專利名稱：金屬富勒醇及其在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型納米材料及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。具體地說(shuō)，涉及通式為M@C2m(OH)x的金屬富勒醇納米顆粒及其在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用，其中，M選自Gd，La等稀土金屬，10≤X＜50。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，目前已成為人類死亡的主要原因。在中國(guó)，肝癌，肺癌，胃癌和乳腺癌是發(fā)病率最高的腫瘤。目前全世界每年至少有700萬(wàn)人死于癌癥，其中我國(guó)約130萬(wàn)。癌癥除了致人死亡外，也給家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。新抗腫瘤藥物的不斷發(fā)現(xiàn)及深入研究已使腫瘤化學(xué)治療成為學(xué)科并使腫瘤內(nèi)科學(xué)得以誕生。但是，抗腫瘤藥的研究面臨嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，這就是多數(shù)常見(jiàn)實(shí)體瘤如肺癌、肝癌、結(jié)腸癌及胰腺癌等還缺乏有效藥物，不少抗腫瘤藥在臨床應(yīng)用過(guò)程中產(chǎn)生耐藥性，副作用極大。環(huán)磷酰胺、阿霉素、順鉑、紫杉醇等在起到治療作用的同時(shí)，產(chǎn)生骨髓抑制、消化道劇烈反應(yīng)、腎臟毒性等等度副作用，嚴(yán)重地限制了其臨床使用劑量。因此，新型抗腫瘤藥物研究勢(shì)在必行。
在生命科學(xué)研究中，納米顆粒已經(jīng)顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和誘人的應(yīng)用前景，如靶向性納米藥物載體、疾病高效檢測(cè)的量子點(diǎn)、高效醫(yī)學(xué)成像以及腫瘤治療技術(shù)相關(guān)的納米材料等，已經(jīng)成為國(guó)際前沿科學(xué)問(wèn)題。
富勒烯C60是一種由碳原子構(gòu)成，納米尺度的球體分子，具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用前景。Friedman等于1993年在J.Am.Chem.Soc.1156506-6509理論計(jì)算模擬了富勒烯C60衍生物可以抑制HIV病毒的活性C60是強(qiáng)疏水性球形分子，直徑為0.71nm，而HIV是末端開(kāi)口的圓柱狀分子，尺寸與C60直徑相似，其活性位置表面也是強(qiáng)疏水性的，兩者有可能以共價(jià)鍵結(jié)合，從而阻止HIV病毒的生長(zhǎng)。含有14核苷酸富勒烯衍生物和DNA的加合物可形成較穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)，在光催化下可對(duì)DNA進(jìn)行選擇性的位點(diǎn)切割。
由于富勒烯及其許多衍生物是疏水性的，無(wú)法與人體內(nèi)“靶分子”作用，使得它們?cè)谏锘瘜W(xué)領(lǐng)域中的研究和應(yīng)用受到很大的限制。近年來(lái)，研究合成水溶性富勒烯衍生物方面的突破和成功，大大加速和拓寬了C60衍生物在生物方面的應(yīng)用。在水環(huán)境中，羥基衍生化的富勒烯并不是以單獨(dú)的分子形式存在的，而是通過(guò)與大分子相互作用團(tuán)聚成納米顆粒物，這些顆粒物有很好的生物親和性(Sayes CM et al，Nano Lett，2004，4(10)1881-1887.Dugan LL et al，Proc Natl Acad Sci USA 1997；949434-9439.Mirkova SM et al，NitricOxide 2004；11201-207.Chiang LY et al，J Org Chem 1994，59；3960-3968)。發(fā)表在2004年10月份Nano Lett的一篇論文中(Sayes CM et al，Nano Lett，2004，4(10)1881-1887)，Rice大學(xué)Colvin指出富勒烯的細(xì)胞毒性高度依賴于其碳籠表面是否修飾和修飾的基團(tuán)。在兩種細(xì)胞系中，不同的結(jié)構(gòu)的毒性可相差7個(gè)數(shù)量級(jí)，以富勒烯毒性最大，富勒醇(C60(OH)24)最小。富勒醇(C60(OH)24)的LD50＞5,000ppm，而富勒烯的LD50為20ppb。人們對(duì)富勒烯及其衍生物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的分布進(jìn)行了初步的研究。Nakamura等于1994年首先合成了14C標(biāo)記的一種富勒烯吡咯環(huán)衍生物，并研究了它在小鼠體內(nèi)的生物分布和藥物代謝，通過(guò)尾靜脈注射到SD大鼠，化合物很快分布到小鼠身體的各個(gè)器官，90-95％富集于肝臟。166Ho@C82(OH)x則顯出生物分布較廣，在肝、骨骼、脾、腎、肺的含量依次遞減，其它組織分布極低(Cagle DW et al.，Proc Natl Acad Sci 1999；965182-5187)。
過(guò)去幾年，籠內(nèi)包金屬富勒烯的研究已取得很大進(jìn)展，迄今為止，三價(jià)金屬原子(Sc，Y)、堿土金屬原子(Ca，Sr，Ba)、堿金屬原子(Li，Na，K，Cs)和四價(jià)金屬原子(Zr，Hf)等已成功地被包籠到富勒烯內(nèi)，形成了單原子、雙原子、三原子金屬包籠物。籠內(nèi)包金屬富勒烯的許多優(yōu)異的物理和化學(xué)性質(zhì)使它們有可能發(fā)展成為超導(dǎo)、有機(jī)鐵磁體、非線性光學(xué)材料、功能分子開(kāi)關(guān)，核磁造影劑、生物示蹤劑等新型材料(Bolskar RD et al.，J Am Chem Soc 2003；1255471-5478)。

發(fā)明內(nèi)容
我們知道，腫瘤組織較正常組織富含血管，且腫瘤組織的毛細(xì)血管壁上有許多納米尺寸的孔徑，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可通過(guò)這些孔徑滲透到腫瘤組織之中。假設(shè)這些血液通道恰好被同尺寸的納米粒子所堵塞，就會(huì)抑制血液的流通，使腫瘤不能夠獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而中斷了腫瘤組織的生長(zhǎng)。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，發(fā)明人設(shè)計(jì)并制備了一種金屬富勒醇化合物，其分子直徑約為1nm，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金屬富勒醇納米顆粒有很強(qiáng)的腫瘤抑制作用，當(dāng)其在溶液中形成直徑為1-200nm的顆粒時(shí)腫瘤抑制效果更佳，其作用機(jī)制不是通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺死作用而完成的。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種金屬富勒醇。
本發(fā)明的另一目的是提供一種腫瘤抑制組合物，其中含有治療有效的金屬富勒醇顆粒和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的再一目的是提供一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包含以下方案一種金屬富勒醇，它以通式表示，通式中，M選自La，Gd等稀土金屬；m＝41或30；10≤X＜50。
上述化合物包括一個(gè)磁性中心金屬離子M和一個(gè)由C原子構(gòu)成的納米碳籠，其表面存在許多羥基基團(tuán)，因此M@C2m(OH)x在生物體內(nèi)有很好的生物親和性。(參見(jiàn)圖1)同時(shí)，由于羥基基團(tuán)的存在，與金屬富勒烯比較毒性大大降低。
由于相鄰羥基的重排，實(shí)際上碳籠上O的數(shù)目與H的數(shù)目會(huì)有一些不同，因此，也可以將上述通式寫(xiě)成M@C2mOxHy形式。
本發(fā)明的通式為M@C2m(OH)x(m＝41或30；10≤X＜50)的金屬富勒醇，其中M為L(zhǎng)a。
本發(fā)明的通式為的M@C2m(OH)x(m＝41或30；10≤X＜50)金屬富勒醇，其中M為Gd。
一種腫瘤抑制組合物，其中含有以通式M@C2m(OH)x表示的金屬富勒醇，通式中，M選自Gd、La等稀土金屬；m＝41或30；10≤X＜50。
一種腫瘤抑制組合物，其中含有以通式[M@C2m(OH)x]n表示的金屬富勒醇納米顆粒，通式中，M選自Gd、La等稀土金屬；m＝41或30；10≤X＜50；n表示團(tuán)聚成該金屬富勒醇納米顆粒的金屬富勒醇分子數(shù)，1≤n＜200。
通式為M@C2m(OH)x的金屬富勒醇通過(guò)大分子相互作用可團(tuán)聚成納米顆粒物。在溶劑環(huán)境中，可以通過(guò)選擇溶劑、控制濃度及超聲波等方法控制顆粒物的尺寸，形成直徑分布范圍在1-200nm的顆粒。
上述組合物還可包括溶劑和/或藥學(xué)上可接受的載體。上述溶劑優(yōu)選水、生理鹽水、Tris-HCl溶液或磷酸鹽緩沖液。上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑，填充劑，吸收促進(jìn)劑等。
本發(fā)明的腫瘤抑制組合物，其中，所述的組合物中金屬富勒醇在溶劑中的濃度優(yōu)選為1×10-5～1mmol/L。當(dāng)濃度高于1mmol/L時(shí)金屬富勒醇的溶解性能降低，易團(tuán)聚成較大顆粒。金屬富勒醇終濃度在1×10-5～1mmol/L之間，對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。
上述腫瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、直腸結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮膚癌。
一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用，該金屬富勒醇以通式M@C2m(OH)x表示，通式中，M選自Gd，La等稀土金屬；m＝41或30；10≤X＜50。所述腫瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、直腸結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮膚癌。
一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用，該藥物被制備成各種劑型，這些劑型所對(duì)應(yīng)的給藥量以金屬富勒醇計(jì)優(yōu)選為5×10-8～1×10-2mmol/kg/天。上述針對(duì)人的給藥量是由藥效實(shí)驗(yàn)的小鼠給藥量1×10-6～2×10-1mmol/kg/天換算得來(lái)的。
一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用，該藥物被制備成各種劑型，這些劑型所對(duì)應(yīng)的給藥量以金屬富勒醇計(jì)更優(yōu)選為5×10-6～1.25×10-4mmol/kg/天。上述針對(duì)人的給藥量是由藥效實(shí)驗(yàn)的小鼠給藥量1×10-4～2.5×10-3mmol/kg/天換算得來(lái)的。
上述腫瘤抑制組合物優(yōu)選通過(guò)靜脈注射、腹腔內(nèi)注射、口服或局部給藥等方式施用于需要治療的患者。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將上述腫瘤抑制組合物制成注射用溶液。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是與目前臨床普遍使用的環(huán)磷酰胺、順鉑、紫杉醇等相比，金屬富勒醇M@C2m(OH)x具有用量小，毒性低，且腫瘤抑制率高的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為M@C2m(OH)x分子結(jié)構(gòu)示意2為Gd@C2m的HPLC分離結(jié)果譜圖(5PBB柱)。
圖3為Gd@C82(OH)22(a)和Gd@C82(OH)12(b)的C1s電子的XPS譜。
圖4為生理鹽水溶液中[Gd@C82(OH)22]n納米顆粒的高分辨AFM圖。
圖5為Gd@82(OH)22低劑量組注射后小鼠H22肝癌的生長(zhǎng)曲線圖。
圖6為Gd@C82(OH)22高劑量組注射后小鼠H22肝癌的生長(zhǎng)曲線圖。
圖7為CTX組腫瘤抑制率和劑量關(guān)系曲線圖。
圖8為Gd@C82(OH)22組腫瘤抑制率和劑量關(guān)系曲線圖。
圖9為鼠肝癌H22模型不同治療組腫瘤組織病理切片照片。其中，A、B為對(duì)照組；C、D為Gd@C82(OH)22治療組；E、F為環(huán)磷酰胺治療組。
圖10為L(zhǎng)a@C82(OH)18注射后小鼠Lewis肺癌的生長(zhǎng)曲線圖。
圖11為金屬富勒醇Gd@C82(OH)22對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞存活率的影響。
圖12為金屬富勒醇Gd@C82(OH)22誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的百分比。
圖13為金屬富勒醇Gd@C82(OH)26誘導(dǎo)鼠肝癌Rh35細(xì)胞凋亡的百分比。
圖14為金屬富勒醇Gd@C82(OH)32誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的百分比。
圖11、圖12、圖13和圖14中橫坐標(biāo)的數(shù)值為M@C82(OH)x摩爾濃度的乘方值。
圖15為金屬富勒醇La@C82(OH)20對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人采用化學(xué)合成法制備了金屬富勒醇Gd@C82(OH)x，Gd@C60(OH)x，La@C82(OH)x，La@C60(OH)x，其制備方法參考中國(guó)發(fā)明專利03146028.3。Gd@C60的合成與分離純化參考文獻(xiàn)Robert D.Bolskar等，J.AM.CHEM.SOC.2003，125，5471-5478。
采用本發(fā)明方法制備的金屬富勒醇M@C2m(OH)x，其羥基數(shù)目在10～50的范圍，在本文中當(dāng)羥基數(shù)用具體數(shù)值表示時(shí)，該數(shù)值指羥基數(shù)目的加全平均值。該值由合成金屬富勒醇反應(yīng)中NaOH溶液的濃度決定，可根據(jù)需要調(diào)節(jié)NaOH溶液的濃度，從而獲得指定羥基數(shù)目加全平均值的金屬富勒醇。當(dāng)羥基數(shù)目低于10時(shí)，金屬富勒醇的生物相容性不好；當(dāng)羥基數(shù)目高于50時(shí)，碳籠的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。
精確測(cè)定富勒醇的羥基數(shù)目至關(guān)重要，本發(fā)明中，我們利用北京同步輻射裝置X射線光電子能譜(XPS)并結(jié)合元素分析方法來(lái)確定金屬富勒烯的表面修飾后的羥基數(shù)目。
XPS實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院北京同步輻射裝置上進(jìn)行。在單晶硅片上通過(guò)磁控離子濺射鍍上高純Pt作為XPS樣品測(cè)試基底。M@C82和M@C82(OH)x滴加在高純Pt基底上獲得XPS測(cè)量的薄膜，將薄膜放入8×10-10Torr的XPS樣品制備室的超高真空系統(tǒng)足夠長(zhǎng)時(shí)間，以除去樣品上可能吸附的空氣雜質(zhì)。金屬富勒醇的C 1s光電子發(fā)射譜用于確定樣品包含的羥基數(shù)目。改變?nèi)肷涔庾幽芰浚杉瘶悠返膬r(jià)帶光電子能譜。采集樣品的部分產(chǎn)額譜以獲得樣品的吸收譜。裝置的能量分辨率約為～0.5eV。樣品在采集數(shù)據(jù)前，先進(jìn)行XPS掃描，以確保樣品表面清潔并確定儀器處于良好運(yùn)行狀態(tài)。
金屬富勒醇M@C2m(OH)x分子的粒徑約為1nm。金屬富勒醇分子可通過(guò)大分子相互作用團(tuán)聚成納米顆粒物。在溶劑環(huán)境中，可以通過(guò)超聲波等方法控制顆粒物的尺寸，形成直徑分布范圍在1-200nm的顆粒。本文以下實(shí)施例中所涉及的金屬富勒醇溶液均為含有直徑分布范圍在1-200nm的金屬富勒醇顆粒的溶液。
以下結(jié)合實(shí)施例和對(duì)比例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述實(shí)施例范圍之中。
實(shí)施例1Gd@C2m(OH)x的制備第一步Gd@C2m的合成將高純(＞99.999％)Gd2O3與高純石墨粉(＞99.999％)按原子比Gd∶C＝0.5～3∶100混合，壓制成模，制成石墨-金屬混合電極；或者將直徑為6～20mm石墨棒鉆空，充填氧化釓得到石墨-金屬混合電極。1000～2000℃高溫?zé)Y(jié)后，使用惰性氣體弧形放電法，合成金屬富勒烯Gd@C2m。惰性氣體為He或Ar，壓力為50～600Torr，電流為80～500A。
第二步Gd@C82和Gd@C60的分離純化a.采用高溫回流加高溫高壓兩步高效提取方法萃取分離碳納米類物質(zhì)。首先將弧形放電的煙炱在甲苯中100～200℃下回流12～24小時(shí)，再在DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中100～200℃下高溫高壓(50～100MPa)提取12～24小時(shí)，以萃取碳納米類物質(zhì)。
b.使用廣泛應(yīng)用的循環(huán)式HPLC(高效液相色譜)兩步法或萃取法純化目標(biāo)所需要金屬富勒烯Gd@C82和Gd@C60，得到純度大于99.99％的目標(biāo)產(chǎn)物Gd@C82和Gd@C60。Gd@C82的產(chǎn)率為碳棒的10％；Gd@C60產(chǎn)率為碳棒的35％。HPLC分離結(jié)果譜圖參見(jiàn)圖2。(5PBB柱)第三步金屬富勒醇Gd@C82(OH)22的合成使用NaOH法，在甲苯溶液中將Gd@C82與濃度為35％的NaOH溶液進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)濾、離子交換層析等分離、純化過(guò)程，除去NaOH后，得到純度大于99.99％的產(chǎn)物Gd@C82(OH)22，冷凍干燥保存。
金屬富勒醇Gd@C82(OH)12的合成在甲苯溶液中將Gd@C82與濃度為30％的NaOH溶液進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)濾、離子交換層析等分離、純化過(guò)程，除去NaOH后，得到純度大于99.99％的產(chǎn)物Gd@C82(OH)12，冷凍干燥保存。
Gd@C60(OH)x的合成將300mgGd@C60懸浮液與210mg KH在20mL THF中混合后，連續(xù)攪拌15分鐘，并將1.255g二乙基溴代丙二酸一滴滴地加入混合液。攪拌40分鐘以后生成咖啡色溶液。然后過(guò)濾，除去沒(méi)有反應(yīng)的KH。將粗產(chǎn)物用四氫呋喃分離，再用己烷漂洗，低壓抽干，然后在甲苯中與NaH一起回流，并用甲醇結(jié)束反應(yīng)。用酸性離子交換柱分離純化，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值到7.0。蒸干得到Gd@C60(OH)x產(chǎn)品。
第四步金屬富勒醇顆粒[Gd@C82(OH)22]n(1≤n＜200)的合成將金屬富勒醇Gd@C82(OH)22溶解在生理鹽水中，超聲1分鐘，形成直徑分布范圍在1-200nm的顆粒物[Gd@C82(OH)22]n，1＜n＜200。
實(shí)施例2測(cè)定Gd@C82(OH)22和Gd@C82(OH)12的羥基數(shù)Gd@C82(OH)22(a)和Gd@C82(OH)12(b)的C1s電子的XPS譜如圖3所示，C-C和C-O鍵之間的相對(duì)強(qiáng)度用于分析Gd@C82(OH)x中的羥基數(shù)目。圖2中實(shí)線的高斯擬合分析表明分子中存在兩種不同的碳原子峰位置在284.4eV的是沒(méi)有連接其它基團(tuán)的具有sp2雜化的碳原子(C-C)的結(jié)合能；位于285.3 eV的峰是羥基化的碳原子(C-OH)。
實(shí)施例3La@C2m(OH)x的制備采用與上述制備Gd@C82類似的方法制備La@C82和La@C60。
(1)金屬富勒醇La@C82(OH)18的合成使用NaOH法，在甲苯溶液介質(zhì)中將La@C82與28％的NaOH溶液進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)一系列分離、純化過(guò)程，除去NaOH后，得到純度大于99.99％的La@C82(OH)18產(chǎn)物，冷凍干燥保存。
(2)金屬富勒醇La@C60(OH)22的合成使用NaOH法，在甲苯溶液介質(zhì)中將La@C60與35％的NaOH溶液進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)一系列分離、純化過(guò)程，除去NaOH后，得到純度大于99.99％的La@C60(OH)22產(chǎn)物，冷凍干燥保存。
實(shí)施例4納米顆粒的測(cè)定金屬富勒醇M@C2m(OH)x分子的粒徑約為1nm。在溶劑環(huán)境中，金屬富勒醇分子通過(guò)大分子相互作用團(tuán)聚成納米顆粒物，可以通過(guò)超聲波等方法控制顆粒物的尺寸，形成直徑分布范圍在1-200nm的顆粒。
采用同步輻射小角X-射線衍射(SR-SAXS)測(cè)得生理鹽水溶液中[Gd@C82(OH)22]n納米顆粒的粒徑范圍為1-200nm，平均粒徑22nm。
高分辨原子力顯微鏡(AFM，Nano IIIa SPM，Digital Instruments Inc，3A)證實(shí)生理鹽水溶液中[Gd@C82(OH)22]n納米顆粒的粒徑范圍為1-200nm，平均粒徑22.4nm存在，參見(jiàn)圖4。由兩種獨(dú)立的方法得到的結(jié)果一致。
實(shí)施例5含[Gd@C82OH22]n(1≤n＜200)的注射用溶液將500mg Gd@C82OH22，溶解于400ml生理鹽水中，室溫超聲1分鐘，封裝于100個(gè)玻璃管中，制成注射用溶液。
實(shí)施例6Gd@C82(OH)m組合物對(duì)小鼠肝癌腫瘤的抑制作用動(dòng)物品系 昆明種雌鼠，體重為18到22g。
腫瘤模型 小鼠肝癌H22瘤株。
實(shí)驗(yàn)分組 A.陰性對(duì)照組生理鹽水(saline)；B.陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，臨床上普遍使用的一種抗癌藥物；C.藥物組Gd@C82(OH)m，每組5-7只小鼠。
給藥方式腹腔注射(intraperitoneal，i.p.)。
CTX和Gd@C82(OH)m(m＝22或26)溶液以0.9％的生理鹽水為溶劑。
劑量設(shè)計(jì)(1×10-6～2×10-3mmol/kg小鼠)本實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)劑量組A.高劑量組CTX30mg/kg(0.1mmol/kg)，僅需在實(shí)驗(yàn)的前7天注射；Gd@C82(OH)22，2×10-4mmolGd/kg；Gd@C82(OH)26，2×10-3mmol/kg；注射體積均為0.2ml。
低劑量組CTX15mg/kg(0.05mmol/kg)；Gd@C82(OH)22，1×10-4mmol/kg；Gd@C82(OH)26，1×10-6mmol/kg；注射體積均為0.2ml。
實(shí)驗(yàn)方法每只小鼠右后肢皮下接種小鼠肝癌H22瘤株1×106癌細(xì)胞(分散于100μl的0.9％生理鹽水中)，接種24小時(shí)后開(kāi)始給藥0.2ml/只；實(shí)驗(yàn)期間每24小時(shí)給藥一次，每隔一天測(cè)量接種腫瘤的后肢直徑，記錄其生長(zhǎng)情況；同時(shí)觀察小鼠的反應(yīng)情況；當(dāng)生理鹽水組小鼠右后肢直徑長(zhǎng)到20mm左右時(shí)，停止實(shí)驗(yàn)(正常小鼠后肢直徑為6mm)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束摘除眼球取血，使用109mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，血液與抗凝劑的比例為1∶9；摘取腫瘤，稱重；取臟器/器官并稱重，計(jì)算臟器系數(shù)；同時(shí)用10％的福爾馬林固定臟器/器官。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果Gd@C82(OH)m組合物抗肝癌H22活性如表1所示，注射Gd@C82(OH)m納米顆粒后同注射CTX一樣可以抑制小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，且納米材料的腫瘤抑制特性優(yōu)于臨床普遍使用的抗腫瘤藥物CTX。
高劑量組Gd@C82(OH)22對(duì)荷瘤小鼠血清總膽紅素，ALT，AST和肌苷水平的影響數(shù)據(jù)參見(jiàn)下頁(yè)的表2。從反映肝細(xì)胞損害最敏感的指標(biāo)是谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和谷草轉(zhuǎn)氨酶AST的活性上分析，注射Gd@C82(OH)22納米材料可顯著抑制荷瘤鼠兩種酶的增高，并且接近正常機(jī)體的水平。而環(huán)磷酰胺組ALT水平反而增加，說(shuō)明其增加動(dòng)物肝的損傷。
根據(jù)公式V＝4πr3/3計(jì)算腫瘤體積，并得到抑瘤率；結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量組中0.1μmol/kg的Gd@C82(OH)22抑制腫瘤生長(zhǎng)的效率為32.9％(圖5和圖6)，雖然比0.05mmol/kg的CTX的抑瘤率52.0％低，但是其用藥量只是CTX藥量的1/500。
另外，我們還比較了抑瘤率與藥物使用量之間的關(guān)系，當(dāng)把CTX的劑量提高0.05mmol/kg時(shí)，其腫瘤抑制率提高了15％而把Gd@C82OH22納米材料的使用劑量?jī)H提高0.1μmol/kg時(shí)，其腫瘤抑制率就提高26％(圖7和圖8)。
鼠肝癌H22模型組腫瘤組織病理切片結(jié)果以下參見(jiàn)圖9，Gd@C82(OH)22治療組小鼠腫瘤浸潤(rùn)范圍更小，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕。HE染色切片可見(jiàn)腫瘤周圍形成明顯的腫瘤包繞帶(炎細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及毛細(xì)血管)?？杉せ顧C(jī)體免疫功能。
對(duì)照組腫瘤細(xì)胞向骨骼肌浸潤(rùn)明顯。
環(huán)磷酰胺組腫瘤細(xì)胞大量壞死，但不能防止腫瘤細(xì)胞向骨骼肌浸潤(rùn)。
表1 Gd@C82(OH)m抗肝癌H22活性數(shù)據(jù)表

(N為小鼠數(shù)量，表中數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示)表2 高劑量組Gd@C82(OH)22荷瘤小鼠血清總膽紅素，ALT，AsT和肌苷水平

注a與生理鹽水組比較P＜0.01。
實(shí)施例7Gd@C82(OH)m對(duì)人源MCF-7乳腺癌裸鼠乳腺癌模型的抑制腫瘤效果實(shí)驗(yàn)方法BALB/c雌性裸鼠(16.0±1.0g)皮下接種MCF-7細(xì)胞懸液(1×107細(xì)胞)后，飼養(yǎng)20天，把皮下產(chǎn)生的腫瘤取出，切割成3mm×3mm×3mm的腫瘤小塊重新植入BALB/c雌性裸鼠備用。接種3天后開(kāi)始給藥，分別給予Gd@C82(OH)m(m＝32或12)、環(huán)磷酰胺、紫杉醇、生理鹽水。
給藥方法Gd@C82(OH)322.5μmol/kg/天×13天(以Gd濃度計(jì)算)；注射液濃度為0.25μmol/ml。
Gd@C82(OH)121.0μmol/kg/天×13天，以Gd濃度計(jì)算；注射液濃度為0.1μmol/ml。
環(huán)磷酰胺第一周71.6μmol/kg/天×7天，第8-12天生理鹽水紫杉醇 第0、3、6、9、12天15.2μmol/kg/天，不給藥天注射生理鹽水生理鹽水0.2mlq.d.×13動(dòng)物品系 BALB/c雌性裸鼠，Gd@C82(OH)32組 10只；Gd@C82(OH)12組 10只；環(huán)磷酰胺組 10只紫杉醇組9只；生理鹽水組 8只腫瘤模型 MCF-7人乳腺癌給藥方式腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。
CTX和Gd@C82(OH)m溶液，以0.9％的生理鹽水為溶劑。紫杉醇是商用液體制劑。
抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，Gd@C82(OH)32組在2.5μmol/kg體重給藥13天時(shí)抑瘤率可達(dá)到47％，與環(huán)磷酰胺組71.6μmol/kg體重給藥7天結(jié)果一致。Gd@C82(OH)12組在1μmol/kg體重給藥13天時(shí)抑瘤率可達(dá)到35.6％。但是環(huán)磷酰胺組小鼠出現(xiàn)明顯的毒副作用，如明顯體重減輕、消瘦、動(dòng)物精神狀態(tài)差。紫杉醇在15.2μmol/kg體重劑量下，每隔2天給藥，抑瘤率可達(dá)到82％，但是45％的小鼠死亡，說(shuō)明紫杉醇毒性非常大。而金屬富勒醇組小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與目前臨床普遍使用的環(huán)磷酰胺、紫杉醇相比，帶有不同羥基數(shù)的金屬富勒醇Gd@C82(OH)32和Gd@C82(OH)12具有用量小，毒性低，且腫瘤抑制率高的優(yōu)點(diǎn)。
表3 Gd@C82(OH)m抑制裸鼠移植的人源乳腺癌生長(zhǎng)數(shù)據(jù)表

(N為小鼠數(shù)量)實(shí)施例8La@C82(OH)18組合物對(duì)小鼠Lewis肺癌模型的抑制腫瘤效果實(shí)驗(yàn)方法C57純系雌性小鼠(18.0±1.0g)皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞懸液(1×107細(xì)胞)，接種次日開(kāi)始給藥，分別給予La@C82(OH)18、環(huán)磷酰胺、生理鹽水，每組10只。
給藥方式腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。
給藥方法La@C82(OH)181μmol/kg q.d.×14環(huán)磷酰胺第一周71.6μmol/kg q.d.×7，第8-14天給予生理鹽水生理鹽水0.2ml q.d.×14CTX和La@C82(OH)18溶液，均以0.9％的生理鹽水為溶劑。
抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖10，La@C82(OH)18在1μmol/kg體重給藥14天時(shí)可以明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，腫瘤的重量不明顯增加，與環(huán)磷酰胺71.6μmol/kg體重給藥7天結(jié)果基本一致。但是環(huán)磷酰胺組小鼠出現(xiàn)明顯的毒副作用，如明顯體重減輕、消瘦、動(dòng)物精神狀態(tài)差。而金屬富勒醇組小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與目前臨床普遍使用的環(huán)磷酰胺相比，金屬富勒醇La@C82(OH)18納米顆粒具有用量小，毒性低，且腫瘤抑制率高的優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例9Gd@C60(OH)20對(duì)小鼠Lewis肺癌模型的抑制腫瘤效果實(shí)驗(yàn)方法C57純系雌性小鼠(20.0±1.0g)皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞懸液(1×107細(xì)胞)，接種次日開(kāi)始給藥，分別給與Gd@C60(OH)20、生理鹽水，每組10只。Gd@C60(OH)20溶液，以0.9％的生理鹽水為溶劑。
給藥方式腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。
給藥方法Gd@C60(OH)200.5μmol/kg q.d.×18生理鹽水 0.2ml q.d.×18抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gd@C60(OH)20在0.5μmol/kg體重給藥18天時(shí)可以明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，與生理鹽水對(duì)照組相比，接種腫瘤的體積不明顯增加，抑瘤率可達(dá)到42％。
實(shí)施例10細(xì)胞毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法(1)MTT的方法分析金屬富勒醇對(duì)不同種類癌細(xì)胞存活率的影響MTT法作為四氮唑類染料之一的MTT進(jìn)入細(xì)胞后，被線粒體呼吸鏈酶(如琥珀酸脫氫酶)還原為不溶性有色產(chǎn)物，利用光吸收的方法測(cè)定有色產(chǎn)物的量，從而間接反映細(xì)胞的活性。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×104/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種100μl，分為6個(gè)劑量組，每組8個(gè)復(fù)孔。接種24h后，換成無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔100μl，按劑量組濃度分別加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄上清，每孔加100μl MTT緩沖液及10μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)3h，棄上清，加DMSO150μl/孔，震蕩，自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定595nm處各孔吸光值。
(2)流式細(xì)胞儀分析法碘化丙啶(PI)染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)將5ml濃度為105個(gè)/ml的細(xì)胞接種與25cm2培養(yǎng)瓶中，24h后換成5ml無(wú)血清培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的金屬富勒醇，24h后收取細(xì)胞，包括培養(yǎng)基中的少量細(xì)胞，收集好的細(xì)胞用生理鹽水洗兩次，然后70％乙醇4℃固定，做流式分析前，用生理鹽水洗2次，最后用生理鹽水懸起細(xì)胞，加入RNase A及碘化丙啶(PI)，終濃度分別是25ppm和50ppm，37℃水浴中放置30分鐘，用尼龍紗布過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。PI不能通過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)于凋亡中晚期細(xì)胞或死細(xì)胞，PI能透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染，DNA結(jié)合PI染色后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可在G1峰前出現(xiàn)一亞二倍體峰，根據(jù)此峰的百分率可檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果舉例[1]MTT的方法分析金屬富勒醇對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞存活率的影響Gd@C82(OH)22終濃度在10～106nmol/L范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，細(xì)胞活性較未加任何藥物的細(xì)胞活性有所增加，但藥物各劑量組之間差別不大，也沒(méi)有明顯的線性關(guān)系。
流式細(xì)胞儀的方法分析金屬富勒醇Gd@C82(OH)22對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的毒性結(jié)果如圖12所示，細(xì)胞凋亡比例均在3.5％～7％之間，Gd@C82(OH)22的終濃度在10～106nmol/L范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡比例與對(duì)照組基本一致，藥物各劑量組之間沒(méi)有顯著性差別。Gd@C82(OH)22不誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞的增值和生長(zhǎng)沒(méi)有影響。
流式細(xì)胞儀的方法分析Gd@C82(OH)26對(duì)鼠肝癌Rh35細(xì)胞的毒性結(jié)果如圖13所示，Gd@C82(OH)26的終濃度在10～106nmol/L范圍內(nèi)，與未加任何誘導(dǎo)劑的對(duì)照組細(xì)胞凋亡百分比相當(dāng)，凋亡細(xì)胞的比例均在2.0％～3.5％之間，說(shuō)明Gd@C82(OH)26不誘導(dǎo)鼠肝癌Rh35細(xì)胞凋亡。
流式細(xì)胞儀的方法分析Gd@C82(OH)32對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的毒性結(jié)果如圖14所示，Gd@C82(OH)32的終濃度在10～106nmol/L范圍內(nèi)，與對(duì)照組細(xì)胞凋亡百分比相當(dāng)，凋亡細(xì)胞的比例在3.0％～9％之間，表明Gd@C82(OH)32不誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞毒性較小。
MTT的方法分析金屬富勒醇對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響La@C82(OH)20終濃度在100～106nmol/L范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示，細(xì)胞存活率與未加任何藥物的對(duì)照組基本一致，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。
上述不同濃度的金屬富勒醇對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在10-1000000nmol/ml的濃度范圍內(nèi)，金屬富勒醇對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)細(xì)胞存活率與不加藥物的對(duì)照組一致，說(shuō)明金屬富勒醇不具備直接的細(xì)胞毒性，不直接殺死細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種金屬富勒醇，其特征在于它以通式M@C2m(OH)x表示，通式中，M為L(zhǎng)a或Gd；m＝41或30；10≤X＜50。
2.一種腫瘤抑制組合物，其特征在于它包括以通式M@C2m(OH)x表示的金屬富勒醇，通式中，M為Gd或La；m＝41或30；10≤X＜50。
3.一種腫瘤抑制組合物，其特征在于它包括以通式[M@C2m(OH)x]n表示的金屬富勒醇納米顆粒，通式中，M為Gd或La；m＝41或30；10≤X＜50；n表示團(tuán)聚成所述金屬富勒醇納米顆粒的金屬富勒醇分子數(shù)，1≤n＜200。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的組合物還包括溶劑和/或藥學(xué)上可接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的溶劑為水、生理鹽水、Tris-HCl溶液或磷酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的腫瘤抑制組合物，其特征在于，所述的組合物中金屬富勒醇在溶劑中的濃度為1×10-5～1mmol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的腫瘤，包括肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、直腸結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮膚癌。
8.一種金屬富勒醇在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于該金屬富勒醇以通式M@C2m(OH)x表示，通式中，M為L(zhǎng)a或Gd；m＝41或30；10≤X＜50。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的金屬富勒醇在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物被制備成各種劑型，這些劑型所對(duì)應(yīng)的給藥量以金屬富勒醇計(jì)為5×10-8～1×10-2mmol/kg/天。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的金屬富勒醇在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物被制備成各種劑型，這些劑型所對(duì)應(yīng)的給藥量以金屬富勒醇計(jì)為5×10-6～1.25×10-4mmol/kg/天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種金屬富勒醇及其在制備抑制腫瘤藥物中的應(yīng)用。具體地說(shuō)，涉及通式為M@C
文檔編號(hào)A61K31/28GK1935812SQ200610152170
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日
發(fā)明者趙宇亮, 陳春英, 邢更妹 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所