基因或者突變動物的適當繁殖而被滅活，可以產(chǎn)生缺乏產(chǎn)生內(nèi)源CD16α鏈的天然能力、但是具有產(chǎn)生人CD16α鏈和/或CD20的能力的宿主。
在一個實施方式中，表達人CD16α鏈的轉(zhuǎn)基因小鼠與鼠CD16α鏈缺陷的小鼠交配，從而在CD16多肽缺陷的小鼠中重建特定的人CD16的表達。在另一個實施方式中，這些轉(zhuǎn)基因小鼠可隨后與表達人CD20的小鼠繁殖，以制造表達CD16和人CD20然而不表達內(nèi)源CD16的小鼠系。
D.轉(zhuǎn)基因的存在的證實可經(jīng)過任何合適的方法以所需組織、細胞或者動物中該轉(zhuǎn)基因的存在和/或表達篩選代理宿主的轉(zhuǎn)基因后代。篩選經(jīng)常利用對該轉(zhuǎn)基因的至少一部分互補的探針經(jīng)過Southern印跡或者Northern印跡分析完成?？梢允褂美每褂稍撧D(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體進行的蛋白質(zhì)印跡分析，作為篩選轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物存在的可選的或者補充的方法。典型的，DNA制備自尾組織，并且，通過Southern分析或者PCR分析該轉(zhuǎn)基因。或者，利用Southern分析或者PCR，測試被認為以最高水平表達該轉(zhuǎn)基因的組織或者細胞中該轉(zhuǎn)基因的存在與表達，雖然任何組織或者細胞類型也可被用來進行這一分析。
評價轉(zhuǎn)基因存在的其它或者附加方法包括，但不限于，合適的生物化學試驗例如酶和/或免疫學測定、對于特定標記物或者酶活性的組織學染色、流式細胞計分析，等等。對血液的分析也可以對檢測血中該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在、以及評定該轉(zhuǎn)基因在各種類型血細胞及其它血液組分水平的影響有用處。在一個實施方式中，人CD20或CD16或者兩者的表達可以利用抗人CD20或CD16或兩者的可檢測的標記抗體、并且利用FACS分析標記的細胞，在來自脾、骨髓、外周血、淋巴結(jié)、與派伊爾斑的免疫細胞上檢測。
對本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠中表達模式的檢驗揭示出對在人B系譜細胞中發(fā)現(xiàn)的正常人CD20表達的反映。在細胞百分數(shù)與表型特征方面加以考察的其它免疫學參數(shù)，包括T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞與嗜中性白細胞的百分數(shù)與表型特征，揭示在轉(zhuǎn)基因陰性與陽性同窩出生仔畜之間的相似性。對CD20Tg+/CD16Tg+中表達模式的考察顯示人CD20與CD16標志物兩者的表達。
E.轉(zhuǎn)基因動物的使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物代表人中CD16和/或CD20表達與作用的模型。相應地，這些動物在研究其起作用與相關的事件后面的機制、并且生成及測試對治療與診斷CD20有關的人類疾病包括癌癥與自身免疫病癥有用的產(chǎn)物(例如，抗體、雙特異性、多特異性等等)中有用。
在優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)基因表達的人CD20和/或CD16保有在人細胞中顯示出的類似功能特性。例如，表達人CD20的B淋巴細胞被抗-人CD20抗體識別，并且如同在人中一樣，響應人CD20抗體給藥而類似地從該轉(zhuǎn)基因動物中消減。如在實施例中更進一步詳細描述的，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠中的B淋巴細胞響應抗-人CD20抗體例如Rituxan處理而被消減。在一個實施方式中，人CD20轉(zhuǎn)基因鼠特征為人CD20在細胞上的表達水平足以使與表達細胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細胞的殺傷，引起至少大約75％、和更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的和/或循環(huán)B細胞的B細胞消減。另外，人CD20在與人CD20相同種類的B細胞上發(fā)現(xiàn)。表達人CD16的細胞也被抗-人CD16抗體識別。
轉(zhuǎn)基因CD16動物優(yōu)選能介導至少一種Fc-受體介導的效應子細胞功能或者反應。術語″Fc-受體介導的效應子細胞功能″意圖包括任何效應子功能，其是由免疫球蛋白(例如IgG)結(jié)合至效應細胞上的Fc受體而觸發(fā)的。例如，免疫球蛋白例如IgG與攜帶轉(zhuǎn)基因表達的人CD16的細胞結(jié)合可以誘導各種各樣的效應子功能，例如抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)，NK細胞介導的反應與溶菌酶生產(chǎn)。
相應地，在一個實施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物被用于測試藥劑例如抗體、多或者雙特異性分子、免疫粘附素(例如對于人體的安全性與效力)與靶表位，例如人CD20、人CD16或者兩者的區(qū)域的結(jié)合。其它藥劑可以包括有或者沒有Fc區(qū)域的抗體的抗原結(jié)合片段、單鏈抗體、微抗體(僅有重鏈的抗體)、異源多聚體(heteromultimeric)免疫粘附素，其具有多聚(multimer)抗-人CD20和/或抗-人CD16抗原結(jié)合區(qū)域之一。其它的藥劑可以包括抑制或者導致CD20-B細胞消減的小分子，可以包括與CD20結(jié)合、但是不激活CD20的CD20配體的變體。例如，像這樣的藥劑消減CD20表達細胞例如惡性的B細胞的效力可以經(jīng)過測量測試藥劑給藥前后轉(zhuǎn)基因動物中B淋巴細胞水平來測定。
相應地，本發(fā)明通過給予表達人CD20的轉(zhuǎn)基因動物一種藥劑與確定B淋巴細胞數(shù)目是否有減少，提供鑒定能治療B細胞淋巴瘤的藥劑，以及能消減或者殺死表達人CD20的B淋巴細胞的藥劑的方法。如同在這里使用的，″B細胞消減″指在藥物或者抗體處理之后同像這樣的處理以前的水平比較起來在動物或者人中B細胞水平的減少。使用如同在這里描述的已知方法可度量B細胞水平。B細胞消減可以是部分或者完全的。優(yōu)選，該藥劑誘導的B細胞消減的水平與疾病或紊亂癥狀的減輕或者改善相關。該推定藥劑的效力(即它消減表達CD20B淋巴細胞的能力)可以通過測量表達CD20的轉(zhuǎn)基因動物中循環(huán)B淋巴細胞基線水平、并與同一動物中給藥之后水平相比較而評估。B細胞消減效力的比較可以針對已知治療劑例如抗-人CD20抗體(例如Rituxan)進行，以測量該推定的藥劑對于CD20相關癥狀治療的效力。或者，B淋巴細胞的基線水平可以在表達人CD20的第一轉(zhuǎn)基因動物的各種組織(例如脾、骨髓、外周血、淋巴結(jié)、派伊爾斑)中測量?？呻S后給予表達人CD20的第二轉(zhuǎn)基因動物該推定的藥劑。動物然后被殺死，并且分析B淋巴細胞的水平。在表達人CD20的轉(zhuǎn)基因動物中B淋巴細胞數(shù)目減少指示該藥劑在減低與B細胞淋巴瘤有聯(lián)系的癌細胞和/或在人受試者中治療B細胞淋巴瘤的效力。也可以測試聯(lián)合治療來判定消減該所需細胞類型的效力。例如，抗-人CD20抗體可以與另一個藥劑例如Br3-Fc結(jié)合以引起任何可能是對抗-人CD20殺傷有抗力的攜帶CD20的B細胞消減。
B淋巴細胞恢復還可以通過隨著時間測量在一系列轉(zhuǎn)基因動物中細胞水平來評估。該藥劑對人CD20的特異性可以通過比較該藥劑對表達人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的影響與對野生型小鼠(不表達CD20標志物)的影響而評估。該藥劑的效力還可以與安慰劑或者對照物質(zhì)例如非特異性抗體或者其它對照劑的效應比較。優(yōu)選，該藥劑導向大多數(shù)或者所有攜帶人CD20的細胞但是不影響提供針對刺激T非依賴性免疫反應的抗原的免疫反應性的細胞。
另外，這些動物對于評估在人中可能的免疫反應是有用的模型，因為在轉(zhuǎn)基因動物中給藥像這樣的藥劑后免疫反應的起始指示該藥劑將在人中產(chǎn)生相同的效應。在像這樣的轉(zhuǎn)基因動物中對免疫反應的影響可以例如通過細胞因子水平的改變、抗體的生產(chǎn)或者T細胞反應來檢測。另外，轉(zhuǎn)基因動物可以在多或者雙特異性分子給藥之前被改造以包含靶細胞(例如腫瘤、病毒)。
本發(fā)明因此提供鑒定能誘發(fā)效應細胞反應例如ADCC或者NK細胞介導的免疫反應的藥劑。特別地，本發(fā)明提供鑒定能誘發(fā)Fc-介導的效應子細胞反應、特別是FcγIII-介導的效應子細胞反應的方法。推定的藥劑誘導像這樣的反應的能力可以通過，例如，分析細胞因子水平而評估。例如，推定藥劑的效力可以通過測量一種或更多在表達人CD16的第一轉(zhuǎn)基因動物中與FcγIII-介導的效應子細胞反應有聯(lián)系的一種或更多細胞因子基線水平、并且與該動物給藥之后的水平相比較而評估。或者，比較可在已經(jīng)給予該藥劑的表達人CD16的轉(zhuǎn)基因動物與或者沒有給予藥劑或者已經(jīng)給予安慰劑或者對照物質(zhì)的第二轉(zhuǎn)基因動物之間進行。該藥劑的特異性可以通過比較該藥劑對表達人CD16的轉(zhuǎn)基因動物與對具有被破壞的內(nèi)源CD16基因(例如CD16敲除)的轉(zhuǎn)基因動物和/或野生型動物(即具有功能性的內(nèi)源CD16)的影響而評估。在表達人CD16的轉(zhuǎn)基因動物中與人FcγIII介導的效應子細胞反應相關的細胞因子水平增加指示該藥劑在人受試者中誘發(fā)像這樣的反應的效力。
本發(fā)明的一個方面包含將推定藥劑至給予人CD20和人CD20/CD16轉(zhuǎn)基因動物中的每一個，并且比較該藥劑的效力，例如，殺死或者消減人CD20B細胞。一個實施方式是鑒定能誘發(fā)抗表達人CD20的B淋巴細胞的Fc介導的效應子細胞反應的藥劑，包含將該藥劑給予該CD20轉(zhuǎn)基因動物；測量在該CD20轉(zhuǎn)基因動物中表達人CD20的B淋巴細胞水平；確定B淋巴細胞水平降低的百分率；將該藥劑給予該CD20+/CD16+轉(zhuǎn)基因動物；測量在該CD20+/CD16+轉(zhuǎn)基因動物中表達人CD20的B淋巴細胞水平；并確定在該CD20+/CD16+動物中B淋巴細胞水平的降低百分率；其中如果在該CD20+/CD16+動物中測定的B淋巴細胞降低百分率大于在該CD20動物中測定的降低百分率，該藥劑被認為能誘發(fā)Fc介導的抗表達人CD20的B淋巴細胞的效應子細胞反應。
為了在抗-CD16和/或抗-CD20抗體或者雙或多特異性分子給藥至轉(zhuǎn)基因動物后檢測抗體結(jié)合，可使用任何合適的分析法。例如，可以取動物血樣品并且利用本領域已知的篩選試驗，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、或者蛋白質(zhì)印跡試驗，分析抗CD抗體-CD復合物的存在。這些分析中的每一個通常通過使用特異于目的復合物的標記試劑(例如抗體)檢測特定目的的蛋白質(zhì)-抗體復合物的存在。相應地，在本發(fā)明中，這些試驗被用于檢測包含在動物血清中的免疫球蛋白(例如IgG，IgA等等)與在該動物的特定細胞表面上包含的人CD標志物之間形成的CD-抗體復合物。
利用例如識別并特定地與抗體-CD標志物復合物結(jié)合的酶聯(lián)抗體或者抗體片段可以檢測該CD標志物-抗體復合物?；蛘撸梢岳酶鞣N各樣的其它的免疫測定中任何一種檢測該復合物。例如，抗體可以是放射性標記的，并且被用于放射免疫測定(RIA)。放射性同位素可以通過像利用γ粒子計數(shù)管或者閃爍計數(shù)器或者通過放射自顯影術的方式檢測。
為了在抗體、或者雙或者多特異性分子或者其它藥劑給藥到轉(zhuǎn)基因動物后檢測免疫反應，可以使用測量動物血漿或者血清中例如細胞因子、抗體或者T細胞群體濃度方面改變的任何合適的程序。例如，體內(nèi)細胞因子濃度改變可以通過各種各樣的免疫測定檢測，例如酶免疫測定(EIA)、放射免疫測定(RIA)或者ELISPOT測定。可以被分析的示范性的細胞因子包括粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、白細胞介素1-12(IL-1至IL-12)。
例如，血漿可以從已經(jīng)進行抗體、雙特異性或者多特異性分子或者其它藥劑給藥的轉(zhuǎn)基因動物獲得。可以利用EIA，通過檢測細胞因子與同酶偶聯(lián)的抗體的交互作用測量細胞因子的濃度。用合適的底物—優(yōu)選顯色底物—進行反應，借助于產(chǎn)生可以被檢測的化學部分的方法，例如，通過分光光度法、熒光的或者經(jīng)過視覺的方法，來檢測酶活性(Voller，“The EnzymeLinked Immunosorbent Assay(ELISA)”，Diagnostic Horizons 21-7，1978，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，MD；Voller，etal.，J.Clin.Pathol.31507-520(1978)；Butler，Meth.Enzymol.73482-523(1981)；Maggio，(ed.)Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L，1980；Ishikawa，et al.，(eds.)Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo，1981)。可用于檢測性地標記該抗體的酶包括，但是不局限于，蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-甾體異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸鹽脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶與乙酰膽堿酯酶。檢測可以通過使用對該酶的顯色底物的比色法進行。檢測也可以通過視覺上將底物的酶促反應程度同類似制備的標準比較或者利用RIA進行。
也可能用熒光化合物標記抗-細胞因子抗體或者抗CD20藥劑。當熒光標記的抗體暴露于適當波長的光時，可隨后檢測它的存在。最通常使用的熒光標記化合物是異硫氰酸熒光素、若丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍蛋白，o-苯二甲醛與熒光胺?？贵w還可以利用發(fā)熒光金屬例如152銪或者其它的鑭系進行可檢測地標記。這些金屬可以利用金屬螯合基團例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)來附著于抗體。抗體也可以通過將其偶聯(lián)至化學發(fā)光的化合物而可檢測地標記。然后經(jīng)過檢測在化學反應期間產(chǎn)生的熒光確定化學發(fā)光示蹤的抗體的存在。特別有用的化學發(fā)光標記化合物的例子是發(fā)光氨、異氨基苯二酰肼、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽與乙二酸酯。同樣地，生物發(fā)光的化合物可能用來標記抗體。生物發(fā)光是一類在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的化學螢光，其中催化蛋白質(zhì)提高化學發(fā)光反應的效率。生物發(fā)光的蛋白質(zhì)的存在經(jīng)過檢測熒光的存在而測定。用于標記用途的重要生物發(fā)光化合物是熒光素、熒光素酶與水母蛋白。
本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物可以更進一步提供向人給藥的特定藥劑的安全性指示。例如，可以將人源化抗體或者其它藥劑給予該轉(zhuǎn)基因動物，并且作為該人源化抗體或者藥劑人體內(nèi)利用的安全性與耐受性指示，監(jiān)視作為將該藥劑投藥給該動物的結(jié)果的任何毒性或者副作用?？梢栽诙唐诨A上出現(xiàn)的不利情況包括頭痛、感染、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疼痛、惡心、無力、咽炎、腹瀉、鼻炎、灌輸反應、與肌痛。短期不利情況是處理后數(shù)天內(nèi)測量的。長期的副作用包括某些細胞類型的細胞毒、血小板減少導致的出血、由于炎性和/或變態(tài)反應導致的介體釋放、免疫系統(tǒng)和/或抗治療劑抗體發(fā)育的抑制、終端器官毒性、和感染或者惡性腫瘤發(fā)生率增加。長期的不利情況是處理后數(shù)月內(nèi)測量的。
本發(fā)明的另一方面涉及測定抗CD20藥劑的效力的方法。通過向一系列具有人CD20和/或人CD16α鏈的轉(zhuǎn)基因動物給予一劑量范圍的該藥劑、確定導致攜帶人CD20細胞減少的至少一個劑量而確定效力。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，包括細胞、組織、或者從其中衍生的其它材料，可以作為疾病模型，特別是與攜帶CD20細胞有關的或者其介導的疾病模型被使用。任何物種的動物，包括然而不限于，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬(micro-pig)、山羊，和非人靈長目、例如狒狒，猴子和黑猩猩可被用來產(chǎn)生疾病動物模型。這些系統(tǒng)可被用于各種各樣的應用。像這樣的試驗可以作為被設計來鑒別藥劑的篩選策略的一部分，所述藥劑例如能緩解疾病癥狀的化合物。因此，以動物和細胞為基礎的模型可以用來鑒別可能在治療疾病中有效的藥物、藥品、治療和介入法。
以細胞為基礎的系統(tǒng)可被用來鑒別可以對緩解疾病癥狀起作用的化合物。例如，像這樣的細胞系統(tǒng)可能以足夠的濃度并且以在該顯露的細胞中足夠?qū)е逻@樣的疾病癥狀的緩解的時間內(nèi)暴露于認為顯示出具有緩解疾病癥狀能力的化合物。暴露后，檢查細胞以判定疾病細胞表現(xiàn)型中一個或多個是否已經(jīng)改變，以類似于更正常的或更野生型的、非疾病表現(xiàn)型。
其它用途對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
以下非限制性實施例舉例說明本發(fā)明。在這里所引用的所有文件因此明白地引入作為參考。
實施例實施例1
本實施例描述人CD20BAC轉(zhuǎn)基因(Tg+)小鼠的產(chǎn)生，并且研究了抗-人CD20抗體處理在hCD20+小鼠中的效果。
利用來自Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)的人CD20CITB人BAC-D-克隆No.117H19生產(chǎn)人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。編碼人CD20的DNA從人淋巴細胞中分離，并且送至Invitrogen。Invitrogen用帶有來自人BAC文庫的克隆的濾紙測試DNA，并且鑒定克隆117H19。先前產(chǎn)生表達人CD20的轉(zhuǎn)基因小鼠的嘗試不成功，也許部分由于無法將足夠的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域摻入轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。通過用克隆117H19制備的人CD20BAC構(gòu)建物顯微注射入小鼠FVB近交系的受精卵而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠。受精卵孵化1-7天，然后移植入代理小鼠(surrogate mouse)?；谌薈D20表達的FACS分析篩選小鼠。如同可以從在圖1的FACS圖中看到的，對于轉(zhuǎn)基因雜合的(Tg+/-)和純合的(Tg+/+)小鼠在他們的B220+B細胞上表達人CD20。未有意地破壞鼠CD20基因。
圖2提供在B細胞分化與成熟期間各種細胞表面標志物(CD43，IgM，IgD)表達的示意圖。在Tg+小鼠中，hCD20在前-B、未成熟B細胞與成熟B細胞上表達。人CD20在與人相同的細胞類型中發(fā)現(xiàn)，并且以與人B細胞相比較稍微低的水平在這些細胞類型上表達。
利用偶聯(lián)至FITC的抗-人CD20抗體(BD Pharmingen)篩選Tg+小鼠骨髓、脾、腸系膜淋巴法與派伊爾斑B細胞上人CD20的表達(結(jié)果示于圖3-6)。以B220和CD43、CD21、或者CD38對細胞門化使得對來自各種組織的各種B細胞群體進行劃分。為了進行門化，細胞用偶聯(lián)至PerCP的抗-B220抗體(BD Biosciences)染色，并且用偶聯(lián)至PE的抗CD43抗體，抗-CD21抗體或者抗-CD38抗體(fluorescence，Becton Dickinson)染色。
利用FACS分析并計算平均熒光強度，將在轉(zhuǎn)基因小鼠外周血細胞上人CD20的表達水平與在人外周血細胞上人CD20表達水平相比較。外周血細胞獲自人供體和來自hCD20Tg+小鼠，并且用標記的抗-人CD20抗體(mH27)染色。細胞用FACS分析，在人CD19+與B220+群體上門化。圖28顯示與人外周血細胞上CD20表達比較，在來自人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血細胞上人CD20表達水平的代表性比較。在圖上的數(shù)字表示平均熒光強度。結(jié)果表明人CD20在轉(zhuǎn)基因細胞上以在人細胞上人CD20的大約40％的水平表達。
這些結(jié)果表明獲自轉(zhuǎn)基因小鼠中許多不同組織的B細胞表達人CD20標志物。人CD20標志物主要地在成熟B細胞上發(fā)現(xiàn)，但也可以以類似于在人中觀察到的模式在前-B與未成熟B細胞中發(fā)現(xiàn)。
該轉(zhuǎn)基因小鼠然后用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理，以判定該抗體處理是否將導致B細胞消減。抗體m2H7可以獲得自BD PharMingen(SanDiego，CA)，eBioscience，或者Calbiochem。將m2H7的抗-人CD20活性與體外試驗中的Rituxan活性相比較，并且具有可比擬的活性。人源化的抗體，例如Rituxan，也可用于細胞殺傷研究中，因為體內(nèi)細胞殺死發(fā)生在足夠短的時間，不用考慮對該人源化抗體的免疫反應。
如同在圖7中示意性概括的，以總計1毫克劑量給予該轉(zhuǎn)基因小鼠抗體m2H7，相當于對于70公斤人而言3.5毫克。在箭頭指示的日子對外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、和派伊爾斑進行FACS分析。監(jiān)視抗-CD20單克隆抗體的血清水平。
單獨用抗-CD20單克隆抗體(m2H7)處理Tg+小鼠導致外周血、成熟外周淋巴結(jié)B細胞、脾T2與濾泡B細胞中B細胞的消減(參見圖8-11)。然而，盡管在細胞表面上有非常高，很可能是飽和水平的抗體，也觀察到某些B細胞亞群對抗抗-CD20抗體殺傷。這些抗性B細胞是脾邊緣區(qū)B細胞(圖10)，和派伊爾斑(圖12)與脾(圖14)兩者中的生發(fā)中心B細胞。在圖14中，小鼠用第一劑量的抗-CD20單克隆抗體以100tg在第1天注射，繼之以在第3天上以第二劑量100μg注射(可能50μg單一劑量就足夠飽和B細胞)。T2/濾泡B細胞被消減，但是派伊爾斑生發(fā)中心B細胞顯示與抗-CD20單克隆抗體結(jié)合，但是對殺傷具抗性。
研究了抗-人CD20抗體處理后B細胞的恢復。在第1天給予小鼠抗體。圖13表明抗體處理后第6天，外周血中檢測不到B細胞。在第6周，剛一清除抗體，hCD20+細胞就開始被檢測，并且到第14周，B細胞似乎回升至正常水平。恢復由前體B細胞引起，該細胞不表達CD20而且然后隨后發(fā)育成為具有人CD20+的成熟B細胞。
圖14顯示FACS圖，指示脾生發(fā)中心B細胞對短期(單一注射)抗-CD20單克隆抗體治療的抵抗。在第1天通過腹膜內(nèi)注射，用綿羊紅細胞(SRBC)非免疫或者免疫小鼠以在脾中誘導生發(fā)中心。生發(fā)中心在第7天出現(xiàn)。在第8天，一組小鼠用m2H7處理。對照組的小鼠用mIgG2a同種型對照抗體處理。在第12天對小鼠脾細胞進行分析。使用對生發(fā)中心染色的PNA(花生凝集素)。在未用SRBC免疫的小鼠脾中沒有見到可檢測的生發(fā)中心細胞，而免疫小鼠脾顯示0.3％的PNA染色細胞。盡管T2/濾泡B細胞被用抗-CD20抗體處理消減，脾邊緣中心B細胞對抗體是有抗力的。
然后，測定是否B細胞剛一消減，小鼠就能發(fā)展出不依賴于T的免疫反應。在第0天，小鼠用m2H7或同種型對照抗體mIgG2a處理。在第3-7天，B細胞消減已經(jīng)發(fā)生。在第7天，小鼠用肺炎鏈球菌IV靜脈注射以誘導對多糖的反應。在第11天建立起T細胞不依賴的反應。圖15中顯示的結(jié)果表明，用抗-人CD20處理不影響來自邊緣區(qū)與B1細胞的B細胞反應，即非消減的邊緣區(qū)與B 1B細胞賦予對T-非依賴的抗原的保護。這個數(shù)據(jù)顯示，盡管用抗-CD20單克隆抗體處理，體液免疫的一些方面，特別地是T-非依賴的B細胞反應(在這種情況下)仍是保留的。
總之，人CD20轉(zhuǎn)基因動物在血液、骨髓、脾、淋巴結(jié)和派伊爾斑的成熟、前-B與未成熟B細胞上表達人CD20。人CD20在轉(zhuǎn)基因細胞上以相當于人細胞上表達的CD20的40％的水平表達。用抗人CD20抗體處理小鼠，除了脾邊緣區(qū)B細胞(圖10)與派伊爾斑(圖12)和脾(圖14)兩者的生發(fā)中心B細胞之外，在處理3-4天之內(nèi)導致B細胞的顯著消減。不一定受任何學說束縛，B細胞死亡似乎是由ADCC、依賴于補體的細胞毒性(CDC)或者細胞程序死亡或者該三者的組合所介導。在用抗-人CD20處理過的小鼠中觀察到對T非依賴性抗原的反應，其與脾邊緣區(qū)B細胞對抗-人CD20抗體導致的消減的對抗相一致。對抗-人CD20抗體的殺傷作用有抗力的B細胞引起T-非依賴性免疫反應的保留，和/或提供如果想要的話可能需要聯(lián)合治療以消減所有的B細胞的指示。在用抗-人CD20抗體處理后14周觀察到表達人CD20的B細胞的恢復，很可能是由于前體B細胞的成熟。這些結(jié)果類似于在用Rituxan處理過的人中觀察到的。
實施例2這個實施例顯示在抗-CD20單克隆抗體與BR3拮抗劑治療對于B細胞調(diào)制/消減之間的協(xié)同作用。BR3-Fc是免疫粘附素，其中人BR3的細胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白序列(在這種情況下是人IgG1)的恒定結(jié)構(gòu)域融合。
表達人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為hCD20+小鼠)用抗CD20單克隆抗體(在第9天單個注射100微克)、BR3-Fc(從第1天至第12天，100微克每隔一天)，或者抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc的聯(lián)合進行腹膜內(nèi)注射來處理。每組由4只小鼠組成。最后一次注射后兩天，殺死小鼠，并且分析hCD20+B細胞。針對B細胞標志物(CD21+CD23+)對脾、血、淋巴結(jié)和派伊爾斑進行FACS分析。
結(jié)果表示抗-CD20單克隆抗體治療消減多于99％的血液與淋巴結(jié)成熟循環(huán)B細胞，并且BR3-Fc處理在血與淋巴結(jié)中降低成熟循環(huán)B細胞(圖16)?？?CD20單克隆抗體治療消減T2與濾泡B細胞，但不消減脾邊緣區(qū)B細胞，而BR3-Fc處理降低脾T2/濾泡與邊緣區(qū)B細胞。
抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc的聯(lián)合協(xié)同消減脾中所有的B細胞群體。抗-CD20單克隆抗體消減不發(fā)生于大部分邊緣區(qū)與一些濾泡/T2脾B細胞，而BR3-Fc消減主要發(fā)生在邊緣區(qū)與一些濾泡/T2B細胞(圖16)。因此，這兩試劑的組合完全消減脾的B系譜細胞。BR3-Fc、2H7以及兩者的組合對派伊爾斑生發(fā)中心B細胞都沒有影響(圖17)。用抗-CD20單克隆抗體處理后漿細胞沒有受到顯著影響(圖18)，指示免疫反應性的一些方面在用抗-CD20抗體處理過的小鼠中仍保持著。
這些結(jié)果表明聯(lián)合治療對消減大多數(shù)B細胞是有效的。類似于人，轉(zhuǎn)基因小鼠中一些B細胞對用抗-CD20抗體的殺傷作用有抗性。聯(lián)合治療導致脾中對抗-CD20抗體有抗力的B細胞的消減。這顯示轉(zhuǎn)基因小鼠對鑒定藥物組合(combinations of agents)上也有用處，該藥物組合在具有抗-CD20抗性細胞或者極具侵襲性的腫瘤的情況下可能更有效。
實施例3在這個實驗中，證實自然殺傷細胞在抗-CD20單克隆抗體介導的B細胞消減中起作用。
產(chǎn)生PK-136單克隆抗體(特異針對小鼠NK1.1)的雜交瘤克隆從ATCC獲得。分別用對照單克隆抗體、PK-136、抗-CD20單克隆抗體與PK-136/抗-CD20的聯(lián)合腹膜內(nèi)注射給四組人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。腹膜內(nèi)注射的劑量如下對照單克隆抗體200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20單克隆抗體10μg/ip，單一劑量在抗-CD20單克隆抗體腹膜內(nèi)注射之后3天分析來自外周血、淋巴結(jié)與脾的淋巴細胞。數(shù)據(jù)用平均數(shù)+/-標準誤差來表示，n＝8。
該結(jié)果指示在已檢查過的組織之中(肝臟，脾與血液)用PK-136處理導致NK細胞群體大約80％至90％的減少(圖19)。在大多數(shù)NK細胞缺乏時，2H7介導的B細胞消減有效性降低(圖20)。因此，NK細胞在抗-CD20單克隆抗體介導的B細胞消減中起作用。
實施例4生產(chǎn)表達人CD20/CD16的轉(zhuǎn)基因動物，并且評價人標志物的表達。
如實施例1中的描述從人CD20BAC DNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)生產(chǎn)人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠?；谌薈D20表達的FACS分析篩選小鼠。具有對于人CD16α鏈亞型A的人轉(zhuǎn)基因與缺乏鼠CD16α鏈的裸鼠獲得自Ravetch博士(洛克菲勒大學)。這些小鼠然后先后與C57B16、FVB、129小鼠交配，以獲得在129/裸鼠/FVB/B6背景下對于編碼CD16α鏈的人轉(zhuǎn)基因來說陽性、并且缺乏鼠CD16α鏈的小鼠。具有人CD20的FVB小鼠然后與具有人CD16α鏈并缺乏小鼠CD16α鏈的129/裸鼠/FVB/B6小鼠雜交。
人標志物在huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16-/-小鼠中的表達通過分離來自外周血細胞的白細胞并且對其染色來評價，染色使用標記的抗-人CD20抗體(m2H7)、抗-B220抗體(獲得自BD PharMingen)、與抗-人CD16抗體(獲得自BD PharMingen)。利用FACS進行染色的細胞群體的分析。將huCD20Tg+huCD 16Tg+mCD 16與CD20Tg-/CD16Tg-(對照小鼠)、CD20Tg+/CD16Tg-、CD20Tg-/CD16Tg+小鼠比較。結(jié)果示于圖21。
結(jié)果顯示CD20Tg+/CD16Tg-小鼠具有表達人CD20的細胞，而且基于他們與抗-B220抗體的反應性確定這些細胞是B細胞。基于用抗-人CD16進行的染色，CD20Tg-/CD16Tg+小鼠具有表達人CD16的細胞，但是不是B細胞，因為這些細胞不與抗-B220抗體反應。huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16-/-兼?zhèn)淇磥硎遣煌毎后w的CD20與CD16陽性細胞。結(jié)果顯示CD20Tg+/CD16Tg+小鼠被成功地生產(chǎn)。這些結(jié)果也與如下觀點一致，即人CD20在B細胞上存在，并且人CD16主要在自然殺傷細胞、巨噬細胞與粒細胞上表達。
分析表達人CD16轉(zhuǎn)基因的細胞，以判定哪個細胞類型表達該轉(zhuǎn)基因。外周血細胞獲自huCD20+huCD16+mCD16-/-轉(zhuǎn)基因小鼠，并且用PE標記的抗人CD16抗體(BD Pharmingen)染色，并且用偶聯(lián)至APC的抗F4/80抗體門化以檢測巨噬細胞，或用抗-DX5+抗體以檢測自然殺傷細胞。結(jié)果表明表達huCD16+轉(zhuǎn)基因的細胞是自然殺傷細胞與巨噬細胞。
分析來自缺乏鼠CD16α鏈小鼠的細胞，以判定鼠CD16α鏈是否在該細胞上存在。來自缺乏鼠CD16α鏈小鼠和野生型小鼠的外周血細胞用抗-小鼠CD16抗體染色，并且用FACS分析。結(jié)果示于圖26。結(jié)果表明由于該基因的敲除，在缺乏CD16α鏈小鼠的細胞上沒有可檢測的鼠CD16α鏈。
分析缺乏鼠CD16α鏈小鼠的細胞，以判定是否表達其它的Fc受體。分析該細胞中小鼠FcγRI(CD64)的存在或者缺乏。缺乏鼠CD16α鏈小鼠與野生型小鼠的外周血細胞用抗-小鼠CD64單克隆抗體(由Genentech制備)染色，并用FACS分析。血細胞通過用抗-mac-1染色對巨噬細胞進行門化。結(jié)果示于圖27。陰影部分是同種型對照。結(jié)果表明在由于CD16α鏈基因敲除而缺乏CD16α鏈的小鼠的巨噬細胞上有FcγRI(CD64)表達。染色的微弱漂移(shift)可能是由于該抗體的低親合力。這些結(jié)果暗示鼠CD16α鏈-/-敲除小鼠表達其它的小鼠Fc受體和小鼠γ鏈同二聚體。
權(quán)利要求
1.一種非人轉(zhuǎn)基因動物，所述非人轉(zhuǎn)基因動物的基因組中包含編碼人CD20的第一核苷酸序列以及編碼異源FcγIII受體的亞單位的第二核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述第一核苷酸序列可操作地與人內(nèi)源啟動子連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物的細胞表達人CD20。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因動物，其中人CD20在B淋巴細胞的表面上表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述第二核苷酸序列可操作地與人內(nèi)源啟動子連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述第二核苷酸序列編碼人CD16α鏈亞型A。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述受體在白細胞表面上表達。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述受體在包含自然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性白細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞或者胸腺細胞或者其混合物的細胞表面上表達。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物的基因組進一步在內(nèi)源基因上包含破壞，所述內(nèi)源基因編碼基本上與異源FcγIII受體同源的受體亞單位。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因動物，其中內(nèi)源基因編碼鼠CD16α鏈。
11.鑒定能治療B細胞淋巴瘤的藥物的方法，所述方法包含a)測量權(quán)利要求1或者9的動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；b)給藥根據(jù)權(quán)利要求1或者9的動物所述藥物；并且c)測量在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；其中用該藥物處理后在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞數(shù)目減少，則鑒定該藥物為能治療B細胞淋巴瘤的藥物。
12.用根據(jù)權(quán)利要求11的方法鑒定的藥物。
13.鑒定能消減或者殺死表達人CD20的細胞的藥物的方法，所述方法包含a)測量權(quán)利要求1或者9的動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；b)給藥根據(jù)權(quán)利要求1或者9的動物所述藥物；并且c)測量在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；其中在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞數(shù)目減少鑒定能消減或者殺死表達CD20的細胞的藥物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述細胞是癌細胞。
15.用根據(jù)權(quán)利要求14的方法鑒定的藥物。
16.來源于權(quán)利要求1或者9的轉(zhuǎn)基因動物的細胞或者組織。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或者9的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物是嚙齒類動物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述嚙齒類動物是小鼠。
19.鑒定能誘導Fc-介導的效應子細胞反應的藥物的方法，所述方法包含a)測量權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物中與Fc-介導的效應子細胞反應相關的一個或更多細胞因子的基線水平；b)給藥該轉(zhuǎn)基因動物所述藥物；c)測量該動物中細胞因子的水平；其中給藥之后細胞因子水平增加鑒定能誘導Fc-介導的效應子細胞反應的藥物。
20.鑒定能誘導針對表達人CD20的B淋巴細胞的Fc-介導的效應子細胞反應的藥物的方法，所述方法包含a)測量在第一轉(zhuǎn)基因動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；b)給藥第一轉(zhuǎn)基因動物所述藥物；c)測量第一轉(zhuǎn)基因動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；d)確定在步驟(a)與步驟(c)之間B淋巴細胞水平的降低百分率；e)測量權(quán)利要求1的第二轉(zhuǎn)基因動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；f)給藥權(quán)利要求1的第二轉(zhuǎn)基因動物所述藥物；g)測量第二轉(zhuǎn)基因動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；并且h)確定在步驟(e)與步驟(g)之間B淋巴細胞水平的降低百分率；其中如果在步驟(h)中確定的降低百分率大于在步驟(d)中確定的降低百分率，則該藥物被鑒定為能誘導針對表達人CD20的B淋巴細胞的Fc-介導的效應子細胞反應的藥物。
21.測試抗-人CD20治療的安全性的方法，所述方法包含a)測量權(quán)利要求1或者9的動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；b)給藥根據(jù)權(quán)利要求1或者9的動物所述藥物；并且c)測量該動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；其中該動物中表達人CD20的B淋巴細胞數(shù)目減少鑒定能消減或者殺死表達CD20的細胞的藥物；d)監(jiān)視該動物短期或者長期的副作用。
22.測試抗-人CD20治療效力的方法，所述方法包含a)測量權(quán)利要求1或者9的一組動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；b)給藥該組的每個動物不同劑量的一種藥物；并且c)測量在每一劑量之后該動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；和d)確定導致最多的B細胞消減的藥物的至少一個劑量。
全文摘要
本發(fā)明在通常意義上涉及表達人細胞標志物(包括CD20和/或優(yōu)選CD16)的非－人轉(zhuǎn)基因動物。
文檔編號A61KGK1748143SQ200380109690
公開日2006年3月15日 申請日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月16日
發(fā)明者安德魯·C－Y·陳, 龔謙, 弗萊維厄斯·馬丁 申請人:健泰科生物技術公司