專利名稱：：用于癌癥治療的靶向嵌合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、癌癥生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域。更具體說，本發(fā)明涉及用于癌癥治療的耙向嵌合分子，包括耙向細(xì)胞毒劑如TNTF，和耙向促調(diào)亡分子如粒酶B。
背景技術(shù)：
：癌癥的發(fā)病率和死亡率居高不下促進(jìn)了對改進(jìn)療法的需要，不僅用于新發(fā)癌癥病例，還用于已經(jīng)治療和對一種或多種化療產(chǎn)生耐受的病例。有效癌癥治療的其它有利特征包括治療的副作用小，如通過將組合物特異性耙向癌細(xì)胞，而不損傷正常細(xì)胞。即，有益組合物能夠有效治療一種或多種癌細(xì)胞，而避免對正常細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。具體說，有用組合物包括能提供單獨(dú)的靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分的組合物。本發(fā)明提供了可用于任何癌癥類型的此種有益組合物。黑色素瘤和靶向的細(xì)胞毒性分子通過分子工程改造，可修飾蛋白質(zhì)以顯著增強(qiáng)其生物學(xué)活性。例如，目前經(jīng)設(shè)計(jì)組合了抗體與細(xì)胞因子、抗體與細(xì)胞因子受體或細(xì)胞因子與毒素的融合蛋白正在臨床前和臨床研究評價(jià)中(Davis和Gillies，2003;Veenendaal等，2002;Liu等，2000)。單鏈重組抗體(scFv)包括通過設(shè)計(jì)的彈性肽系鏈(tether)連接起來的抗體VL和Vh結(jié)枸域(Bird等，1988)。與完整IgG相比，scFv具有尺寸小和結(jié)構(gòu)簡單，而抗原結(jié)合親合力相當(dāng)?shù)膬?yōu)點(diǎn)，它可能比類似的雙鏈Fab片段更穩(wěn)定(Cocher等，1990;Kantor等，1982)。幾項(xiàng)研究證明，尺寸較小的scFv能更好地滲入腫瘤組織、改進(jìn)藥代動力學(xué)性能、以及相對于完整鼠抗體降低i.v.給予Fab時(shí)觀察到的免疫原性(Cocher等，1990;Kantor等，1982;Macey等，1998;Aggarwal和Natarajan，1996)。例如，scFvMEL單鏈抗體保持了與識別人黑色素瘤細(xì)胞上存在的gp240抗原的表面結(jié)構(gòu)域的母體ZME-018抗體相同的結(jié)合親和力和特異性(Burger和Dayer，2002;Boris和Steinke，2003)。腫瘤壞死因子(TNP)是主要由活化巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞毒性多肽，它與另一種肽激素一活化淋巴細(xì)胞分泌的淋巴毒素(LT或TNF-p)有一些序列同源性(30。/。)(Zouboulis等，1990)。純化的重組人TNF-a是分子量為17kDa的單鏈非糖基化多肽，但在溶液中它聚合成緊密的非二硫鍵連接的三聚體。TNF介導(dǎo)各種全身反應(yīng)和細(xì)胞反應(yīng)，包括發(fā)熱、休克、組織損傷、腫瘤壞死、誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)分子、細(xì)胞增殖、分化和凋亡(Shiohara等，1997;Cosman，1994)。在體外，TNF對許多人類腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞抑制作用或細(xì)胞毒作用，包括(例如)SKBR-3乳腺癌和A-375M人黑色素瘤(Smith和Baglioni，1987;Cappello等，2002)。所有這些體外或體內(nèi)反應(yīng)都是由TNF-誘導(dǎo)的兩種不同細(xì)胞表面受體TNFR1和TNFR2的三聚化引起的，這兩種表面受體中至少一種存在于幾乎每種細(xì)胞類型中(Rao，2001;Cowan和Storey，2003)。雖然這兩種受體誘導(dǎo)不同和重疊的反應(yīng)，但看起來大多數(shù)TNF效應(yīng)，包括啟動細(xì)胞死亡級聯(lián)反應(yīng)和宿主對抗各種病原體的反應(yīng)，都是由TNFR1介導(dǎo)的(Tsujimoto等，1985)。TNFR1和TNFR2轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的能力取決于其胞質(zhì)尾與下游調(diào)節(jié)蛋白的相互作用。與TNFR2相反，TNFR1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有所謂的"死亡結(jié)構(gòu)域"，它能結(jié)合銜接子蛋白如TRADD(TNFR-結(jié)合死亡結(jié)構(gòu)域蛋白)。TRADD能結(jié)合另外兩種轉(zhuǎn)導(dǎo)物，TRAF2(TNFR-結(jié)合因子-2)和受體-相互作用蛋白。這些蛋白進(jìn)而誘導(dǎo)激酶級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-KB和/或細(xì)胞死亡途徑的活化。MADD(MAP激酶-活化的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白)是結(jié)合TNFRl死亡結(jié)構(gòu)域的另一種蛋白。然而相反的是，MADD不引起細(xì)胞死亡或NF-kB活化，但特異性刺激促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員(Sugaraian等，1985)。目前，MAPK家族包括三個(gè)亞家族，即(a)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK);(b)c-JunNH2-末端激酶/應(yīng)激-活化的蛋白激酶(JNK/SAPK);和(c)p38MAPK超家族(Niitsu等，1985)。幾個(gè)小組已經(jīng)證明，人類腫瘤細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞可顯示100-5000個(gè)TNF受體位點(diǎn)(Rosenblum等，1991;Rosenblum等，1995)。然而，沒有發(fā)現(xiàn)受體數(shù)量(或親合力)與細(xì)胞對TNF細(xì)胞毒作用的反應(yīng)之間的顯著相關(guān)性，這提示，受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件可能主要調(diào)節(jié)TNF生化作用(Koizumi等，1988)。本發(fā)明者先前進(jìn)行的研究是，首先證明，在培養(yǎng)物中，由人TNF和單克隆抗體的化學(xué)偶聯(lián)物組成的免疫細(xì)胞因子可顯示出對腫瘤細(xì)胞顯著的靶向細(xì)胞毒特性，似乎比天然TNF好得多，并且對TNF耐受性腫瘤細(xì)胞有活性(Rosenblum等，1991;Mujoo等，1995;Hanada和Yoshimura，2002)。此外，在異種移植物中的硏究提示，抗體-TNF偶聯(lián)物易于在腫瘤組織中特異性累積，并顯示出比天然TNF優(yōu)越的體內(nèi)抗腫瘤活性(Tamanini等，2003)。根據(jù)這些原始觀察結(jié)果，本發(fā)明者設(shè)計(jì)和構(gòu)建了第二代重組融合物毒素，它含有耙向人黑色素瘤細(xì)胞的重組單鏈抗-gp240抗體scFvMEL組成和作為細(xì)胞毒效應(yīng)物分子的人TNF。與天然TNF相比，融合蛋白顯示出對TNF-敏感性和TOF-耐受性人黑色素瘤細(xì)胞體外殺傷作用增強(qiáng)。進(jìn)一步研究證明，由于與游離抗體的競爭降低了該構(gòu)建物的顯著細(xì)胞毒作用，所以觀察的作用是抗體介導(dǎo)的(Mujoo等，1995)。HER-2/neu癌癥和耙向的細(xì)胞毒性分子HER-2/neu原癌基因是屬于表皮生長因子家族的185-kDa跨膜受體酪氨酸激酶(Bargman等，1986;Coussens等，1985;Yamamoto等，1986)，它在20-30%的人乳腺癌和卵巢癌中過度表達(dá)(Slamon等，1989;Tyson等，1991)。HER-2/neu過度表達(dá)能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞系中的增殖、促存活和轉(zhuǎn)移信號(Hung禾QLau，1999;Ignatoski等，2000;Tzahar和Yarden，1998)，并與卵巢癌、淋巴結(jié)陽性和淋巴結(jié)陰性乳腺癌的預(yù)后差有關(guān)(Berchuck等，1990;Slamon等，1987;Ro等，1989;Ross和Fletcher,1998)。此癌基因起到的關(guān)鍵作用之一應(yīng)該是調(diào)節(jié)細(xì)胞對細(xì)胞毒性細(xì)胞因子如TNF的反應(yīng)(Lichtenstein等，1991;Tang等，1994)。許多研究小組證明，天然過度表達(dá)HER-2/neu的細(xì)胞和HER-2/neu-轉(zhuǎn)染細(xì)胞都能耐受TNF的細(xì)胞毒作用(Lichtenstein等，1990;Hudziak等，1988)。由于TNF在免疫監(jiān)視功能中起到核心作用(Saks和Rosenblum，1992)，對乳腺癌中HER-2/neu過度表達(dá)介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的耐受可能通過逃避宿主防御機(jī)制賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長優(yōu)勢。隨著構(gòu)建獨(dú)特、靶向治療劑的分子工程方法的出現(xiàn)，產(chǎn)生包含連接于識別HER-2/neu的單鏈抗體(scFv23)的TOF的第二代重組構(gòu)建物。先前研究證明了針對培養(yǎng)的人乳腺腫瘤細(xì)胞的scFv23/TNF構(gòu)建物的產(chǎn)生、純化和生物特征(Rosenblum等，2000)，并發(fā)現(xiàn)，靶向HER-2/neu的融合構(gòu)建物對耐受TNF本身的細(xì)胞有活性。例如，靶向分子與胰腺癌相關(guān)也值得注意。胰腺癌仍然是美國和歐洲的癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一(Haycox等，1998;Ward等，2001;Gumbs等，2002;Magee等，2002;Kulke，2002)。這是攻擊性和轉(zhuǎn)移性高的腫瘤類型，基本能耐受所有化療(Permert等，2001)和放療介入(Boz等，2001;Matsuno等，2001)。目前，化療介入的一線方法是5-氟尿嘧啶(FU)或含5-FU方案(Lokich和Skarin，1972;Frey等，1981;Takada等，1992;Ducreux和Rougier，1996)。然而，最近的研究顯示了用吉西他濱和含吉西他濱方案治療的一些臨床優(yōu)點(diǎn)(vanMoorsel等，1997;Carmicheal，1997;Michael和Moore，1997;Cascinu等，1999)。在胰腺腫瘤活檢樣品中，有多種癌基因如HER-2/neu和HER-1過度表達(dá)(Tomaszewska等，1998;Sakorafas等，1995;Williams等，1991;Tamanaka，1992;Lemoine等，1992;Ozawa等，1988),還有各種基因如p53、Ki-ras禾卩p-21中發(fā)生突變(Yokoyama等，1994;Hahn和Kern,1995;Dergham等，1997)。許多這些遺傳異常在臨床上出現(xiàn)的攻擊性、轉(zhuǎn)移性和治療耐受性表型的發(fā)展中起到主要作用。使用疫苗(Gjertsen和Gaudernack，1998;Gunzburg禾HSalmons,2001;Jaffee等，2001;Kaufman等，2002)或抗體來靶向癌基因蛋白產(chǎn)物的方法(Buchler等，2001;Xiong和Abbreuzzese，2002;Buchsbaum等，2002)正在開發(fā)或已經(jīng)完成，這些方法能更集中地控制腫瘤生長。WO93/21232描述了用于治療癌癥的細(xì)胞靶向部分和細(xì)胞毒部分的偶聯(lián)物。特定例子包括c-erbB-2蛋白抗體和白樹毒素。耙向促調(diào)亡分子在各種臨床情況下常常需要選擇性破壞單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞中有大量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與其死亡和存活相關(guān)，遞送通路的有限和/或關(guān)鍵組件可產(chǎn)生破壞作用。這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的經(jīng)典例子是凋亡，凋亡通路的各種元件可用于靶向細(xì)胞死亡。凋亡或程序性細(xì)胞死亡是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和死亡之間的平衡控制正常組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的基本過程(Vaux等，1994;Jacobson等，1997)。絲氨酸蛋白酶粒酶B(GrB)(Lobe等，1986;Schmid和Weissman，1987;Trapani等，1988)是參與靶細(xì)胞接觸細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)和天然殺傷(NK)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的溶酶體樣胞質(zhì)顆粒(細(xì)胞裂解顆粒)的內(nèi)容物后誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞死亡(Henkart，1985;Young和Cohn'1986;Smyth和Trapani，1995)必備的。細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞顆粒含有穿孔蛋白(一種孔道形成蛋白)和稱為粒酶的絲氨酸蛋白酶家族。穿孔蛋白與補(bǔ)體蛋白C6、C7、C8和C9(補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物成員)有一些結(jié)構(gòu)和功能相似之處(Shinkai等，1988)。在淋巴細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞溶解中，穿孔蛋白插入靶細(xì)胞膜，然后似乎聚合形成孔道(Podack，1992;Yagita等，1992)，該孔道能介導(dǎo)粒酶B進(jìn)入靶細(xì)胞胞質(zhì)。一旦進(jìn)入后，粒酶B通過直接活化胱冬酶和快速誘導(dǎo)DNA片段化誘導(dǎo)凋亡(Shi等，1992)。粒酶結(jié)構(gòu)相關(guān)，但具有不同的底物偏好。憑借在天冬氨酸殘基后進(jìn)行切割的獨(dú)特能力，粒酶B可以在體外切割許多胱冬酶原，它已經(jīng)成為分析胱冬酶-3(Darmon等，1995;Quan等，1996;Martin等，1996)、胱冬酶-7(Chinnaiyan等，1996;Gu等，1996;Femandes-Alnemri等，1995)、胱冬酶-6(Orth等，1996;Femandes-Alnemri等，1995)、胱冬酶-8(Muzio等，1996)、胱冬酶-9(Duan等，1996)和胱冬酶-10a/b(Fernandes-Alnemri等，1996;Vincenz和Dixit,1997)成熟化的重要工具。而且，它對靶細(xì)胞的毒性高(Shi等，1992)。直到目前才假定，粒酶B通過直接活化胱冬酶，并且在某些情況下通過直接損傷下游胱冬酶底物殺死細(xì)胞(Andrade等，1998)。進(jìn)入胞漿后，粒酶B快速轉(zhuǎn)運(yùn)至核(Jans等，1996;Trapani等，1996)，并可切割聚(ADP-核糖)聚合酶和核基質(zhì)抗原，有時(shí)利用非胱冬酶偏好切割位點(diǎn)(Andrade等，1998)。雖然在體外能有效切割許多胱冬酶原，但粒酶B-誘導(dǎo)的胱冬酶活化以等級方式在完整細(xì)胞中發(fā)生，在處決胱冬酶如胱冬酶-3、然后是胱冬酶-7水平開始(Yang等，1998)。這與FasL-介導(dǎo)的殺傷相反，F(xiàn)asL-介導(dǎo)的殺傷依賴通過頂端胱冬酶如胱冬酶-8產(chǎn)生的膜信號(Muzio等，1996;Sarin等，1997)。此外，一些研究證明，粒酶B也可通過胱冬酶非依賴機(jī)制誘導(dǎo)死亡，包括直接損傷非核結(jié)構(gòu)，但仍未闡明此通路的關(guān)鍵底物(Sarin等，1997;Trapani等，1998;Heibein等，1999;Beresford等，1999)。Froelich和同事們的研究提示，GrB通過受體介導(dǎo)的胞吞作用內(nèi)化，穿孔蛋白的作用是介導(dǎo)粒酶B從胞吞小泡中釋放。實(shí)際上，穿孔蛋白可被其它小泡破壞因子如腺病毒產(chǎn)生的此種物質(zhì)取代(Froelich等，1996;Pinkoski等，1998;Browne等，1999)。粒酶通常高度同源，與GrB的同源性為38-67%(Haddad等，1991)，它們含有胰蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶的催化三鏈體(His-57、Asp-102和Ser-195)。其它特征包括成熟、N-末端的Ile-Ile-Gly-Gly序列、三個(gè)或四個(gè)二硫鍵橋和保守基序(PHSRPYMA)，此保守基序也出現(xiàn)在中性粒細(xì)胞組織蛋白酶G和肥大細(xì)胞糜蛋白酶中。粒酶的糖部分連接于Asn(Griffiths和Isaaz，1993)。粒酶mRNA轉(zhuǎn)錄物翻譯為前蛋白酶原。信號肽酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上切下前-或前導(dǎo)序列。切除前肽時(shí)，無活性的粒酶原(酶原)變成活性蛋白酶。粒酶前肽序列從前導(dǎo)肽后開始，在蛋白酶折疊成催化構(gòu)象所需的N末端Ile之前結(jié)束(Kam等，2000)。在迄今為止鑒定的各種凋亡因子中，Bd-2家族成員代表了這種死亡通路中了解最多一些調(diào)節(jié)物。Bd-2家族的一些成員，包括Bcl-2、Bcl-XL、Ced-9、Bcl-w等能促進(jìn)細(xì)胞存活，而其它成員，包括Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bid、Bik和Bim顯示能促進(jìn)凋亡(Adams和Cory，1998)。迄今為止，提出了許多不同的關(guān)于Bcl-2家族成員的可能生物學(xué)功能的假說。它們包括二聚體形成(01tvai等，1993)、蛋白酶活化(Chinnaiyan等，1996)、線粒體膜去極化(6)、產(chǎn)生活性氧中間體(Hockenbery等，1993)、調(diào)節(jié)鈣流(Lam等，1994;Huiling等，1997)和孔道形成(Antonsson等，1997;Marzo等，1998)。Bax是Bcl-2家族的21kDa死亡促進(jìn)成員，首先鑒定為與不同細(xì)胞系的Bcl-2免疫共沉淀的蛋白質(zhì)(OItvai等，1993)。響應(yīng)于各種細(xì)胞毒結(jié)果，Bax過度表達(dá)加速了細(xì)胞死亡。測定Bax蛋白的氨基酸序列顯示，它與Bcl-2高度同源。Bax基因由六個(gè)外顯子組成，產(chǎn)生另路轉(zhuǎn)錄物，其主要形式編碼1.0kbmRNA，稱為Bax.a。如同Bcl-2和Bcl-2家族的其它幾個(gè)成員，Bax蛋白具有高度保守區(qū)BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域，這些蛋白質(zhì)序列的親水性分析表明，在其C末端存在疏水性跨膜節(jié)段(Oltvai等，1993)。Bax表達(dá)廣泛，沒有顯著的組織特異性。然而，誘導(dǎo)凋亡時(shí)，Bax易位到線粒體中，導(dǎo)致線粒體功能障礙并釋放細(xì)胞色素c，隨后激活胱冬酶通路(Hsu和Youle，1997;Wolter等，1997;Gross等，1998)。這種易位過程迅速，并且在凋亡早期發(fā)生(Wolter等，1997)。通過腺病毒基因轉(zhuǎn)移在人卵巢癌中選擇性過度表達(dá)Bax產(chǎn)生顯著的體內(nèi)腫瘤細(xì)胞殺傷作用(Tai等，1999)。通過雙腺病毒系統(tǒng)在人肺癌培養(yǎng)細(xì)胞系中過度表達(dá)Bax基因?qū)е码锥富罨?、凋亡誘導(dǎo)和細(xì)胞生長抑制。而且，腫瘤內(nèi)注射表達(dá)Bax基因的腺病毒載體能抑制裸小鼠中建立的人肺癌異種移植瘤的生長(Kagawa等，2000;Kagawa等，2000)。WO99/45128和Aqeilan等(1999)涉及具有細(xì)胞靶向特異性和凋亡誘導(dǎo)活性的嵌合蛋白，特別是特異性靶向表達(dá)IL2受體的細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞特異性凋亡的重組嵌合蛋白IL-2-Bax。WO99/49059涉及用于檢測人腺癌表達(dá)的腫瘤相關(guān)表位的由促性腺素釋放激素(GnRH)和假單胞菌外毒素A(PE)組成的嵌合毒素。WO97/46259涉及包含導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞靶向部分和細(xì)胞殺傷部分的耙向嵌合毒素。在具體實(shí)施例中，嵌合毒素包含促性腺素釋放激素同源物和假單胞菌外毒素A。WO97/22364涉及過敏反應(yīng)的靶向治療，其中嵌合細(xì)胞毒素Fc2'-3-PE4C)用于靶向清除表達(dá)FcsRI受體的細(xì)胞。雖然描述了一些嵌合蛋白組合物，但與殺傷細(xì)胞有關(guān)的改進(jìn)治療仍需要其它方法和組合物。發(fā)明概述本發(fā)明通常涉及用包含(例如)靶向部分和抗-細(xì)胞增殖因子的嵌合分子治療癌癥?？?細(xì)胞增殖因子還可定義為(例如)細(xì)胞毒劑，或者促凋亡誘導(dǎo)部分。因此，嵌合多肽由至少兩部分組成一部分是(例如)殺傷細(xì)胞的效應(yīng)組分(細(xì)胞毒素或促凋亡部分)；第二部分是(例如)用于使殺傷組分靶向感興趣細(xì)胞的嵌合多肽的遞送組分。在特定實(shí)施方式中，可用合適的靶向部分靶向任何感興趣細(xì)胞，但在特定實(shí)施方式中，細(xì)胞靶向部分會靶向癌細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)部分，優(yōu)選兩個(gè)部分都為人源，這能避免給予嵌合多肽的個(gè)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。嵌合分子的兩部分組分可以任何合適方式相連，但在具體實(shí)施方式中，它們偶聯(lián)在一起。在一些實(shí)施方式中，這兩個(gè)組分互相偶聯(lián)，而在其它實(shí)施方式中多肽經(jīng)重組工程改造產(chǎn)生融合蛋白。偶聯(lián)化合物可通過(例如)接頭互相連接。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，細(xì)胞毒劑是TNF-a。雖然以前對于耙向嵌合分子已經(jīng)描述了這種分子，但本發(fā)明將它們用于新型治療方法，包括例如，恢復(fù)化療耐受性癌細(xì)胞的化療敏感性；治療過度表達(dá)Her-2/neu和Nf-KB的癌癥；誘導(dǎo)TNF耐受性癌細(xì)胞凋亡；和將該組合物與通過中斷Nf-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用的化療藥一起給藥。在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式中，細(xì)胞殺傷部分是促凋亡因子。雖然任何合適的促調(diào)亡因子均可用于本發(fā)明，但在具體實(shí)施方式中，促調(diào)亡因子是粒酶，如Bax、粒酶A或粒酶B。任何合適的細(xì)胞特異性靶向部分均可用于本發(fā)明嵌合分子，但在具體實(shí)施方式中，它包含一種或多種具體細(xì)胞表面抗原的抗體、細(xì)胞標(biāo)記、生長因子、激素或細(xì)胞因子。在一個(gè)方面，嵌合組合物的靶向部分是抗體，如單鏈抗體、抗體片段、Fab、新型構(gòu)建物，如小抗體、雙抗體、三抗體等。靶向分子的特定例子包括scFv23、C6.5或ML3-9，其含有識別HER-2/neu的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體；含有抗-gp240抗原單鏈Fv的scFvMEL;含有AF-20抗原單鏈抗體的scFvAF20;和識另U(如)CD-33抗原的人/小鼠嵌合抗體HuM195。本發(fā)明組合物可涉及任何合適的癌癥，包括例如肺癌、乳腺癌、腦癌、前列腺癌、脾癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌、食道癌、肝癌、皮膚癌、腎癌、白血病、骨癌、睪丸癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等等。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，它們涉及具有特定分子病因和/或基因型的癌癥。在具體實(shí)施方式中，癌癥病因使具體治療至少起初難治該疾病和/或使其能夠耐受一種或多種治療。在其它具體實(shí)施方式中，準(zhǔn)備治療的癌癥是過度表達(dá)Her-2/neu;TNF-a耐受性；過度表達(dá)Nf-KB;Nf-icB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型；包括上調(diào)EGF受體；包括上調(diào)多藥耐藥蛋白(MDR或MRP);和/或耐受一種或多種常規(guī)化療如5-氟尿嘧啶的癌癥。而且，本發(fā)明組合物可通過不同機(jī)制發(fā)揮作用，如下調(diào)Akt磷酸化；誘導(dǎo)凋亡，如通過切割胱冬酶-8、胱冬酶-3和/或聚ADP-核糖聚合酶；誘導(dǎo)胱冬酶-3活化；下調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2;降解IkB(X;激活p38MAP激酶；激活SAPK/JNK通路；和/或誘導(dǎo)凋亡核；等等。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，采用由TNF與識別HER-2/neu的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體scFv23連接組成的免疫細(xì)胞因子scFv23/TNF。本發(fā)明人證明，scFv23/TNF能有效對抗高度耐受化療和過度表達(dá)HER-2/neu的癌癥，如胰腺腫瘤和乳腺腫瘤。更具體說，采用一組人胰腺細(xì)胞系，本發(fā)明者表征了HER-2/neu、HER-1、TNFR-1、TNFR-2和p-Akt的相對表達(dá)，并評價(jià)了在體外細(xì)胞對scFv23/TNF、TNF和幾類化療藥的反應(yīng)。HER-2/neu和TNFR-l的表達(dá)水平與細(xì)胞對受試藥物的反應(yīng)之間有關(guān)聯(lián)。例如，HER-2/neu和TNFR-1表達(dá)水平最高的胰腺L3.6pl細(xì)胞對常規(guī)化療藥最敏感，而HER-2/neu和TNFR-1表達(dá)水平相對較低的Capan-2細(xì)胞對受試藥物的耐受性最強(qiáng)。多柔比星、吉西他濱和scFv23/TNF是活性最高的細(xì)胞毒劑，而相對來講，所有細(xì)胞系都能耐受5-氟尿嘧啶、順鉑、依托泊甙和TNF。組合研究證明，在所有胰腺細(xì)胞系中，scFv23/TNF與5-氟尿嘧啶有一致的協(xié)同作用，scFv23/TOF與多柔比星有拮抗作用。機(jī)制研究證明，scFv23/TNF和5-FU組合特異性導(dǎo)致存活蛋白磷酸化-Akt和抗-凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)。此外，該組合能通過切割(如)胱冬酶-8、胱冬酶-3和聚ADP-核糖聚合酶誘導(dǎo)凋亡。因此，用scFv23/TNP融合毒素靶向表達(dá)HER-2/neu的腫瘤細(xì)胞能有效治療癌癥，如胰腺癌，尤其是與化療藥如5-氟尿嘧啶聯(lián)用時(shí)。為了分析乳腺癌中HER-2/neu表達(dá)與TNF耐受性之間的相關(guān)性，鑒定了與scFv23/TNF的細(xì)胞毒作用有關(guān)的獨(dú)特信號傳導(dǎo)途徑。SKBR-3/H細(xì)胞表達(dá)的HER-2/neu水平高3.3倍，而SKBR-3/L細(xì)胞表達(dá)的TNF受體-1和TNF受體-2水平分別高2.3倍和4倍。與HER-2/neu低表達(dá)的SKBR-3/L細(xì)胞相比，過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3/H細(xì)胞能完全耐受TNF本身，但對scFv23/TNF敏感。用scFv23/TNF處理SKBR-3/H細(xì)胞導(dǎo)致Akt磷酸化下調(diào)，并至少通過切割胱冬酶-8、胱冬酶-3和聚ADP-核糖聚合酶誘導(dǎo)凋亡。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，ScFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用依賴于胱冬酶-3的活化。另一方面，scFv23和TNF能單獨(dú)激活A(yù)kt的磷酸化，但對胱冬酶活化和凋亡沒有影響。因此，與TNF相比，scFv23/TNF具有獨(dú)特的作用機(jī)制，并能有效抵抗過度表達(dá)HER-2/neu的TNF耐受性癌細(xì)胞。本發(fā)明其它示范性融合毒素包括融合構(gòu)建物scFvMEL/TNF，其包含連接于人TNF的抗-gp240抗原單鏈Fv。本發(fā)明人鑒定了與抗人黑色素瘤細(xì)胞的TNF相比，抗黑色素瘤融合毒素scFvMEL/TNF的細(xì)胞毒作用的分子機(jī)制。具體說，鑒定了構(gòu)建物能夠克服細(xì)胞對TNF本身耐受的機(jī)制，具體是參與TNF-誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子途徑如NF-kB和JNK，以及凋亡介導(dǎo)物(包括胱冬酶-3和PARP)。而且，用TNF和scFvMEL/TNF處理的細(xì)胞的cDNA微陣列分析鑒定到TNF和scFvMEL/TNF之間細(xì)胞毒活性機(jī)制的獨(dú)特差異。具體說，本發(fā)明者證明，與單獨(dú)TNF相比，scFvMEL/TNF融合構(gòu)建物對抗原陽性A375-M細(xì)胞的細(xì)胞毒性更強(qiáng)(I.C.5o分別為0.1nM與1.4nM)，對完全耐受TNF的AAB-527細(xì)胞也有細(xì)胞毒性(I.C.50~20nM)。用TNF或scFvMEL/TNF處理能以時(shí)間依賴方式在A375-M和AAB-527細(xì)胞中誘導(dǎo)IkBcc降解和p38MAP激酶活化。在TNF處理的TNF耐受性AAB-527細(xì)胞中觀察到SAPK/JNK通路快速活化，但在scFvMEL/TNP處理后沒有觀察到這種現(xiàn)象。因此，在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，SAPK/JNK的活化產(chǎn)生了觀察到的細(xì)胞對TNF耐受。與細(xì)胞毒數(shù)據(jù)一致的是，scFvMEL/TNF在A375-M和AAB-527細(xì)胞中誘導(dǎo)PARP切割和凋亡作用。然而，TNF僅在A375-M細(xì)胞中誘導(dǎo)PARP切割和凋亡。根據(jù)這些研究以及在黑色素瘤細(xì)胞中有許多基因，包括主要參與與細(xì)胞表面受體有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞周期事件和核苷酸代謝調(diào)節(jié)的基因被scFvMEL/TNF而非TNF處理下調(diào)或上調(diào)的事實(shí)，與TNF相比scFvMEL/TNP具有獨(dú)特的作用機(jī)制。更具體說，融合構(gòu)建物可克服TNF耐受，因?yàn)榕c接觸TNF相比，融合構(gòu)建物能誘導(dǎo)凋亡、阻斷SAPK/JNK細(xì)胞存活通路并活化基因的獨(dú)特互補(bǔ)物。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，嵌合分子包含凋亡誘導(dǎo)劑和靶向部分。雖然能夠殺傷細(xì)胞的任何具體凋亡誘導(dǎo)劑均可用于本發(fā)明，但在具體實(shí)施方式中，凋亡誘導(dǎo)劑是粒酶，如粒酶B。靶向部分可以是任何種類，只要該部分基本上將嵌合分子耙向癌細(xì)胞；在具體實(shí)施方式中，靶向部分是(例如)一種或多種具體細(xì)胞標(biāo)記的抗體、生長因子、激素或細(xì)胞因子。在一個(gè)方面，嵌合組合物的靶向部分是抗體，如單鏈抗體、抗體片段、Fab等。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明者利用新型融合構(gòu)建物GrB/scFvMEL，其包含人促調(diào)亡絲氨酸蛋白酶粒酶B(GrB)和識別gp240抗原的單鏈抗體scFvMEL，gp240抗原是大多數(shù)(80%)黑色素瘤細(xì)胞系和新鮮腫瘤樣品上存在的高分子量糖蛋白。具體說，用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測gp240抗原在不同黑色素瘤細(xì)胞上的表達(dá)。gp240存在于A375、TXM-18L、TXM-13和MEL-526黑色素瘤細(xì)胞上，然而，在TXM-1黑色素瘤細(xì)胞上表達(dá)水平非常低。通過抗-scFvMEL抗體檢觀iJ，GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物結(jié)合于高水平gp240抗原的A375、TXM-18L、TXM-13和MEL-526而非TXM-1細(xì)胞。融合構(gòu)建物對對數(shù)期A375細(xì)胞的I.C.5o為20nM，對MEL-526細(xì)胞為~50nM，對TXM-18L為100nM，對TXM-13細(xì)胞為~200nM，在劑量高達(dá)1時(shí)對TXM-1和非耙SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞毒性最小。通過比較，GrB/scFvMEL與另一種融合毒素scFvMEL/rGel對這些黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用基本相同。將GrB/scFvMEL和化療藥(如多柔比星、硫酸長春新堿、依托泊甙、順鉑或阿糖胞苷)共同給予A375細(xì)胞72小時(shí)證明，GrB/scFvMEL與多柔比星、長春新堿或順鉑有協(xié)同的抗腫瘤活性，GrB/scFvMEL與依托泊甙或阿糖胞苷聯(lián)用有加成作用。與藥物預(yù)處理后共同接觸融合構(gòu)建物相比，用GrB/scFvMEL預(yù)處理6小時(shí)后，共同接觸化療藥72小時(shí)顯示能顯著抑制生長。而且，與不用GrB/scFvMEL預(yù)處理相比，用GrB/scFvMEL預(yù)處理A375細(xì)胞6小時(shí)后用化療藥處理72小時(shí)時(shí)，各種化療藥的細(xì)胞毒性顯著提高(p〈0.01)。可通過GrB/scFvMEL預(yù)處理6小時(shí)，提高化療藥對gp240抗原陽性靶細(xì)胞的作用。通過TUNEL試驗(yàn)評價(jià)，在GrB/scFvMEL處理組，給予A375異種移植瘤荷瘤小鼠24小時(shí)后，腫瘤組織顯示出凋亡核。通過抗-GrB或抗-scFvMEL抗體的免疫組化染色檢測評價(jià)，在腫瘤組織中觀察到GrB/scFvMEL的定位或內(nèi)化。每隔一天給予A375腫瘤荷瘤小鼠(尾靜脈iv，37.5mg/kg)GrB/scFvMEL或鹽水5次，測定42天的腫瘤體積。鹽水處理的對照腫瘤在此期間從50mm3增大到1200mm3。用GrB/scFvMEL處理的腫瘤從50mm3增大到200mm3。因此，GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物顯示出顯著的抗腫瘤活性，并能提高人黑色素瘤細(xì)胞對化療的敏感性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，有一種使個(gè)體中一種或多種化療耐受性癌細(xì)胞產(chǎn)生或恢復(fù)化療敏感性的方法，其包括將治療有效量的嵌合分子遞送給個(gè)體，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。在特定實(shí)施方式中，該細(xì)胞特異性靶向部分被進(jìn)一步限定為癌細(xì)胞-靶向部分。在其它具體實(shí)施方式中，該癌細(xì)胞-靶向部分被進(jìn)一步限定為(例如)抗體、生長因子、激素、肽、適體、細(xì)胞因子、干擾素、維生素或其混合物。該抗體可被進(jìn)一步限定為(例如)全長抗體、嵌合抗體、Fab'、Fab、F(ab')2、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、Fv、單鏈Fv(scFv)、小抗體、雙抗體、三抗體或其混合物。在具體實(shí)施方式中，該抗體是抗-HER-2/neu抗體，如scFv23。在其它具體實(shí)施方式中，該抗體是抗-gp240抗原抗體，如包含scFvMEL的抗體。在其它具體實(shí)施方式中，該癌細(xì)胞-靶向部分包含一種或多種生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、調(diào)蛋白、血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子或缺氧誘導(dǎo)因子。在另一具體實(shí)施方式中，該癌細(xì)胞-靶向部分包含一種或多種激素，如人絨毛膜促性腺素、促性腺素釋放激素、雄激素、雌激素、促甲狀腺激素、促卵泡激素、黃體生成素、促乳素、生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、催產(chǎn)素、促甲狀腺激素釋放激素、生長激素釋放激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、促生長素抑制素、多巴胺、褪黑激素、甲狀腺素、降鈣素、甲狀旁腺激素、糖皮質(zhì)激素類、電解質(zhì)代謝皮質(zhì)激素、腎上腺素、去甲腎上腺素、孕酮、胰島素、胰高血糖素、糊精、促紅細(xì)胞生成素、骨化三醇、骨化醇、心房利鈉肽、胃泌素、促胰液素、膽囊收縮素、神經(jīng)肽Y、ghrelin、PYY3.36、胰島素樣生長因子-1、瘦激素、血小板生成素、血管緊張素原、IL-1、IL-2、IL-3、IL陽4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL隱IO、IL-ll、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL誦25、IL-26、IL陽27、IL-28、IL-29、IL陽30、IL陽31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和/或IL-36。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，該癌細(xì)胞-靶向部分包含一種或多種細(xì)胞因子，如IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、ILIO、ILll、IL12、IL13、IL14、IU5、IL-16、IL-17、IL-18、粒細(xì)胞-集落刺激因子、巨噬細(xì)胞-集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白血病抑制因子、紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、制瘤素M、白血病抑制因子、IFN-y、IFN-a、IFN-卩、LT-p、CD40配體、Fas配體、CD27配體、CD30配體、4-lBBL、TGF-p、IL-la、IL-1卩、IL-1RA、MIF、IGIF和/或其混合物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述抗-細(xì)胞增殖部分被進(jìn)一步限定為凋亡誘導(dǎo)部分或細(xì)胞毒劑。該凋亡誘導(dǎo)部分可以是(例如)粒酶、Bd-2家族成員、細(xì)胞色素C、胱冬酶或其組合。示范性粒酶包括(例如)粒酶A、粒酶B、粒酶C、粒酶D、粒酶E、粒酶F、粒酶G、粒酶H、粒酶I、粒酶J、粒酶K、粒酶L、粒酶M、粒酶N或其組合。在其它具體實(shí)施方式中，Bcl-2家族成員是(例如)Bax、Bak、Bcl-Xs、Bad、Bid、Bik、Hrk、Bok或其組合。在其它具體實(shí)施方式中，所述胱冬酶是(例如)胱冬酶-l、胱冬酶-2、胱冬酶-3、胱冬酶_4、胱冬酶-5、胱冬酶-6、胱冬酶-7、胱冬酶-8、胱冬酶-9、胱冬酶-10、胱冬酶-11、胱冬酶-12、胱冬酶-13、胱冬酶-14或其組合。在特定實(shí)施方式中，所述細(xì)胞毒劑是(例如)TNF-a、白樹毒素、靈菌紅素(Prodigiosin)、核糖體抑制蛋白(RIP)、假單胞菌外毒素、艱難梭菌(C/oiWwmd驕cze)毒素B、幽門螺桿菌(/^//0^"^;_y/on')VacA、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(7era'm'ae"m)coto'ccr)Y叩T、紫色桿菌素、二亞乙基三胺五乙酸、伊羅夫文、白喉毒素、絲林霉素、蓖麻毒蛋白、肉毒桿菌毒素、霍亂毒素、皂草毒蛋白6或其組合。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞毒劑可以是重組毒劑。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分是化學(xué)偶聯(lián)的。在其它實(shí)施方式中，所述細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分包含在融合多肽中，在具體實(shí)施方式中，它們通過(例如)接頭連接。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，化療耐受性癌細(xì)胞被進(jìn)一步限定為過度表達(dá)HER-2/neu、耐受TNF-a、過度表達(dá)Nf《B、Nf-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型或其組合，在具體實(shí)施方式中，它們可能耐受(例如)一種或多種類型的化療藥，如烷化劑、亞硝基脲、抗代謝劑、抗腫瘤抗生素、植物生物堿、紫杉垸、激素藥或其組合。在特定實(shí)施方式中，化療耐受性細(xì)胞能耐受(例如)5-氟尿嘧啶、順鉑、依托泊甙、多柔比星、吉西他濱中的一種或多種或其組合。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，該方法還包括其它個(gè)體癌癥治療，如化療、手術(shù)、放療、基因治療、激素治療、免疫治療或其組合。在具體實(shí)施方式中，可伴隨或依次給予其它治療和嵌合分子。例如，可以在化療前給予嵌合分子和/或可以在化療后給予嵌合分子。在特定實(shí)施方式中，化療和嵌合分子對癌細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同作用，或它們對癌細(xì)胞產(chǎn)生加成作用。嵌合分子可被進(jìn)一步限定為(例如)腫瘤輔助手術(shù)治療或輔助后(postadjuvant)手術(shù)治療。在特定實(shí)施方式中，該嵌合分子是scFvMEL/GrB、scFv23/TNF-oc、scFvMEL/TNF-a或其組合。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，有一種使個(gè)體中一種或多種癌細(xì)胞對化療敏感的方法，其包括給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。癌細(xì)胞可被進(jìn)一步限定為過度表達(dá)HER-2/neu、TNF-a耐受性、過度表達(dá)Nf-icB、Nf-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型或其組合。所述癌細(xì)胞可能耐受化療，如5-氟尿嘧啶、順鉑、依托泊甙、多柔比星或吉西他濱。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，有一種誘導(dǎo)個(gè)體中一種或多種TNF耐受性癌細(xì)胞凋亡的方法，其包括給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。誘導(dǎo)一種或多種細(xì)胞凋亡可被進(jìn)一步限定為包括以下一種或多種過程阻斷SAPK/JNK信號通路；抑制Akt磷酸化；下調(diào)Bcl-2;切割胱冬酶-8;切割胱冬酶-3;切割聚ADP-核糖聚合酶；降解lKB-a;和其組合。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，有一種誘導(dǎo)個(gè)體中一種或多種過度表達(dá)HER-2/neu的癌細(xì)胞凋亡的方法，其包括給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。誘導(dǎo)一種或多種細(xì)胞凋亡被進(jìn)一步限定為包括以下一種或多種過程阻斷SAPK/JNK信號通路；抑制Akt磷酸化；下調(diào)Bcl-2;切割胱冬酶-8;切割胱冬酶-3;切割聚ADP-核糖聚合酶；降解IkB-oc;和其組合。在另一實(shí)施方式中，有一種誘導(dǎo)個(gè)體中一種或多種gp240抗原陽性細(xì)胞凋亡的方法，其包括給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性耙向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，有一種在個(gè)體中治療過度表達(dá)Her-2/neu和Nf《B的癌癥的方法，其包括給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性耙向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，有一種在個(gè)體中治療癌癥的方法，其包括給予該個(gè)體治療有效量的至少一種化療藥和嵌合分子，其中所述藥物通過中斷NF-icB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。在具體實(shí)施方式中，所述化療藥是抗代謝劑，如5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、卡培他濱、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、甲氨蝶呤或硫鳥嘌呤。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，有一種含有靶向細(xì)胞，如細(xì)胞的一種或多種蛋白，包括細(xì)胞表面上的一種或多種蛋白的適體的組合物。適體可被認(rèn)為是細(xì)胞特異性耙向部分，在具體實(shí)施方式中，它與抗-細(xì)胞增殖部分相連，如連接或偶聯(lián)。適體可與本發(fā)明嵌合分子相連，如連接或偶聯(lián)，其中所述嵌合分子本身包含細(xì)胞特異性耙向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。在其它實(shí)施方式中，將治療有效量的適體組合物給予個(gè)體，以產(chǎn)生或恢復(fù)個(gè)體中一種或多種化療耐受性癌細(xì)胞的化療敏感性。也可通過將治療有效量的適體組合物給予個(gè)體，用該組合物使個(gè)體中的一種或多種癌細(xì)胞對化療敏感。也可用適體組合物誘導(dǎo)個(gè)體中一種或多種TNF耐受性癌細(xì)胞、個(gè)體中一種或多種過度表達(dá)HER-2/neu的癌細(xì)胞和/或個(gè)體中一種或多種gp240抗原-陽性細(xì)胞凋亡。在另一實(shí)施方式中，將適體組合物給予患有過表達(dá)HER-2/neu和NF-kB的癌癥的個(gè)體。上述內(nèi)容相當(dāng)廣泛地列出了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，目的是更好地理解以下發(fā)明詳述。下面開始描述本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，它們形成了本發(fā)明權(quán)利要求書的主題。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述構(gòu)思和具體實(shí)施方式不難用作修飾或設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明相同目的的其它結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)認(rèn)識到，這些等效構(gòu)建不會背離所附權(quán)利要求書所列的本發(fā)明構(gòu)思和范圍。參照附圖閱讀以下說明書能更好地理解相信成為本發(fā)明特征的新特征，及其組織和操作方法，以及其它目的和優(yōu)點(diǎn)。然而應(yīng)該清楚地了解，提供各圖的目的只是說明和描述，不應(yīng)認(rèn)為限制了本發(fā)明。附圖簡要說明為了更全面地理解本發(fā)明，現(xiàn)在連同附圖一起參考以下描述。圖1顯示了四種人胰腺細(xì)胞系中HER-2/neu、HER-1、TNFR-1、TNFR-2和p-Akt的表達(dá)模式。以5xl05個(gè)細(xì)胞A))60mm皮氏培養(yǎng)皿接種四種胰腺癌細(xì)胞系(AsPc-l、Capan-l、Capan-2和L3.6pl)，孵育24小時(shí)，然后收集細(xì)胞裂解物。用SDS-PAGE分析全細(xì)胞裂解物(50嗎)，并用抗-HER-2/neu、TNF受體-1、TNF受體-2和p-Akt抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，隨后用抗-小鼠或抗-兔辣根過氧化物酶-標(biāo)記抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作蛋白質(zhì)加樣的加樣對照。圖2A-2D提供了TNF、scFv23/TNF、5-氟尿嘧啶、順鉑、依托泊甙、多柔比星和吉西他濱對四種胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPc-l(圖2A)、Capan-l(圖2B)、Capan-2(圖2C)和L3.6pl(圖2D)的劑量反應(yīng)曲線。用不同藥物處理細(xì)胞72小時(shí)，然后用結(jié)晶紫染色評價(jià)生長抑制。值為至少四次獨(dú)立接觸的平均值士SD。圖3顯示了scFv23、TNF和scFv23/TNF對Akt和磷酸化-Akt表達(dá)的影響。用IC25的5-FU、scFv23禾卩5-FU與scFv23/TNF聯(lián)合處理L3.6pl細(xì)胞。處理后，用SDS-PAGE分析細(xì)胞裂解物(50pg)，并用抗-Akt和磷酸化-Akt抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，然后用抗-兔辣根過氧化物酶-標(biāo)記的抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對照。圖4顯示了scFv23、TNF和scFv23/TNF對Bcl-2表達(dá)的影響。用IC25的5-FU、scFv23和5-FU與scFv23/TNF聯(lián)合處理L3.6pl細(xì)胞。處理后，用SDS-PAGE分析細(xì)胞裂解物(50嗎)，并用抗Bcl-2抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，然后用抗-兔辣根過氧化物酶-標(biāo)記的抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對照。圖5顯示了5-氟尿嘧啶、scFv23/TNF和其組合對胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP切割活化的影響。用IC25的5-FU、scFv23/TNF和其組合處理L3.6pl細(xì)胞48小時(shí)。處理后，用SDS-PAGE分析細(xì)胞裂解物(50pg)，并用抗-胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，然后與抗-小鼠辣根過氧化物酶-標(biāo)記的抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對照。圖6顯示了胱冬酶-3抑制劑對5-FU+scFv23/TNF組合處理的L3.6pl細(xì)胞活力的影響。用或不用100胱冬酶-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)預(yù)處理L3.6pl細(xì)胞3小時(shí)，然后用IC25的5-FU、scFv23/TNF和其組合處理。接觸72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)測定活力。圖7A-7B顯示了scFv23/TNF對SKBR-3乳腺癌細(xì)胞系的影響。顯示了HER-2/neu、TNF受體1和TNP受體2的表達(dá)模式。以5><105個(gè)細(xì)胞/(|)60mm皮氏培養(yǎng)皿接種SKBR-3/H和SKBR-3/L細(xì)胞系，孵育24小時(shí)，然后收集細(xì)胞裂解物。用SDS-PAGE分析全細(xì)胞裂解物(50嗎)，并用抗-HER-2/neu、TNF受體-1和TNF受體-2抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，隨后用抗-小鼠或抗-兔辣根過氧化物酶-標(biāo)記抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對照(圖7A)。TNF或scFv23/TNF對SKBR-3/H和SKBR-3/L細(xì)胞有生長抑制。用不同濃度的TNF或scFv23/TNF處理SKBR-3/H和-3/L細(xì)胞。接觸72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)測定活力(圖7B)。圖8顯示了TNF受體-1抗體對scFv23/TNF-誘導(dǎo)的生長抑制的中和作用。在200nMscFv23/TNF處理前，SKBR-3細(xì)胞接觸抗-TNF受體-1Ab(25和50pg/ml)2小時(shí)。接觸72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)測定活力。圖9提供了scFv23、TNF和scFv23/TNF對IkB-cx、TRADD禾卩TRAF2表達(dá)的影響。用200nMscFv23、200nMTNF或200nMscFv23/TNF處理SKBR-3/H細(xì)胞所示時(shí)間。處理后，用SDS-PAGE分析細(xì)胞裂解物(50嗎)，用抗-IkB-ouTRADD和TRAF2抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，然后用抗-兔辣根過氧化物酶-標(biāo)記的抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對照。圖10顯示了scFv23、TNF和scFv23/TNF對Akt和磷酸化-Akt表達(dá)的影響。用200nMscFv23、200nMTNF或200nMscFv23/TNF處理SKBR-3/H細(xì)胞所示時(shí)間。處理后，用SDS-PAGE分析細(xì)胞裂解物(50ng)，并用抗-Akt和磷酸化-Akt抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，然后用抗-兔辣根過氧化物酶-標(biāo)記的抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對照(圖IOA和圖IOB)。圖11A-11B顯示了TNF和scFv23/TNF對過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3/H細(xì)胞凋亡的影響。顯示了凋亡細(xì)胞的顯微鏡分析。SKBR-3/H細(xì)胞接觸200nMTNF或200nMscFv23/TNF24小時(shí)和48小時(shí)。處理后，用PBS洗滌細(xì)胞，用通透溶液(0.1%TritonX-IOO，0.1%檸檬酸鈉)通透，然后用4%多聚甲醛固定。固定細(xì)胞用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(Roche)染色。用熒光顯微鏡檢測發(fā)生凋亡的細(xì)胞(X200)(圖IIA)。凋亡細(xì)胞的DNA片段化。裂解接觸200nMTNF或200nMscFv23/TNF24小時(shí)和48小時(shí)的SKBR-3/H細(xì)胞。提取DNA，電泳分離，溴乙錠染色(圖11B)。圖12顯示了scFv23、TNF和scFv23/TNF對胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP切割活化的影響。如圖所示，用200nMscFv23、200nMTNF或200nMscFv23/TNF處理SKBR-3/H細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)。處理后，用SDS-PAGE分析細(xì)胞裂解物(50嗎)，并用抗-胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，然后用抗-小鼠辣根過氧化物酶-標(biāo)記的抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對照。圖13顯示了胱冬酶-3抑制劑對scFv23/TNF處理的SKBR-3/H細(xì)胞活力的影響。用或不用100nM胱冬酶-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)預(yù)處理SKBR-3/H細(xì)胞3小時(shí)，然后用不同濃度的scFv23/TNF處理。接觸72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)測定活力。圖14顯示了胱冬酶抑制劑對scFv23/TNF處理的SKBR-3-LP細(xì)胞活力的影響。用或不用200通用胱冬酶抑制劑(Z-VAD-FMK)、200胱冬酶-8抑制劑(Z-IETD-FMK)或200胱冬酶-3抑制劑(Z-DEVD-FMK)預(yù)處理SKBR-3-LP細(xì)胞2小時(shí)，然后用不同濃度的scFv23/TNF處理。接觸72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)測定活力。圖15A-15B顯示了SKBR-3乳腺癌細(xì)胞系上信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)和比較敏感性。在圖15A中，為SKBR-3-LP和-HP細(xì)胞系中HER-2/neu、TNF-Rl和TNF-R2的Western印跡分析。以5xl0S個(gè)細(xì)胞Aj)60mm皮氏培養(yǎng)皿接種SKBR-3-LP和SKBR-3-HP細(xì)胞系，孵育24小時(shí)，然后收集細(xì)胞裂解物。用SDS-PAGE分析全細(xì)胞裂解物(50[ig)，并用抗-HER-2/neu、TNF受體-1和TNF受體-2抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，隨后用抗-小鼠或抗-兔辣根過氧化物酶-標(biāo)記抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對照。在圖15B中，賀賽汀、scFv23/TNF和TNF對SKBR-3-LP和SKBR-3-HP細(xì)胞有生長抑制。用不同濃度的TNF或scFv23/TNF處理SKBR-3-LP和-3-HP細(xì)胞。接觸72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)測定活力。圖16顯示了TNF受體對scFv23/TNF-誘導(dǎo)的生長抑制的作用。為了確定scFv23/TNF、賀賽汀或TNF的細(xì)胞毒作用是否完全通過與細(xì)胞表面TNF受體-1的相互作用介導(dǎo)，用TNFRl:Fc融合蛋白(l和10小g/ml)阻斷scFv23/TNF與TNF受體-1的結(jié)合。接觸72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)測定活力。圖17A-17B顯示了scFv23/TNF對TNF受體-1表達(dá)調(diào)節(jié)的影響。為了確定scFv23/TNF可否調(diào)節(jié)TNF-R1的表達(dá)，我們用scFv23、TNF、scFv23/TNF(圖17A)或賀賽汀(圖17B)處理SKBR-3-LP和L3.6pl細(xì)胞。用SDS-PAGE分析全細(xì)胞裂解物(50pg)，并用抗-TNF受體-1和TNF受體-2抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，隨后用抗-小鼠或抗-兔辣根過氧化物酶-標(biāo)記抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對昭?！?、、、o圖18顯示了調(diào)節(jié)SKBR-3-LP細(xì)胞的TNF敏感性。為了確定TNF-R1過度表達(dá)可否調(diào)節(jié)過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3-LP細(xì)胞的TNF敏感性，用TNF、scFv23、scFv23/TNF或TNF與scFv23聯(lián)合處理SKBR-3-LP細(xì)胞。接觸72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)測定活力。圖19顯示了scFv23、TNF和scFv23/TNF對TRADD、TRAF-2、Ik-B、Akt和p-Akt表達(dá)的影響。用200nMscFv23、200nMTNF或200nMscFv23/TNF處理SKBR-3-LP細(xì)胞所示時(shí)間。處理后，用SDS-PAGE分析細(xì)胞裂解物(50嗎)，并用抗-TRADD、TRAF-2、Ik-B、Akt或磷酸化-Akt抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，隨后用抗-兔辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將肌動蛋白用作加樣對照。圖20提供了TNF和scFv23/TNF對過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3-LP細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響的小結(jié)。圖21顯示了通過彈性系鏈G4S將scFvMEL基因融合于人TNF基因。在多克隆位點(diǎn)中以iVcoI和將融合構(gòu)建物scFvMEL/TNF克隆入細(xì)菌表達(dá)載體pET32a(+)。圖22A-22C顯示了scFvMEL/TNF融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE和Western印跡分析。圖22A提供了還原條件下的8.5。/。SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色。泳道1，蛋白質(zhì)標(biāo)記。泳道2，未誘導(dǎo)的總裂解物。泳道3，誘導(dǎo)的總裂解物。泳道4，經(jīng)IMAC純化。泳道5，rEK消化后。泳道6，最終純化的scFvMEL/TNF。圖23B和23C顯示了兔抗-huTNF抗體(圖22B)或兔抗-scFvMEL抗體(圖22C)檢測的Western印跡；其中，泳道l，ZME-018;泳道2，由IMAC純化的具有his尾的表達(dá)蛋白；泳道3，rEK消化后最終純化的表達(dá)蛋白；泳道4，重組huTNF。圖23A-23B顯示了IicB-a降解的western印跡分析。圖24A中，在6孔板中接種細(xì)胞(2><105個(gè)細(xì)胞/孔)，用I.C.so濃度的TNF或scFvMEL/TNF處理2、5、15、30、45和60分鐘。提取細(xì)胞裂解物，將30|ig總蛋白加載到8.5%SDS-PAGE上，用LcBa抗體(l:3000稀釋)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Western印跡檢測。圖23B中，用ZME-018(40pg/ml)預(yù)處理細(xì)胞4小時(shí)，然后用I.C.so濃度的scFvMEL/TNF處理所示時(shí)間。分析與圖23A相同量的細(xì)胞裂解物，以檢測lKB-a降解。圖24顯示了p38MAP激酶通路的Western印跡分析。提取用scFvMEL/TNF或TNF處理不同時(shí)間的細(xì)胞裂解物。將50嗎總蛋白量加載到12。/。SDS-PAGE上，并用MKK3、磷酸化-MKK3/MKK6、p38MAP激酶、磷酸化-p38MAP激酶(Thrl80/Tyr182)、ATF-2或磷酸化-ATF-2抗體進(jìn)行Western印跡分析。圖25顯示了SAPK/JNK通路的Western印跡分析。將用scFvMEL/TNF或TNF處理不同時(shí)間的細(xì)胞裂解物的50tag總蛋白量加載到12%SDS-PAGE上，并用MKK4、磷酸化-SEK1/MKK4、SAPK/JNK、磷酸化-p54/46SAJK/JNK(Thrl83/Tyrl85)、c-Jun或磷酸化c-Jun抗體進(jìn)行Western印跡分析。圖26A-26C顯示了凋亡概況圖26A顯示了PARP切割。用1nMTNF處理A375-M細(xì)胞(2xl()6個(gè)細(xì)胞/ml)，用200nM處理AAB-527細(xì)胞(2xl()6個(gè)細(xì)胞/ml);或者用0.1nMscFvMEL/TNF處理A375-M細(xì)胞(2xl06個(gè)細(xì)胞/ml)，用20nM處理AAB-527細(xì)胞(2xl(^個(gè)細(xì)胞/ml)24小時(shí)。將細(xì)胞裂解物的50嗎總蛋白量加到7.5%SDS-PAGE上，用能識別切割蛋白(86kDa)和未切割蛋白(116kDa)的抗-PARP抗體進(jìn)行Western印跡分析。圖26B顯示了切割的胱冬酶-3。用scFvMEL/TNF或TNF處理細(xì)胞1、4、8、16和24小時(shí)。將細(xì)胞裂解物的50|ig總蛋白量加載到12%SDS-PAGE上，并用切割的胱冬酶-3單克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析。圖26C顯示了凋亡細(xì)胞的原位細(xì)胞死亡(TUNEL)分析。用1.C.5。濃度的scFvMEL/TNF或TNF處理16孔室玻片中每孔10,000個(gè)細(xì)胞24小時(shí)，用PBS簡單洗滌。用3.7%甲醛室溫固定細(xì)胞IO分鐘，用0.1°/。TritonX-IOO，0.1%檸檬酸鈉在冰上通透2分鐘。用TUNEL反應(yīng)混合物37"孵育細(xì)胞60分鐘。最終洗滌后，在NikonEclipseTS-100熒光顯微鏡下放大400x分析細(xì)胞。圖27顯示了黑色素瘤細(xì)胞上TNF受體和TNF受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的Western印跡分析。將來自scFvMEL/TNF或TNF處理不同時(shí)間的細(xì)胞裂解物的相同總蛋白量(30pg)加載到10%SDS-PAGE上，并用抗-TNFRl、抗-TNFR2、抗-TRADD、抗-TRAF2、抗-RIP和抗-(5-肌動蛋白抗體進(jìn)行Western印跡分析。圖28顯示了抗-TNFRlAb對scFvMEL/TNF細(xì)胞毒性的中和。用25(ig/ml抗-TNFR1Ab預(yù)處理A375-M細(xì)胞或SKBR3-HP細(xì)胞(每孔4000個(gè)細(xì)胞)2小時(shí)，然后用I.C.濃度的scFvMEL/TNF或TNF處理細(xì)胞72小時(shí)。用結(jié)晶紫染色確定scFvMEL/TNF和TNF對培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長的作用，然后測定595nm處的光密度。圖29顯示了1251-標(biāo)記的scFvMEL/TNF在小鼠中的藥代動力學(xué)。將放射性標(biāo)記的融合構(gòu)建物給予(尾靜脈i.v.)Balb/c小鼠。在給藥后不同時(shí)間處死小組(5只/組)。評價(jià)血槳中的放射性，用最小平方非線性回歸分析結(jié)果(PKAnalyst;MicroMath，Inc.)。數(shù)據(jù)顯示出三相曲線擬合，計(jì)算的a-、P-和，相半衰期分別為0.38小時(shí)、3.9小時(shí)和17.6小時(shí)。圖30提供了組均終末體重(TBW)和相對器官重量。用0.2、0.4、0.6和0.8mg/kg/天scFvMEL/TNF每天靜脈內(nèi)注射每組五只小鼠5天(第2-5組)。遞送的總劑量為1、2、3、4mg/kg，其對應(yīng)于建立的MTD的25、50、75和100%。載體對照組(第1組)由鹽水組成。最后一次注射7天后(第12天)，用C02處死小鼠。測定各小鼠的終末體重(TBW)，然后進(jìn)行完全尸檢，包括肝、腎、脾等。測定單個(gè)動物的器官重量，然后通過浸入緩沖至中性的10%甲醛溶液固定器官。相對(于體重)器官重量計(jì)算成對照的百分?jǐn)?shù)(器官WT/TBWxl00)計(jì)算。ScFvMEL/TNF使相對脾重(相對于體重)隨劑量增加。圖31顯示了通過XenogenIVIS200成像系統(tǒng)監(jiān)測，scFvMEL/TNF對A375GFP異種移植瘤的抗腫瘤活性。用鹽水(對照)或2.5mg/kgscFvMEL或scFvMEL(0.2mg/kg)加TNF(0.2mg/kg)或2.5mg/kg(總劑量)scFvMEL/TNF連續(xù)處理(i.v.尾靜脈)右側(cè)面荷有用綠色熒光蛋白(GFP)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建立的(50mi^)人黑色素瘤(A375GFP)的裸小鼠5天。處理后每周用50mg/kg(i.p.)Nembutal麻醉小鼠后用XenogenIVIS200成像系統(tǒng)監(jiān)測腫瘤一次。圖32顯示用鹽水(對照)或2.5mg/kgscFvMEL或scFvMEL(0.2mg/kg)加人重組TNF(0.2mg/kg)或2.5mg/kg(總劑量)scFvMEL/TNF連續(xù)i.v.(尾靜脈)處理人黑色素瘤(A375GFP)荷瘤裸小鼠5天(箭頭)。用劑量為2.5mg/kg的scFvMEL/TNF處理建立(50mm^腫瘤荷瘤小鼠導(dǎo)致顯著腫瘤抑制和所有損傷的腫瘤完全消退(第43天5/5小鼠無腫瘤)。相反，用鹽水、單獨(dú)的scFvMEL或scFvMEL加TNF處理的所有小鼠都顯示出快速腫瘤生長。荷有較大腫瘤(150mmS)的小鼠也顯示腫瘤消退(第44天3/5無腫瘤)。圖33顯示經(jīng)ELISA檢測不同黑色素瘤細(xì)胞上gp240抗原的表達(dá)。為了檢測gp240抗原在黑色素瘤A375-M、TXM-18、TXM-13、MEL526和TXM-1細(xì)胞上的表達(dá)，將特異性結(jié)合于gp240抗原的母體單克隆抗體ZME-018IgG2a用于ELISA。通過加入含有5。/。牛血清白蛋白(BSA)的溶液1小時(shí)封閉含有貼壁黑色素瘤細(xì)胞(每孔5xl04個(gè)細(xì)胞)的96孔ELISA平板。用單克隆抗體ZME-018IgG2a(由我們的中心實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))孵育細(xì)胞，然后用山羊抗-小鼠/辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(HRP-GAM)孵育。將含有1ml/ml30%H2O2的底物溶液ABTS加入各孔。30分鐘后測定405nm處的吸光度。結(jié)果表明，A375-M、TXM-18L、TXM-13和MEL-526細(xì)胞上存在gp240抗原，然而，觀察到gp240抗原在TXM-1細(xì)胞上表達(dá)水平非常低。圖34顯示出經(jīng)FACS試驗(yàn)檢測黑色素瘤細(xì)胞系上的gp240表達(dá)。首先在4。C用單克隆抗體ZME-018IgG2a處理由1><106個(gè)細(xì)胞組成的黑色素瘤細(xì)胞20分鐘，然后用別藻藍(lán)蛋白(APC)-偶聯(lián)的山羊-抗-小鼠抗體(BDImmunocytometrySystem,CA)4°C染色20分鐘，都重懸于100mlFACS染色緩沖液(2。/。FCS/DPBS)中。作為陰性染色對照，用特異性不相關(guān)的同種型匹配的對照抗體(小鼠IgG2a，PharMingen，加州圣地亞哥Iifomia)染色細(xì)胞，其濃度與gp240抗體濃度相同。染色后，用DPBS洗滌細(xì)胞兩次，然后重懸于500ml1°/。多聚甲醛溶液中，并在冰上避光保存。之后立即在FACSCaliber流式細(xì)胞儀(BectonDickinson,SanJose，CA)上進(jìn)行FACS分析。在FL-4通道檢測APC熒光。對于各細(xì)胞系，獲得10,000個(gè)事件。用CdlQuestPro軟件(BectonDickinson)進(jìn)行分析。對于所有五種黑色素瘤細(xì)胞系(A375M、TXM13、TXM18、MEL526和TXM1)，gp240的表達(dá)表示為實(shí)線，它們與代表同種型對照的虛線重疊。圖35A和35B顯示由ELISA測定的GrB/scFvMEL融合蛋白的scFvMEL部分的結(jié)合活性。通過加入含有5。/。牛血清白蛋白(BSA)的溶液1小時(shí)封閉含有貼壁黑色素瘤細(xì)胞(每孔5x104個(gè)細(xì)胞)的96孔ELISA平板。為了檢測GrB/scFvMEL的結(jié)合活性，用各種濃度的純化GrB/scFvMEL室溫(RT)孵育細(xì)胞1小時(shí)。洗滌后，用兔抗-scFvMEL抗體孵育細(xì)胞，然后加入山羊抗-兔/HRP偶聯(lián)物(HRP-GAR)抗體。最后，將含有1ml/ml30。/。H2O2的底物溶液ABTS加入各孔。30分鐘后測定405nm處的吸光度。圖35A中，吸光度概況表明了不同濃度的GrB/scFvMEL與不同黑色素瘤細(xì)胞系的結(jié)合活性。圖35B中，在不同黑色素瘤細(xì)胞系上有相同IC5。濃度的GrB/scFvMEL的吸光度。結(jié)果證明，GrB/scFvMEL結(jié)合于高水平表達(dá)gp240抗原的黑色素瘤A375-M、TXM-18L、TXM-13和MEL-526細(xì)胞。而且，在A375-M和MEL-526中結(jié)合活性較強(qiáng)，其次是TXM-18L和TXM-13。然而，該蛋白不結(jié)合gp240抗原表達(dá)水平非常低的TXM-1。圖36顯示體外抗黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。用黑色素瘤細(xì)胞單層的標(biāo)準(zhǔn)72小時(shí)細(xì)胞增殖試驗(yàn)和結(jié)晶紫染色測定樣品(GrB/scFvMEL或MELsFv/rGel)。對照百分?jǐn)?shù)指與對照(未處理)孔相比，藥物處理孔的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。柱顯示了對不同黑色素瘤細(xì)胞系的IC5o值。對gp240抗原高表達(dá)的A375M、MEL526、TXM-18L和TXM13有細(xì)胞毒作用。然而，在劑量高達(dá)1時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)對TXM-1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。圖37提供了GrB/scFvMEL與各種化療藥聯(lián)用的研究。用各種化療藥(1<:25劑量)預(yù)先處理抗原陽性(A375M)細(xì)胞6小時(shí)，然后加入GrB/scFvMEL(IC25)。然后孵育細(xì)胞共72小時(shí)(順序Cl)?；蛘?，首先用GrB/scFvMEL處理細(xì)胞6小時(shí)，然后加入各種化療藥72小時(shí)(順序C2)。化療藥包括多柔比星(DOX)、長春新堿(VCR)、依托泊武(VP-16)、順鉬(CDDP)、阿糖胞苷(AraC)和5-Fu。將GrB/scFvMEL和化療藥共同給予A375細(xì)胞72小時(shí)，與DOX、VCR或CDDP聯(lián)用時(shí)顯示出協(xié)同的抗腫瘤活性，與VP-16或AraC聯(lián)用時(shí)顯示出加成作用。與藥物預(yù)處理后共同接觸融合構(gòu)建物(C1)相比，用GrB/scFvMEL預(yù)處理6小時(shí)，然后共同接觸這些化療藥72小時(shí)(C2)顯示出顯著的生長抑制。圖38提供了GrB/scFvMEL的體內(nèi)抗腫瘤活性。6-8周齡雌性無胸腺(nu/nu)小鼠右側(cè)皮下注射3"06對數(shù)期A375-M細(xì)胞，使腫瘤形成。一旦腫瘤達(dá)到可測定大小(~30-50mm"后，每隔一天通過i.v.尾靜脈用鹽水(對照)或GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物(37.5mg/kg總劑量)處理動物，共處理5次。監(jiān)測動物，再測定腫瘤28天。鹽水處理的對照腫瘤在28天中增大24倍(從50mm3至1200mm3)。相反，GrB/scFvMEL(37.5mg/kg)處理的腫瘤增大4倍(從50mm3至200mm3)。圖39顯示，通過ELISA評價(jià)，GrB/scFvMEL特異性結(jié)合于gp240抗原陽性的黑色素瘤細(xì)胞系。通過加入含有5M牛血清白蛋白(BSA)的溶液1小時(shí)封閉含有貼壁黑色素瘤細(xì)胞(每孔5\104個(gè)細(xì)胞)的96孔ELISA平板。為了檢測GrB/scFvMEL的結(jié)合活性，用各種濃度的純化GrB/scFvMEL室溫孵育細(xì)胞1小時(shí)。洗滌后，用兔抗-scFvMEL抗體孵育細(xì)胞，然后加入山羊抗-兔/HRP偶聯(lián)物(HRP-GAR)抗體。最后，將含有1|_il/ml30%H2O2的底物溶液ABTS加入各孔。30分鐘后測定405nm處的吸光度。GrB/scFvMEL結(jié)合于高水平表達(dá)gp240抗原的黑色素瘤A375-M、MEL-526、TXM-18，而不結(jié)合于gp240抗原表達(dá)水平非常低的TXM-1。圖40顯示對多柔比星的細(xì)胞耐受性與對GrB/scFvMEL的邊際交叉耐受有關(guān)。A375-多柔比星耐藥(A375DR)細(xì)胞對多柔比星的耐藥性是親代A375細(xì)胞的400倍。用不同劑量的GrB/scFvMEL處理對數(shù)期A375DR細(xì)胞72小時(shí)。對照百分?jǐn)?shù)指與對照(未處理)孔相比，藥物處理孔的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。A375DR細(xì)胞所顯示的GrB/scFvMEL耐藥性僅為親本A375細(xì)胞的4.5倍(I.C.so為63.6與14.5nM)。圖41A-41C顯示了GrB/scFvMEL處理使黑色素瘤細(xì)胞對電離輻射敏感。GrB/scFvMEL的輻射敏化作用基于克隆源性細(xì)胞存活試驗(yàn)。用GrB/scFvMEL預(yù)處理A375(圖41A)、A375DR(圖41B)和SKBR3-HP(圖41C)細(xì)胞(10nM16小時(shí))，洗掉藥物，用各種劑量輻射細(xì)胞，鋪板進(jìn)行克隆源性細(xì)胞存活試驗(yàn)。在2、4和6Gy劑量組觀察到對A375細(xì)胞的敏化作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p0.05)，在4和6Gy劑量組觀察到對A375DR細(xì)胞的敏化作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p分別小于0.05和0.005)。在gp240抗原陰性SKBR3細(xì)胞中沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性敏化作用(pX).05)。圖42A和42B顯示，GrB/scFvMEL抑制了A375DR細(xì)胞侵襲基質(zhì)膠(Matrigel)。如材料和方法章節(jié)所述制備A375DR細(xì)胞聚集體。將細(xì)胞聚集體轉(zhuǎn)移到基質(zhì)膠墊層上，然后再用100pl基質(zhì)膠覆蓋。用400|il不含或含有GrB/scFvMEL(50nM)的培養(yǎng)基覆蓋夾入基質(zhì)膠的聚集體。然后在光學(xué)顯微鏡下每天觀察該聚集體(圖42A)。A375DR細(xì)胞在第4和第6天主動離開該聚集體并侵入基質(zhì)膠制劑中。用GrB/scFvMEL處理A375DR細(xì)胞能抑制A375DR在第4和第6天侵入基質(zhì)膠。用AlphaEase⑧FC軟件分析侵入聚集體周圍的基質(zhì)膠中的細(xì)胞密度，根據(jù)兩組的細(xì)胞密度計(jì)算侵入百分?jǐn)?shù)，并用未處理對照組作為100%侵入的值標(biāo)準(zhǔn)化(圖42B)。圖43顯示，GrB/scFvMEL在異種移植黑色素瘤模型中通過誘導(dǎo)腫瘤組織凋亡具有抗腫瘤活性。GrB/scFvMEL對A375-M異種移植瘤有抗腫瘤作用。6-8周齡雌性無胸腺(nu/nu)小鼠右側(cè)皮下注射3xl(^對數(shù)期A375-M細(xì)胞，使腫瘤形成。一旦腫瘤達(dá)到可測定大小(50mm"后，每隔一天靜脈內(nèi)給予動物鹽水(對照)或GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物5次(總劑量37.5mg/kg)。在接下來的28天中監(jiān)測動物并測定腫瘤。在28天中鹽水處理對照腫瘤增大24倍(從50mm3至1200mm3)。相反，GrB/scFvMEL處理的腫瘤增大4倍(從50mm3至200mm3)。發(fā)明詳述本申請說明書中所用"一個(gè)"可以指一個(gè)或多個(gè)。本申請權(quán)利要求書中所用(與"包含"聯(lián)用時(shí))術(shù)語"一個(gè)"可以指一個(gè)或一個(gè)以上。本文所用"另一個(gè)"可以指至少第二個(gè)或更多個(gè)。本發(fā)明一些實(shí)施方式可由或主要由本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)元件、方法步驟和/或方法組成?？紤]到本文所述任何方法或組合物均可用于本文所述的任何其它方法或組合物。I.定義本文所用術(shù)語"阻斷SAPK/JNK信號途徑"指至少部分抑制該途徑中一種或多種組分的功能，降低該途徑中一種或多種組分的半衰期和/或生物學(xué)活性，降低該途徑中一種或多種組分的表達(dá)等。本領(lǐng)域已經(jīng)知道SAPK/JNK信號途徑的組分，但示范性實(shí)施方式包括(例如)SAPK/JNK、c-Jun、MKK4、SEK1、p54/46ZAP-70、NfiVT、MEKK1、GrB2、MEKK4/7和粘著斑蛋白。本文所用術(shù)語"化療敏感性"指癌癥治療有效治療一種或多種細(xì)胞的能力。具體說，它指一種或多種化療破壞一種或多種細(xì)胞或至少將其增殖的能力。本文所用術(shù)語"化療耐受性"指癌細(xì)胞用一種或多種化療藥難以治愈的能力。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述一種或多種化療起初對一種或多種藥物有效(敏感)，而在其它實(shí)施方式中，所述一種或多種化療從未對癌細(xì)胞基本有效。術(shù)語"細(xì)胞毒性"指一種物質(zhì)對一種或多種細(xì)胞如癌細(xì)胞，包括腫瘤如實(shí)體瘤中的細(xì)胞有毒性或破壞性作用。在另一實(shí)施方式中，所述物質(zhì)對不是腫瘤中的癌細(xì)胞，如非實(shí)體瘤，包括白血病或淋巴瘤的癌細(xì)胞有破壞性。術(shù)語"抑制Akt磷酸化"指至少部分阻斷Akt對一種或多種分子的磷酸化?？捎帽绢I(lǐng)域的任何合適方法，例如用磷酸化-Akt的抗體進(jìn)行Western印跡檢測這種抑制。術(shù)語"下調(diào)Bcl-2"指降低Bcl-2的表達(dá)水平?？捎帽绢I(lǐng)域的任何合適方法，包括Western或Northern測定該水平。本文所用術(shù)語"粒酶"定義為進(jìn)入胞漿后誘導(dǎo)凋亡和/或核DNA片段化的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞顆粒的酶。在具體實(shí)施方式中，所述粒酶是淋巴細(xì)胞絲氨酸蛋白酶。在一些實(shí)施方式中，所述粒酶為全長，而在其它實(shí)施方式中，所述粒酶是一部分。本文所用術(shù)語"過度表達(dá)HER-2/neu"指在特定細(xì)胞中HER-2/neu的表達(dá)比相同組織的對應(yīng)非癌細(xì)胞高兩倍以上。此外，本文用"與過度表達(dá)HER-2/neu有關(guān)的癌癥"指所含HER-2/neu多于來自相同身體部分的非癌組織的癌組織?？捎帽绢I(lǐng)域任何合適方法，如Western印跡、northern印跡或定量FISH測定HER-2/neu的表達(dá)水平。本文所用術(shù)語"免疫細(xì)胞因子"指包含融合于抗體的細(xì)胞因子的一類重組物質(zhì)，這些構(gòu)建物可用于將其生物學(xué)作用重定向，以耙向特定細(xì)胞并防止非靶毒性。本文所用術(shù)語"過度表達(dá)NF《B"指在具體細(xì)胞中NF-kB的表達(dá)比相同組織的對應(yīng)非癌細(xì)胞高兩倍以上。此外，本文用"與過度表達(dá)NF-KB有關(guān)的癌癥"指所含NF-KB多于來自相同身體部分的非癌組織的癌組織?？捎帽绢I(lǐng)域任何合適方法，如Western印跡、northern印跡或定量FISH測定NF-kB的表達(dá)水平。本文所用術(shù)語"對化療敏感"指可用一種或多種化療治療，在具體實(shí)施方式中，可用一種或多種具體化療治療。II.
發(fā)明內(nèi)容因?yàn)榧膊⊥哂心退幮蕴卣鳎詡鹘y(tǒng)化療可能對于治療具體癌癥極其無效。對介導(dǎo)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的分子事件越來越多的了解導(dǎo)致開發(fā)出合理設(shè)計(jì)的靶向治療，靶向治療具有效力最大化和對正常組織毒性最小化的雙重優(yōu)點(diǎn)(Awada等，2003)。近年來，癌癥治療方案一般采用最大耐受劑量的非特異性毒劑，并研究了通過各種生物學(xué)途徑特異性耙向腫瘤相關(guān)分子的許多新藥。例如，在黑色素瘤的新藥開發(fā)中，對直接調(diào)節(jié)凋亡途徑的方法特別感興趣。黑色素瘤細(xì)胞中凋亡機(jī)制的激活直接與患者腫瘤對化療的反應(yīng)、對放療的反應(yīng)和轉(zhuǎn)移傾向有關(guān)。本發(fā)明涉及嵌合分子和它們在治療和/或預(yù)防癌癥中的應(yīng)用。更具體說，嵌合分子用于治療難治性或?qū)煯a(chǎn)生耐受的癌癥。這些癌癥可以是任何類型，但在具體實(shí)施方式中，它們過度表達(dá)Her-2/neu和/或?qū)为?dú)使用的TNF-a耐受。在特定實(shí)施方式中，所述癌癥是例如黑色素瘤、胰腺癌或乳腺癌。嵌合分子包含至少兩種組分，包括靶向部分和細(xì)胞毒部分或凋亡誘導(dǎo)部分。在特定實(shí)施方式中，所述靶向部分是抗體片段。在其它具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞毒部分包括TNF-a，所述凋亡誘導(dǎo)部分包括粒酶，如粒酶A或粒酶B。本發(fā)明尤其可用于產(chǎn)生或恢復(fù)化療耐受性細(xì)胞的化療敏感性，在具體實(shí)施方式中，該嵌合分子可與常規(guī)化療藥聯(lián)用。在特定實(shí)施方式中，該嵌合分子通過特定機(jī)制起作用，如不管該嵌合分子的抗-細(xì)胞增殖因子組分是細(xì)胞毒劑或是促調(diào)亡誘導(dǎo)部分都刺激凋亡通路。具體說，本發(fā)明嵌合分子可用于治療包括特定細(xì)胞病因的癌癥，如過度表達(dá)HER-2/neu、耐受TNF-a、NF-kB缺陷或其組合的癌癥。III.化療耐受性化療中特別引人關(guān)注的是在治療期間發(fā)生對特定化療或化療類型耐受的癌癥。此耐受性可能出現(xiàn)在第一次化療或后續(xù)化療期間。在其它實(shí)施方式中，一種或多種化療從未可檢測地有效對抗癌癥。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，在具體化療期間，沒有被化療殺死的一些細(xì)胞發(fā)生突變，變得能耐受特定藥物。一旦這些細(xì)胞增殖后，與化療敏感性細(xì)胞相比，可能有更多的耐受性細(xì)胞。在化療耐受性的其它實(shí)施方式中，發(fā)生基因擴(kuò)增，如當(dāng)癌細(xì)胞產(chǎn)生許多拷貝的特定基因時(shí)，基因擴(kuò)增會引發(fā)過度產(chǎn)生使抗癌藥無效的蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施方式中，癌細(xì)胞可能將藥物泵出細(xì)胞，其速度基本與藥物進(jìn)入細(xì)胞的速度一樣快，或者癌細(xì)胞甚至可以終止攝入藥物，因?yàn)榭缂?xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的蛋白失去功能。在化療耐受機(jī)制的其它實(shí)施方式中，癌細(xì)胞學(xué)會如何修復(fù)一些抗癌藥引起的DNA斷裂和/或癌細(xì)胞發(fā)展出使藥物失活的機(jī)制。在許多情況下，發(fā)生耐藥是常常進(jìn)行聯(lián)合用藥的一個(gè)原因，聯(lián)合用藥可降低對任何一種藥物發(fā)生耐藥的發(fā)生率。已知對一種藥物或一組藥物發(fā)生耐藥后，癌癥很可能對其它藥物發(fā)生耐藥。在本發(fā)明的具體方面，本發(fā)明組合物和方法利用一種以上癌癥治療劑。例如，可將一種以上本發(fā)明嵌合分子給予一個(gè)癌癥患者，如懷疑有發(fā)生耐藥的癌細(xì)胞的個(gè)體，或者本發(fā)明嵌合分子可與常規(guī)化療劑，如5-氟尿嘧淀聯(lián)用。IV.化療藥在本發(fā)明的實(shí)施方式中，，包含細(xì)胞特異性靶向部分和凋亡誘導(dǎo)部分或細(xì)胞毒劑的嵌合分子與一種或多種化療藥聯(lián)用時(shí)是有效的，能有效使癌癥對一種或多種化療藥敏感，能有效產(chǎn)生或恢復(fù)化療耐受性癌癥的敏感性，或其組合。具體說，所述嵌合分子和化療藥可對癌癥起加成或協(xié)同作用。本文所用術(shù)語"協(xié)同"指嵌合分子和化療劑的聯(lián)用療效大于其單獨(dú)療效之和。本文所用術(shù)語"化療藥"至少涉及以下示范性種類的常規(guī)化療藥烷化劑；亞硝基脲；抗代謝劑；抗腫瘤抗生素；植物生物堿；紫杉垸；激素藥；和其它藥物。雖然本發(fā)明嵌合分子能有效治療癌癥，但在本
發(fā)明內(nèi)容中，它們不屬于本文所用的常規(guī)"化療藥"。因?yàn)樵诩?xì)胞中存在的條件下能夠?qū)③拥皆S多負(fù)電基團(tuán)上，從而干擾DNA復(fù)制以防止癌細(xì)胞增殖，烷化劑因此得名。大多數(shù)烷化劑是細(xì)胞周期非特異性的。在特定實(shí)施方式中，它們通過交聯(lián)DNA雙螺旋鏈中的鳥嘌呤堿基阻止腫瘤生長。例子包括(例如)白消安、卡鉑、瘤可寧、順鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、異環(huán)磷酰胺、鹽酸氮芥、美法侖、丙卡巴肼、硫替派和尿嘧啶氮芥。將亞硝基脲稱為烷化劑是因?yàn)樗鼈兺ㄟ^烷化過程起到抑制DNA修復(fù)的作用。這些垸化劑是干擾DNA修復(fù)所需酶的代謝物。亞硝基脲能夠穿過血腦屏障，因此用它們治療(例如)腦腫瘤以及非霍奇金淋巴瘤。多發(fā)性骨髓瘤和惡性黑色素瘤。大多數(shù)亞硝基脲類藥物是細(xì)胞周期非特異性的。例子包括卡莫司汀、洛莫司汀(lumustine;)和鏈佐星?？勾x劑在細(xì)胞周期的合成(S)期防止堿基摻入DNA，阻止正常發(fā)育和分裂?？勾x劑包括以下藥物，例如5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、卡培他濱、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、甲氨蝶呤和硫鳥嘌呤。有許多抗腫瘤抗生素通常通過干擾細(xì)胞分裂所需酶或改變細(xì)胞周圍的膜阻止細(xì)胞分裂。這類抗生素包括蒽環(huán)類抗生素，如多柔比星，它通過破壞DNA結(jié)構(gòu)和終止其功能起到阻止細(xì)胞分裂的作用。這些藥物是細(xì)胞周期非特異性的?？鼓[瘤抗生素包括放線菌素d、道諾霉素、多柔比星、黃膽素、絲裂霉素-c和米托蒽醌。植物生物堿能抑制或終止有絲分裂，或抑制防止細(xì)胞制備細(xì)胞生長所需的蛋白質(zhì)的酶。常用的植物生物堿包括長春花堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞濱。紫杉烷能影響稱為微管的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，微管在細(xì)胞功能中起重要作用。在正常細(xì)胞生長中，細(xì)胞開始分裂時(shí)形成微管，但一旦細(xì)胞停止分裂，微管則解聚或破壞。紫杉烷阻止微管降解，使得癌細(xì)胞中塞滿微管，以致于不能生長和分裂。示范性紫杉烷包括紫杉醇和多西他賽。激素藥和激素樣藥用于某些類型的癌癥，包括例如，白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。它們常常與其它類型的化療藥一起使用，以增強(qiáng)其功效。用性激素來改變雌性或雄性激素的作用和產(chǎn)生，用它們減緩(例如)乳腺癌、前列腺和子宮內(nèi)膜癌的生長。抑制這些激素的產(chǎn)生(芳香酶抑制劑)或作用(他莫昔芬)常常用作附加治療。其它一些腫瘤也是激素依賴性腫瘤。他莫昔芬是干擾促進(jìn)生長乳腺癌細(xì)胞的雌激素活性的激素藥的例子。其它藥物包括化療劑如博來霉素、羥基脲、L-天冬酰胺酶和丙卡巴肼。V.嵌合分子的產(chǎn)生可用任何合適方式產(chǎn)生嵌合分子，使靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分相連。雖然可通過化學(xué)合成方法或兩部分之間的化學(xué)連接產(chǎn)生本發(fā)明嵌合蛋白，但是例如，在具體實(shí)施方式中，可通過在調(diào)節(jié)序列控制下融合細(xì)胞特異性靶向部分的編碼序列和凋亡誘導(dǎo)蛋白的編碼序列產(chǎn)生嵌合分子，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)融合多核苷酸在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，嵌合蛋白各組分包含其各部分作為細(xì)胞特異性靶向部分和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路因子(如凋亡誘導(dǎo)蛋白)的功能活性。在用化學(xué)接頭連接細(xì)胞靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分的實(shí)施方式中，本發(fā)明可利用任何合適接頭。具體例子包括例如SPDP、SMPT和/或親和素/鏈霉親和素生物素?？赏ㄟ^分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知的方法融合兩段全長編碼序列。優(yōu)選的是，融合多核苷酸僅含第一個(gè)編碼序列5'端的AUG翻譯起始密碼子，不含第二個(gè)編碼序列的起始密碼子，以防止產(chǎn)生兩種不同的編碼產(chǎn)物。此外，前導(dǎo)序列可置于多核苷酸的5'端，以使表達(dá)產(chǎn)物靶向宿主細(xì)胞內(nèi)特定位點(diǎn)或區(qū)室，以有利于基因表達(dá)后的分泌或隨后的純化。這兩段編碼序列可不用接頭直接融合，或可用彈性聚合接頭融合，如由五聚體Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重復(fù)1-3次組成的接頭。用這種接頭插入VH和VL之間構(gòu)建單鏈抗體(scFv)(Bird等，1988;Huston等，1988)。設(shè)計(jì)接頭，以便形成單鏈抗體可變區(qū)的兩段卩折疊之間能夠產(chǎn)生正確的相互作用。可采用的其它接頭包括(例如)Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly陽Ser-Gly-Ser陽Glu-Ser國Lys-Val-Asp(SEQIDNO:1)(Chaudhary等，1990)禾口Lys-Glu陽Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln陽Phe陽Arg-Ser-Leu-Asp(SEQIDNO:2)(Bird等，1988)。A.細(xì)胞特異性靶向部分本發(fā)明嵌合蛋白由細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分組成。細(xì)胞特異性靶向部分賦予該分子細(xì)胞類型特異性結(jié)合能力，根據(jù)所靶向的具體細(xì)胞群選擇該部分。各種蛋白質(zhì)都適合用作細(xì)胞特異性靶向部分，包括但不限于受體的配體，如生長因子、激素和細(xì)胞因子，以及抗體或其抗原結(jié)合片段。1.抗體在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，將一種或多種抗體用作細(xì)胞特異性靶向部分。本文所用術(shù)語"抗體"廣泛地指任何免疫結(jié)合物，如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常優(yōu)選IgG和/或IgM，因?yàn)樗鼈兪巧項(xiàng)l件下最常見的抗體，并且它們最容易在實(shí)驗(yàn)室條件下制備。用術(shù)語"抗體"指具有抗原結(jié)合區(qū)的任何抗體樣分子，包括抗體片段如Fab'、Fab、F(ab')2、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。本領(lǐng)域熟知制備和使用各種抗體構(gòu)建物和片段的技術(shù)。本領(lǐng)域也熟知制備和鑒定抗體的方法(參見例如，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》(Antibodies:ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,1988;納入本文作參考)?？贵w是種類極多和極其有用的細(xì)胞特異性靶向部分，因?yàn)榭僧a(chǎn)生抵抗任何感興趣的細(xì)胞表明抗原的抗體。己產(chǎn)生針對細(xì)胞表面受體、腫瘤相關(guān)抗原和白細(xì)胞譜系-特異性標(biāo)記如CD抗原的單克隆抗體。不難用本領(lǐng)域熟知方法從雜交瘤細(xì)胞中分離抗體可變區(qū)基因。在過去的幾年中，已經(jīng)批準(zhǔn)幾種單克隆抗體的治療應(yīng)用，并已獲得顯著的臨床和商業(yè)成功。單克隆抗體的許多臨床實(shí)用性來自它們與靶標(biāo)結(jié)合的親和力和特異性，以及由于其相對大而產(chǎn)生的長循環(huán)壽命。然而，單克隆抗體不是非常適用于短半衰期有利的情況或其大尺寸在物理上抑制了它們到達(dá)潛在治療活性的區(qū)域的情況。而且，由產(chǎn)生量需要大致相等并且正確組裝的兩條不同多肽鏈組成的天然形式抗體不是最適合用于治療目的的候選物。然而，可能產(chǎn)生可保持單克隆抗體的抗原結(jié)合特性的單獨(dú)多肽。單鏈抗體(SCA)是經(jīng)設(shè)計(jì)擴(kuò)展到單克隆抗體可以進(jìn)行的治療和診斷應(yīng)用的遺傳工程改造的蛋白質(zhì)。SCA具有單克隆抗體的結(jié)合特異性和親和力，其天然形式約為單克隆抗體大小的五分之一至六分之一，它們的半衰期一般非常短。與大多數(shù)單克隆抗體相比，人SCA具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括更特異地定位以靶向體內(nèi)位點(diǎn)、更快地從體內(nèi)清除以及(例如)口服、鼻內(nèi)、透皮或吸入應(yīng)用的機(jī)會更大。除了這些優(yōu)點(diǎn)以外，完全的人SCA可直接分離自人SCA文庫，無需昂貴和耗時(shí)的"人源化"過程。也不難通過細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生SCA，使它們可用于SCA分子用作細(xì)胞功能的特異性抑制劑的基因治療應(yīng)用。單鏈重組抗體(scFv)由通過設(shè)計(jì)的彈性肽連接連接起來的抗體VL和VH結(jié)構(gòu)域組成(Atwell等，1999)。與完整IfG相比，scFv具有抗原結(jié)合親和力相當(dāng)而尺寸小和結(jié)構(gòu)簡單的優(yōu)點(diǎn)，它們可能比類似的2-鏈Fab片段更穩(wěn)定(Colcher等，1998;Adams和Schier，1999)。幾項(xiàng)研究證明，scFv的尺寸較小使其更易于滲入腫瘤組織、改進(jìn)藥代動力學(xué)性能、以及相對于完整鼠抗體降低i.v.給予Fab觀察到的免疫原性(Bird等，1988;Cocher等，1990;Colcher等，1998;Adams和Schier，1999)。例如，scFvMEL單鏈抗體保持了與母體ZME-018抗體相同的結(jié)合親和力和特異性，該母體抗體能識別人黑色素瘤細(xì)胞上遞呈的gp240抗原的表面結(jié)構(gòu)域(Kantor等，1982;Macey等，1998)。已用基于重組單鏈Fv抗體(scF力的藥物進(jìn)行細(xì)胞靶向遞送細(xì)胞因子(Liu等，2004)和胞內(nèi)遞送高細(xì)胞毒性n-糖苷酶如重組白樹毒素(rGel)(Rosenblum等，2003)的臨床前研究。這些抗體片段尺寸較小使得它們能更容易的滲入腫瘤組織，改進(jìn)的藥代動力學(xué)性能、以及降低靜脈內(nèi)給予鼠抗體時(shí)觀察到的免疫原性。最初，為了耙向黑色素瘤細(xì)胞，我們選擇稱為scFvMEL的重組單鏈抗體，它能識別在大多數(shù)(80%)黑色素瘤細(xì)胞系和新鮮腫瘤樣品上發(fā)現(xiàn)的高分子量糖蛋白gp240(Kantor等，1982)。本發(fā)明者將其廣泛用于在體外靶向攜帶gp240的細(xì)胞和異種移植瘤模型(Rosenblum等，2003;Liu等，2003;Rosenblum等，1991;Rosenblum等1994;Rosenblum等，1995;Rosenblum等，1996;Rosenblum等，1999)。這種抗體能結(jié)合靶細(xì)胞并有效內(nèi)化，使其成為遞送毒素或其它治療荷載物的出色運(yùn)載體。在黑色素瘤患者中廣泛研究了作為靶向gp240抗原的scFvMEL母體抗體的稱為ZME-018或225.28S的抗體，顯示出在全身給藥后定位于轉(zhuǎn)移腫瘤的出色能力(Rosenblum等，1994;Kantor等，1986;Macey等，1988;Rosenblum等，1991)。這種抗體具有高黑色素瘤特異性，與各種正常組織的反應(yīng)性很小，這使其成為有希望進(jìn)一步研究的候選物(Rosenblum等，1995;Macey等，1988;Rosenblum等，1991;Mujoo等，1995)。更重要的是，正常細(xì)胞上不表達(dá)gp240抗原，因此使其成為治療介入的感興趣靶點(diǎn)。重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH和VL)的長度都約為110個(gè)氨基酸。它們可通過具有序列(SEQIDNO:3)3的15個(gè)氨基酸接頭連接，例如，該接頭具有足夠彈性以使這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組裝成功能性抗原結(jié)合口袋。在特定實(shí)施方式中，加入各種信號序列使得scFv可靶向細(xì)胞內(nèi)的不同細(xì)胞器，或被分泌。加入輕鏈恒定區(qū)(Ck)使其能夠通過二硫鍵二聚化，穩(wěn)定性和親合力提高。因此，對于單鏈Fv(scFv)SCA，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由不同基因編碼，但已經(jīng)證明可能制備合成接頭，使它們能夠通過重組方法制備成單獨(dú)蛋白鏈scFv(Bird等，1988;Huston等，1988)。而且，由于易于從噬菌體呈現(xiàn)文庫分離和能夠識別保守抗原，它們是常用的(綜述參見Adams和Schier，1999)。例如，通過逆轉(zhuǎn)錄載體呈現(xiàn)的抗-CEAscFv用scFv將自殺基因靶向表達(dá)癌胚抗原(CEA)的腫瘤細(xì)胞(Kuroki等，2000)。而且，抗體重鏈的Fc部分可用于靶向表達(dá)Fc受體的細(xì)胞，如采用IgE抗體的Fc部分靶向肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞。目前已經(jīng)批準(zhǔn)通過抗體定向治療或免疫定向治療采用抗體耙向感興趣的多肽或肽，已用于治療市場。Fab抗體片段可用于本發(fā)明。Fab片段包括輕鏈和由二硫鍵連接的重鏈的N末端部分。其分子量一般約為50kD，包括一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段可通過有限還原從F(ab')2片段獲得，或者在還原劑存在下用木瓜蛋白酶消化從完整抗體獲得。2.除抗體外的部分除抗體或抗體片段外的分子可用作細(xì)胞特異性耙向部分。由于在各種譜系的造血細(xì)胞中鑒定到大量細(xì)胞表面受體，這些受體特異性的配體或抗體可用作細(xì)胞特異性靶向部分。IL2可用作嵌合蛋白中的細(xì)胞特異性靶向部分，以靶向IL2R+細(xì)胞?；蛘撸捎闷渌肿尤鏐7-l、B7-2和CD40特異性靶向活化T細(xì)胞(《白細(xì)胞抗原手冊》(TheLeucocyteAntigenFactsBook)，1993，Barclay等(編)，AcademicPress)。而且，B細(xì)胞表達(dá)CD19、CD40和IL4受體可作為結(jié)合這些受體的部分，如CD40配體、IL4、IL5、IL6和CD28的靶點(diǎn)。清除免疫細(xì)胞如T細(xì)胞和B細(xì)胞在治療自身免疫病、超敏、移植排斥反應(yīng)和治療淋巴瘤中特別有用。自身免疫病的例子是多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴性糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病和葡萄膜炎(uviatis)。更具體說，由于已知髓磷脂堿性蛋白是多發(fā)性硬化中免疫細(xì)胞攻擊的主要靶點(diǎn)，所以此蛋白可用作治療多發(fā)性硬化的細(xì)胞特異性靶向部分(WO97/19179;Becker等，1997)。可用于耙向特定細(xì)胞亞組的其它細(xì)胞因子包括白介素(ILl-IL15)、粒細(xì)胞-集落刺激因子、巨噬細(xì)胞-集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白血病抑制因子、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子和/或成纖維細(xì)胞生長因子(Thompson(編)，1994，《細(xì)胞因子手冊》(TheCytokineHandbook),AcademicPress，SanDiego)。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，有各種已知的細(xì)胞因子，包括促紅細(xì)胞生成素(四螺旋束)(如Epo(紅細(xì)胞生成素)、IL-2(T細(xì)胞生長因子)、IL-3(多集落CSF)、IL-4(BCGF-1、BSF-1)、IL-5(BCGF-2)、IL-6、IL-4(IFN-(52、BSF-2、BCDF)、IL-7、IL-8、IL-9、IL-ll、IL-13(P600)、G-CSF、IL-15(T細(xì)胞生長因子)、GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、OSM(OM、制瘤素M)和LIF(白血病抑制因子))；干擾素(如IFN-y、IFN-a和IFN-p);免疫球蛋白超家族(如B7.1(CD80)和B7.2(B70、CD86));TNF家族(如TNF-a(惡病質(zhì)素)、TNF-(3(淋巴毒素、LT、LT-ot)、LT-p、CD40配體(CD40L)、Fas配體(FasL)、CD27配體(CD27L)、CD30配體(CD30L)和4-lBBL));和未分配到特定家族的細(xì)胞因子(如TGF-P、IL-la、IL-1(3、IL-1RA、IL-10(細(xì)胞因子合成抑制劑F)、IL-12(NK細(xì)胞刺激因子)、MIF、IL-16、IL-17(mCTLA-8)和/或IL-18(IGIF、干擾素-y誘導(dǎo)因子))。此外，某些細(xì)胞表面分子在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，包括激素受體如人絨毛膜促性腺素受體和促性腺素釋放激素受體(Nechushtan等，1997)。因此，相應(yīng)激素可用作癌癥治療的細(xì)胞特異性靶向部分?？捎米骷?xì)胞特異性靶向部分的激素例子包括例如蛋白質(zhì)、肽和修飾氨基酸、或類固醇。具體激素包括人絨毛膜促性腺素、促性腺素釋放激素、雄激素如睪酮、或雌激素如雌二醇。其它具體激素包括例如促甲狀腺激素、促卵泡激素、黃體生成素、促乳素、生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、催產(chǎn)素、促甲狀腺激素釋放激素、生長激素釋放激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、促生長素抑制素、多巴胺、褪黑激素、甲狀腺素、降鈣素、甲狀旁腺激素、糖皮質(zhì)激素類(如氫化可的松)、電解質(zhì)代謝皮質(zhì)激素(如醛固酮)、腎上腺素、去甲腎上腺素、孕酮、胰島素、胰高血糖素、糊精、促紅細(xì)胞生成素、骨化三醇、骨化醇、心房利鈉肽、胃泌素、促胰液素、膽囊收縮素、神經(jīng)肽Y、ghrdin、PYY3.36、胰島素樣生長因子-1、瘦激素、血小板生成素或血管緊張素原。此外，干擾素可用作(例如)細(xì)胞靶向部分。干擾素(IFN)屬于稱為細(xì)胞因子的一大類糖蛋白，并且是免疫系統(tǒng)細(xì)胞響應(yīng)于外來物質(zhì)(包括例如病毒、細(xì)菌、寄生物和腫瘤細(xì)胞)的刺激產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。人體中存在三種主要類型I型、II型和III型。I型IFN包括至少13種不同的a同種型IFNA(l、2、4、5、6、7、8、10、13、14、16、17、21);以及卩(IFNBl);co(IFNWl);s(IFNEl);和K(IFNK)同種型。II型IFN包括IFNy(IFNG)。第三類包括IFN-x,其具有至少3種不同同種型(IL29、IL28A和IL2犯)。而且，維生素可用作細(xì)胞靶向部分，包括例如葉酸、維生素D3、維生素K,、維生素E、和/或維生素A。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，嵌合多肽中沒有采用抗體。B.抗-細(xì)胞增殖部分本發(fā)明的組合物和方法利用具有抗-細(xì)胞增殖部分的嵌合分子，該抗-細(xì)胞增殖部分至少部分負(fù)責(zé)間接或直接損傷細(xì)胞增殖、破壞細(xì)胞增殖的能力、降低細(xì)胞增殖的速率和/或程度、使細(xì)胞休眠；使細(xì)胞不增殖；和/或殺傷、破壞和/或根除細(xì)胞。在特定實(shí)施方式中，細(xì)胞是癌細(xì)胞，可以或可以不是實(shí)體瘤中的癌細(xì)胞。在具體實(shí)施方式中，抗-細(xì)胞增殖部分包括一種或多種凋亡誘導(dǎo)部分或者一種或多種細(xì)胞毒部分。1.凋亡誘導(dǎo)部分治療癌癥的傳統(tǒng)化療方法通常依賴于通過抑制DNA復(fù)制或細(xì)胞分裂耙向快速增殖的細(xì)胞。雖然這種方案有效，但它固有的對腫瘤細(xì)胞缺乏選擇性導(dǎo)致效果降低，達(dá)到可接受毒性的限制。用各種抗癌劑處理的腫瘤中，凋亡也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Debatin，1999)。癌細(xì)胞對化療藥發(fā)生耐藥性與耐藥細(xì)胞中凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻斷有關(guān)(Serrone和Hersey，1999;Lin等，2003)。乳腺癌的轉(zhuǎn)移似乎也直接關(guān)系到凋亡通路。一些研究證明，高轉(zhuǎn)移潛能確實(shí)與凋亡耐受性增加相關(guān)(Lin等，2003;Bucci等，2001;Sierra等，2000;Lipponen，1999)。通過過度表達(dá)癌基因如bcl-2、生長因子或其受體抑制藥物誘導(dǎo)的凋亡(Wu等，2004;Botti等，2004;Abramovitch和Werner，2003;Rowinsky，2003)可能是癌轉(zhuǎn)移和固有的化療和放療耐受性的重要原因。近年來對乳腺癌患者的臨床研究(Martinez-Arribas等，2003)表明腫瘤凋亡、標(biāo)記指數(shù)(Ki-67)和患者對化療方案的反應(yīng)直接相關(guān)。該研究通過在ECF[6個(gè)表柔比星循環(huán)(50mg/m2，iv，第1天)，順鉑(50mg/m2，iv，第1天)和連續(xù)灌注5Fu(200mg/m2/24小時(shí))]術(shù)前化療前評價(jià)患有可手術(shù)的乳腺癌的患者組織中的凋亡指數(shù)(AI)、Ki67和Bcl-2蛋白表達(dá)，評價(jià)化療前和完成治療時(shí)殘留的耐藥細(xì)胞群中的人乳腺腫瘤中凋亡與增殖及Bcl-2蛋白的體內(nèi)關(guān)系。在化療前和化療后，AI和Ki67之間顯著正相關(guān)。與預(yù)處理活檢樣品相比，在一些殘留樣品中AI和Ki67顯著降低，而Bcl-2表達(dá)顯示顯著增加。這些數(shù)據(jù)提示，體內(nèi)的凋亡和增殖緊密相關(guān)。凋亡減少和Bcl-2增加的表型可能與耐受細(xì)胞毒性化療的乳腺癌細(xì)胞有關(guān)(Ellis等，1998)。幾項(xiàng)研究提示，對化療的反應(yīng)和凋亡通路的活化直接相關(guān)(Park等，2004;Archer等，2003;Simoes-Wust等，2002;Serrano等，2002)?；熌褪苄运坪醭３０殡S著乳腺癌從激素依賴性、非轉(zhuǎn)移性、抗雌激素-敏感性表型到激素-非依賴性、侵襲性、轉(zhuǎn)移性、抗雌激素-耐受性表型(CampbeI等，2001)的發(fā)展。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及將作為此作用核心介導(dǎo)物的某些促調(diào)亡蛋白遞送至耙細(xì)胞內(nèi)部，這會導(dǎo)致細(xì)胞通過凋亡機(jī)制死亡。遞送的嵌合多肽通過細(xì)胞特異性靶向部分結(jié)合于靶細(xì)胞，進(jìn)入嵌合多肽的靶細(xì)胞后，凋亡誘導(dǎo)部分誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。任何合適的促調(diào)亡部分均可用于本發(fā)明。促調(diào)亡部分包括粒酶，如粒酶A或粒酶B，或Bcl-2家族成員。BCL2家族的促調(diào)亡蛋白也可用作本發(fā)明的凋亡誘導(dǎo)部分。預(yù)計(jì)這種人蛋白的免疫原性低于由細(xì)菌毒素組成的許多免疫毒素。雖然在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，Bax是有用的凋亡誘導(dǎo)部分，但本家族其它成員也適用于本發(fā)明，包括Bak(Farrow等，1995;Chittenden等，1995;Kiefer等，1995)、Bcl-Xs(Boise等，1993;Fang等，1994)、Bad(Yang等，1995)、Bid(Wang等，1996)、Bik(Boyd等，1995)、Hrk(Inohara等，1997)和/或Bok(Hsu等，1997)。本領(lǐng)域已知編碼這些蛋白質(zhì)的核苷酸序列，不難從數(shù)據(jù)庫如GenBank獲得這些序列，因此不難獲得cDNA克隆，以與細(xì)胞特異性靶向部分的編碼序列融合于表達(dá)載體中。研究了Bcl-2家族具體成員的特定結(jié)構(gòu)域的凋亡誘導(dǎo)活性。例如，Bak的GD結(jié)構(gòu)域參與了凋亡功能(美國專利號5,656,725)。此外，Bax和Bipla共享同源性結(jié)構(gòu)域。因此，Bcl-2家族的任何生物活性結(jié)構(gòu)域均可用作實(shí)施本發(fā)明的凋亡誘導(dǎo)部分。胱冬酶也在凋亡中起到核心作用，可能占據(jù)凋亡的共有核心機(jī)制的一部分。胱冬酶被認(rèn)為是凋亡介導(dǎo)物。由于認(rèn)識到一種發(fā)育細(xì)胞死亡所需的蛋白CED-3與哺乳動物半胱氨酸蛋白酶白介素-ip-轉(zhuǎn)變酶(ICE)有序列相同性，鑒定了至少IO種相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶的家族。這些蛋白質(zhì)的特征是在P1位置上對天冬氨酸幾乎完全特異。所有胱冬酶(ICE-樣蛋白酶)都含有保守的QACKG(其中X是R、Z或G)五肽活性位點(diǎn)基序。胱冬酶合成為含有N末端肽(Prodomain)以及一個(gè)大亞基和一個(gè)小亞基的失活酶原。胱冬酶-1和胱冬酶-3的晶體結(jié)構(gòu)顯示，活性酶是異四聚體，含有兩個(gè)小亞基和兩個(gè)大亞基。在凋亡期間激活胱冬酶導(dǎo)致切割重要的細(xì)胞底物，包括聚(ADP-核糖)聚合酶和核纖層蛋白，從而促成顯著的凋亡形態(tài)改變(Cohen，1997，Biochem.J.326:1-16)。因此，將胱冬酶用作凋亡誘導(dǎo)部分也屬于本發(fā)明范圍。近年來，克隆了幾種新型蛋白質(zhì)，并鑒定為介導(dǎo)參與凋亡通路的蛋白質(zhì)，主要是胱冬酶的活性所需的因子。一種因子被確定為之前已知的電子轉(zhuǎn)移蛋白細(xì)胞色素c(Lin等，1996，Cell86:147-157)，稱為Apaf-2。除細(xì)胞色素c以外，激活胱冬酶-3需要兩種其它胞漿因子-Apaf-l和Apaf-3。Apaf-l是與秀麗新小桿線蟲CED-4同源的蛋白質(zhì)，Apaf-3被確定為胱冬酶家族成員胱冬酶-9。在細(xì)胞色素c存在下，這兩種因子通過其各自的NH2-末端CED-3同源結(jié)構(gòu)域互相結(jié)合，此事件導(dǎo)致胱冬酶-9活化。活化的胱冬酶-9進(jìn)而切割并活化胱冬酶-3(Liu等，1996;Zou等，1997;Li等，1997)。參與凋亡通路的另一種蛋白是DNA片段化因子(DFF)，它是45和40kd亞基的異源二聚體，在胱冬酶-3下游起到引發(fā)基因組DNA片段化成核小體節(jié)段的作用(Liu等，1997)。2.細(xì)胞毒劑用于本發(fā)明的其它形式的抗-細(xì)胞增殖部分包括一種或多種細(xì)胞毒劑，也可稱為細(xì)胞毒素。細(xì)胞毒劑與細(xì)胞靶向部分一起用于本發(fā)明組合物和方法，在具體實(shí)施方式中，細(xì)胞毒劑是嵌合分子中主要負(fù)責(zé)殺傷一種或多種細(xì)胞如一種或多種癌細(xì)胞和/或降低其增殖的組分。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，細(xì)胞毒劑是能夠阻滯、抑制、阻抑(等)細(xì)胞活性和/或細(xì)胞的繁殖能力的細(xì)胞生長抑制劑。任何有用的細(xì)胞毒劑均可用于嵌合分子，直接細(xì)胞毒性酶的主要類型包括例如核糖體抑制蛋白類(RIP);假單胞菌外毒素(PE);強(qiáng)效植物n-糖苷酶白樹毒素(可能是重組毒素(rGel));和TTS(F-a。已經(jīng)成功利用毒素如假單胞菌外毒素(PE)和白樹毒素(rGd)，因?yàn)閮H需少數(shù)分子就能對耙細(xì)胞發(fā)生不可挽回的毒性作用(Rosenblum等，2003;Veenendaal等，2002)。近年來，Newton等描述了含有人RNA酶的一類新型免疫偶聯(lián)物，它主要通過降解RNA具有抵抗人腫瘤細(xì)胞系和異種移植瘤的體外和體內(nèi)細(xì)胞毒活性(Newton等，2001)。細(xì)胞毒劑的其它實(shí)施方式包括腎毒素、神經(jīng)毒素、腸毒素、艱難梭菌(C/ay/^fe^4^"7e)毒素B、幽門螺桿菌(/^//(:0^"^;;;/0"/;^&0八、小腸結(jié)腸炎耳|5爾森菌(J^〖m'flfe她raco欣ca)YopT。雖然在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明細(xì)胞毒劑是TNF-a，但在其它實(shí)施方式中，該嵌合分子包括通過壞死而非凋亡過程殺傷細(xì)胞的rGd融合構(gòu)建物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，將重組細(xì)胞毒劑用于該嵌合分子。它們可稱為"設(shè)計(jì)者毒素"。這些重組細(xì)胞毒劑可能改變了天然序列，如通過相對于天然蛋白質(zhì)序列取代或去除氨基酸。重組細(xì)胞毒劑可包括完整序列或部分序列，所述部分序列可與異源序列相連。如以全文納入本文作參考的美國專利申請序列號10/074596所述，重組白樹毒素可能改變了天然白樹毒素序列。重組白樹毒素或本發(fā)明不具有天然白樹毒素的所有氨基酸，但在一些實(shí)施方式中，包括核心毒素區(qū)，限定為其中具體序列的氨基酸殘基110-210。僅作為示范性實(shí)施方式，本發(fā)明重組白樹毒素可包括截短了天然序列的白樹毒素，該毒素缺少至少5、10、20、30、40、50或更多個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，該毒素含有核心毒素區(qū)，但可缺失核心毒素區(qū)以外任何地方的氨基酸。除缺失以外，本發(fā)明重組白樹毒素可用氨基酸替代去除的氨基酸。例如，可用非甘氨酸氨基酸殘基或修飾氨基酸取代白樹毒素蛋白序列中7位上的甘氨酸殘基。如果僅僅去除7位的甘氨酸殘基，SEQIDNO:1中8位的丙氨酸變成7位，但不認(rèn)為發(fā)生取代，因?yàn)榘被嵛恢脙H移動了1位?？紤]到該細(xì)胞毒劑的示范性白樹毒素實(shí)施方式中可取代至少l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個(gè)氨基酸。VI.嵌合分子的產(chǎn)生可用本領(lǐng)域的任何合適方式產(chǎn)生本發(fā)明嵌合分子，但在具體實(shí)施方式中，嵌合分子是作為融合多肽形式產(chǎn)生的或通過接頭化學(xué)偶聯(lián)的。A.用接頭獲得的嵌合化學(xué)偶聯(lián)物/嵌合偶聯(lián)物在通過偶聯(lián)，如化學(xué)偶聯(lián)或接頭產(chǎn)生嵌合分子的實(shí)施方式中，提供或獲得單一組分，然后通過化學(xué)偶聯(lián)或連接方法相連。例如，嵌合分子組分可通過可經(jīng)生物方法釋放的鍵，如選擇性切割的接頭或氨基酸序列連接。例如，考慮了包括優(yōu)選位于腫瘤環(huán)境中或在腫瘤環(huán)境中有活性的酶的切割位點(diǎn)的肽接頭。這種肽接頭的示范形式是由尿激酶、纖溶酶、凝血酶、凝血因子IXa、凝血因子Xa或金屬蛋白酶，如膠原酶、明膠酶或溶基質(zhì)素切割的接頭?；蛘撸幕蚨嚯目膳c佐劑聯(lián)用。氨基酸如選擇性切割接頭、合成接頭或其它氨基酸序列可用于分隔蛋白質(zhì)部分。此外，雖然已知許多類型含二硫鍵的接頭可成功用于偶聯(lián)毒素部分與靶向劑，但根據(jù)不同藥理特征和能力，通常偏好某些接頭。例如，優(yōu)選含有空間"位阻"的二硫鍵的接頭，因?yàn)樗鼈兊捏w內(nèi)穩(wěn)定性更好，從而防止在結(jié)合于作用位點(diǎn)之前釋放毒素部分。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它連接/偶聯(lián)劑和/或機(jī)制可用于組合本發(fā)明組分，例如抗體-抗原相互作用、親和素-生物素連接、酰胺連接、酯連接、硫酯連接、醚連接、硫醚連接、磷酸酯連接、磷酸酰胺連接、酸酐連接、二硫鍵連接、離子和疏水作用、雙特異性抗體和抗體片段、或其組合?？紤]采用在血液中具有合理穩(wěn)定性的交叉接頭。已知許多類型含有二硫鍵的接頭可成功用于偶聯(lián)靶向劑和治療/預(yù)防劑。含有空間位阻的二硫鍵的接頭可提供更高的體內(nèi)穩(wěn)定性，防止在達(dá)到作用位點(diǎn)之前釋放靶向肽。因此，這些接頭是一類連接劑。另一種交聯(lián)試劑是SMPT，它是含有與相鄰苯環(huán)和甲基形成"空間位阻"的二硫鍵的雙功能交叉接頭。相信二硫鍵的空間位阻具有保護(hù)該鍵免受組織和血液中可能存在的硫醇陰離子如谷胱甘肽的攻擊的功能，從而有助于防止偶聯(lián)物在將連接物遞送至靶位點(diǎn)之前解離。如同許多其它已知的交聯(lián)試劑，SMPT交聯(lián)試劑將該能力賦予交聯(lián)官能團(tuán)，如半胱氨酸或伯胺(如賴氨酸的s氨基)的SH。交聯(lián)蛋白的另一種可能類型包括異源雙功能光反應(yīng)性苯基疊氮，其含有可切割的二硫鍵如磺基琥珀酰亞胺基-2-(對疊氮基水楊酰氨基)乙基-l,3'-二硫代丙酸酯。N-羥基-琥珀酰亞胺基與伯氨基反應(yīng)，苯基疊氮(光解時(shí))與任何氨基酸殘基發(fā)生非選擇性反應(yīng)。除位阻交聯(lián)劑外，本發(fā)明也可采用非位阻接頭。不認(rèn)為含有或產(chǎn)生保護(hù)的二硫鍵的其它有用交聯(lián)劑包括SATA、SPDP和2-亞氨基四氫噻吩(Wawrzynczak和Thorpe，1987)。本領(lǐng)域熟知這種交聯(lián)劑的使用。另一實(shí)施方式包括使用彈性接頭。美國專利4,680,338描述了可用于產(chǎn)生配體與含胺聚合物和/或蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物，尤其是與螯合劑、藥物、酶、可檢測標(biāo)記等形成抗體偶聯(lián)物的雙功能接頭。美國專利5,141,648和5,563,250公開了含有可在各種溫和條件下切割的不穩(wěn)定鍵的可切割偶聯(lián)物。此接頭尤其有用，因?yàn)檫@種感興趣物質(zhì)可直接與接頭鍵合，而切割導(dǎo)致活性物質(zhì)的釋放。優(yōu)選應(yīng)用包括將游離氨基或游離巰基加到蛋白質(zhì)如抗體或藥物上。美國專利5,856,456提供了用于連接多肽組分以制備融合蛋白(如單鏈抗體)的肽接頭。該接頭的長度至多約為50個(gè)氨基酸，含有至少一個(gè)帶電氨基酸(優(yōu)選精氨酸或賴氨酸)，后接脯氨酸，其特征是穩(wěn)定性較高和聚集降低。美國專利5,880,270公開了用于各種免疫診斷和分離技術(shù)的含氨氧基的接頭。B.嵌合的融合分子在嵌合分子包含融合蛋白的實(shí)施方式中，可用編碼嵌合蛋白、突變多肽、嵌合蛋白的生物活性片段或其功能等價(jià)物的多核苷酸產(chǎn)生在合適宿主細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)嵌合蛋白、嵌合肽片段或其功能等價(jià)物的重組DNA分子。由于遺傳密碼的固有簡并性，編碼基本相同或功能等價(jià)的氨基酸序列的其它DNA序列也可用于實(shí)施本發(fā)明，以克隆和表達(dá)嵌合蛋白。這種DNA序列包括能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交于嵌合序列或其互補(bǔ)序列的DNA序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本文所用術(shù)語"嚴(yán)謹(jǐn)條件"指以下雜交條件(l)洗滌中采用低離子強(qiáng)度和高溫，例如0.015MNaC1/0.0015M檸檬酸鈉/0.1。/。SDS和50。C;(2)在雜交期間采用變性劑如甲酰胺，例如50%(vol/vol)甲酰胺與0.1%牛血清白蛋白/0.1。/。Ficoll/0.1。/。聚乙烯吡咯烷酮/50mMpH6.5的磷酸鈉緩沖液，以及750mMNaCl，75mM檸檬酸鈉，42°C;或(3)采用50%甲酰胺，5xSSC(0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉，5xDenhardt溶液，超聲處理的鮭精DNA(50pg/ml)，0.1%SDS和10%硫酸右旋糖苷，42°C，42。C用0.2xSSC和0.1。/。SDS洗滌?？捎糜诒景l(fā)明的DNA序列改變包括缺失、加入或取代不同核苷酸殘基，產(chǎn)生編碼相同或功能等價(jià)的融合基因產(chǎn)物的序列?；虍a(chǎn)物本身的嵌合序列內(nèi)可含有產(chǎn)生沉默改變的氨基酸殘基的缺失、加入或取代，從而產(chǎn)生功能等價(jià)的嵌合蛋白?？筛鶕?jù)所用殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性的相似程度作出這種氨基酸取代。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸、組氨酸和精氨酸；親水性值相似、具有不帶電極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸；具有非極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸?？晒こ谈脑毂景l(fā)明DNA序列，以便因各種目的改變嵌合編碼序列，包括但不限于修飾基因產(chǎn)物的加工和表達(dá)的改變。例如，可用本領(lǐng)域熟知技術(shù)如定位誘變引入突變，以插入新限制性位點(diǎn)、改變糖基化模式、磷酸化等。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法整個(gè)或部分合成嵌合蛋白的編碼序列。(參見例如，Camthers等，1980;Crea和Hom，1980;和Chow和Kempe，1981)。例如，可用固相技術(shù)合成某部分的活性結(jié)構(gòu)域，從樹脂上切割，用制備型高效液相層析純化，然后化學(xué)連接形成嵌合蛋白。(參見例如Creighton，1983，《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理》(ProteinsStructuresandMolecularPrinciples),W.H.Freeman和Co.，紐約，第50-60頁)。可用氨基酸分析或測序(如Edman降解法；參見Creighton，1983，《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理》(Proteins,StructuresandMolecularPrinciples),W.H.Freeman和Co.，紐約，第34-49頁)確認(rèn)合成肽的組成?；蛘?，可按照本領(lǐng)域熟知方法用化學(xué)接頭將合成或重組方法產(chǎn)生的嵌合蛋白的兩部分偶聯(lián)(Brinkmann和Pastan，1994)。為了表達(dá)有生物學(xué)活性的嵌合蛋白，將編碼嵌合蛋白或功能等價(jià)物的核苷酸序列插入合適表達(dá)載體中，即含有轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的編碼序列所需元件的載體。嵌合基因產(chǎn)物以及用重組嵌合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系可用于各種目的。這些目的包括但不限于產(chǎn)生結(jié)合于蛋白質(zhì)表位以有利于其純化的抗體(即單克隆或多克隆抗體)?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法構(gòu)建含有嵌合蛋白編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳重組。參見例如，以下文獻(xiàn)所述技術(shù)Sambrook等，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(MolecularCloningALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,紐約和Ausubel等，1989，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，紐約?？衫酶鞣N宿主表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)嵌合蛋白編碼序列。這些載體包括但不限于微生物如用含有嵌合蛋白編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用含有嵌合蛋白編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用含有嵌合蛋白編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)感染或用含有嵌合蛋白編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動物細(xì)胞系統(tǒng)。應(yīng)注意到，由于大多數(shù)凋亡誘導(dǎo)蛋白引起哺乳動物細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡，本發(fā)明嵌合蛋白優(yōu)選在原核或低等真核細(xì)胞中表達(dá)。各系統(tǒng)表達(dá)元件的能力和特異性各異。根據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，許多轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動子均可用于該表達(dá)載體。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可采用誘導(dǎo)型啟動子如噬菌體X的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜交啟動子；巨細(xì)胞病毒啟動子)等；在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可采用諸如桿狀病毒多角體蛋白啟動子等啟動子；在植物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可采用衍生自植物細(xì)胞基因組的啟動子(如熱休克啟動子；RUBISCO小亞基的啟動子；葉綠素ct/p結(jié)合蛋白的啟動子)或衍生自植物病毒的啟動子(如CaMV的35SRNA啟動子；TMV的外被蛋白啟動子)；在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可釆用衍生自哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(如金屬硫蛋白啟動子)或衍生自哺乳動物病毒的啟動子(如腺病毒晚期啟動子；痘病毒7.5K啟動子)；產(chǎn)生含有多個(gè)拷貝的嵌合DNA的細(xì)胞系時(shí)，可將SV40-、BPV-和EBV-載體與合適的選擇性標(biāo)記一起使用。在細(xì)菌系統(tǒng)中，宜根據(jù)所表達(dá)嵌合蛋白的預(yù)定用途選擇許多表達(dá)載體。例如，產(chǎn)生大量嵌合蛋白時(shí)，可能需要指導(dǎo)容易純化的高水平蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)的載體。這種載體包括但不限于pHL906載體(Fishman等，1994);大腸桿菌(五.co/Z)表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983)，其中可將嵌合蛋白編碼序列連接入載體中，與lacZ編碼區(qū)位于同一閱讀框內(nèi)，以產(chǎn)生雜交AS-lacZ蛋白；pIN載體(Inouye禾口Inouye，1989;VanHeeke和Schuster,1989)等?？捎糜诒磉_(dá)嵌合蛋白的另一表達(dá)系統(tǒng)是昆蟲系統(tǒng)。在一個(gè)昆蟲系統(tǒng)中，用苜蓿夜蛾G4wtogra—acfl^/bm/ca)核型多角體病毒(AcNPV)作為載體表達(dá)外來基因。該病毒在草地夜蛾OS^^c^era/n^^eWfl)細(xì)胞中生長?？蓪⑶逗系鞍拙幋a序列克隆入該病毒的非必需區(qū)(如多角體蛋白基因)，并置于AcNPV啟動子(如多角體蛋白啟動子)的控制下。成功插入嵌合蛋白編碼序列會導(dǎo)致多角體蛋白基因失活和產(chǎn)生非包含體重組病毒(即缺少多角體蛋白基因編碼的蛋白性外被膜的病毒)。然后用這些重組病毒感染草地夜蛾細(xì)胞，在其中表達(dá)插入的基因。(參見例如Smith等，1983;美國專利號4,215，051)。有效翻譯插入的嵌合蛋白編碼序列也可能需要特定起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。在將整個(gè)嵌合基因，包括其自身起始密碼子和相鄰序列都插入合適表達(dá)載體的情況下，不需要其它翻譯控制信號。然而，在該嵌合蛋白編碼序列不包括其自身起始密碼子的情況下，必須提供外源性翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。而且，起始密碼子必須與嵌合蛋白編碼序列的閱讀框同相，以保證翻譯整個(gè)插入物。這些外源性翻譯控制信號和起始密碼子可以來自各種來源，可以是天然和合成的?？赏ㄟ^包括合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等提高表達(dá)效率。(參見Bittner等，1987)。此外，可選擇調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)、或以所需特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞系。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這種修飾(如糖基化)和加工(如切割)可能對蛋白質(zhì)功能很重要。嵌合蛋白中存在共有N-糖基化位點(diǎn)可能需要適當(dāng)修飾，以改進(jìn)嵌合蛋白功能。不同宿主細(xì)胞對蛋白質(zhì)的翻譯后加工和修飾有特征性和特定的機(jī)制?？蛇x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以保證正確修飾和加工嵌合蛋白。因此，可采用具有能適當(dāng)加工原始轉(zhuǎn)錄物、糖基化和磷酸化嵌合蛋白的細(xì)胞機(jī)器的真核宿主細(xì)胞。這種哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、W138等。就長期、高產(chǎn)率產(chǎn)生重組嵌合蛋白而言，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。例如，可工程改造穩(wěn)定表達(dá)嵌合蛋白的細(xì)胞系。與其采用含有病毒復(fù)制來源的表達(dá)載體，不如用合適的表達(dá)控制元件(如啟動子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的嵌合編碼序列和選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。引入外來DNA后，可使工程改造細(xì)胞在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長1-2天，然后將其轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。該重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記對選擇力產(chǎn)生抗性，允許細(xì)胞將該質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到其染色體中，并生長形成細(xì)胞灶，進(jìn)而可克隆和擴(kuò)增成細(xì)胞系?？刹捎迷S多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalski和Szybalski，1962)和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980)基因可分別用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞。同時(shí)，抗代謝劑抗性可用作dhfr、gpt、neo和hygro的選擇基礎(chǔ)，dhfr產(chǎn)生甲氨蝶呤抗性(Wigler等，1980;O，Hare等，19S1);gpt產(chǎn)生霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981);neo產(chǎn)生氨基糖苷G-418抗性(Colbere-Garapin等，1981);hygro產(chǎn)生潮霉素抗性(Santerre等，1984)基因。已經(jīng)描述了其它選擇性基因，即允許細(xì)胞用吲哚替代色氨酸的trpB;允許細(xì)胞用組胺醇替代組氨酸的hisD(Hartman和Mulligan,1988);和對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸(DFMO)產(chǎn)生抗性的ODC(鳥氨酸脫羧酶)(McConlogueL，1987，《新編分子生物學(xué)通訊》(CurrentCommunicationsinMolecularBiology)，ColdSpringHarborLaboratory編)。VII.突變蛋白在具體實(shí)施方式中，改變的分子，如改變的TNF分子，包括改變的TNF-ot分子可用于本發(fā)明嵌合分子。其它分子可用作突變蛋白，本文對TNF的描述僅為示范性實(shí)施方式。改變的TNF分子可被進(jìn)一步限定為TNF突變體，它可被進(jìn)一步限定為TNF突變蛋白。TNF突變蛋白包括具有一個(gè)或多個(gè)突變的TNF分子，其中該TNF分子保留了TNF功能，在具體實(shí)施方式中指對癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性。在特定實(shí)施方式中，與野生型TNF相比，TNF突變蛋白的活性基本相同或更高，例如在抗癌活性和低毒方面。這種改變可能影響TNF與p75-TNF-受體和/或p55-TNF-受體的結(jié)合親和力。在本發(fā)明實(shí)施方式中，取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在具體實(shí)施方式中用天然產(chǎn)生的氨基酸取代，以改變突變蛋白。一個(gè)或多個(gè)突變可以位于(例如)N-末端和/或C-末端。突變可以是(例如)點(diǎn)突變、移碼突變、缺失、倒位或剪接突變。突變可以發(fā)生在TNF的特定區(qū)域，如TNF的功能域。在特定實(shí)施方式中，突變位于三聚化結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO:4(GenBank登錄號AAA61200)提供了準(zhǔn)備改變?yōu)門NF突變蛋白的示范性TNF分子?？筛鶕?jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和分子建模方法設(shè)計(jì)TNF突變蛋白。TNF突變蛋白的具體例子包括例如以全文納入本文作參考的美國專利5,773,582;美國專利5,422,104;美國專利5,247,070;美國專利5,606,023;美國專利5,652,353;美國專利4,677,064;美國專利5,519,119;和美國專利5,652,353鑒定的突變蛋白。vni.多肽純化可用本領(lǐng)域合適技術(shù)如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析等純化本發(fā)明嵌合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，用于純化具體蛋白質(zhì)的實(shí)際條件將部分取決于以下因素，例如凈電荷、疏水性、親水性等。在親和層析純化中，可采用特異性結(jié)合該蛋白的任何抗體。在抗體產(chǎn)生中，可通過注射嵌合蛋白或其片段免疫各種宿主動物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。蛋白質(zhì)可通過側(cè)鏈官能團(tuán)或連接于側(cè)鏈官能團(tuán)的接頭連接于合適的運(yùn)載體，如牛血清白蛋白(BSA)?？筛鶕?jù)宿主種類采用各種佐劑來提高免疫應(yīng)答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、無機(jī)凝膠如氫氧化鋁、表面活性劑如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔槭血藍(lán)蛋白、二硝基酚和可能有用的人佐劑如BCG(桿菌Calmetter-Guerin)禾口短小棒狀桿菌(Co7"e6acfen'wm/a/-vwm)?？捎媚軌蛲ㄟ^培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)制備嵌合蛋白的單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限于最初由Koehler和Milstein(1975)描述的雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1983;Cote等，1983)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985)。此外，可采用通過將抗原特異性合適的小鼠抗體分子的基因與生物學(xué)活性合適的人抗體分子的基因剪接在一起產(chǎn)生"嵌合抗體"(Morrison等，1984;Neuberger等，1984;Takeda等，1985)的技術(shù)?；蛘撸墒巩a(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利號4，946,778)適應(yīng)于產(chǎn)生嵌合蛋白-特異性單鏈抗體，用于嵌合蛋白的純化和檢測。IX.多肽產(chǎn)生在本發(fā)明的具體方面，產(chǎn)生多肽形式的嵌合分子，在具體方面，多肽是蛋白質(zhì)。可認(rèn)為該多肽是通過(例如)下述示范性方法產(chǎn)生的。大規(guī)模生產(chǎn)本發(fā)明嵌合多肽的方法將有助于它的產(chǎn)生和應(yīng)用，如癌癥治療。在具體方面，可采用以下試劑平衡(EQ)緩沖液(20mMTris，pH8.0，200mMNaCl);和洗脫緩沖液(20mMTris，pH8.0，500mMNaCl，300mM咪唑)。除非另有說明，所有緩沖液都可儲存于4-8"C，以利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定。除非另有說明，所有操作都在4-8"C進(jìn)行，以利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定。A.分批發(fā)酵的小規(guī)模分析可將以下方法用于分批發(fā)酵的小規(guī)模分析用10mlOD6(K)-10的細(xì)胞進(jìn)行分析。離心獲得細(xì)胞并棄去上清液。將細(xì)胞重懸于4mlEQ緩沖液。超聲裂解，3X20秒，2分鐘間隔。在微量離心管中離心，15分鐘，14,000rpm。小心地去除3.2ml上清液并轉(zhuǎn)移到新試管中。檢查pH，以保證其pH約為8.0加入100^用氯化鈷螯合的金屬親和樹脂室溫培育15分鐘；旋轉(zhuǎn)以使樹脂保持懸浮。將懸浮液轉(zhuǎn)移到10ml柱(Bio-Rad，#731隱1550)上，收集流出物。加入650pl洗脫緩沖液，用新的eppendorf管收集洗脫液。將20nl等份在10%SDS-PAGE凝膠上跑電泳估計(jì)產(chǎn)率并外推獲得預(yù)計(jì)分批產(chǎn)率。B.嵌合分子的大規(guī)模純化可采用以下方法進(jìn)行嵌合分子的大規(guī)模純化。1.細(xì)菌裂解和回收1.將細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)懸液(約100g濕重細(xì)菌糊狀物)解凍。用EQ緩沖液將終體積調(diào)整為1L。2.將細(xì)胞培養(yǎng)懸液等分到5x250ml離心管中，每管200ml。3.超聲處理各離心管中的細(xì)胞懸液，每次1分鐘，處理5次，各處理之間在冰上中止10分鐘。4.4°C40,000rpm離心該細(xì)胞提取物1小時(shí)。5.將上清液小心地轉(zhuǎn)移到1L量筒或燒杯中。注意上清液可于4t:儲存過夜。對于長期儲存，則在-2(TC儲存，解凍后，在進(jìn)行下一步驟之前如上所述離心上清液。6.用0.45pm濾器去除裂解物中的顆粒物質(zhì)，然后上柱。2.細(xì)菌裂解物的純化過程I)為純化嵌合多肽準(zhǔn)備固定金屬親和層析(IMAC)柱(柱尺寸寬2.5cm;高20cm(Bio-Rad，#737-2521);柱床高8cm;柱床容積40ml)7.制備40ml柱床容積的螯合瓊脂糖快流樹脂(AmershamPharmaciaBiotech)柱。將柱流速調(diào)整到4ml/分鐘，用蒸餾水平衡。8.用至少2個(gè)柱體積(CV)的蒸餾水洗滌該柱。9.加入約0.5CV的氯化鈷溶液(0.2M的蒸餾水溶液)。10.用至少5CV的蒸餾水洗滌該柱以去除過量金屬離子。11.用至少5CV乙酸鈉溶液(0.02M乙酸鈉，0.5MNaCl，pH3.0)繼續(xù)洗滌該柱，或者洗滌到流出液pH達(dá)到3.0為止(通常約1CV)。這將洗脫結(jié)合松散的離子，否則它們可能在實(shí)際層析步驟的吸附/解吸階段泄漏。12.用5CVEQ緩沖液平衡該柱。13.使裂解物通過該柱并收集流出物。14.用2CVEQ緩沖液洗滌該柱。15.用3CV20mMTris，pH8.0，0.5MNaCl洗滌該柱。16.用3CV20mMTris，pH8.0，200mMNaCl，20mM咪唑洗滌該柱。收集15ml組分。17.用5CV20mMTris，pH8.0，0.5MNaCl，300mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。收集15ml組分。18.將各組分在10。/。SDS-PAGE凝膠(各組分20iil)跑電泳。蛋白質(zhì)分子量為62kDa(單體)。II)聚組氨酸尾的消化19.收集含有嵌合多肽的組分，通過過夜?jié)B析用"rEK緩沖液"(20mMTris，pH8，150mMNaCl)進(jìn)行緩沖液交換。20.將滲析液離心過夜以去除沉淀。用SDS-PAGE凝膠分析樣品，估計(jì)總嵌合多肽。21.通過每毫克嵌合多肽加入4單位重組腸激酶(rEK，Novagen)去除硫氧還蛋白/聚組氨酸尾，室溫消化過夜。22.取出20pl等份進(jìn)行消化效率的電泳分析。23.通過過夜?jié)B析用0.5xPBS對消化的嵌合多肽進(jìn)行緩沖液交換。III)用離子交換層析和藍(lán)瓊脂糖進(jìn)行蛋白質(zhì)純化(柱尺寸寬1.5cm;高15cm(Bio-Rad，#737-1516);柱床高6cm;柱床容積10ml)24.制備10ml柱床容積的藍(lán)瓊脂糖6快流樹脂(AmershamPharmaciaBiotech)柱。將柱流速調(diào)整到5ml/分鐘。25.用10CV10mMNa2HPO4，pH7.2("磷酸鹽緩沖液")洗滌該柱。26.用3CVPBS/2MNaCl洗滌該柱。27.用IOCV磷酸鹽緩沖液洗滌該柱。28.將透析的蛋白質(zhì)樣品離心過夜以去除沉淀。用磷酸鹽緩沖液1:1稀釋該蛋白質(zhì)樣品，以使[NaCl]為35mM。29.使蛋白質(zhì)樣品通過藍(lán)瓊脂糖柱并收集流出物。將流出物重新加到柱上。30.用5CV磷酸鹽緩沖液洗滌該柱。31.用6CVPBS/150mMNaCl洗滌該柱。收集6ml組分。32.用9CVPBS/2MNaCl洗脫VEGF121/rGd。收集6ml組分。33.取出10pl等份進(jìn)行電泳分析。VEGF121/rGel分子量為43kDa(單體)。34.收集含有VEGF121/rGel的組分，通過過夜?jié)B析用PBS進(jìn)行緩沖液交換。IV)去除內(nèi)毒素(柱尺寸寬1.5cm;高15cm;柱床高3cm;柱床容積5ml)35.制備5ml柱床容積的脫毒-凝膠(Detoxi-Gel)內(nèi)毒素去除凝膠(Pierce)。借助重力維持柱流。按照生產(chǎn)商說明書制備和使用Endo-Gel(步驟30-32)36.用5CVl。/。脫氧膽酸鈉洗滌該柱。37.用3-5CV無熱原水洗滌該柱38.用5CVPBS洗滌該柱39.使嵌合多肽通過該柱并收集流出物。用3mlPBS洗滌該柱；將此洗脫液(含有嵌合多肽)與流出物合并。40.用鱟變形細(xì)胞裂解物試驗(yàn)(Cambrex)確定內(nèi)毒素水平41.重復(fù)步驟30-33以再生該柱，并去除結(jié)合的內(nèi)毒素，直到內(nèi)毒素水平低于0.65EU/mg。V)緩沖液交換和濃縮42.將緩沖液交換成無菌DPBS(pH7.4)43.將嵌合分子濃縮至1mg/ml。44.評價(jià)其它釋放說明45.用0.22(im濾膜無菌過濾并將蛋白質(zhì)儲存于-2(TC(優(yōu)選用軟袋)。在此示范性方法之后和/或期間，可以監(jiān)測純度和產(chǎn)率，如％純度和/或％產(chǎn)率?？蓪Σ煌M分進(jìn)行電泳以幫助監(jiān)測。C.嵌合多肽在示范性大腸桿菌中的給料分批發(fā)酵在另一實(shí)施方式中，可采用以下載體和大腸桿菌的給料分批發(fā)酵方法來產(chǎn)生重組融合蛋白。在特定實(shí)施方式中，采用(例如)pET載體和大腸桿菌AD494(DE3)pLysS-宿主系統(tǒng)。AD494菌株是K-12衍生的硫氧還蛋白還原酶(^^)突變體，它能在胞質(zhì)中形成二硫鍵?？稍诳敲顾厣线x擇突變；因此，推薦將此菌株與攜帶氨芐青霉素抗性標(biāo)記Wa的質(zhì)粒一起使用。pLysS包含編碼T7溶菌酶的氯霉素抗性質(zhì)粒，它能更好地控制基礎(chǔ)表達(dá)水平。1.載體和宿主系統(tǒng)在示范性實(shí)施方式中，大腸桿菌AD494(DE3)pLysS中包含編碼嵌合多肽的pET載體。2.接種培育①用250mL高壓滅菌的錐形瓶制備接種培養(yǎng)基，具體如下50mLLB培養(yǎng)基，氨芐青霉素2G0mg/L，卡那霉素30mg/L和氯霉素30mg/L。②將一瓶凍存于-8(TC的甘油細(xì)胞儲存液(1mL展種到LB培養(yǎng)基中。③接種培育條件為37'C和240rpm，搖床恒溫箱中。5±0.5小時(shí)后，將50mL細(xì)胞肉湯(OD,^-1.0士0.5)接種到主發(fā)酵罐(工作容積=1.5L)中。*就大規(guī)模發(fā)酵而言，可改變此接種培育中的兩個(gè)步驟。對于一致的接種，需要在以下參數(shù)值相同的情況下進(jìn)行最終接種培育最終OD和接種體大小(3.0。/。，主培育的接種體積/工作體積x100)。3.在2-L容器中進(jìn)行主要發(fā)酵①用pH4和pH7的標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)連接于發(fā)酵罐控制器的pH電極。②制備以下初始批次培養(yǎng)基(iGYG):24.0g/L甘油；20.0g/L酵母提取物(Difco，USA);7,0g/LK2HPO4;3.0g/LKH2P04;0.5g/LMgS04.7H20;0.01g/L生物素(Sigma，USA);0.5g/L甘氨酸(6.6mM)。冷卻至設(shè)定溫度37'C后，將甘油和甘氨酸單獨(dú)滅菌并加入裝有無菌培養(yǎng)基的主發(fā)酵罐中。對于1-L接種培養(yǎng)基(fdGYG)，需要600.0g甘油、60.0g酵母提取物和3.0甘氨酸。這三種組分需要單獨(dú)進(jìn)行高壓滅菌。③在37'C和600rpm下校準(zhǔn)DO(溶解氧)電極。對于零位調(diào)整(00=0%)，用氮?dú)庖?wm(氣體體積/液體體積/分鐘)清洗發(fā)酵罐。對于跨度(00=100%)，采用空氣。④加入抗生素終濃度為，氨芐青霉素200mg/L，卡那霉素30mg/L，氯霉素30mg/L。⑤將種子接種到發(fā)酵罐中，取樣分析細(xì)胞密度(OD,^)。⑥用酸(42.5。/。H3PO4)和堿(50。/。NH4OH)溶液將培養(yǎng)基的pH控制在7.0。⑦OD^9.00士2.0(或12±1小時(shí))時(shí)，以控制K特定細(xì)胞生長速率，小時(shí)")的給料方法用給料溶液啟動給料分批發(fā)酵。用下式測定體積給料速率F=C'其中F:培養(yǎng)基的體積給料速率(L/h);C:校正因子(>0);控制的特定細(xì)胞生長速率(/h);X:培養(yǎng)肉湯中的細(xì)胞濃度(OD);K發(fā)酵罐的工作體積(L);K甘油細(xì)胞產(chǎn)率(OD/g/L);S/:給料溶液中的甘油濃度(g/L);h給料期間的時(shí)間間隔(h);F+6，其中F,:給料泵的設(shè)定值；F:培養(yǎng)基的體積給料速率(L/h);用尸中測定的校準(zhǔn)曲線預(yù)先確定O(斜率)和6(常數(shù))。⑧OD^35.0士5.0時(shí)，將培養(yǎng)溫度從37。C改變到23°C，加入誘導(dǎo)劑(IPTG，0.1mM,OD10)以表達(dá)耙蛋白。改變泵的設(shè)定值(Fs)將給料速率降低到25mL/小時(shí)，1.8L培養(yǎng)體積(15g-甘油/小時(shí)或8.3g-甘油/L/小時(shí))。(D將振蕩速率(RPM)提高到990(或控制RPM以在培育過程中將DO水平維持在20%以上)。@10±1小時(shí)后，收獲細(xì)胞，離心分離細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀重懸于Tris-緩沖液(20mMTris-HCl，pH8)中，儲存于冰箱(-2(TC)或進(jìn)行純化。4.用考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE(6.5n/。)表達(dá)測試①用4mL20mMTris緩沖液，pH8重懸細(xì)胞沉淀(ODIO，10mL)。②在冰浴中超聲處理細(xì)胞懸液(20秒，2或3次)。③用Ti50.4轉(zhuǎn)子以40K對破壞的細(xì)胞4'C超速離心15分鐘。取3.2mL上清液(細(xì)胞裂解物)并加入0.2mLTALON樹脂(在20mMTris緩沖液，pH8中的50%懸液)和0.1mL4MNaCl(終濃度二200mM)。⑤室溫結(jié)合30分鐘。⑥將樣品轉(zhuǎn)移到柱上，收集流出物('FT')。⑦用1mL洗脫緩沖液(20mMTris，200mMNaCl和500mM咪唑，pH8)('E')洗脫靶蛋白(V3825)。⑧用0.2mL20mMTris緩沖液，pH8重懸保留在柱內(nèi)的TALON樹脂，將其轉(zhuǎn)移到微量離心管('TAL')中。⑨用標(biāo)準(zhǔn)品(各泳道3-0.5嗎)進(jìn)行SDS-PAGE(6.5。/。)并用光密度計(jì)分析靶蛋白⑩計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage52</formula>其中:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage52</formula>[V3825]—V3825的特定產(chǎn)量[mg/L/OD10]Z:用光密度分析估計(jì)各泳道的靶蛋白量[^g]SDS-PAGE各孔的加樣體積[pL]為懸浮細(xì)胞沉淀加入的20mMTris緩沖液，pH8的體積[mL]細(xì)胞裂解(超聲處理)和超速離心后上清液(細(xì)胞裂解物)體積[mL]K:原始上樣體積40[mL],:V3825總產(chǎn)量[mg/L]OD:從發(fā)酵罐收集的初始樣品的光密度(600nm)本章節(jié)所描述的示范性方案可用于任何本發(fā)明嵌合分子，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道該方案中按照具體嵌合分子優(yōu)化的方面。X.適體在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，組合物和方法利用包含適體的嵌合分子。本文所用術(shù)語"適體"指可結(jié)合于另一種分子的一種或多種小分子。在特定實(shí)施方式中，適體可包含核酸，包括RNA或DNA，可包括寡核苷酸，和/或它們可包括肽。在某些實(shí)施方式中，適體包括寡核苷酸，如可預(yù)測高度特異的三維構(gòu)象的寡核苷酸化學(xué)合成鏈。經(jīng)設(shè)計(jì)，適體可對某些靶分子，包括例如嵌合分子靶向的相同分子具有合適的結(jié)合親和力和特異性。在其它實(shí)施方式中，適體用作一種或多種抗-細(xì)胞增殖部分的細(xì)胞靶向部分。可用本領(lǐng)域任何合適方法將適體分子偶聯(lián)于本發(fā)明所需分子，但在本發(fā)明的具體方面，通過異源雙功能交聯(lián)劑正琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)將所需分子偶聯(lián)于適體?？蓮谋绢I(lǐng)域關(guān)于已知適體的知識中獲得適體，或者可用本領(lǐng)域常規(guī)方法篩選適體。因此，在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，將適體連接于抗-細(xì)胞增殖部分。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，將適體連接于細(xì)胞靶向部分與抗-細(xì)胞增殖部分相連的嵌合分子，在這種情況下，適體/嵌合分子具有兩個(gè)細(xì)胞靶向部分。以下描述關(guān)于采用包含靶向前列腺特異性膜抗原(PMSA)適體的白樹毒素偶聯(lián)物的示范性適體組合物，但本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，其它實(shí)施方式可與一部分或全部本發(fā)明嵌合分子和/或其它適體一起使用。PSMA是疾病進(jìn)展期間在前列腺腫瘤細(xì)胞上表達(dá)增加的跨膜受體。這種蛋白質(zhì)也在腫瘤血管而非正常血管的內(nèi)皮上表達(dá)。適體是以高親和力和特異性選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)如細(xì)胞表面腫瘤抗原的小核酸。適體可能用作細(xì)胞靶向抗體或其它細(xì)胞靶向配體的替代物。本發(fā)明者利用已知以高親合力(以前報(bào)道幻=2nM)結(jié)合PSMA的外部結(jié)構(gòu)域的修飾RNA適體。用異源雙功能交聯(lián)劑SPDP將22kDa的適體分子偶聯(lián)于重組白樹毒素(rGel)。然后，用離子交換和凝膠滲透層析純化適體/rGel偶聯(lián)物。最終產(chǎn)物未被游離適體或游離rGEL污染，在SDS-PAGE中遷移為單一條帶(50kDa)。對構(gòu)建物的分析證明，與游離rGel相比，rGd組分有酶學(xué)活性。此外，發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物能特異性結(jié)合于表達(dá)PSMA的LNCAP細(xì)胞。該適體/rGei偶聯(lián)物的細(xì)胞毒研究顯示，與對該抗原含量少得多的PC3細(xì)胞的I.C.so為350,000nM相比，對抗原陽性LNCAP細(xì)胞的I.C.5o為32nM;靶向指數(shù)約為IO,OOO倍。內(nèi)化研究應(yīng)該揭示出毒素偶聯(lián)物實(shí)體的詳情，動物模型研究正在進(jìn)行當(dāng)中。這些數(shù)據(jù)表明，可用適體將蛋白質(zhì)分子如毒素成功地遞送給腫瘤細(xì)胞，并提供了開發(fā)靶向治療劑的新方法。事實(shí)上，適體可化學(xué)合成，因此位點(diǎn)特異性偶聯(lián)使它們作為靶向配體特別受關(guān)注。示范性PSMA-rGel構(gòu)建物可用于靶向前列腺細(xì)胞和腫瘤血管上的PSMA。嵌合分子的給藥在一些實(shí)施方式中，將有效量的本發(fā)明嵌合分子給予細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，將治療有效量的本發(fā)明嵌合分子給予個(gè)體，以治療疾病。本文所用術(shù)語"有效量"定義為在給予本發(fā)明嵌合分子的細(xì)胞或組織中產(chǎn)生生理改變所需的本發(fā)明嵌合分子用量。本文所用術(shù)語"治療有效量"定義為能消除、減輕、延遲或最大程度減少疾病如癌癥的副作用的本發(fā)明嵌合分子的用量。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難認(rèn)識到，在許多情況下，嵌合分子可能無法提供治愈效果，而僅提供部分益處，如緩解或改善至少一種癥狀。在一些實(shí)施方式中，有一些益處的生理改變也認(rèn)為是在治療上有益。因此，在一些實(shí)施方式中，產(chǎn)生生理改變的嵌合分子用量被認(rèn)為是"有效量"或"治療有效量"。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中并且作為優(yōu)于本領(lǐng)域已知方法的優(yōu)點(diǎn)，以蛋白質(zhì)而非經(jīng)翻譯產(chǎn)生所需多肽的核酸分子的形式遞送嵌合分子。另一優(yōu)點(diǎn)是，在一些實(shí)施方式中，將人序列用于本發(fā)明嵌合多肽，以避免外來多肽產(chǎn)生的不良免疫應(yīng)答。本發(fā)明嵌合蛋白可以本身形式或藥物組合物形式給予對象，例如通過耙向病毒抗原如HIV的gpl20治療癌癥、自身免疫病、移植排斥、創(chuàng)傷后免疫應(yīng)答和傳染病。更具體說，嵌合多肽可用于清除參與免疫細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的細(xì)胞，這些疾病包括淋巴瘤、自身免疫病、移植排斥、移植物抗宿主病、缺血和中風(fēng)?？赏ㄟ^常規(guī)的混合、溶解、造粒、包衣、水飛、乳化、包膠、包埋或凍干方法生產(chǎn)包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的藥物組合物?？梢猿Ｒ?guī)方式用一種或多種生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑配制該藥物組合物，加入所述載體、稀釋劑、賦形劑或助劑有利于將蛋白質(zhì)加工成可進(jìn)行藥物應(yīng)用的制劑。合適制劑取決于所選的給藥途徑。對于局部給藥而言，眾所周知，本發(fā)明蛋白質(zhì)可配制成溶液、凝膠、軟膏、乳膏、懸浮劑等。全身性制劑包括為注射給藥，如皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，以及透皮、跨粘膜、吸入、口服或經(jīng)肺給藥設(shè)計(jì)的制劑。就注射而言，本發(fā)明蛋白質(zhì)可配制成水溶液，優(yōu)選生理相容性緩沖液如Hanks溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液。該溶液可含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，該蛋白質(zhì)可以是在臨用前用合適載體如無菌無熱原水構(gòu)建的粉末形式。就跨粘膜給藥而言，將適合準(zhǔn)備透入的屏障的穿透劑用于該制劑。本領(lǐng)域通常了解這種穿透劑。就口服給藥而言，不難通過將該蛋白質(zhì)與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體混合配制該蛋白質(zhì)。這種運(yùn)載體使本發(fā)明蛋白質(zhì)能夠制成片劑、丸劑、糖衣丸劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸液等，以被治療患者口服攝入。就口服固體制劑如粉末、膠囊和片劑而言，合適的賦形劑包括填充劑，例如糖，如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇；纖維素制劑如玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪樹膠、甲基纖維素、羥丙基甲基-纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP);成粒劑；和粘合劑。如果需要，可加入崩解劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸，或其鹽如藻酸鈉。如果需要，固體劑型可以是用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的糖衣或腸溶衣。就口服液體制劑，例如懸液、酏劑和溶液而言，合適的運(yùn)載體、賦形劑或稀釋劑包括水、多元醇、油、醇等。此外，可加入調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等。就含服給藥而言，該分子可以取用常規(guī)方式配制的片劑、錠劑等形式。就吸入給藥而言，本發(fā)明所用分子可以方便地經(jīng)加壓包裝或噴霧器中的氣溶膠噴霧形式遞送，其中采用合適的推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲垸、二氯四氟乙垸、二氧化碳或其它合適氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過一個(gè)閥門遞送給定劑量，從而確定劑量單位?？膳渲坪性摰鞍踪|(zhì)和合適粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物的用于吸藥器或吹藥器的明膠膠囊和藥筒。該嵌合分子也可配制成直腸或陰道組合物，如含有常規(guī)栓劑基料如可可油或其它甘油酯的栓劑或保留灌腸劑。除前述制劑外，該分子也可配制成長效制劑。這種長效制劑可通過植入(如植入皮下或肌肉內(nèi))或通過肌肉內(nèi)注射給藥。因此，例如，該分子可與合適的聚合物或疏水性物質(zhì)配制在一起(如成為可接受油中的乳液)或離子交換樹脂，或配制成幾乎不溶的衍生物，如幾乎不溶的鹽?；蛘撸刹捎闷渌幬镞f送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是熟知的遞送載體，它們可用于遞送本發(fā)明蛋白質(zhì)。也可采用某些有機(jī)溶劑如二甲亞砜，但通常代價(jià)是毒性較高。此外，可用緩釋系統(tǒng)，如含有治療劑的固體聚合物的半透性基質(zhì)遞送該分子。已經(jīng)建立了各種緩釋物質(zhì)，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。根據(jù)其化學(xué)特性，緩釋膠囊可在數(shù)周至超過IOO天中釋放該分子。根據(jù)該嵌合分子的化學(xué)特性和生物學(xué)穩(wěn)定性，可采用其它方法使該分子穩(wěn)定。由于本發(fā)明嵌合分子的蛋白質(zhì)實(shí)施方式可含有帶電側(cè)鏈或末端，所以它們可作為游離酸或堿或藥學(xué)上可接受的鹽包含在上述制劑中。藥學(xué)上可接受的鹽是基本保留了游離堿的生物學(xué)活性和與無機(jī)酸反應(yīng)制備的鹽。與相應(yīng)的游離堿形式相比，藥物鹽可能在水或其它質(zhì)子容積中的溶解度更高。A.有效劑量通常以有效實(shí)現(xiàn)所需目的的用量使用本發(fā)明嵌合分子。為了用于治療或預(yù)防疾病，以治療有效量給予或施用本發(fā)明分子或其藥物組合物。治療有效量是有效改善或預(yù)防所治療患者的癥狀，或延長其存活期的用量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠測定治療有效量，尤其是根據(jù)本文提供的詳細(xì)說明。就全身給藥而言，最初可從體外試驗(yàn)估計(jì)治療有效劑量。例如，可在動物模型中確定劑量，以使循環(huán)濃度范圍包括細(xì)胞培養(yǎng)中測定的IC5。這些信息可用于更準(zhǔn)確地在人中的有用劑量。也可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)從體內(nèi)數(shù)據(jù)，如動物模型估計(jì)初始劑量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難根據(jù)動物數(shù)據(jù)優(yōu)化對人的給藥?？蓡为?dú)調(diào)整劑量和間隔，以使分子的血漿水平足以維持療效。注射給藥時(shí)，患者劑量通常約為0.1-5mg/kg/天，優(yōu)選約0.5-1mg/kg/天?？赏ㄟ^每天給予多個(gè)劑量實(shí)現(xiàn)治療有效的血清水平。在局部給藥或選擇性攝取的情況下，蛋白質(zhì)的有效局部濃度可能與血漿濃度無關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在不進(jìn)行額外試驗(yàn)的情況下優(yōu)化治療有效的局部劑量。當(dāng)然，給予的分子量將取決于所治療對象，取決于對象的體重、痛苦程度、給藥方式和處方醫(yī)生的判斷。癥狀可檢測或不可檢測時(shí)，可以間歇性地重復(fù)治療。該治療可以單獨(dú)提供或與其它藥物聯(lián)用。在自身免疫病的情況下，可與本發(fā)明IL2-Bax聯(lián)用的藥物包括但不限于固醇和非固醇消炎劑。B.毒性優(yōu)選地，本文所述嵌合分子的治療有效劑量將提供治療益處，而不引起顯著毒性?？捎脴?biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法，如測定LD50(使50%群體死亡的劑量)或LD咖(使100%群體死亡的劑量)在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動物中確定本文所述分子的毒性。毒性和療效的劑量比為治療指數(shù)。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的蛋白質(zhì)。獲自這些細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動物研究的數(shù)據(jù)可用于配制對人類無毒的劑量范圍。本文所述蛋白質(zhì)的劑量優(yōu)選在包括有效劑量而毒性很低或無毒的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。根據(jù)所用劑型和所用給藥途徑，劑量可以在此范圍內(nèi)變化。醫(yī)生可根據(jù)患者情況選擇確切的劑型、給藥途徑和劑量。(參見例如，F(xiàn)ingl等，1975，《治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)》(ThePharmacologicalBasisofTherapeutics),第1章，第1頁)。C.藥物制劑本發(fā)明藥物組合物含有有效量的一種或多種嵌合多肽，在一些實(shí)施方式中，還含有溶解或分散于藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的至少一種其它物質(zhì)。術(shù)語"藥學(xué)或藥理學(xué)上可接受"指以適當(dāng)方式給予動物如人時(shí)，不產(chǎn)生副作用、過敏或其它不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說明書可了解含有至少一種嵌合多肽或其它活性成分的藥物組合物的制劑，如納入本文作參考的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences),第18版，MackPrintingCompany,1990所述。而且，就動物(如人)給藥而言應(yīng)理解，該制劑應(yīng)該滿足FDA生物標(biāo)準(zhǔn)辦公室要求的無菌、熱源性、總體安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。本文所用術(shù)語"藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體"包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料等材料及其組合，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知(參見例如，《雷明頓藥物科學(xué)》，第18版，MackPrintingCompany,1990，第1289-1329頁，納入本文作參考)。除非常規(guī)運(yùn)載體與活性成分不相容，否則就考慮將其用于治療或藥物組合物。嵌合分子可含有不同類型的運(yùn)載體，這取決于它是以固體、液體還是氣溶膠形式給予，以及給藥途徑如注射需要無菌。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，可通過以下方式給予本發(fā)明靜脈內(nèi)，皮內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，損傷內(nèi)，顱內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，前列腺內(nèi)，胸膜內(nèi)，氣管內(nèi)，鼻內(nèi)，玻璃體內(nèi)，陰道內(nèi)，直腸內(nèi)，外用，腫瘤內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，結(jié)膜下，囊泡內(nèi)，粘膜，心包內(nèi)，臍帶內(nèi)，眼內(nèi)，口服，外用，局部，吸入(如氣溶膠吸入)，注射，輸注，連續(xù)輸注，通過導(dǎo)管、通過灌洗、以乳膏形式、以液體組合物形式(如脂質(zhì)體)直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞，或其它方法或上述方法的任意組合(參見例如《雷明頓藥物科學(xué)》，第18版，MackPrintingCompany,1990，納入本文作參考)。可根據(jù)身體和生理因素如體重、疾病嚴(yán)重程度、所治療疾病的類型、先前或同時(shí)進(jìn)行的治療介入、患者特發(fā)病和給藥途徑確定給予動物患者的本發(fā)明組合物的實(shí)際劑量。在任何情況下，負(fù)責(zé)給藥的醫(yī)師應(yīng)確定組合物中活性成分的濃度和用于該個(gè)體對象的合適劑量。在某些實(shí)施方式中，藥物組合物可含有(例如)至少約0.1%活性化合物。在其它實(shí)施方式中，活性化合物可占約2%-75%重量單位，或約25%-60%和其中產(chǎn)生的任何范圍。在其它非限制性實(shí)施例中，劑量也可包括每次給予約1微克/kg/體重、約5微克/kg/體重、約10微克/kg/體重、約50微克/kg/體重、約100微克/kg/體重、約200微克/kg/體重、約350微克/kg/體重、約500微克/kg/體重、約1毫克/kg/體重、約5毫克/kg/體重、約10毫克/kg/體重、約50毫克/kg/體重、約100毫克/kg/體重、約200毫克/kg/體重、約350毫克/kg/體重、約500毫克/kg/體重至約1000毫克/kg/體重或更大，以及其中產(chǎn)生的任何范圍。在本文所列數(shù)字產(chǎn)生的范圍的非限制性例子中，可根據(jù)上述數(shù)字給予約5mg/kg/體重-100mg/kg/體重、約5微克/kg/體重-500毫克/kg/體重等的范圍。在任何情況下，該組合物可含有各種抗氧化劑以阻止一種或多種成分的氧化。此外，可用防腐劑防止微生物的活動，如各種抗菌劑和抗真菌劑，包括但不限于對羥基苯甲酸酯類(如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。該嵌合分子可配制成游離堿、中性或鹽形式的組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽，如與蛋白質(zhì)組合物的游離氨基形成的鹽，或與無機(jī)酸如鹽酸或磷酸或者有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可衍生自無機(jī)堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或者有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、組氨酸或普魯卡因。在該組合物是液體形式的實(shí)施方式中，運(yùn)載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括但不限于水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、液體(如甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)和其組合。可通過(例如)采用包被物如卵磷脂；通過分散于運(yùn)載體如液體多元醇或脂質(zhì)中維持所需粒度；采用表面活性劑如羥丙基纖維素；或這些方法的組合來維持合適的流動性。在許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑，如糖、氯化鈉或其組合。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明可以采用滴眼劑、鼻溶液或噴霧、氣溶膠或吸入劑。這些組合物的設(shè)計(jì)通常與靶組織類型相容。在非限制性實(shí)施例中，鼻溶液通常是設(shè)計(jì)給予鼻孔的滴劑或噴霧形式的水溶液。制備的鼻溶液應(yīng)該在許多方面類似于鼻分泌物，以便維持正常的纖毛作用。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，鼻水溶液通常是等滲溶液，或者用少量緩沖液緩沖以維持約5.5-6.5的pH。此外，如果需要，該制劑中也可包含類似于眼用制劑中所用的抗微生物性防腐劑，藥物或合適的藥物穩(wěn)定劑。例如，已知各種市售鼻制劑，包括藥物如抗生素或抗組胺劑。在某些實(shí)施方式中，根據(jù)諸如口服攝入等途徑給藥來制備該嵌合分子。在這些實(shí)施方式中，固體組合物可包含(例如)溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊(如硬或軟殼明膠膠囊)、緩釋制劑、含服組合物、藥片、酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙囊劑或其組合。口服組合物可直接摻入食物?？诜o藥的優(yōu)選運(yùn)載體包括惰性稀釋劑、可同化可食用運(yùn)載體或其組合。在本發(fā)明的其它方面，口服組合物可制備成糖漿或酏劑。糖漿或酏劑了包含(例如)至少一種活性劑、甜味劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料、防腐劑或其組合。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，口服組合物可含有一種或多種粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、調(diào)味劑及其組合。在某些實(shí)施方式中，組合物可含有以下成分中的一種或多種粘合劑，如黃芪樹膠、阿拉伯樹膠、玉米淀粉、明膠或其組合；賦形劑、如磷酸二鈣、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或其組合;崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸或其組合；潤滑劑，如硬脂酸鎂；甜味劑，如蔗糖、乳糖、糖精或其組合；調(diào)味劑，如薄荷、冬青油、櫻桃調(diào)味劑、橙味調(diào)味劑等；或上述物質(zhì)的組合。當(dāng)單位劑型是膠囊時(shí)，除上述物質(zhì)以外，它可含有運(yùn)載體如液體運(yùn)載體。也可存在各種其它物質(zhì)如包衣，或者改變單位劑型的物理形式的物質(zhì)。例如，可用紫膠、糖或二者給片劑、丸劑或膠囊包衣。適合其它給藥方式的其它劑型包括栓劑。栓劑是通常加入藥物的不同重量和形狀的固體劑型，用于插入直腸、陰道或尿道。插入后，栓劑在體腔液體中軟化、融化或溶解。對于栓劑而言，傳統(tǒng)運(yùn)載體通?？砂ɡ缇蹃喭榛?、甘油三酯或其組合。在某些實(shí)施方式中，可用含有(例如)約0.5%-10%、優(yōu)選約1%-2%的活性成分的混合物形成栓劑。通過將所需量的活性化合物和所需的上述各種其它成分摻入合適溶劑中、然后除菌過濾來制備無菌注射溶液。通常將各種滅菌的活性成分摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和其它成分的無菌載體中制備分散體。在無菌粉末用于制備無菌注射溶液、懸液或乳液的情況下，優(yōu)選的制備方法是能得到來自事先過濾除菌的液體介質(zhì)的活性成分加任何其它所需成分的粉末的真空干燥和凍干技術(shù)。如果需要，應(yīng)該適當(dāng)?shù)鼐彌_該液體介質(zhì)，先足量的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲，然后注射。也考慮了制備用于直接注射的高濃縮組合物，其中考慮到采用DMSO作為溶劑能導(dǎo)致極迅速的滲透，向一小塊區(qū)域遞送高濃度的活性成分。該組合物必須在生產(chǎn)和儲存條件下穩(wěn)定，保藏時(shí)必須防止微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染作用。應(yīng)理解，至少將內(nèi)毒素污染控制在安全水平，例如，小于0.5ng/mg蛋白質(zhì)。在具體實(shí)施方式中，組合物中采用延遲吸收的物質(zhì)，如單硬脂酸鋁、明膠或其組合可延長可注射組合物的吸收。XII.聯(lián)合治療/癌癥治療為增強(qiáng)本發(fā)明嵌合分子或編碼它的表達(dá)構(gòu)建物的效力，可能需要將這些組合物與治療增殖過度性疾病有效的其它藥物(例如抗癌藥物)聯(lián)用。實(shí)際上，在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明嵌合分子與一種或多種化療劑聯(lián)用，從而能有效地將該化療劑遞送至耐受性細(xì)胞。除另一種癌癥治療外，例如放療、外科手術(shù)、基因療法等等，可單獨(dú)給予嵌合分子或與一種或多種化療劑聯(lián)合給予患有癌癥的個(gè)體。"抗癌"藥物在對象中能負(fù)面影響癌癥，例如通過殺傷癌細(xì)胞、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、降低癌細(xì)胞生長速率、降低轉(zhuǎn)移的發(fā)生率或數(shù)量、減小腫瘤體積、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或癌細(xì)胞的血液供應(yīng)、促進(jìn)針對癌細(xì)胞或腫瘤的免疫應(yīng)答、防止或抑制癌癥發(fā)展或增長癌癥患者的壽命。更具體地說，這些其它組合物可以能有效殺傷或抑制細(xì)胞增殖的用量提供。該方法包括使細(xì)胞同時(shí)與表達(dá)構(gòu)建物和一種或多種藥物或多因子接觸。這可通過使細(xì)胞與一種組合物或包含兩種藥物的藥學(xué)制劑接觸，或通過使細(xì)胞同時(shí)與兩種不同的組合物或制劑接觸來實(shí)現(xiàn)，其中一種組合物含有表達(dá)構(gòu)建物，另一種含有第二藥物。對化療和放療藥物耐受的腫瘤細(xì)胞代表臨床腫瘤學(xué)的主要問題。目前癌癥研究的目的之一是發(fā)現(xiàn)通過將化療和放療與基因治療聯(lián)合來提高化療和放療效力的方法。例如，當(dāng)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)將單純皰疹-胸苷激酶(HS-tK)基因遞送至腦腫瘤時(shí)，其成功地誘導(dǎo)了對抗病毒藥物更昔洛韋的敏感性(Culver等，1992)。除其它促凋亡或細(xì)胞周期調(diào)節(jié)藥物外，在本發(fā)明上下文中，考慮了可類似地聯(lián)用嵌合分子與化療、放療、基因療法或免疫治療干預(yù)。或者，所述治療可以數(shù)分鐘到數(shù)周為間隔在其它藥物治療之前或之后進(jìn)行。在將其它藥物和表達(dá)構(gòu)建物分別施用于細(xì)胞的實(shí)施方式中，通常應(yīng)確保未超出每次遞送時(shí)間之間的有效時(shí)間，從而使得藥物和表達(dá)構(gòu)建物能對細(xì)胞施加有利的并用效果。在這種情況中，考慮了在彼此間約12-24小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在彼此間約6-12小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞與兩種藥征(modality)接觸。然而，在各給藥之間是幾天(2、3、4、5、6或7)到幾周(l、2、3、4、5、6、7或8)間隔的一些情況中，需要明顯延長治療時(shí)間段?？刹捎酶鞣N組合，其中嵌合分子治療是"A"，第二藥物，例如放療或化療是例如"B":A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A考慮到載體的毒性(如果有的話)，可根據(jù)給予化療劑的通用方法給予患者本發(fā)明治療性表達(dá)構(gòu)建物。估計(jì)如果需要可重復(fù)該治療周期。也考慮了可將各種標(biāo)準(zhǔn)治療以及外科手術(shù)干預(yù)與所述過度增殖性細(xì)胞治療聯(lián)用。A.化療癌癥治療也包括聯(lián)用化學(xué)或放射治療的各種組合治療。聯(lián)合化療包括，例如-順鉑(CDDP)、碳鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異磷酰胺、美法侖、瘤可寧、白消安、硝基脲、放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、博萊霉素、普卡霉素(plicomydn)、絲裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合藥物、紫杉酚、吉西他濱、諾維本、法尼基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉑(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、長春新堿、長春堿和甲氨喋呤，或上述藥物的任何類似物或衍生變體。B.放療導(dǎo)致DNA損傷并廣泛應(yīng)用的其它因素包括通常稱為，射線、X-射線和/或?qū)⒎派湫酝凰刂苯舆f送至腫瘤細(xì)胞的那些因素。也考慮了其它形式的DNA損傷因素，例如微波和紫外輻射。所有這些因素很可能對DNA、DNA的前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)以及染色體的裝配和維持施加了廣泛的損傷作用。X-射線劑量范圍從用于長期(3-4周)的50-200倫琴的每日劑量到2000-6000倫琴的單劑量。放射性同位素的劑量范圍取決于同位素的半衰期、所發(fā)出輻射的強(qiáng)度和類型、腫瘤細(xì)胞的攝取而極為不同。當(dāng)術(shù)語"接觸"和"暴露"應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)，其在本文用于描述將治療性構(gòu)建物和化療或放療藥物遞送至靶細(xì)胞或置于與靶細(xì)胞直接毗鄰的位置上的過程。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞殺傷或停滯，將組合用量的兩種藥物遞送至細(xì)胞，該組合用來有效殺傷細(xì)胞或防止其分裂。C.免疫療法免疫療法通常依賴于免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子來靶向和破壞癌細(xì)胞。例如，免疫效應(yīng)物可以是腫瘤細(xì)胞表面一些標(biāo)記的特異性抗體。單獨(dú)的抗體可用作治療的效應(yīng)物或它可募集其它細(xì)胞從而實(shí)際上影響細(xì)胞殺傷。也可將抗體與藥物或毒素(化療、放射性核素、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)綴合，而抗體只是用作靶向物質(zhì)?；蛘?，效應(yīng)物可以是攜帶能直接或間接與腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)相互作用的表面分子的淋巴細(xì)胞。各種效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。因此，免疫療法可用作聯(lián)合治療的一部分而與基因療法聯(lián)用。聯(lián)合治療的通用方法如下文所述。腫瘤細(xì)胞一般必須攜帶適合于靶向的一些標(biāo)記(即不存在于大多數(shù)其它細(xì)胞上)。腫瘤標(biāo)記有許多，在本發(fā)明范圍中任何這些標(biāo)記適用于靶向。常規(guī)腫瘤標(biāo)記包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、尿腫瘤相關(guān)抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、SialylLewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erbB和pl55。D.基因在還有另一實(shí)施方式中，第二治療是基因療法，其中治療性多核苷酸在給予本發(fā)明嵌合多肽之前、之后或同時(shí)給予。聯(lián)合遞送嵌合多肽和編碼以下基因產(chǎn)物之一的第二載體對靶組織具有聯(lián)合的抗-過度增殖作用?；蛘?，可利用編碼兩種基因的一種載體。本發(fā)明包括各種蛋白質(zhì)，其中一些如下所述。1.細(xì)胞增殖誘導(dǎo)物誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)按照功能還屬于各種類別。所有這些蛋白質(zhì)的共性是它們能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。例如，PDGF的一種形式，sis癌基因是分泌的生長因子。癌基因很少源自編碼生長因子的基因，sis是目前唯一已知的天然產(chǎn)生的致癌生長因子。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，考慮利用細(xì)胞增殖的具體誘導(dǎo)物的反義mRNA來防止該細(xì)胞增殖誘導(dǎo)物的表達(dá)。蛋白質(zhì)FMS、ErbA、ErbB和neu是生長因子受體。這些受體突變導(dǎo)致可調(diào)節(jié)功能喪失。例如，影響Neu受體蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變導(dǎo)致neu癌基因。erbA癌基因源自甲狀腺激素的胞內(nèi)受體。據(jù)信，修飾的致癌性ErbA受體與內(nèi)源性甲狀腺激素受體競爭，從而導(dǎo)致失控的生長。最大一類癌基因包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(例如，Src、Abl和Ras)。蛋白Src是胞質(zhì)蛋白-酪氨酸激酶，在一些情況中其通過酪氨酸殘基527的突變從原癌基因轉(zhuǎn)化為癌基因。相反，在一個(gè)實(shí)例中，GTP酶蛋白ras序列中的氨基酸12從纈氨酸突變?yōu)楦拾彼釋?dǎo)致其從原癌基因轉(zhuǎn)化為癌基因，從而降低了GTP酶活性。與轉(zhuǎn)錄因子一樣，蛋白Jun、Fos和Myc是對核功能直接施加影響的蛋白質(zhì)。2.細(xì)胞增殖抑制劑腫瘤抑制癌基因起到抑制細(xì)胞過度增殖的作用。這些基因的失活破壞了它們的抑制活性，從而導(dǎo)致增殖不受控。腫瘤抑制物p53、pl6和C-CAM如下所述。在化學(xué)致癌作用、紫外輻射和幾種病毒轉(zhuǎn)化的許多細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了高水平的突變型p53。在各種人腫瘤中，p53基因是突變滅活的常見靶位，該基因早已證實(shí)是普通的人癌癥中最頻繁突變的基因。它在超過50。/。的人NSCLC(Hollstein等，1991)和廣泛的其它腫瘤中發(fā)生突變。p53基因編碼能與宿主蛋白(例如大T抗原和E1B)形成復(fù)合物的393個(gè)氨基酸的磷蛋白。在正常組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)該蛋白，但與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或腫瘤組織比較，其濃度極低。野生型p53被認(rèn)為是許多細(xì)胞類型中重要的生長調(diào)節(jié)物。錯(cuò)義突變對于p53基因常見，對于癌基因的轉(zhuǎn)化能力至關(guān)重要。點(diǎn)突變促使的單一遺傳變化能產(chǎn)生致癌性p53。然而，與其它癌基因不同，已知p53點(diǎn)突變發(fā)生在至少30個(gè)不同的密碼子中，常產(chǎn)生細(xì)胞表型改變而純合性不降低的顯性等位基因。此外，這些顯性負(fù)等位基因中有許多顯示在生物中耐受并能在種系中傳遞。各種突變型等位基因出現(xiàn)的范圍從最低限度的功能失調(diào)到完全透徹的顯性負(fù)等位基因(Weinberg，1991)。另一種細(xì)胞增殖抑制劑是p16。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶或CDK觸發(fā)真核細(xì)胞周期的主要轉(zhuǎn)變。一種CDK，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)調(diào)節(jié)G1期的進(jìn)展。該酶的活性是在Gl后期磷酸化Rb。CDK4的活性受活化亞單位——D-型細(xì)胞周期蛋白和抑制性亞單位——pl6INK4(已通過生物化學(xué)方法特征鑒定為特異性結(jié)合并抑制CDK4的蛋白)的控制，從而可調(diào)節(jié)Rb磷酸化(Serrano等，1993;Serrano等，1995)。由于pl6INK4蛋白是CDK4抑制劑(Serrano，1993)，使該基因缺失可提高CDK4的活性，從而導(dǎo)致Rb蛋白高度磷酸化。pl6也已知能調(diào)節(jié)CDK6的功能。pl6INK4屬于一類新揭示的CDK-抑制性蛋白，該類蛋白也包括pl6B、p19、p21WAFl和p27KIPl。pl6INK4基因作圖定位于9p21，這是在許多腫瘤類型中常缺失的染色體區(qū)域。人腫瘤細(xì)胞系中常發(fā)現(xiàn)pl6INK4基因的純合缺失和突變。該證據(jù)提示pl6INK4基因是腫瘤抑制基因。然而，原代未培養(yǎng)腫瘤中pl6INK4基因的變化頻率遠(yuǎn)低于培養(yǎng)的細(xì)胞系的觀察結(jié)果挑戰(zhàn)了這種解釋(Caldas等，1994;Cheng等，1994;Hussussian等，1994;Kamb等，1994;Kamb等，1994;Mori等，1994;Okamoto等，1994;Nobori等，1995;Orlow等，1994;Arap等，1995)。通過用質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染來恢復(fù)的野生型pl6INK4功能降低了一些人癌細(xì)胞系的集落形成(Okamoto，1994;Arap，1995)。本發(fā)明可用的其它基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zacl、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/pl6融合體、p21/p27融合體、抗-血栓形成基因(例如，COX-l、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、參與血管生成的基因(例如，VEGF、FGF、血小板反應(yīng)蛋白、BAI-1、GDAIF或它們的受體)和MCC。3.程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)物凋亡或程序性細(xì)胞死亡對于正常的胚胎發(fā)育、維持成熟組織中穩(wěn)態(tài)和抑制癌形成至關(guān)重要(Kerr等，1972)。Bd-2蛋白家族和ICE樣蛋白酶已證實(shí)是其它系統(tǒng)中凋亡的重要調(diào)節(jié)物和效應(yīng)物。發(fā)現(xiàn)與濾泡性淋巴瘤有關(guān)的Bd2蛋白在應(yīng)答多種凋亡刺激而控制凋亡和提高細(xì)胞存活中起主要作用(Bakhshi等，1985;Cleary和Sklar，1985;Cleary等，1986;Tsujimoto等，1985;Tsujimoto和Croce，1986)?，F(xiàn)在認(rèn)識到進(jìn)化保守的Bcl2蛋白是可歸類為死亡激動劑或死亡拮抗劑的相關(guān)蛋白質(zhì)家族的成員。在發(fā)現(xiàn)Bcl2后，已顯示其起到遏制各種刺激觸發(fā)的細(xì)胞死亡的作用?，F(xiàn)在明顯也有一族Bcl2細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白，它們具有共有結(jié)構(gòu)和序列同源性。這些不同的家族成員顯示具有與Bcl2相似的功能(例如，BclXL、BclW、BclS、Mcl-l、Al、Bfl-l)或抵消Bcl2的功能從而促進(jìn)細(xì)胞死亡(例如，Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。E.外科手術(shù)約60%患癌癥的人會接受某些類型的外科手術(shù)，包括預(yù)防性、診斷性或分期的(staging)、治愈性和姑息性手術(shù)。治愈性手術(shù)是可與其它治療(例如本發(fā)明治療、化療、放療、激素療法、基因療法、免疫療法和/或其它療法)聯(lián)用的一種癌癥治療方法。本發(fā)明嵌合分子可用作新輔助手術(shù)療法(neoadjuvantsurgicaltherapy),例如在切除前減小腫瘤體積，或者可用作手術(shù)后輔助療法(postadjuvantsurgicaltherapy),例如在除去部分或所有腫瘤之后使得手術(shù)床(surgicalbed)消除活性。治愈性手術(shù)包括切除術(shù)，其中物理除去、割除和/或破壞了所有或部分癌組織。腫瘤切除術(shù)指物理除去腫瘤的至少一部分。除腫瘤切除術(shù)外，外科手術(shù)治療包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電外科手術(shù)和顯微控制的手術(shù)(Mohs外科手術(shù))。還考慮了可將本發(fā)明與除去淺表癌癥、初癌或附帶量的正常組織聯(lián)合應(yīng)用。切除部分或所有癌細(xì)胞、組織或腫瘤后，體內(nèi)可能形成空腔?？刹捎闷渌拱┌Y療法通過該區(qū)域的灌注、直接注射或局部涂布實(shí)現(xiàn)治療。這種治療可重復(fù)進(jìn)行，例如每l、2、3、4、5、6或7天，或每l、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月。這些治療的劑量也可以不同。F.其它藥物考慮了聯(lián)用其它藥物與本發(fā)明以提高治療的療效。這些其它藥物包括免疫調(diào)節(jié)藥物、影響上調(diào)細(xì)胞表面受體和GAP連接的藥物、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和分化藥物、細(xì)胞黏著抑制劑或提高過度增殖性細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)物的敏感性的藥物。免疫調(diào)節(jié)藥物包括腫瘤壞死因子；干擾素a、(3和y;IL-2和其它細(xì)胞因子；F42K和其它細(xì)胞因子類似物；或MIP-1、MIP-1|3、MCP-1、RANTES和其它趨化因子。還考慮了上調(diào)細(xì)胞表面受體或它們的配體(例如Fas/Fas配體、DR4或DR5/TRAIL)可通過對過度增殖性細(xì)胞產(chǎn)生自分泌或旁分泌作用來加強(qiáng)本發(fā)明的凋亡誘導(dǎo)能力。通過增加GAP連接數(shù)目來提高細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可增強(qiáng)對毗鄰過度增殖性細(xì)胞群的抗過度增殖效力。在其它實(shí)施方式中，聯(lián)用細(xì)胞穩(wěn)態(tài)或分化藥物與本發(fā)明可提高治療的抗過度增殖效力。考慮了細(xì)胞黏著抑制劑能提高本發(fā)明效力。細(xì)胞黏著抑制劑的例子是黏著斑激酶(FAK)抑制劑和洛伐他丁。還考慮了聯(lián)用能提高過度增殖性細(xì)胞對凋亡的敏感性的其它藥物，例如抗體c225與本發(fā)明可提高療效。也可聯(lián)用激素療法與本發(fā)明或以前描述的任何其它癌癥療法。在某些癌癥，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或?qū)m頸癌的治療中可利用激素來降低某些激素，例如睪酮或雌激素的水平或阻斷其作用。該治療常與至少一種其它癌癥療法聯(lián)用作為治療選擇或降低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。XIII.本發(fā)明藥盒可將本文所述的任何一種或多種組合物裝在藥盒中。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，嵌合分子、嵌合分子組分和/或一種或多種其它藥物可裝在藥盒中。因此，這些藥盒可在合適的容器裝置中裝有本發(fā)明的嵌合分子、嵌合分子組分和/或其它藥物。這些藥盒(無論有標(biāo)簽或沒有標(biāo)簽)可裝有合適等分的本發(fā)明嵌合分子、嵌合分子組分和/或其它藥物成分，可用于治療患有癌癥的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體。該藥盒的一種或多種組分可包裝成在水性介質(zhì)中或凍干形式。這些藥盒的容器裝置通常包括盛放組分(優(yōu)選合適等分)的至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器裝置。當(dāng)藥盒中有多種組分時(shí)，藥盒通常也裝有分別盛放其它組分的第二、第三或其它額外的容器。然而，可將組分的各種混合物裝在一個(gè)小瓶中。本發(fā)明藥盒通常也密封裝有商業(yè)出售的包含嵌合分子、嵌合分子組分和/或其它藥物的裝置和任何其它試劑容器。這種容器可包括裝有所需小瓶的注射或吹塑的塑料容器。本發(fā)明治療性藥盒是裝有嵌合分子、嵌合分子組分或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥盒。該藥盒通常在合適的容器裝置中裝有嵌合蛋白、多肽、肽、結(jié)構(gòu)域、抑制劑、和/或表達(dá)上述物質(zhì)的基因和/或載體的藥學(xué)上可接受的制劑。所述藥盒可裝有一個(gè)容器裝置和/或各化合物可具有不同的容器裝置。當(dāng)用一種和/或多種液體溶液提供藥盒的各組分時(shí)，所述液體溶液可能是水溶液，優(yōu)選無菌水溶液。也可將嵌合分子和嵌合分子組分組合物配制成可注射組合物。在此情況中，容器裝置本身可以是能將制劑應(yīng)用至身體受感染的區(qū)域、注射入動物和/或甚至應(yīng)用于和/或與藥盒其它組分混合的注射器、移液管和/或其它類型的裝置。然而，藥盒各組分可以干粉形式提供。當(dāng)以干粉提供各試劑和/或組分時(shí)，可加入合適的溶劑重建粉末。溶劑可以是水性溶劑或有機(jī)溶劑。預(yù)計(jì)溶劑也可在另一容器裝置中提供。該容器裝置通常包括至少一個(gè)藥瓶、試管、燒瓶、罐、注射器和/或其它容器裝置，其中放入(優(yōu)選適當(dāng)分配)的嵌合分子和/或嵌合分子組分是蛋白質(zhì)、基因和/或抑制劑。這些藥盒也可裝有第二容器裝置來包含無菌的藥學(xué)上可接受的緩沖液和/或其它稀釋劑。無論容器的數(shù)目和/或類型，本發(fā)明藥盒也可包括和/或包裝有協(xié)助將最終的嵌合分子多肽和/或基因組合物注射/給予和/或置于動物體內(nèi)的工具。這種工具可以是注射器、移液管、鑷子和/或任何這種醫(yī)學(xué)上批準(zhǔn)的遞送載體。實(shí)施例給出以下實(shí)施例來示范本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道以下實(shí)施例所公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的能在本發(fā)明實(shí)施中起良好作用的技術(shù)，因此可以認(rèn)為構(gòu)成其優(yōu)選實(shí)施方式。然而，鑒于本文內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道可在公開的具體實(shí)施方式中作出許多變化，但仍能得到類似或相似的結(jié)果而不脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體說，應(yīng)理解，可用某些化學(xué)和生理上相關(guān)的藥物替代本文所述藥物以獲得相同或相似結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的所有這些相似取代或修飾都屬于所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明精神、范圍和構(gòu)思。實(shí)施例l實(shí)施例2-8的示范性材料和方法細(xì)胞系和培養(yǎng)用補(bǔ)充有10。/。熱滅活胎牛血清(FBS)、100單位/ml青霉素和100pg/ml鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，LifeTechnologiesInc.，馬里蘭州羅克維爾)培養(yǎng)四種人胰腺癌細(xì)胞系(AsPc-l、Capan-l、Capan-2和L3.6pl)?；熕幒蛃cFV23/TNF融合構(gòu)建物5-氟尿嘧啶(5-FU)購自RocheLaboratories(Nutley，NJ)。順鉑和依托泊甙(VP-16)購自BristolLaboratories(Princeton，NJ)。多柔比星購自CetusCorporation(Emeryville，CA)。吉西他濱購自EliLillyCo.(印第安納州印第安納波利斯)。如上所述，在細(xì)菌表達(dá)宿主中產(chǎn)生scFv23/TNF融合構(gòu)建物，純化至均一并評價(jià)生物學(xué)活性(Rosenblum等，1995)?？贵w單克隆抗-HER-2/neu抗體(Ab)、兔多克隆抗-HER-lAb、兔多克隆抗-TNFR-lAb、兔多克隆抗-TNFR-2Ab、兔多克隆抗-胱冬酶-8Ab、單克隆抗-胱冬酶-3Ab和單克隆抗-PARPAb獲自SantaCruzBiotechnology,加州圣克魯斯。將兔多克隆抗-磷酸化AktAb和兔多克隆抗-AktAb(CellSignalingTechnology,馬薩諸塞州貝弗禾U)用于Western印跡分析。胱冬酶-3抑制劑正乙酰基-Asp-Glu-Val-Asp-al，(Ac-DEVD-CHO)購自Sigma-AldrichCo.(密蘇里州圣路易斯)。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)和聯(lián)合用藥研究將所有人胰腺癌細(xì)胞接種(lxl(yV孔)到平底96孔微量滴定板(BectonDickinsonLabware，新澤西州FranklinLakes)中，24小時(shí)后，以三復(fù)孔加入scFv23/TNF、TNF和五種化療藥(5-氟尿嘧啶、順鉑、依托泊甙、多柔比星和吉西他濱)。在聯(lián)合用藥研究中，以各自的IC25濃度聯(lián)用scFV23/TNF和五種化療藥之一。為了檢測胱冬酶-3活化是否介導(dǎo)聯(lián)合治療的協(xié)同作用，用或不用100胱冬酶-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)預(yù)處理細(xì)胞3小時(shí)，然后用各自的IC25濃度處理。再孵育72小時(shí)后，加入50^結(jié)晶紫(0.5n/。w/v的20e/。MeOH/H2O溶液)使剩余的貼壁細(xì)胞染色。加入100plSorenson緩沖液[100mM擰檬酸鈉(pH4.2)的50%乙醇溶液]溶解被染料染色的細(xì)胞，用ELISA平板閱讀器(Bio-TekInstruments,Inc.，Winooski，VT)測定630nm處的吸光度。按照Chou和Talalay(Chou和Talalay，1984)所述的中值作用原理fa/fii=(D/Dm)m評價(jià)聯(lián)合用藥的協(xié)同、加成或拮抗劑作用，其中D是藥物劑量，Dm是IC50，fa是劑量影響的分?jǐn)?shù)，fu未影響的分?jǐn)?shù)，m是確定曲線形狀(sigmoidicity)的系數(shù)。Western印跡分析為了檢測HER-1、HER-2/neu、TNF受體-1、TOF受體-2和p-Akt的狀態(tài)，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌四種人胰腺癌細(xì)胞系(AsPc-l、Capan-l、Capn-2和L3.6pl)兩次，用0.3ml裂解緩沖液(IOmMTris-HCl，pH8，60mMKC1，1mMEDTA，1mMDTT，0.2°/。NP-40)冰上裂解20分鐘。用8-15。/。SDS-PAGE對細(xì)胞裂解物(50mg)進(jìn)行級分，并轉(zhuǎn)移到Immobilon-P硝酸纖維素膜(Schleicher&SchuellInc.，新罕布什爾州西基涅)上。用含有3n/。牛血清白蛋白的Tris-緩沖鹽水(TBS)封閉該膜2小時(shí)。用單克隆抗-HER-2/neuAb(OncogeneResearchProducts,加州圣地亞哥)、兔多克隆抗-HER-lAb、兔多克隆抗-TNFR-lAb、兔多克隆抗-TNFR-2Ab、兔多克隆抗-磷酸化AktAb、兔多克隆抗-Akt和山羊抗-(3-肌動蛋白Ab進(jìn)行免疫印跡。用ECL檢測試劑(AmershamPharmaciaBiotechInc.,新澤西州皮斯卡塔韋)1:4000稀釋的偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗-小鼠/山羊抗-兔或豬抗-山羊抗體(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)觀察免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。檢測凋亡用TUNEL試驗(yàn)檢測凋亡。為了評價(jià)凋亡，將L3.6pl細(xì)胞接種于蓋玻片上，靜置過夜貼壁，然后用200nMTNF或200nMscFv23/TNF處理48小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞，通透(0.1。/。TritonX-100，0.1%檸檬酸鈉)，然后用4%多聚甲醛固定。固定細(xì)胞用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(Roche)染色。用熒光顯微鏡鑒定發(fā)生凋亡的細(xì)胞。實(shí)施例2四種人胰腺癌細(xì)胞系中HER-2/NEU、HER-1、TNFR-1、TNFR-2和P-AKT的狀態(tài)以前發(fā)現(xiàn)，HER-2/neu在胰腺腫瘤活檢樣品中過度表達(dá)，HER-2/neu表達(dá)被看作胰腺上皮內(nèi)腫瘤預(yù)后情況不好的標(biāo)記物(Tomaszewska等，1998)。測定四種胰腺癌細(xì)胞系中HER-2/neu的表達(dá)。所有四種胰腺癌細(xì)胞系(AsPc-1、Capan-1、Capan-2和L3.6pl)均表達(dá)HER-2/neu、TNFR-1、TNFR-2和磷酸化-Akt。與AsPc-l細(xì)胞相比，L3.6pl細(xì)胞表達(dá)的HER-2/neu水平高3.7倍、TNFR-1水平高3.1倍、TNFR-2水平高1.6倍。四種胰腺細(xì)胞系中三種(Capan-l、Capan-2和L3.6pl)也顯示出活化Akt的基線水平升高。與AsPc-l細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)Capan-l細(xì)胞的p-Akt表達(dá)水平最高(圖1和表1)。以前發(fā)現(xiàn)，33%人胰腺癌中表皮生長因子受體(HER-1)過度表達(dá)(Thybusch-Bemhardt等，2001)。因此，評價(jià)了所有四種胰腺癌細(xì)胞系中的HER-1狀態(tài)?？梢栽谌N胰腺癌細(xì)胞系(AsPc-l、Capan-2和L3.6pl)中檢測到HER-1表達(dá)。在所測試的四種細(xì)胞系中Capan-l細(xì)胞基本不表達(dá)HER-1(EGFR)，而AsPc-l細(xì)胞表達(dá)水平最高(圖1和表1)。表l:人胰腺癌細(xì)胞系上各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>實(shí)施例3SCFV23/TNF、TNF和化療藥對人胰腺癌細(xì)胞系生長的影響在所測試的四種細(xì)胞系中，這些化療藥抑制體外細(xì)胞增殖的能力明顯不同。所有胰腺癌細(xì)胞系對TNF的細(xì)胞毒作用高度耐受(IC5?！?600nM)。5-氟尿嘧啶、順鉑和依托泊甙的IC5o值為1-300mM，而相比較而言，多柔比星、吉西他濱和scFv23/TNF的活性更高，ICso值為6-700nM(圖2A-2D和表2)。表2:各種藥物對四種示范性人胰腺癌細(xì)胞系的IC5()<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>*達(dá)到的最高濃度。接觸藥物72小時(shí)后測定IC5o值，ICso值定義為與對照細(xì)胞相比，在處理的細(xì)胞中引起50%生長抑制的濃度。有趣的是，HER-2/neu、TNFR-1、TNFR-2表達(dá)水平最高的L3.6pl細(xì)胞對測試藥物最敏感，而HER-2/neu、TNFR-1和TNFR-2表達(dá)水平相對較低的Capan-2細(xì)胞對測試藥物耐受性最高。實(shí)施例4SCFV23/TNF與各種化療藥聯(lián)用對四種人胰腺癌細(xì)胞系生長的影響scFv23/TNF和各種化療藥聯(lián)合用藥的研究顯示，在所有胰腺癌細(xì)胞系中，scFv23/TNF與5-氟尿嘧啶有協(xié)同的細(xì)胞毒作用，scFv23/TNF與多柔比星有拮抗作用。然而，將順鉑或吉西他濱加入scFv23/TNF導(dǎo)致所測試的3/4細(xì)胞系中發(fā)生拮抗性細(xì)胞毒作用，而將依托泊甙加入scFv23/TNF導(dǎo)致3/4胰腺癌細(xì)胞系中發(fā)生協(xié)同作用(表3)。表3:scFv23/TNF與其它化療藥聯(lián)用誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的分析治療__聯(lián)合指數(shù)(CI)AsPc-lCapan-lCapan-2L3.6pl5-FU+scFv23/TNFSYN(0.632)SYN(0.611)SYN(0.548)SYN(0.366)CIS+scFv23/TNFANT(2.250)SYN(0.566)ANT(1.532)ANT(4.667)ETO+scFv23/TNFSYN(0.498)SYN(0.869SYN(0.664)ANT(1.640)DOX+scFv23/TNFANT(1.805)ANT(1.203)ANT(2.084)ANT(3.578)GEM+scFv23/TNFANT(2.375)ANT(1.250)SYN(0.703)ANT(2.833)為了分析兩種藥物之間的細(xì)胞相互作用，就互斥藥物而言，如Chou和Talalay(1984)所述計(jì)算受試2種藥物聯(lián)用的聯(lián)合指數(shù)(CI):CI=(D)l/(Dx)l+(D)2/(Dx)2。其中(D)l和(D)2聯(lián)用殺傷X。/。細(xì)胞，(Dx)l和(Dx)2是單獨(dú)用藥能夠產(chǎn)生與聯(lián)合用藥相同的效果的藥物估計(jì)劑量。CI接近1表明了加成作用(ADD)，Ol表明了拮抗作用(ANT)，CK1表明了協(xié)同作用(SYN)。這些結(jié)果表明，用scFv23/TNF融合毒素靶向表達(dá)HER-2/neu和TNFR-1的腫瘤細(xì)胞可以有效治療胰腺癌，尤其是與特定化療藥如5-FU聯(lián)用時(shí)。實(shí)施例55-氟尿嘧啶、SCFV23/TNF和5-FU加SCFV2/TNF對AKT磷酸化的影響HER-2/neu過度表達(dá)導(dǎo)致不同下游通路如Akt激酶通路的激活，這導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活。為了測定5-FU或scFv23/TNF是否影響此存活通路，用1<325劑量的5國氟尿嘧啶、scFv23或5-FU+scFv23/TNF處理L3.6pl細(xì)胞。然后以Western印跡分析用Akt和磷酸化-Akt的抗體評價(jià)Akt激酶的活化。如圖3所示，用單獨(dú)的5-FU、scFv23/TNF或聯(lián)合處理細(xì)胞對Akt總水平無影響，而5-FU+scFv23/TNF聯(lián)用能抑制64。/。Akt蛋白的磷酸化。這些結(jié)果表明，對Akt磷酸化事件的抑制作用至少部分介導(dǎo)了5-FU+scFv23/TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。實(shí)施例65-氟尿嘧啶、SCFV23/TNF和5-FU加SCFV2/TNF對BCL-2表達(dá)的影響抗凋亡蛋白Bcl-2的水平升高導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對各種化療藥，包括環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、蒽環(huán)霉素、阿糖胞苷、紫杉醇和皮質(zhì)類固醇產(chǎn)生細(xì)胞耐受(Wachter等，1999)。為了確定5-FU、scFv23/TNF或5-FU+scFv23/TNF作用是否通過Bcl-2細(xì)胞水平的改變介導(dǎo)，用IC25劑量的5-氟尿嘧啶、scFv23、TNF或5-FU+scFv23/TNF處理L3.6pl細(xì)胞。如圖4所示，用5-FU處理細(xì)胞對Bcl-2細(xì)胞水平無影響，而scFv23/TNF和5-FU+scFv23/TNF分別抑制了44%和74%的Bcl-2表達(dá)。這些結(jié)果提示，5-FU+scFv23/TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性可能由Bcl-2表達(dá)抑制介導(dǎo)。實(shí)施例75-氟尿嘧啶、SCFV23/TNF和5-FU加SCFV2/TNF對凋亡、胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP細(xì)胞水平的影響為了確定scFv23/TNF的細(xì)胞毒作用是否與凋亡有關(guān)，用TUNEL染色測定L3.6pl細(xì)胞的凋亡。5-FU+scFv23/TNF處理的細(xì)胞在處理后48小時(shí)內(nèi)顯示出凋亡性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。已知胱冬酶系列蛋白是TNF和其它細(xì)胞因子的凋亡作用的核心介導(dǎo)物。為了確定在5-FU+scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中L3.6pl細(xì)胞中胱冬酶-8和胱冬酶-3是否被激活，研究了胱冬酶-8、胱冬酶-3和其底物聚(ADP)-核糖聚合酶(PARP)的切割。5-FU處理對胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP切割無影響，而細(xì)胞接觸scFv23/TNF或scFv23/TNF與5-FU聯(lián)用后導(dǎo)致胱冬酶-8和胱冬酶-3切割。此外，scFv23/TNF與5-FU聯(lián)用在48小時(shí)后誘導(dǎo)PARP切害U(圖5)。為了確定5-FU+scFv23/TNF誘導(dǎo)的凋亡是否依賴胱冬酶-3通路的激活，在L3.6pl細(xì)胞中檢測了胱冬酶-3抑制劑對5-FU+scFv23/TNF引起的細(xì)胞毒性的影響。如圖6所示，胱冬酶-3抑制劑處理對單獨(dú)的5-FU或scFv23/TNF的細(xì)胞毒作用無影響。然而，用抑制劑預(yù)處理后進(jìn)行聯(lián)合處理(5-FU+scFv23/TNF)能夠部分逆轉(zhuǎn)觀察到的協(xié)同性細(xì)胞毒作用。這表明，聯(lián)合用藥的協(xié)同性細(xì)胞毒作用可能至少部分取決于胱冬酶驅(qū)動的通路。實(shí)施例8耙向胰腺癌中TNF的顯著性人表皮生長因子受體-2(HER-2/erbB-2)屬于一個(gè)四種跨膜受體的家族(HER-l、HER-3禾口HER-4)(Lohrisch禾卩Piccart，2001;Yarden，2001;Rubin和Yarden，2001)，它在HER家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中起到關(guān)鍵作用，通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)與其它HER受體合作調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化和存活。在幾種與多藥耐受、遷移可能性較高和患者存活時(shí)間縮短有關(guān)的癌癥中觀察到HER-2/neu過度表達(dá)(Tomaszewska等，1998;Hynes禾PStem，1994;Singleton禾BStrickler，1992;Stancovski等，1994;Torre等，1997;Safran等，2001)。由于涉及對治療劑的臨床反應(yīng)，評價(jià)了胰腺癌中HER-2/neu表達(dá)的影響，各小組采用幾種HER-2/neu耙向方案，包括采用HER-2/neu靶向的核酶(Irie等，200;Thybusch-Bemhardt等，2001;Aigner等，2000;Suzuki等，2000)、人源化抗-HER-2/neu抗體(賀賽汀)和化療方案與賀賽汀聯(lián)用(Waldmann等，2000;Buchler等，2001;Butera等，1998)。本發(fā)明具體實(shí)施方式的方法是將腫瘤細(xì)胞表面上HER-2/neu的表達(dá)用作治療靶點(diǎn)，以采用抗-HER-2/neu單鏈抗體將TNF直接遞送給腫瘤細(xì)胞(Rosenblum等，2000)本發(fā)明者先前進(jìn)行的研究證明，這種方法在將TNF導(dǎo)向體內(nèi)腫瘤細(xì)胞中高度有效，還證明，含有TNF的融合構(gòu)建物即使對TNF耐受性腫瘤細(xì)胞也有高細(xì)胞毒性。在四種胰腺癌細(xì)胞系中檢測了scFv23/TNF構(gòu)建物的機(jī)理性作用，其特征是癌基因的表達(dá)水平和對化療藥的相對反應(yīng)不同。根據(jù)不同細(xì)胞靶點(diǎn)選擇用于此示范性研究的化療藥，它們代表了具有治療價(jià)值的主要藥物類型。以前沒有檢測腫瘤靶向遞送TNF與化療藥的可能組合。scFv23/TNF和各種化療藥聯(lián)用證明，scFv23/TNF和5-FU聯(lián)用在所有胰腺腫瘤細(xì)胞系中能產(chǎn)生一致的協(xié)同作用。HER-2/neu和TNFR-1的表達(dá)與過度表達(dá)HER-2/neu的細(xì)胞如L3.6pl對化療藥與scFv23/TNF聯(lián)用更敏感的反應(yīng)之間有關(guān)。Pegram等報(bào)道了5-FU與抗-HER-2/neu單克隆抗體聯(lián)用有體外拮抗作用，而以前報(bào)道順鉑、依托泊甙和多柔比星與賀賽汀聯(lián)用有協(xié)同或加成作用(Pegram等，2000)。然而，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在所有四種胰腺癌細(xì)胞系中，scFv23/TNF與5-FU聯(lián)用產(chǎn)生一致的協(xié)同作用，scFv23/TNF與多柔比星聯(lián)用產(chǎn)生拮抗作用(表3)。已知HER-2/neu過度表達(dá)能激活A(yù)kt通路，并對許多治療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生耐受(Kneufermann等，2003)。3/4人胰腺癌細(xì)胞系顯示出活化Akt基線水平升高，HER-2/neu和p-Akt表達(dá)相關(guān)。特別地，Capan-l和L3.6pl細(xì)胞系具有高水平的HER-2/neu和活化Akt。5-FU+scFv23/TNF聯(lián)合處理L3.6pl細(xì)胞導(dǎo)致Akt磷酸化顯著降低。這表明，抑制Akt存活信號傳導(dǎo)途徑至少部分介導(dǎo)了5-FU+scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。經(jīng)證明，Bd-2過度表達(dá)會產(chǎn)生對各種化療藥物，包括環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、蒽環(huán)霉素、阿糖胞苷、紫杉醇和皮質(zhì)類固醇的細(xì)胞耐受性。(Wuchter等，1999)Sasaki等報(bào)道，癌細(xì)胞的Bd-2水平是5-FU效力的指標(biāo)(Sasaki等，2003)。本發(fā)明者測定scFv23/TNF和5-FU+scFv23/TNF能分別抑制44%和74%;然而，5-FU處理細(xì)胞對Bcl-2水平無影響。scFv23/TNF下調(diào)Bcl-2可能誘導(dǎo)L3.6pl細(xì)胞的敏感化，以對5-FU更敏感。因此，scFv23/TNF與5-FU聯(lián)用加速了Bcl-2表達(dá)的抑制。本發(fā)明者也確定了scFv23/TNF細(xì)胞毒性介導(dǎo)中的另一重要因子是胱冬酶活化級聯(lián)反應(yīng)。TNF與TNFR-1的結(jié)合可誘導(dǎo)形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物TNF-Rl-TRADD-FADD-胱冬酶原-8，導(dǎo)致胱冬酶-8活化(Nagata，1997)。認(rèn)為胱冬酶-8的活化能導(dǎo)致其它胱冬酶的蛋白水解激活(Medema等，1997)。胱冬酶-3活化使紫杉醇誘導(dǎo)過度表達(dá)HER-2/neu的SKOV3.ip159凋亡和免疫毒素誘導(dǎo)的凋亡(Keppler-Hafkemeyer等，1998)。單獨(dú)用scFv23/TOF處理和5-FU+scFv23/TNF聯(lián)合處理導(dǎo)致胱冬酶-8活化，最終切割胱冬酶-3和PARP。本發(fā)明者確定，5-FU+scFv23/TNF聯(lián)用可通過激活胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP切割引起協(xié)同的細(xì)胞毒作用。表4小結(jié)了5-FU、scFv23/TNF和5-FU+scFv23/TNF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。表4:5-氟尿嘧啶、scFv23/TNF和其聯(lián)用對示范性L3.6pl細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響的小結(jié)信號_5-氟尿嘧啶_scFv23/TNF_5-FU+scFv23/TNF"XJ^t^Sip-AktNENE丄Bcl-2_^_i_^_胱冬酶-8切割^ff胱冬酶-3切割NET卞PARP切割NENET4NE代表無效。因此，用scFv23/TNF融合毒素將細(xì)胞因子TNF遞送給表達(dá)HER-2/neu的腫瘤細(xì)胞能有效治療胰腺癌，尤其是與化療藥聯(lián)用時(shí)。實(shí)施例9實(shí)施例10-14的方法和材料材料單克隆抗-HER-2/neu抗體(Ab)、兔多克隆抗-TNFRlAb、兔多克隆抗-TNFR2Ab、兔多克隆抗-胱冬酶-8Ab、單克隆抗-胱冬酶-3Ab、單克隆抗-PARPAb、兔多克隆抗-TRADDAb、兔多克隆抗-TRAF2Ab、兔多克隆抗-IicB-aAb均獲自SantaCruzBiotechnology,加州圣克魯斯。用兔多克隆抗-磷酸化AktAb和兔多克隆抗-AktAb(CellSignalingTechnology,馬薩諸塞州貝弗利)進(jìn)行Western印跡分析。在中和試驗(yàn)中，單克隆抗-TNFR-lAb購自O(shè)ncogeneResearchProducts(加州圣地亞哥)。N陽乙?；?Asp-Glu-Val-Asp-al(Ac-DEVD-CHO)購自Sigma-AldrichCo,(密蘇里州圣路易斯)。細(xì)胞生長XTT測定試劑盒購自RocheDiagnosticsCo.(印第安納州印第安納波利斯)。細(xì)胞系和培養(yǎng)用補(bǔ)充有10。/。熱滅活胎牛血清(FBS)、2mML-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100昭/ml鏈霉素的McCoy's5A改良培養(yǎng)基培養(yǎng)SKBR-3細(xì)胞。用于我們研究的表達(dá)大量HER-2/neu的SKBR-3低代細(xì)胞為5-8代(SKBR-3/H)，而所用的SKBR-3高代細(xì)胞是40-45代，顯示HER-2/neu表達(dá)水平相對較低(SKBR-3/L)。體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)將SKBR-3細(xì)胞接種(lxl0V孔)到平底96孔微量滴定板(BectonDickinsonLabware,新澤西州FranklinLakes)中，24小時(shí)后，以三復(fù)孔加入scFv23、TNF和scFv23/TNF。為了檢測胱冬酶-3抑制劑對scFv23/TNF細(xì)胞毒性的影響，用或不用100胱冬酶-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)預(yù)處理SKBR-3/H細(xì)胞3小時(shí)，然后用不同濃度的scFv23/TNF處理。72小時(shí)后，向各孔中加入50plXTT標(biāo)記混合物(Roche)，然后再孵育該細(xì)胞4小時(shí)。用ELISA閱讀器(Bio-TekInstruments,Inc.,Winooski，佛蒙特州)測定450nm處的吸光度?？?TNFR-l抗體對scFv23/TNF處理的SKBR-3細(xì)胞生長的中和作用將SKBR-3細(xì)胞接種(lxl0"孔)到平底96孔微量滴定板(BectonDickinsonLabware，新澤西州FranklinLakes)中，24小時(shí)后，用不同濃度的抗-TNFR-l抗體預(yù)處理2小時(shí)，然后以三復(fù)孔加入TNF和scFv23/TNF。72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)(Roche)檢測細(xì)胞活力。檢測凋亡用DNA片段化和TUNEL試驗(yàn)檢測凋亡。為了評價(jià)DNA片段化，以5"05個(gè)細(xì)胞/60mm皮氏培養(yǎng)皿接種SKBR-3/H細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，然后用200nMTNF或200nMscFv23/TNF處理。24小時(shí)和48小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞，重懸于含有5mMTris-HCl、pH8、50mMEDTA、10|Lig/mlRNA酶和0.25%SDS的DNA提取緩沖液中，然后37t:孵育l小時(shí)。為了去除蛋白質(zhì)，在5(TC用100pg/ml蛋白酶K處理重懸的細(xì)胞裂解物3小時(shí)。用苯酚和氯仿提取DNA，然后用乙醇沉淀。將基因組DNA重懸于Tris-EDTA(pH8)中，在含溴乙錠的1%瓊脂糖凝膠中電泳分離。為了評價(jià)凋亡，將SKBR-3/H細(xì)胞接種于蓋玻片上，靜置過夜貼壁，然后用200nMTNF或200nMscFv23/TNF處理24小時(shí)和48小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞，通透(0.1%TritonX-IOO，0.1%檸檬酸鈉)，然后用4%多聚甲醛固定。固定細(xì)胞用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(Roche)染色。用熒光顯微鏡鑒定發(fā)生凋亡的細(xì)胞。Western印跡分析以5xl()S個(gè)細(xì)胞/60mm皮氏培養(yǎng)皿接種SKBR-3/H細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，然后用200nMscFv23、200nMTNF或200nMscFv23/TOF處理。處理后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞兩次，在0.3ml裂解緩沖液(IOmMTris-HCl，pH8，60mMKCl，1mMEDTA，1mMDTT，0.2%NP-40)中冰上裂解20分鐘。用8-15%SDS-PAGE對細(xì)胞裂解物(50嗎)進(jìn)行分離，并電轉(zhuǎn)移到Immobilon-P硝酸纖維素膜(Schleicher和SchuellInc.，新罕布什爾州西基涅)上。用含有3%牛血清白蛋白的Tris-緩沖鹽水(TBS)封閉該膜2小時(shí)，然后用不同抗體(單克隆抗-HER-2/neuAb、兔多克隆抗-TNFRlAb、兔多克隆抗-TNFR2Ab、兔多克隆抗-胱冬酶-8Ab、單克隆抗-胱冬酶-3Ab、單克隆抗-PARPAb、兔多克隆抗-TRADDAb、兔多克隆抗-TRAF2Ab、兔多克隆抗-IicB-aAb、兔多克隆抗-磷酸化AktAb和兔多克隆抗-AktAb)檢測。用ECL檢測試劑(AmershamPharmaciaBiotechInc.，新澤西州皮斯卡塔韋)1:4000稀釋的偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗-小鼠/山羊抗-兔或豬抗-山羊抗體(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)觀察免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。實(shí)施例10信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)和SCFV23/TNF敏感性之間的關(guān)系為了確定HER-2/neu、TNFR-1和TNFR-2表達(dá)水平與TNF和scFv23/TNF的細(xì)胞毒作用是否有關(guān)，我們用Western印跡分析檢測了SKBR-3/H和3/L細(xì)胞系上HER-2/neu、TNF受體-l(TNFR-l)和TNF受體-2(TNFR-2)的相對表達(dá)水平(圖7A)，并通過表5的光密度分析定量。如圖7A和表5所示，這兩種SKBR-3細(xì)胞系均表達(dá)HER-2/neu、TNFR-1和TNFR-2。表5:敏感性與SKBR-3人乳腺癌細(xì)胞系中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>*NE代表無效有趣的是，SKBR-3/H細(xì)胞的HER-2/neu表達(dá)水平比SKBR-3/L細(xì)胞高3.3倍。另一方面，SKBR-3/L細(xì)胞的TNF受體-1和TNF受體-2表達(dá)水平分別比SKBR-3/H細(xì)胞高2.3倍和4倍。HER-2/neu表達(dá)水平較高的SKBR-3/H細(xì)胞能完全耐受劑量高達(dá)6nM的TNF本身，但這些細(xì)胞對scFv23/TNF的細(xì)胞毒作用敏感(IC5『150nM)。scFv23本身的處理對這些細(xì)胞系均無作用。然而，TNF本身和scFv23/TNF對HER-2/neu表達(dá)水平較低以及TNFR-1和TNFR-2表達(dá)水平高的SKBR-3/L細(xì)胞的IC5o值相似(分別為10nM和4nM)(圖7B)。這些結(jié)果表明，SKBR-3細(xì)胞系的連續(xù)培養(yǎng)導(dǎo)致TNFR-1和TNFR-2受體上調(diào)，并伴隨HER-2/neu下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，scFv23/TNF融合構(gòu)建物可以克服HER-2/neu誘導(dǎo)的TNF耐受性。實(shí)施例11TNF受體-1對scFv23/TNF-誘導(dǎo)的生長抑制的中和作用為了測定scFv23/TNF構(gòu)建物的細(xì)胞毒作用是否完全通過與細(xì)胞表面TNFR-1受體的相互作用介導(dǎo)，檢測了抗-TNFR-l中和抗體對scFv23/TNF的SKBR-3細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響。如圖8所示，用劑量為25^g/ml抗體處理SKBR-3/L細(xì)胞能夠完全消除TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。相反，在濃度達(dá)到50嗎/ml抗-TNFR-lAb之前scFv23/TNF對SKBR-3/H細(xì)胞的細(xì)胞毒性不受影響。加入抗-TNFR-l中和抗體無法完全消除scFv23/TNF對SKBR-3/H細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。實(shí)施例12scFv23/TNF、TNF和scFv23對IkB-A和AKT通路的影響與腫瘤細(xì)胞表面上的TNF受體結(jié)合后，可通過激活啟動程序性細(xì)胞死亡的信號傳導(dǎo)途徑直接介導(dǎo)TNF-oc的細(xì)胞毒作用。為了確定與天然TNF相比，scFv23/TNF是否按照相似信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程誘導(dǎo)凋亡，測定了這三種藥物對lKB-oc、TRADD和TRAF2表達(dá)的影響。用200nMscFv23、TNF或scFv23/TNF處理過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3/H細(xì)胞不同時(shí)間，然后收獲細(xì)胞裂解物并進(jìn)行Western印跡分析。如圖9所示，用scFv23、TNF或scFv23/TNF處理細(xì)胞對TRAF2水平無影響。scFv23/TNF處理180分鐘導(dǎo)致TRADD稍有增加。30分鐘后，在TNF和scFv23/TNF處理的細(xì)胞中l(wèi)KB-a降解，而scFv23處理對lKB-a降解無影響。加入TTSfF或scFv23/TNF3小時(shí)后，lKB-a水平升高到基礎(chǔ)水平。這表明，lKB-a通路可能參與了scFv23/TNF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但這不是scFv23組分的作用。HER-2/neu過度表達(dá)導(dǎo)致不同下游通路如Akt激酶通路的激活，這導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活。為了確定scFv23/TNF是否影響此Akt存活通路，用scFv23、TNF或scFv23/TNF處理SKBR-3/H細(xì)胞。然后以Western印跡分析用Akt和磷酸化-Akt的抗體評價(jià)Akt激酶的激活。如圖10A和10B所述，用scFv23或TNF處理48小時(shí)能激活A(yù)kt磷酸化。另一方面，用scFv23/TNF處理細(xì)胞導(dǎo)致給藥后不久(30分鐘)和較長時(shí)間(48小時(shí))后磷酸化Akt下調(diào)。這表明，Akt存活信號傳導(dǎo)途徑至少部分介導(dǎo)了HER-2/neu誘導(dǎo)的TNF耐受，抑制Akt磷酸化介導(dǎo)了scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。實(shí)施例13scFv23/TNF和TNF對凋亡、胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP切割的影響為了確定scFv23/TNF的細(xì)胞毒作用是否與凋亡有關(guān)，接觸200nMTNF或scFv23/TNF后24小時(shí)和48小時(shí)提取SKBR-3/H細(xì)胞的DNA。在1%瓊脂糖凝膠上對DNA進(jìn)行電泳。在scFv23/TNF處理的細(xì)胞而非TNF處理的SKBR-3/H細(xì)胞中檢測到具有凋亡特征的DNA片段化模式(圖IIA)。也用TUNEL染色測定了SKBR-3/H細(xì)胞的凋亡。如圖11B所示，scFv23/TNF處理的細(xì)胞在接觸48小時(shí)后顯示出凋亡性細(xì)胞死亡中常見的DNA片段化以及核濃縮。已知胱冬酶系列蛋白是TNF和其它細(xì)胞因子的凋亡作用的核心介導(dǎo)物。為了確定scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡期間SKBR-3/H細(xì)胞中胱冬酶-8和胱冬酶-3是否被活化，研究了胱冬酶-8、胱冬酶-3和其底物聚(ADP)-核糖聚合酶(PARP)的切害U。用TNF處理對胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP切割無影響。相反，用scFv23/TNF處理48小時(shí)導(dǎo)致胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP的切割(圖12)。為了確定scFv23/TNF誘導(dǎo)的凋亡是否依賴胱冬酶-3通路的激活，檢測了胱冬酶-3抑制劑對scFv23/TNF的SKBR-3/H細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響。圖13顯示出，胱冬酶-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)抑制了scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。為了確定scFv23/TNF誘導(dǎo)的凋亡是否依賴胱冬酶-8和-3途徑的激活，檢測了胱冬酶抑制劑對scFv23/TNF的SKBR-3-LP細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響。圖14顯示出，總胱冬酶抑制劑(Z-VAD-FMK)、胱冬酶-8抑制劑(Z-正TD-FMK)和胱冬酶-3抑制劑(Z-DEVD-FMK)能抑制scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。此結(jié)果證明，胱冬酶-8和-3依賴性級聯(lián)反應(yīng)似乎至少部分介導(dǎo)了scFv23/TNF引起的凋亡反應(yīng)。實(shí)施例14過度表達(dá)HER-2/NEU的細(xì)胞中SCFV23/TNF的獨(dú)特凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的顯著性許多研究小組利用TNF、干擾素、IL-2和淋巴毒素實(shí)現(xiàn)利用抗體將細(xì)胞因子特異性遞送給腫瘤細(xì)胞(Rosenblum等，1991;Zuckerman等，1987;Reisfeld等，1996)。其中幾項(xiàng)研究證明，抗體靶向的細(xì)胞因子比原始細(xì)胞因子更有效。本發(fā)明者利用含有TNF的抗體構(gòu)建物初次證明，用含有TNF的重組單鏈抗體融合構(gòu)建物將TNF遞送給腫瘤細(xì)胞，靶向gp240和HER-2/neu可以克服腫瘤細(xì)胞對TNF的體外耐受(Rosenblum等，1995;Rosenblum等，2000)。至少在乳腺、卵巢和HER-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中，HER-2/neu過度表達(dá)似乎與存活優(yōu)勢和TNF耐受有關(guān)(Tang等，1994;Lichtenstein等，1990;Hudziak等，1988)。另一方面，HER-2/neu下調(diào)能提高多柔比星耐藥性腫瘤細(xì)胞系對TNF細(xì)胞毒作用的敏感性(Sleijfer等，1998)。研究還證明，乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞中的EGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也可調(diào)節(jié)TNF的細(xì)胞毒作用(Hoffmann等，1998)。本發(fā)明者確定，連續(xù)培養(yǎng)SKBR-3細(xì)胞系導(dǎo)致HER-2/neu下調(diào)，并使少量表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3/L細(xì)胞對TNF敏感，抗-HER-2/neu單鏈抗體與TNF融合組成的scFv23/TNF可克服過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3/H細(xì)胞中HER-2誘導(dǎo)的TNF耐受。產(chǎn)生scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的兩個(gè)重要因子是Akt和胱冬酶。已經(jīng)證明絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt在細(xì)胞周期進(jìn)展(Brennan等，1997;Muise-Helmericks等，1998;Gill和Downward,1999)、新生血管發(fā)生(Jiang等，2000)、抑制凋亡(Sabbatini和McCormick，1999;Zhou等，2000)和細(xì)胞生長(Verdu等，1999)中的核心作用。己知HER-2/neu過度表達(dá)能激活A(yù)kt途徑并對許多治療性藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生耐受(Yu禾卩Hung，2000;Knuefermann等，2003)。過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3/H細(xì)胞含有內(nèi)源性水平的p-Akt和Akt。用單獨(dú)的TNF或scFv23抗體處理這些細(xì)胞對細(xì)胞生長無影響，但接觸48小時(shí)后能誘導(dǎo)Akt磷酸化。與TNF的作用相反，scFv23/TNF處理導(dǎo)致Akt磷酸化水平顯著降低。結(jié)果提示，在過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3/H細(xì)胞中，Akt磷酸化在產(chǎn)生TNF耐受性中起到重要作用，抑制Akt存活信號傳導(dǎo)途徑至少部分介導(dǎo)了scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。介導(dǎo)scFv23/TNF細(xì)胞毒作用的另一重要因素是胱冬酶激活級聯(lián)反應(yīng)。TNF與TNF-R1結(jié)合可誘導(dǎo)形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物TNF-Rl-TRADD-FADD-胱冬酶原-8，導(dǎo)致胱冬酶-8被激活(Nagata，1997)。認(rèn)為胱冬酶-8的活化會導(dǎo)致其它胱冬酶的蛋白水解激活(Medema等，1997)。胱冬酶-3活化使紫杉醇誘導(dǎo)過度表達(dá)HER-2/neu的SKOV3.ipl凋亡(Ueno等，2000)和免疫毒素誘導(dǎo)的凋亡(Keppler-Hafkemeyer等，1998)。用scFv23/TNF處理以時(shí)間依賴方式導(dǎo)致胱冬酶-8活化，最終在24和48小時(shí)分別切割胱冬酶-3和PARP。數(shù)據(jù)表明，scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒機(jī)制伴隨著通過激活胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP切割誘導(dǎo)凋亡級聯(lián)反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和TNF受體表達(dá)之間有關(guān)是因?yàn)槿诤蠘?gòu)建物在物理上以不同于天然TNF的方式與TNFR-1相互作用?；蛘?，由于scFv23抗體有效內(nèi)化到細(xì)胞中，這可將TNF遞送到胞質(zhì)中，在胞質(zhì)中TNF可與胞內(nèi)TNFR-1相互作用。表6提供了觀察到的TNF和scFv23/TNF之間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的差異。表6:scFv23、TNF和scFv23/TNF對過度表達(dá)HER-2的示范性SKBR-3/H細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響的小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>體外機(jī)理研究表明，scFv23/TNF是過度表達(dá)HER-2/neu的TNF耐受性癌細(xì)胞的有效細(xì)胞毒劑。實(shí)施例15實(shí)施例16-20的示范性材料和方法材料單克隆抗-HER-2/neu抗體(Ab)、兔多克隆抗-TNF-RlAb、兔多克隆抗-TNF-R2Ab、兔多克隆抗-胱冬酶-8Ab、單克隆抗-胱冬酶-3Ab、單克隆抗-PARPAb、兔多克隆抗-TRADDAb、兔多克隆抗-TRAF2Ab和兔多克隆抗-IkB-cxAb均獲自SantaCruzBiotechnology,加州圣克魯斯。用兔多克隆抗-磷酸化AktAb和兔多克隆抗-AktAb(CellSignalingTechnology,馬薩諸塞州貝弗利)進(jìn)行Western印跡分析。在抑制試驗(yàn)中，重組人TNF-Rl:Fc融合蛋白購自Alexis(加州圣地亞哥)。總胱冬酶抑制劑(Z-VAD-FMK)、胱冬酶-8抑制齊lJ(Z-IETD-FMK)和胱冬酶-3抑制劑(Z-DEVD-FMK)購自R&DSystems(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯)。賀賽汀購自Genentech(加州南圣弗朗西斯科)。細(xì)胞生長XTT測定試劑盒購自RocheDiagnosticsCo.(印第安納州印第安納波利斯)。細(xì)胞系和培養(yǎng)用補(bǔ)充有10。/。熱滅活胎牛血清(FBS)、2mML-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100(ig/ml鏈霉素的McCoy's5A改良培養(yǎng)基(DMEM，LifeTechnologiesInc.,馬里蘭州羅克維爾)培養(yǎng)SKBR-3細(xì)胞。用于我們研究的表達(dá)大量HER-2/neu的SKBR-3低代細(xì)胞為5-8代(SKBR-3-LP)，而所用的SKBR-3高代細(xì)胞是40-45代，HER-2/neu表達(dá)水平相對較低(SKBR-3/L)。L3.6pl人胰腺癌細(xì)胞系由Killian博士(M.D.Anderson癌癥中心，得克薩斯州休斯敦)友情提供，用補(bǔ)充有10%熱滅活FBS、100單位/ml青霉素和100|ig/ml鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，LifeTechnologiesInc.)培養(yǎng)。體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)將SKBR-3細(xì)胞接種(^104/孔)到平底96孔微量滴定板(BectonDickinsonLabware，新澤西州FranklinLakes)中，24小時(shí)后，以三復(fù)孔加入scFv23、TNF、scFv23/TNF或賀賽汀(Genentech)。為了檢測胱冬酶抑制劑對scFv23/TNF的細(xì)胞毒性的影響，用或不用200總胱冬酶抑制劑(Z-VAD-FMK)、胱冬酶-8抑制劑(Z-正TD-FMK)或胱冬酶-3抑制劑(Z-DEVD-FMK)(R&D)預(yù)處理SKBR-3-LP細(xì)胞2小時(shí)，然后用不同濃度的scFv23/TNF處理。72小時(shí)后，向各孔中加入50plXTT標(biāo)記混合物(Roche)，然后再孵育該細(xì)胞4小時(shí)。用ELISA閱讀器(Bio-TekInstruments,Inc.,Winooski，佛蒙特州)測定450nm處的吸光度。評價(jià)TNF-R1在scFv23/TNF細(xì)胞毒性中的作用將SKBR-3細(xì)胞接種(lxl0V孑L)到平底96孔微量滴定板(BectonDickinsonLabware，新澤西州FranklinLakes)中，24小時(shí)后，用重組人TNF-Rl:Fc融合蛋白(Alexis)預(yù)處理2小時(shí)，然后以三復(fù)孔加入TNF、賀賽汀(Genentech)或scFv23/TNF處理。孵育72小時(shí)后，用XTT試驗(yàn)(Roche)檢測細(xì)胞活力。檢測凋亡通過DNA片段化和TUNEL試驗(yàn)檢測凋亡性細(xì)胞死亡的發(fā)生。為了評價(jià)DNA片段化，以5xl()S個(gè)細(xì)胞/60mm皮氏培養(yǎng)皿接種SKBR-3-LP細(xì)胞，靜置過夜貼壁，然后用200nMTNF或200nMscFv23/TNF處理。接觸24小時(shí)和48小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞，重懸于含有5mMTris-HCl、pH8、50mMEDTA、10pg/mlRNA酶和0.25%SDS的DNA提取緩沖液中，然后在37"C孵育1小時(shí)。為了去除蛋白質(zhì)，用100pg/ml蛋白酶K在5(TC處理重懸的細(xì)胞裂解物3小時(shí)。用苯酚和氯仿提取DNA，然后用乙醇沉淀。將基因組DNA重懸于Tris-EDTA(pH8)中，在含溴乙錠的1%瓊脂糖凝膠中電泳分離。為了用TUNEL試驗(yàn)評價(jià)凋亡，將SKBR-3-LP細(xì)胞接種于蓋玻片上，靜置過夜貼壁，然后用200nMTNF或200nMscFv23/TNF處理24小時(shí)和48小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞，通透(0.1%TritonX-IOO，0.1%檸檬酸鈉)，然后用4%多聚甲醛固定。固定細(xì)胞用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(Roche)染色。用熒光顯微鏡(Nikon，日本)鑒定發(fā)生凋亡的細(xì)胞。Western印跡分析以5xl()S個(gè)細(xì)胞/60mm皮氏培養(yǎng)皿接種SKBR-3和L3.6pl細(xì)胞系，培養(yǎng)過夜，然后用200nMscFv23、200nMTNF、200nMscFv23/TNF或10mg/ml賀賽汀處理。處理后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞兩次，在0.3ml裂解緩沖液(IOmMTris-HCl，pH8，60mMKCl，lmMEDTA，lmMDTT，0.2%NP-40)中冰上裂解20分鐘。用8-15。/。SDS-PAGE對細(xì)胞裂解物(50嗎)進(jìn)行分離，并電轉(zhuǎn)移到Immobilon-P硝酸纖維素膜(Schleicher和SchudlInc.，新罕布什爾州西基涅)上。用含有3%牛血清白蛋白的Tris-緩沖鹽水(TBS)封閉該膜2小時(shí)，然后用不同抗體(單克隆抗-HER-2/neuAb、兔多克隆抗-TNF-RlAb、兔多克隆抗-TNF-R2Ab、兔多克隆抗-胱冬酶-8Ab、單克隆抗-胱冬酶-3Ab、單克隆抗-PARPAb、兔多克隆抗-TRADDAb、兔多克隆抗-TRAF2Ab、兔多克隆抗-lKB-aAb、兔多克隆抗-磷酸化AktAb和兔多克隆抗-AktAb)檢測。用ECL檢測試齊U(AmershamPharmaciaBiotechInc.,新澤西州皮斯卡塔韋)1:4000稀釋的偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗-小鼠/山羊抗-兔或豬抗-山羊抗體(Bio-RadLaboratories,Hercules，CA)觀察免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)表示為標(biāo)準(zhǔn)化到(3-肌動蛋白的蛋白質(zhì)條帶相對強(qiáng)度。用直方圖定量條帶強(qiáng)度。實(shí)施例16對SCFV23/TNF的敏感性和與HER-2/NEU、TNF-R1和TNF-R2表達(dá)的相關(guān)性以前，本發(fā)明者實(shí)驗(yàn)室的研究顯示，長期體外傳代后人乳腺癌細(xì)胞系SKBR-3似乎下調(diào)了HER-2/neu細(xì)胞表達(dá)。Western印跡分析(圖15A)確認(rèn)，高代細(xì)胞(SKBR-3-HP，傳代>40次)表達(dá)的HER-2/neu水平比低代細(xì)胞(SKBR-3-LP，小于10代)低6倍。此外，SKBR-3-HP細(xì)胞的TNF-R2表達(dá)水平也高2.3倍，但TNF-R1水平相等。本發(fā)明者接下來評價(jià)了這兩種細(xì)胞系對賀賽汀、scFv23/TNF、orTNF的細(xì)胞毒作用的反應(yīng)。與表達(dá)低水平HER-2/neu的SKBR-3-HP細(xì)胞系相比，表達(dá)較高水平HER-2/neu的SKBR-3-LP細(xì)胞對賀賽汀的細(xì)胞毒作用更敏感。另一方面，與SKBR-3-LP細(xì)胞相比，SKBR-3-HP細(xì)胞對TNF的細(xì)胞毒作用更敏感，從而確認(rèn)了表明HER-2/neu過度表達(dá)與TNF耐受有關(guān)的先前研究。相反，兩種SKBR-3細(xì)胞系顯示出基本相同的scFv23/TNF敏感性(圖15B)。這些結(jié)果表明，連續(xù)培養(yǎng)SKBR-3細(xì)胞系導(dǎo)致HER-2/neu下調(diào)，伴隨著TNF-R2上調(diào)。其它研究小組的研究(Sacca等，1998;Amar等，1995)表明，TNF-R1主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)TNF細(xì)胞毒信號。仍不清楚這些觀察結(jié)果是否在原因上相關(guān)或與SKBR-3細(xì)胞對TNF細(xì)胞毒作用的耐受有關(guān)。然而，這些數(shù)據(jù)表明，scFv23/TNF免疫細(xì)胞因子可克服與HER-2/neu過度表達(dá)有關(guān)的TNF細(xì)胞耐受。而且，scFv23/TNF和TNF本身對SKBR-3-LP細(xì)胞的生物學(xué)活性之間的顯著差異使我們有機(jī)會比較可能產(chǎn)生這些觀察結(jié)果的機(jī)制途徑。實(shí)施例17TNF-R1對SCFV23/TNF-誘導(dǎo)的生長抑制的作用為了確定scFv23/TNF的細(xì)胞毒作用是否通過與細(xì)胞表面TNF-Rl的相互作用介導(dǎo)，本發(fā)明者特別用TNF-Rl:Fc融合蛋白阻斷了scFv23/TNF融合構(gòu)建物的TNF組分與TNF-R1的結(jié)合。如圖16所示，在SKBR-3-LP或-HP細(xì)胞中，加入TNF-Rl:Fc能夠消除scFv23/TNF或TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，但不能消除賀賽汀-誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。抑制SCFV23/TNF的細(xì)胞毒作用直接取決于所加入的TNF-Rl:Fc融合蛋白的濃度。結(jié)果表明，在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用主要由與細(xì)胞表面TNF-R1相互作用來介導(dǎo)。實(shí)施例18SCFV23/TNF對TNF-R表達(dá)的影響下一步檢測免疫細(xì)胞因子scFv23/TNF可否調(diào)節(jié)TNF-Rl的細(xì)胞表達(dá)。用scFv23、TNF、scFv23/TNF或賀賽汀處理SKBR-3-LP細(xì)胞。單獨(dú)用scFv23/TNF或scFv23抗體處理SKBR-3-LP細(xì)胞能以時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)TNF-R1表達(dá)上調(diào)。這似乎是scFv23組分的作用，因?yàn)門NF處理降低了TNF-R1水平。由于發(fā)現(xiàn)在SKBR-3-LP細(xì)胞中scFv23/TNF處理能使TNF-R1表達(dá)增加5倍，下一步我們研究了scFv23/TNF介導(dǎo)的TNF-R1上調(diào)是否僅限于特定腫瘤細(xì)胞類型。檢測了scFv23/TNF對過度表達(dá)HER-2/neu的TNF耐受性L3.6pl人胰腺癌細(xì)胞的作用。也發(fā)現(xiàn)用scFv23/TNF處理L3.6pl細(xì)胞能以SKBR-3-LP細(xì)胞相同的方式顯著誘導(dǎo)TNF-R1上調(diào)(圖17A)。這些結(jié)果表明，在過度表達(dá)HER-2/neu的TNF耐受性腫瘤細(xì)胞系中，TNF-R1的細(xì)胞表達(dá)水平與scFv23/TNF細(xì)胞毒作用直接相關(guān)，尤其是在本發(fā)明方面。除采用scFv23/TNF外，下一步檢測其它HER-2/neu耙向分子如賀賽汀可否調(diào)節(jié)TNF-R1或TNF-R2在過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3-LP細(xì)胞上的表達(dá)。如圖17B所示，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，用scFv23/TNF或賀賽汀治療對TNF-R2表達(dá)無效，與對照相比，賀賽汀誘導(dǎo)的TNF-R1表達(dá)高1.8倍，scFv23/TNF誘導(dǎo)的高7.3倍。此結(jié)果表明，TNF-R1而非TNF-R2的表達(dá)和功能參與了過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3-LP細(xì)胞對TNF的耐受。雖然數(shù)據(jù)顯示，抗-HER-2/neu單鏈抗體(scFv23)可誘導(dǎo)TNF-R1上調(diào)，但檢測了scFv23對細(xì)胞生長的影響。本發(fā)明者單獨(dú)用scFv23或與TNF聯(lián)用處理SKBR-3-LP細(xì)胞，將其與TNF或scFv23/TNF細(xì)胞毒性作比較。聯(lián)用scFv23與TNF的細(xì)胞毒性高于單用TNF，類似于SCF23/TNF融合構(gòu)建物對TOF耐受性SKBR-3-LP的作用(圖18)。因此，結(jié)果表明，用scFv23或scFv23/TNF處理誘導(dǎo)TNF-R1表達(dá)在調(diào)節(jié)過度表達(dá)HER-2/neu的癌細(xì)胞對TNF敏感性中起到核心作用。實(shí)施例19SCFV23/TNF對存活通路的影響結(jié)合TNF-R1后，TNF通過激活存活通路和凋亡通路行使兩種生物學(xué)功能。激活TNF-R1導(dǎo)致NF-kB活化(lKB-a降解)和誘導(dǎo)NF-kB調(diào)節(jié)的抗凋亡因子(包括TRADD和TRAF2等途徑)(Wajant等，1999)。為了確定與天然TNF相比scFv23/TNF的TNF組分可否活化抗凋亡通路，本發(fā)明者用200nMscFv23、TNF或scFv23/TNF處理過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3-LP細(xì)胞不同時(shí)間，收獲細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western印跡分析。如圖19所示，scFv23/TNF處理180分鐘導(dǎo)致TRADD略有降低。用scFv23、TNF或scFv23/TNF處理細(xì)胞對TRAF2水平無影響。另一方面，處理30分鐘后，TNF-或scFv23/TNF處理的細(xì)胞中IkB-oc降解；而用scFv23處理對lKB-a降解無影響。這表明影響與scFv23/TNF構(gòu)建物的TNF組分有關(guān)。加入TNF或scFv23/IW3小時(shí)后，lKB-a水平似乎再次升高到基礎(chǔ)水平。這些結(jié)果表明，IkB-oc通路可能參與了scFv23/TNF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種作用似乎不是scFv23/TNF構(gòu)建物的scFv23組分的作用。HER-2/neu過度表達(dá)能導(dǎo)致不同的下游通路如Akt激酶通路的激活，這導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活。為了確定scFv23/TNF處理是否影響Akt存活通路，用scFv23、TNF或scFv23/TNF處理SKBR-3-LP細(xì)胞。然后，以Western印跡分析用Akt和磷酸化-Akt的抗體評價(jià)Akt激酶的活化。如圖19所示，用scFv23或TNF處理對Akt的總細(xì)胞含量或磷酸化Akt無影響。另一方面，用scFv23/TNF處理細(xì)胞在給藥30分鐘后導(dǎo)致磷酸化Akt下調(diào)。這表明，scFv23/TNF可顯著調(diào)節(jié)此存活通路。這看起來是scFv23/TNF構(gòu)建物特異的，因?yàn)閱为?dú)的scFv23或TNF都沒有這種作用。實(shí)施例20SCFV23/TNF作用的顯著性在乳腺、卵巢和HER-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中，HER-2/neu過度表達(dá)似乎與存活優(yōu)勢和TNF耐受有關(guān)(Tang等，1994;Lichtenstein等，1990;Hudziak等，1988)。另一方面，HER-2/neu下調(diào)能提高多柔比星耐藥性腫瘤細(xì)胞系對TNF細(xì)胞毒作用的敏感性(Sleijfer等，1998)。研究還證明，乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞中的EGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也可調(diào)節(jié)TNF的細(xì)胞毒作用(Hoffmann等，1998)。在本研究中，抗-HER-2/neu單鏈抗體與TNF融合組成的scFv23/TNF可克服過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3/H細(xì)胞中HER-2誘導(dǎo)的TNF耐受。這表明，TNF-R1表達(dá)、胱冬酶活化和Akt磷酸化在過度表達(dá)HER-2/neu的TNF耐受性SKBR-3-LP細(xì)胞中產(chǎn)生scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的三個(gè)重要因素。首先，scFv23/TNF細(xì)胞毒性介導(dǎo)的重要因素似乎是調(diào)節(jié)TNF受體-1。擴(kuò)增HER-2/neu癌基因能導(dǎo)致NIH3T3細(xì)胞對TNF產(chǎn)生耐受，這與TNF受體結(jié)合下調(diào)相關(guān)聯(lián)(Hudziak等，1988)。蛋白激酶C下調(diào)TNF結(jié)合能力也與TNF敏感性降低有關(guān)(Unglaub等，1987)。因此，檢測了scFv23/TNF對TNF-R1表達(dá)的影響。scFv23/TNF可以時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)TNF-R1上調(diào)，阻斷scFv23/TNF與TNF受體-1的結(jié)合能夠消除scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，這表明免疫細(xì)胞因子scFv23/TOF能通過調(diào)節(jié)TNF受體-1使過度表達(dá)HER-2/neu的TNF耐受性SKBR-3-LP細(xì)胞對TNF敏感。胰腺腫瘤細(xì)胞中TNF介導(dǎo)的HER-2/neu下調(diào)與TNF敏感性增加有關(guān)(Kalthoff等，1993)。在本發(fā)明中，用scFv23/TNF處理SKBR-3-LP細(xì)胞導(dǎo)致在接觸48小時(shí)后抑制了HER-2/neu磷酸化，而用TNF處理對HER-2/neu磷酸化無影響(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在特定實(shí)施方式中，scFv23/TNF下調(diào)HER-2/neu磷酸化導(dǎo)致TNF受體-1上調(diào)。其次，scFv23/TNF細(xì)胞毒性介導(dǎo)中的重要因素似乎是各種胱冬酶的參與。TNF誘導(dǎo)的凋亡主要由TNF-R1介導(dǎo)(Tartaglia等，1993)。TNF與TNF-RI的結(jié)合可誘導(dǎo)形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物TNF-Rl-TRADD-FADD-胱冬酶原-8，導(dǎo)致胱冬酶-8活化(Nagat，1997)。認(rèn)為胱冬酶-8的活化會導(dǎo)致其它胱冬酶的蛋白水解激活(Medema等，1997)。胱冬酶-3活化使紫杉醇誘導(dǎo)過度表達(dá)HER-2/neu的SK0V3.ipl凋亡(Ueno等，2000)和免疫毒素誘導(dǎo)的凋亡(Keppler-Hafkemeyer等，1998)。用scFv23/TNF處理以時(shí)間依賴方式導(dǎo)致胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP切割活化。數(shù)據(jù)表明，scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒機(jī)制伴隨著通過TNF-R1激活胱冬酶-8、胱冬酶-3和PARP切割誘導(dǎo)凋亡級聯(lián)反應(yīng)。最后，scFv23/TNF細(xì)胞毒性介導(dǎo)中的另一重要因素是調(diào)節(jié)Akt磷酸化。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt在細(xì)胞周期進(jìn)展(Brennan等，1997;Muise-Helmericks等，1998;Gille和Downward,1999)、新生血管發(fā)生(Jiang等，2000)、抑制凋亡(Sabbatini和McCormick，1999;Zhou等，2000)和細(xì)胞生長(Verdu等，1999)中起到核心作用。已知過度表達(dá)HER-2/neu能激活A(yù)kt通路，并對許多治療性藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生耐受(Yu禾卩Hung，2000;Kneufermann等，2003)。過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3-LP細(xì)胞含有內(nèi)源性水平的p-Akt和Akt。用scFv23或TNF處理對Akt的總細(xì)胞水平或磷酸化Akt無影響。另一方面，用scFv23/TNF處理細(xì)胞導(dǎo)致磷酸化Akt下調(diào)。結(jié)果表明，Akt磷酸化在過度表達(dá)HER-2/neu的SKBR-3-LP細(xì)胞中產(chǎn)生TNF耐受方面起到重要作用，抑制Akt存活信號傳導(dǎo)途徑至少可部分介導(dǎo)scFv23/TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。總之，本發(fā)明者觀察到用免疫細(xì)胞因子scFv23/TNF處理SKBR-3-LP細(xì)胞導(dǎo)致TNF-R1表達(dá)上調(diào)、Akt磷酸化下調(diào)和TNF誘導(dǎo)的通過切割胱冬酶-8、胱冬酶-3和聚ADP-核糖聚合酶的凋亡。圖20小結(jié)了觀察到的TNF和scFv23/TNF引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件差異。體外機(jī)制研究表明，scFv23/TNF通過過度表達(dá)TNF受體-1使過度表達(dá)HER-2/neu的TNF耐受性SKBR-3-LP細(xì)胞對TNF誘導(dǎo)的凋亡敏感，在具體實(shí)施方式中，靶向HER-2/neu的scFv23/TNF可能是天生能耐受TNF的過度表達(dá)HER-2/neu的癌細(xì)胞的有效細(xì)胞毒劑。此外，免疫細(xì)胞因子scFv23/TNF對表達(dá)中等水平HER-2/neu的MCF-7乳腺腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性高于TNF本身(數(shù)據(jù)未顯示)。在本發(fā)明的具體方面，scFv23/TNF免疫細(xì)胞因子不可能只克服過度表達(dá)HER-2/neu的細(xì)胞的TNF耐受性，而且可能是所有乳腺癌腫瘤的出色候選物，即使是適度表達(dá)HER-2/neu的乳腺癌腫瘤。例如，體內(nèi)藥代動力學(xué)、組織分配和異種移植物治療研究有助于在臨床上開發(fā)這種藥物。實(shí)施例21實(shí)施例22-32的示范性材料和方法細(xì)胞系人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375-M和AAB-527獲自I.J.Fidler博士(得克薩斯大學(xué)M.D.Anderson癌癥中心，UTMDACC，得克薩斯州休斯敦)和B.Giovanella博士(Stehlin基金會，得克薩斯州休斯敦)。用補(bǔ)充有10。/c)胎牛血清(FBS)、丙酮酸鈉(lmM)、非必需氨基酸(0.01mM)、谷氨酰胺(2mM)、MEM維生素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)A375-M細(xì)胞。用含有10%FBS、丙酮酸鈉(lmM)的DMEM培養(yǎng)AAB-527細(xì)胞。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤H4細(xì)胞獲自BryantDarnay博士(UTMDACC)。用補(bǔ)充有10%FBS、4.5g/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)H4細(xì)胞。人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR3購自美國組織和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，馬里蘭州羅克維爾)。用10%FBS、谷氨酰胺(2mM)改良的McCoy5A培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，通過每周傳代兩次維持于對數(shù)期。scFvMEL/TNF融合蛋白的表達(dá)和純化用基于PCR的構(gòu)建方法構(gòu)建scFvMEL/TNF融合基因。最后將融合基因克隆入細(xì)菌表達(dá)載體pET32a(+)，如上所述表達(dá)和純化可溶性融合蛋白(Mujoo等，1995)。將最后純化的蛋白質(zhì)儲存于4t:。表達(dá)scFvMEL/TNF蛋白的SDS-PAGE和Western印跡分析在還原條件下用10%SDS-PAGE電泳分析蛋白質(zhì)樣品，通過考馬斯藍(lán)染色觀察。用兔抗-scFvMEL抗體(由MDACCCoreFacility產(chǎn)生)或用兔抗-huTNFa抗體(Sigma，密蘇里州圣路易斯)進(jìn)行Western分析，然后用辣根過氧化物酶(HRP)-標(biāo)記的山羊抗-兔IgG(h5000稀釋)孵育，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL，AmershamPharmaciaBiotech)檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，曝光到X射線膠片上。細(xì)胞毒試驗(yàn)用結(jié)晶紫染色評價(jià)各種藥物對對數(shù)期培養(yǎng)的人細(xì)胞的細(xì)胞毒性(Rosenblum等，1991)。簡要說，4><103個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板中，37°C、5%0)2下靜置24小時(shí)貼壁。24小時(shí)后，用含有不同濃度的TNF或純化scFvME/TNF的培養(yǎng)基交換培養(yǎng)基。72小時(shí)后，用結(jié)晶紫染色確定TNF和scFvMEL/TNF對培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長的影響，用96孔多掃描器自動閱讀器以595nm測定染色孔的光密度。用Western印跡測定IkBoi用scFvMEL/TNF或TNF處理細(xì)胞不同時(shí)間，洗滌細(xì)胞，用含有50mMTris、150mMNaCl、5mMEDTA、100mMDTT、1%TritonX-IOO、2pg/ml亮抑肽酶和2嗎/ml抑肽酶的裂解緩沖液裂解。將等量的總蛋白加到8.5%SDS-PAGE上，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Western印跡測定，用1:3000稀釋的抗-IicBa抗體檢測。用PBST洗膜，用偶聯(lián)于HRP的第二抗體處理。用ECL檢測系統(tǒng)觀察抗原-抗體反應(yīng)。p38-MAPK激活試驗(yàn)用一定劑量的scFvMEL/TNF或TTSfF處理細(xì)胞不同時(shí)間，收獲細(xì)胞，用裂解緩沖液裂解。將等量(50pg)總蛋白加到12%SDS-PAGE凝膠上，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Western印跡，用兔產(chǎn)生的MKK3抗體、磷酸化-MKK3/MKK6抗體、p38MAP激酶抗體、磷酸化-p38MAP激酶(Thrl80/Tryl82)抗體、ATF-2或磷酸化-ATF-2抗體(NewEnglandBiolabs)檢測(l:3000稀釋)。然后，用HRP-山羊抗兔IgG(l:5000稀釋)處理、隨后用ECL檢測，以觀察Western印跡。SAPK/JNK激活試驗(yàn)用相同濃度的TNF或scFvMEL/TNF37'C處理對數(shù)期細(xì)胞不同時(shí)間。用細(xì)胞裂解緩沖液提取細(xì)胞裂解物。在10%SDS-PAGE的各泳道上分辨50-|ig等份蛋白，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用MKK4、磷酸特異性抗-SEKl/MKK4、SAPK/JNK、磷酸特異性抗-p54/46SAPK/JNK(Thrl83/Tyr185)、c-Jun或磷酸化c-Jun的兔多克隆抗體(1:3000稀釋)(NewEnglandBiolabs)檢測。然后用HRP-山羊抗-兔IgG(l:5000稀釋)孵育該膜，用ECL檢測系統(tǒng)檢測條帶。PARP切割的分析簡要說，用濃度為1nM的TNF以2xl()s個(gè)細(xì)胞/ml處理A375-M細(xì)胞24小時(shí)，用200nM的濃度以2xl()s個(gè)細(xì)胞/ml處理AAB-527細(xì)胞，或者用濃度為0.1nM的scFvMEL/TNF以2x1(^個(gè)細(xì)胞/ml處理A375-M細(xì)胞24小時(shí)，用20nM的濃度以2x106個(gè)細(xì)胞/ml處理AAB-527細(xì)胞。孵育后，在0.05ml細(xì)胞裂解緩沖液中冰上孵育細(xì)胞30分鐘以制備細(xì)胞提取物。用7.5y。SDS-PAGE凝膠分辨來自各上清液的50卞g蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用抗-PARP抗體(RocheMolecularBiochemicals，印第安納州印第安納波利斯)檢測轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)，用HRP-山羊抗-小鼠IgG檢測，用ECL發(fā)色。檢測到該抗體識別的切割(86kDa)和未切割(116kDa)的蛋白就代表PARP被降解。胱冬酶-3激活用I.C.so濃度的scFvMEL/TNF或TNF處理細(xì)胞不同時(shí)間(l小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)和24小時(shí))。然后，將相同量的總蛋白(50[ig)加到12。/。SDS-PAGE凝膠上，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Western印跡，用切割胱冬酶-3的單克隆抗體(NewEnglandBiolabs)進(jìn)行檢測，然后用HRP-山羊抗小鼠IgG孵育，用ECL檢測系統(tǒng)檢測。原位細(xì)胞死亡檢測(TUNEL)用I.C.5Q的scFvMEL/TNF或TNF處理16孔室玻片(Nunc)中的細(xì)胞(每孔10,000個(gè)細(xì)胞)24小時(shí)，用PBS簡單洗滌。加入3.7%甲醛，室溫處理IO分鐘固定細(xì)胞，用0.1%TritonX-IOO、0.%擰檬酸鈉在冰上通透2分鐘。用TUNEL反應(yīng)混合物(RocheMolecularBiochemicals，印第安納州印第安納波利斯)37。C孵育細(xì)胞60分鐘。最后洗滌步驟后，在NikonEclipseTS-100熒光顯微鏡下分析細(xì)胞。用Western印跡檢測黑色素瘤細(xì)胞上的TNF受體和TNF受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白將相同量的細(xì)胞裂解物總蛋白加到SDS-PAGE上，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Western印跡分析。用TNFRl、TNFR2、TRADD、TRAF2、RIP和(3-肌動蛋白的第一抗體(SantaCruzBiotech、力n州圣克魯斯)檢測蛋白質(zhì)，然后用HRP偶聯(lián)的第二抗體檢測，最后用ECL檢測系統(tǒng)檢測，并曝光到X射線膠片上。scFvMEL/TNF的內(nèi)化將細(xì)胞接種到16-孔室玻片中(每孔lxl0"個(gè)細(xì)胞)，加入25嗎/ml抗-TNFRl抗體預(yù)封閉1小時(shí)，然后用1.C.5o濃度的scFvMEL/TNF處理4小時(shí)、1小時(shí)等。用甘氨酸緩沖液(500mMNaCl，0.1M甘氨酸，pH2.5)處理以去除細(xì)胞表面結(jié)合，用50mMTris，pH7.5中和，然后進(jìn)行免疫熒光雙染色。簡要說，用3.7%甲醛固定細(xì)胞，用PBS配制的0.1%TritonX-100通透。用0.5%BSA封閉后，用兔抗-人TNF或兔抗scFvMEL抗體室溫孵育細(xì)胞30分鐘，然后用含有碘化丙錠(PI，2.5嗎/ml)的FITC偶聯(lián)的抗兔IgG(l:100稀釋，Sigma)室溫避光孵育30分鐘。用PBS洗滌樣品，進(jìn)行空氣干燥。用含有1mg/mlPI的不變色DABCO封固劑封固玻片，在NikonEclipseTS-100熒光顯微鏡下分析。制備用于微陣列分析的RNA用1.C.5。濃度的scFvMEL/TNF或TNF處理人黑色素瘤AAB527細(xì)胞24小時(shí)，未處理細(xì)胞用作對照。按照廠商說明用TRIzol試劑(LifeTechnologies,Inc.，Gaithersburg，MD)從約^107個(gè)細(xì)胞中分離RNA。用變性的甲醛/瓊脂糖凝膠電泳評價(jià)總RNA的質(zhì)量。由得克薩斯州休斯敦的M.D.Anderson癌癥中心的癌癥基因組學(xué)核心實(shí)驗(yàn)室和生物信息學(xué)部進(jìn)行微陣列分析。實(shí)施例22編碼SCFVMEL/TNF融合蛋白的質(zhì)粒的表達(dá)用PCR構(gòu)建scFvMEL/TNF融合基因并連接到細(xì)菌蛋白表達(dá)載體pET32中(圖21)。在T7啟動子控制下用大腸桿菌菌株AD494(DE3)plysS表達(dá)融合蛋白，通過加入IPTG誘導(dǎo)合成靶蛋白。用TALON-金屬親和層析純化可溶性蛋白質(zhì)，通過接觸重組腸激酶(rEK)從靶蛋白上切下His-尾。然后，通過Q-瓊脂糖FF離子交換層析進(jìn)一步純化(polish)融合構(gòu)建物。SDS-PAGE顯示，Talon層析高度純化了遷移到預(yù)計(jì)分子量62kDa處的耙蛋白。在還原條件下用酶切下17kDa標(biāo)簽，使天然scFvMEL/TNF蛋白遷移到45kDa處(圖22A)。用兔抗人TNF(圖22B)或兔抗-scFvMEL抗體(圖22C)經(jīng)Western印跡確認(rèn)最終融合蛋白的組合物。用DNA序列分析再次確認(rèn)了構(gòu)建物結(jié)構(gòu)。實(shí)施例23在培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞中SCFVMEL/TNF和TNF的細(xì)胞毒作用分別評價(jià)了scFvMEL/TNF對對數(shù)期的抗原-陽性、TNF敏感性人黑色素瘤A375-M細(xì)胞和抗原-陽性、TNF-耐受性人黑色素瘤AAB-527細(xì)胞的細(xì)胞毒性。將這些效果與抗原-陰性、TNF-敏感性人乳腺癌SK-BR3-HP和抗原-陰性、TNF-耐受性人神經(jīng)膠質(zhì)瘤H4細(xì)胞作比較。結(jié)果顯示，scFvMEL/TNF對抗原-陽性A375-M細(xì)胞的作用(I.C.so0.1nM)似乎比天然TNF(I.C.so1.4nM)高10倍(p0.0001)。scFvMEL/TNF對TNF-敏感性、抗原陰性SK-BR3-HP細(xì)胞的細(xì)胞毒性(I.C.502.5nM)顯示出類似于真正TNF(I.C.M)2.7nM)的劑量反應(yīng)曲線(pX).05)。在劑量高達(dá)100nM時(shí)，scFvMEL/TNF對抗原陰性、TNF耐受性H4細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用。然而，scFvMEL/TNF對抗原陽性、TNF耐受性人黑色素瘤AAB-527細(xì)胞顯示出顯著劑量相關(guān)的細(xì)胞毒作用(I.C.5o20nM)。相反，這些AAB-527細(xì)胞在濃度高達(dá)5000nM時(shí)能耐受TNF的細(xì)胞毒作用(表7)。表7:scFvMEL/TNF與TNF對不同細(xì)胞系的細(xì)胞毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>a:72小時(shí)處理b:3次獨(dú)立試驗(yàn)的數(shù)據(jù)c:所示濃度下無細(xì)胞毒作用d:耙向指數(shù)二TNF的IC50/scFvMEL/TNF的IC50實(shí)施例24scFvMEL/TNF和TNF均可誘導(dǎo)IkBA降解。用Western印跡分析研究IkBcc的降解。NF-kB以其失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中，與IicB-a結(jié)合。MB-a降解對NF-kB激活和易位至核很重要。在scFvMEL/TNF處理之前和之后用Western印跡分析胞質(zhì)中IkB-cc的水平，結(jié)果顯示，在A375-M和AAB-527細(xì)胞上，scFvMEL/TNF處理能從15分鐘開始引起IkB-cx降解。30分鐘時(shí)完全降解，60分鐘時(shí)重新合成。單獨(dú)用TNF處理后在這些細(xì)胞上觀察到相似的概況(圖23A)?？贵wZME-018是scFvMEL重組片段的母體鼠抗體。這兩種物質(zhì)都識別人黑色素瘤細(xì)胞表面上存在的gp240靶抗原上相同的抗原結(jié)構(gòu)域(Burger和Dayer，2002;Boris和Steinke，2003;Bharti和Aggarwal，2002;Orlowski和Baldin，2002;Sun和Andersson，2002)。用ZME-018預(yù)處理A375-M和AAB-527細(xì)胞4小時(shí)，然后用scFvMEL/TNF處理并檢測胞質(zhì)中的lKBa水平時(shí)，抗體預(yù)處理對scFvMEL/TNF誘導(dǎo)的IkBcx降解無顯著影響(圖23B)。實(shí)施例25TNF和SCFVMEL/TNF對P38-MAP激酶通路的影響用scFvMEL/TNF和TNF接觸A375-M或AAB527細(xì)胞以激活p38MAP激酶通路。用scFvMEL/TNF處理觀察到的激活事件比TNF處理觀察到的激活事件發(fā)生得略晚。對于A375-M細(xì)胞，TNF處理30分鐘后，scFvMEL/TNF處理45分鐘后激活MKK3。MKK3通過磷酸化Thr180和Tyr182活化p38MAP激酶。激活的p38MAP激酶能磷酸化轉(zhuǎn)錄因子ATF-2等(圖24)。實(shí)施例26TNF而非SCFVMEL/TNF能激活SAPK/JNK通路接觸TNF能快速刺激人黑色素瘤A375-M和AAB-527細(xì)胞中SAPK7JNK活化。在AAB527細(xì)胞中，經(jīng)TNF處理5分鐘后開始磷酸化MKK4?；罨腗KK4也能在5分鐘后通過磷酸化Thr183和Tyr185激活SAPK/JNK，顯示出胞質(zhì)p54/p46?；罨疭APK/JNK結(jié)合于c-Jun轉(zhuǎn)錄因子的N末端區(qū)并導(dǎo)致c-Jun的磷酸化。與TNF耐受性AAB527細(xì)胞相比，TNF在TNF敏感性A375-M中誘導(dǎo)的磷酸化信號p54/p46低得多。然而，用scFvMEL/TNF處理AAB-527或A-375M黑色素瘤細(xì)胞時(shí)，沒有觀察到MKK4、SAPK/JNK或c-Jun的磷酸化(圖25)。實(shí)施例27用SCFVMEL/TNF而非TNF處理能誘導(dǎo)抗原陽性、TNF耐受性黑色素瘤細(xì)胞凋亡用TNF(lnM)或scFvMEL/TNF(0.1nM)處理抗原陽性、TNF敏感性A375-M黑色素瘤細(xì)胞24小時(shí)能抑制其生長并顯示出PARP切割。相反，用濃度高達(dá)200nM的TNF處理TNF耐受性AAB-527黑色素瘤細(xì)胞24小時(shí)沒有顯示PARP切割。相反，用scFvMEL/TNF(20nM)處理這些細(xì)胞24小時(shí)后，明顯觀察到PARP切割(圖26A)。用TNF和scFvMEL/TNF處理A375-M細(xì)胞4小時(shí)后導(dǎo)致胱冬酶-3激活。用scFvMEL/TNF而非TNF處理AAB-527細(xì)胞8小時(shí)后導(dǎo)致胱冬酶-3激活(圖26B)。TUNEL試驗(yàn)顯示，scFvMEL/TNF或TNF處理A375-M細(xì)胞24小時(shí)后出現(xiàn)凋亡核，而僅在用scFvMEL/TNF而非TNF處理的AAB-527細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)陽性凋亡核(圖26C)。實(shí)施例28人黑色素瘤A375-M和AAB-527細(xì)胞表達(dá)TNF受體和TNF受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白用Western印跡檢測到A375-M和AAB-527上的TNFRl和TNFR2。也在黑色素瘤細(xì)胞上檢測到TRADD、TRAF2禾BRIP。用scFvMEL/TNF處理A375-M細(xì)胞16小時(shí)后、用TNF處理24小時(shí)后觀察到TRAF2水平下降。Western結(jié)果顯示，用scFvMEL/TNF處理AAB-527細(xì)胞16小時(shí)后TRADD和RIP下降，但用TNF處理這些細(xì)胞時(shí)沒有觀察到顯著改變(圖27)。實(shí)施例29中和性抗-TNFRl抗體對scFvMEL/TNF的A375-M細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響用抗-TNFRl抗體(25|ig/ml，AlexisBiochemicals)中和抗原陽性、TNF敏感性A375-M細(xì)胞或抗原陰性、TNF敏感性SKBR3-HP細(xì)胞上TNF受體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。結(jié)果(圖28)顯示，在SKBR3-HP或A375-M細(xì)胞上，抗-TNFRl可中和TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(均為100。/c))。重要的是，抗-TNFRl可中和scFvMEL/TNF對SKBR3-HP的細(xì)胞毒性(100%),但不能中和scFvMEL/TNF對A375-M的細(xì)胞毒性。這表明，scFvMEL/TNF構(gòu)建物對耙細(xì)胞的細(xì)胞毒作用可能不是單獨(dú)通過與TNFR1受體相互作用發(fā)生的。實(shí)施例30經(jīng)共聚焦顯微鏡觀察scFvMEL/TNF內(nèi)化到抗原陽性A375-M細(xì)胞中如免疫熒光顯微術(shù)所示，用scFvMEL/TNF處理短至1小時(shí)后，scFvMEL/TNF的TNP部分被有效遞送到A375-M細(xì)胞胞漿中。接觸4小時(shí)后，胞漿的熒光信號強(qiáng)度增加，并在其后24小時(shí)中維持恒定。實(shí)施例31微陣列分析評價(jià)的SCFVMEL/TNF和TNF的作用用cDNA微陣列的分析鑒定未處理的TNF耐受性AAB527細(xì)胞樣品和用TNF或scFvMEL/TNF處理24小時(shí)的細(xì)胞樣品中表達(dá)有差異的基因。2500個(gè)基因的陣列分析表明，scFvMEL/TNF和TNF處理使67個(gè)基因下調(diào)、63個(gè)基因上調(diào)。此外，單獨(dú)用scFvMEL/TNF處理使155個(gè)基因下調(diào)、132個(gè)基因上調(diào)。鑒定的基因主要參與了細(xì)胞表面受體連接的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)。scFvMEL/TNF融合蛋白能下調(diào)參與細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的特定基因以及調(diào)節(jié)核苷酸代謝的基因(表8)。表8:經(jīng)微陣列分析AAB-527細(xì)胞上由scFvMEL/TNF而非TNF下調(diào)或上調(diào)的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>實(shí)施例32scFvMEL/TNF克服TNF耐受性的顯著性惡性黑色素瘤是具有高轉(zhuǎn)移性和對各種治療包括化療和Y-放療反應(yīng)差的癌癥的主要例子(Bian等，2002)。本發(fā)明者以前報(bào)道(Mujoo等，1995)，稱為scFvMEL/TNF的融合構(gòu)建物由識別80°/。人黑色素瘤細(xì)胞上遞呈的gp240抗原的表面結(jié)構(gòu)域的抗體scFvMEL組成。與單獨(dú)TNF相比，TNF經(jīng)抗體特異性遞送至黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加。此外，本發(fā)明者證明，抗體-TNF化學(xué)偶聯(lián)物和融合構(gòu)建物能夠?qū)NF遞送到體內(nèi)腫瘤中(Tamanini等，2003)。而且，TNF的化學(xué)偶聯(lián)物對TNF耐受性黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性很高(Rosenblum等，1991;Tamanini等，2003)。然而，本發(fā)明者確認(rèn)，scFvMEL/TNF對僅耐受TNF的人黑色素瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性，并且它對敏感性細(xì)胞的活性高于天然TNF。不出所料，鑒定到scFvMEL/TNF和TNF對抗原陰性細(xì)胞的細(xì)胞毒性之間沒有顯著性差異。進(jìn)行了機(jī)制研究，以鑒定對于理解scFvMEL/TNF為何能克服TNF細(xì)胞耐受性很重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。先前研究(Adams和Schier，1999)證明，TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用中的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件是激活NF-KB和MAP激酶，導(dǎo)致誘導(dǎo)凋亡。在正常情況下，NF-KB以由p50、p65和lKB-a組成的異源三聚體的失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中?；罨螅瑤追N生長調(diào)節(jié)基因如ICAM-1、VCAM-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、cIAP2(凋亡的細(xì)胞抑帝排J)都受NF-kB活化調(diào)節(jié)(Lyu等，submitted;Minami等，2003;Harimaya等，2000;Schoemaker等，2002)。因此，NF-kB似乎是內(nèi)穩(wěn)態(tài)的核心調(diào)節(jié)物，并且是癌癥藥物開發(fā)的潛在靶點(diǎn)(Lin，2003;Xia等，1995)。然而，各種應(yīng)激刺激能啟動NF-kB活化，這些刺激本身即可引起凋亡(Marti等，1997)。本發(fā)明者證明，scFvMEL/TNF和TNF在30分鐘內(nèi)都能誘導(dǎo)TNF敏感性和TNF耐受性人黑色素瘤細(xì)胞上的IkB-oc降解。而且，用scFvMEL/TNF或TNF處理16小時(shí)后的A375-M細(xì)胞上、或用scFvMEL/TNF處理16小時(shí)后的AAB-527細(xì)胞上，NF-kB活化的銜接子蛋白如TRAF2或RIP都降低。這表明，即使在耐受性細(xì)胞中TNF也可誘導(dǎo)早期和瞬時(shí)NF-kB活化。由于ZME-018和scFvMEL/TNF共同給藥不能防止MB-a活化，所以發(fā)現(xiàn)scFvMEL/TNF活化NF-kB是經(jīng)由TNF配體-受體相互作用發(fā)生的。研究提示，根據(jù)不同細(xì)胞類型，NF-kB轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)細(xì)胞存活并誘導(dǎo)凋亡，NF-kB活化和凋亡直接相關(guān)，然而，NF-kB的組成性活化可引起凋亡抗性(Hehlgans和Mannel，2002)。因此，在人黑色素瘤細(xì)胞上通過檢測胱冬酶-3和PARP切割比較scFvMEL/TNF與天然TNF誘導(dǎo)的凋亡。PARP是胱冬酶3的底物(CPP-32)，PARP的特異性切割是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志(Lip沐e(cuò)等，1996)。scFvMEL/TNF構(gòu)建物能誘導(dǎo)TNF敏感性和TNF耐受性人黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生PARP切割和凋亡(TUNEL)。然而，天然TNF僅在TNF敏感性而非TNF耐受性黑色素瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)PARP切割。這表明，融合構(gòu)建物可通過關(guān)于凋亡通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)部分克服TNF耐受。通過研究p38MAP激酶和SAPK/JNK存活通路的活化進(jìn)一步鑒定了scFvMEL/TNF融合蛋白的細(xì)胞毒機(jī)制。即使scFvMEL/TNF和TNF都能活化p38MAP激酶通路，但TNF能在早期(5分鐘內(nèi))快速誘導(dǎo)胞質(zhì)MKK4磷酸化，導(dǎo)致SAPK/JNK的活化/磷酸化。而且，不出所料，TNF在TNF耐受性黑色素瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)的SAPK/JNK磷酸化高于TNF敏感性細(xì)胞中。另一方面，用scFvMEL/TNF構(gòu)建物處理導(dǎo)致SAPK/JNK通路活化水平降低，這表明SAPK/JNK存活通路的活化可能通過在接觸TNF時(shí)增加細(xì)胞存活產(chǎn)生所觀察的細(xì)胞對TNF細(xì)胞毒性耐受。這些研究強(qiáng)烈表明，scFvMEL/TNF融合構(gòu)建物與TNF的細(xì)胞毒性不同之處主要在于對SAPK/JNK存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。TNF文獻(xiàn)中熟知相反通路的活化(Lin，2003)。在幾種細(xì)胞系中，接觸TNF導(dǎo)致活化SAPK/JNK級聯(lián)反應(yīng)和啟動程序性細(xì)胞死亡。Marti等的研究(Marti等，1997)說明在人黑色素瘤細(xì)胞系中SAPK可顯著影響TNF誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但JNK/SAPK途徑的上調(diào)與主要由細(xì)胞類型和位置決定的各種作用有關(guān)。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，降低SAPK/JNK活性導(dǎo)致凋亡是融合構(gòu)建物提高對TNF敏感性細(xì)胞的細(xì)胞毒性以及對TNF耐受性細(xì)胞活性的重要機(jī)制。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，TNF和本文所述示范性融合構(gòu)建物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件之間的區(qū)別是所述構(gòu)建物可以不同于TNF的方式與TNFR1表面受體相互作用。本發(fā)明者證明，抗-TNFRl抗體可有效中和抗原陰性或抗原陽性細(xì)胞中TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。雖然這種中和抗體能中和scFvMEL/TNF對抗原陰性細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但它不能中和對抗原陽性細(xì)胞的細(xì)胞毒性?；蛘?，此數(shù)據(jù)可說明，scFvMEL/TNF的細(xì)胞毒作用可能不能完全通過與細(xì)胞表面TNF受體相互作用進(jìn)行。scFvMEL/TNF的內(nèi)化研究顯示，接觸1小時(shí)后能將融合構(gòu)建物的TNF部分遞送到人黑色素瘤細(xì)胞胞漿中。如果與天然TNF相比scFvMEL/TNF誘導(dǎo)了對細(xì)胞毒性、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和獨(dú)特的基因概況的不同影響，這些影響不同的一種可能解釋是遞送到胞內(nèi)某部分的TNF可能與胞內(nèi)TNFR1或其它胞內(nèi)蛋白相互作用，以轉(zhuǎn)導(dǎo)獨(dú)特的信號。以下觀察結(jié)果支持了這種實(shí)施方式許多細(xì)胞(包括A-375和AAB527黑色素瘤細(xì)胞)的TNFR1胞內(nèi)累積水平高(Hehlgans和Mannel，2002)以及微陣列分析鑒定到與TNF相比、scFvMEL/TNF融合構(gòu)建物調(diào)節(jié)的獨(dú)特基因。因此，與天然TNF單獨(dú)相比，scFvMEL/TNF融合蛋白對黑色素瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性更高，并且對TOF耐受性細(xì)胞有細(xì)胞毒性。融合構(gòu)建物同時(shí)誘導(dǎo)凋亡事件并下調(diào)SAPK/JNK存活通路。這有別于TNF本身的作用，TNF本身誘導(dǎo)存活和凋亡事件。微陣列分析評價(jià)與單獨(dú)的TNF相比，抗體介導(dǎo)的TNF遞送至細(xì)胞活化了許多不同的胞內(nèi)通路，在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，這種差異至少部分由于以不同于TNF的方式與TNF受體相互作用。實(shí)施例33實(shí)施例34-36的示范性材料和方法細(xì)胞系用含有100/o胎牛血清(FBS)和抗生素(0.05mg/ml)的Dulbecco，sMEM(DMEM)培養(yǎng)A375-M(gp240抗原陽性、TNF敏感性人黑色素瘤)、AAB-527(gp240抗原陽性、TNF耐受性人黑色素瘤)、SKBR3-HP(gp240陰性、TNF敏感性人乳腺癌)、H4(gp240陰性、TNF耐受性人神經(jīng)膠質(zhì)瘤)，特別加入谷氨酰胺(200mM)和丙酮酸鈉(100mM)培養(yǎng)AAB-527和A375-M，也特別加入非必需氨基酸(IOmM)和MEM維生素培養(yǎng)A375-M細(xì)胞。組織培養(yǎng)基和添加物購自LifeTechnologiesInc.,(馬里蘭州羅克維爾)。轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定的A375GFP細(xì)胞系通過將含有pCMV-EGFP的增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)編碼序列的HindIII/XhoI片段克隆入pcDNA3.1中的相同位點(diǎn)產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA3-EGFP。用1ml/孔含有10。/。FBS的DMEM培養(yǎng)基在六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，直到達(dá)到60-70%匯合。以2嗎DNA/l(^個(gè)細(xì)胞的比例將脂質(zhì)體DNA(Lipofectamine-pcDNA3-GFP復(fù)合物)或非脂質(zhì)體DNA(pcDNA3)直接加入培養(yǎng)板中。為了產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)EGFP的A375細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)開始進(jìn)行G418(400嗎/ml)選擇。用G418選擇10天后，用熒光顯微鏡檢測存活細(xì)胞。挑選熒光集落進(jìn)行擴(kuò)增。用熒光/可見光顯微鏡評價(jià)GFP在細(xì)胞中的表達(dá)，以直接評價(jià)發(fā)熒光細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。scFvMEL/TNF、scFvMEL和重組人TNF的產(chǎn)生用基于PCR的構(gòu)建方法構(gòu)建scFvMEL/TNF融合基因。最后將融合基因克隆入細(xì)菌表達(dá)載體pET32a(+)，如前所述表達(dá)和純化可溶性融合蛋白(Liu等，2004)。將來自質(zhì)粒pET32scFvMEL/TNF的人重組TNF基因亞克隆到pET32a(+)載體中，在大腸桿菌Origami(DE3)(Novagen，威斯康星州麥迪遜)中表達(dá)蛋白。TNF的表達(dá)和純化與融合蛋白scFvMEL/TNF相同。用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)測定TNF的生物活性，這取決于對L-929鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性，如前所述(Rosenblum等，1991)。來自RocheMolecularBiochemicals(印第安納州印第安納波利斯)的rHuTNFa用作標(biāo)準(zhǔn)品。最終純化的huTNF的生物學(xué)活性為2xl07U/mg蛋白質(zhì)。用PCR從質(zhì)粒pET32scFvMEL/TNF擴(kuò)增scFvMEL基因，將基因克隆入pET21b載體形成質(zhì)粒pET21scFvMEL。用大腸桿菌AD494(DE3)plysS表達(dá)蛋白scFvMEL。根據(jù)SteinleA等的方法(Steinle等，2001)，由包含體再折疊獲得有生物學(xué)功能的scFvMEL蛋白。經(jīng)ELISA檢測，最終純化的scFvMEL蛋白具有特異性結(jié)合活性。scFvMEL/TNF和TNF的體外細(xì)胞毒性為了檢測scFvMEL/TNF和TNF的細(xì)胞毒性，以3000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板中，37°C、5%032中貼壁24小時(shí)。24小時(shí)后，用含有不同濃度的scFvMEL/TNF或TNF的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。如前所述(Rosenblum等，1991)，用結(jié)晶紫染色測定scFvMEL/TNF和TNF對培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長的影響。在630nm處讀出細(xì)胞平板(Bio-TekInstruments,Winooski，Vt)。將吸光度與對照孔(僅培養(yǎng)基)作比較。用P-碘代苯甲酸酯(P-iodobenzoate)進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記如前所述(Rosenblum等，1995)，通過P-碘代苯甲酸酯法用125I(Dupont，特拉華州威爾明頓)標(biāo)記蛋白質(zhì)。動物模型研究顏動力學(xué),究給4-6周齡的BALB/c雌性小鼠每只小鼠注射200|il生理鹽水配制的2^Ci、5嗎總蛋白。注射后l、2、4、8、24、48、72小時(shí)，在各測定時(shí)間用斷頸法處死兩只小鼠。從胸腔取血樣，稱重，用Y計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以測定總放射性(Packard，型號5360)。也離心血樣，傾析血漿，計(jì)數(shù)測定放射性。用最小平方非線性回歸(PKAnalyst,來自MicroMath，Inc.)程序分析血漿放射性測定的結(jié)果。體內(nèi)毒性研究用鹽水(載體對照，第1組)或四種不同劑量的藥物(第2-5組)注射(i.v.尾靜脈)五組雌性BALB/c小鼠(4-6周齡，每組5只小鼠)，每天一次，共5天。各組遞送的總劑量為1、2、3和4mg/kg，其對應(yīng)于所確定最大耐受劑量(MTD)的25、50、75和100%。最后一次注射后第7天(第12天)，用二氧化碳處死研究的動物，最后放血，以進(jìn)行血液參數(shù)研究包括全血計(jì)數(shù)(CBC)和臨床化學(xué)分析包括總膽紅素、磷、AST(SGOT)、ALT(SGPT)總蛋白、白蛋白、球蛋白、鈣、鈉、鉀、氯、Alk磷酸酶、肌氨酸酐(Creatinene)、BUN，并進(jìn)行完全尸檢，包括心、肺、脾、腎和肝等被浸入10%福爾馬林中性緩沖液中固定。將組織包埋到石蠟塊中，從中切出2-至4氺m的切片，用HE染色，這些處理由得克薩斯大學(xué)M.D.Anderson癌癥中心的獸用藥物和手術(shù)科進(jìn)行。體內(nèi)效力研究用3x106個(gè)A375GFP對數(shù)期黑色素瘤細(xì)胞皮下注射4-6周齡的BABL/c裸(nu/nu)小鼠右側(cè)。使腫瘤建立2周，然后開始治療，將小鼠分成四組。各組的五只小鼠建立了30-50mm3的腫瘤。用鹽水、scFvMEL(2.5mg/kg)、scFvMEL(0.2mg/kg)加TNF(0.2mg/kg)或scFvMEL/TNF(2.5mg/kg)每天注射(i.v.尾靜脈)小鼠，共5天。其它小組的5只小鼠建立了100-200mr^的腫瘤。用相同劑量的scFvMEL/TNF每天注射(i.v.尾靜脈)小鼠，共5天。治療結(jié)束時(shí)，用XenogenlVIS200成像系統(tǒng)每周監(jiān)測腫瘤，用游標(biāo)卡尺每2或3天進(jìn)行測量。實(shí)施例34SCFVMEL/TNF的體外細(xì)胞毒性分別評價(jià)了scFvMEL/TNF對對數(shù)期的抗原陽性、TNF敏感性人黑色素瘤A375-M細(xì)胞和抗原陽性、TNF耐受性人黑色素瘤AAB-527細(xì)胞的細(xì)胞毒性。我們也將這些作用與抗原陰性、TNF敏感性人乳腺癌SKBR3-HP和抗原陰性、TNF耐受性人神經(jīng)膠質(zhì)瘤H4細(xì)胞作比較。結(jié)果顯示，scFvMEL/TNF對抗原陽性A375-M細(xì)胞的活性(I.C.M)0.1nM)比天然TNF(I.C.501.4nM)大約高10倍(p〈0.0001)。scFvMEL/TNF對TNF敏感性、抗原陰性SKBR3-HP細(xì)胞的細(xì)胞毒性(1.<:.5()2.5nM)顯示出類似于真正TNF(I.C.502.7nM)的劑量依賴曲線(pX).05)。劑量高達(dá)1000nM時(shí)，scFvMEL/TNF對抗原陰性、TNF耐受性H4細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用。然而，scFvMEL/TNF對抗原陽性、TNF耐受性人黑色素瘤AAB-527細(xì)胞有顯著的劑量相關(guān)性細(xì)胞毒作用(I.C.5Q20nM)。相反，這些AAB-527細(xì)胞能耐受濃度高達(dá)5000nM的TNF的細(xì)胞毒作用(表9)。表9.scFvMEL/TNF與TNF對各種人細(xì)胞系的細(xì)胞毒性*<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>*72小時(shí)處理"靶向指數(shù)-TNF的I.C.5o/scFvMEL/TNF的I.C.***所示濃度下無細(xì)胞毒作用實(shí)施例35SCFVMEL/TNF的體內(nèi)藥代動力學(xué)如實(shí)施例34所述，用以前描述的對碘苯甲酸酯法放射性標(biāo)記scFvMEL/TNF。該圖顯示了各時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)的平均值士SEM。該曲線代表通過這三點(diǎn)的最小平方、最佳擬合線。數(shù)據(jù)顯示出三相曲線擬合，計(jì)算的a-、P-和Y-相的半衰期分別為0.38小時(shí)、3.9小時(shí)和17.6小時(shí)(圖29)。然而，放射性標(biāo)記的TNF、化學(xué)偶聯(lián)物ZME-TNF以及完整抗體ZME的血漿清除率為雙相，并接近地?cái)M合為(y2〉0.94)開口、雙區(qū)數(shù)學(xué)模型。作為比較，如表10所示，在此模型中全長抗體ZME-018和化學(xué)偶聯(lián)物ZME-TNF的半衰期相似，(3-相半衰期分別為1.39小時(shí)和1.2小時(shí)。表10.125I-ZME、ZME-TNF、TNF和scFvMEL/TNF的藥代動力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>Vd:分布容積Cxt:濃度曲線下的面積Clp:血漿清除率此外，41.3小時(shí)和36.1小時(shí)的P-相半衰期也相似。相反，此模型中游離TNF的清除率相當(dāng)快，a-和(3-相半衰期分別為27.1分鐘和2.7小時(shí)。單獨(dú)ZME-018的立即表觀分布容積(Vd)接近血液容積(1.9ml)，而單獨(dú)TNF的Vd稍大(3.9ml)，然而，ZME-TNF化學(xué)偶聯(lián)物的Vd(11.6ml)高于ZME-018或TNF，表明它在脈管系統(tǒng)以外分布較多。其中，融合構(gòu)建物scFvMEL/TNP的Vd最高(19.5ml)，表明在所有組成物質(zhì)中它的脈管外分布最廣泛。TNF濃度曲線下面積(cxt)遠(yuǎn)小于單獨(dú)ZME-018(3.5相對于139.6^Ciml-l分鐘)，因?yàn)樗难獫{半衰期相對短。融合構(gòu)建物scFvMEL/TNF的cxt遠(yuǎn)大于TNF和化學(xué)偶聯(lián)物ZME-TNF，但小于ZME-018,因?yàn)樗诿}管系統(tǒng)外的分布相對較多。實(shí)施例36SCFVMEL/TNF在BALB/C小鼠中的毒性研究死亡率、宏觀病理學(xué)和器官重量本研究中沒有發(fā)生死亡。沒有觀察到劑量相關(guān)性宏觀病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。觀察到幾處宏觀病損，它們被認(rèn)為是偶發(fā)性并且與給予scFvMEL/TNF無關(guān)。劑量為1、2、3和4mg/kg的scFvMEL/TNF引起相對脾重(相對于體重)的劑量相關(guān)性增加(圖30)。增加的程度在3mg/kg時(shí)達(dá)到穩(wěn)定水平。脾重的增加與紅髓髓外造血和白髓濾泡增生增加有關(guān)。臨床病理沒有觀察到血液學(xué)參數(shù)(表ll)和臨床化學(xué)參數(shù)(表12)發(fā)生受試物質(zhì)相關(guān)性改變。表11.血液學(xué)參數(shù)的組間平均值<table>complextableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>與對照組平均值相比時(shí)，2、3和4mg/kg的小組的平均AST和ALT水平稍有增加，但仍然在此實(shí)驗(yàn)室的參比范圍內(nèi)。在這些處理組中平均值的最小增加是由于各組中的單個(gè)動物。在這些動物中沒有觀察到組織病理學(xué)相關(guān)性，這表明這三只動物中的增加可能有誤。組織病理ScFvMEL/TNF全身給藥導(dǎo)致Balb/c雌性小鼠的肝、肺和脾發(fā)生顯著的劑量依賴性損傷(表13)。表13.發(fā)生率小結(jié)scFvMEL/TNF相關(guān)性損傷+和平均損傷級別"<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>*器官形態(tài)診斷**組內(nèi)損傷發(fā)生率1級=適度，罕見5-10%2級=輕微，稀少10-20%3級=中等，頻繁20-50%4級=嚴(yán)重，廣泛〉50%***#P/T，陽性小鼠數(shù)目/全部小鼠數(shù)目這些損傷的發(fā)生率和嚴(yán)重程度顯示出劑量依賴性，包括在scFvMEL/TNF劑量為2、3禾口4mg/kg和更高時(shí)，肝和脾的髓外造血增加；在scFvMEL/TNF劑量為4mg/kg和更高時(shí)，發(fā)生肺纖維蛋白血管；在scFvMEL/TNF劑量為1、2、3和4mg/kg和更高時(shí)，脾白髓濾泡細(xì)胞增生。scFvMEL/TNF相關(guān)作用的最敏感的指標(biāo)是脾濾泡細(xì)胞淋巴增生。在本研究條件下scFvMEL/TNF未觀察到副作用的水平(NOAEL)為3mg/kg。scFvMEL/TNF的體內(nèi)抗腫瘤作用用鹽水、scFvMEL(2.5mg/kg)、scFvMEL(0.2mg/kg)加TNF(0.2mg/kg)或scFvMEL/TNF(2.5mg/kg)每天治療一次(i.v.尾靜脈)A375GFP異種移植瘤荷(30-50mm3)荷瘤小鼠組，共5天(第1-5天)。每2或3天觀察小鼠，用XenogenIVIS200成像系統(tǒng)對它們的腫瘤拍照(圖31)，并用游標(biāo)卡尺測量(圖32)。早期(50mn^)以2.5mg/kg劑量的scFvMEL/TNF治療顯示出顯著的抗腫瘤活性，經(jīng)游標(biāo)卡尺測量監(jiān)測，在第21天5只小鼠中三只無腫瘤，在第54天5只小鼠中5只的腫瘤完全消退(無腫瘤)。而用鹽水、單獨(dú)scFvMEL或scFvMEL加人重組TNF處理的所有小鼠中腫瘤快速生長。在較晚時(shí)期(150mmS)治療小鼠，也顯示出腫瘤消退(在第44天3/5無腫瘤)。無腫瘤后的小鼠后來不會長出腫瘤。這些數(shù)據(jù)證明，scFvMEL/TNF可在體內(nèi)靶向黑色素瘤細(xì)胞，并可導(dǎo)致顯著的抗-黑色素瘤作用。實(shí)施例37SCFVMEL/TNF的作用的顯著性惡性黑色素瘤是高度轉(zhuǎn)移和對各種治療，包括化療和y-放療反應(yīng)差的癌癥的主要例子(Hdmbach等，2001)。目前，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室正在開發(fā)靶向黑色素瘤的新型治療方案(Leong，2003)。本發(fā)明者以前報(bào)道過(Liu等，2004)—種稱為scFvMEL/TNF的融合構(gòu)建物，它由識別存在于80%人黑色素瘤細(xì)胞上的gp240抗原表面結(jié)構(gòu)域的抗體scFvMEL組成。將TNF經(jīng)抗體特異性遞送到黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面導(dǎo)致與單獨(dú)TNF相比細(xì)胞毒性增加。此外，已證明抗體-TNF化學(xué)偶聯(lián)物和融合構(gòu)建物能夠在體內(nèi)將TNF遞送至腫瘤(Liu等，2004;Rosenblum等，1995)。本研究中，我們進(jìn)一步證明，融合構(gòu)建物scFvMEL/TNF在體內(nèi)給藥后具有顯著的抗腫瘤活性。此外，發(fā)現(xiàn)scFvMEL/TNF融合構(gòu)建物的預(yù)計(jì)MTD(4mg/kg)幾乎比TNF本身的MTD(0.3mg/kg)高lO倍(Kuroda等，2000)，這表明靶向構(gòu)建物能夠?qū)⒒钚訲NF細(xì)胞因子導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞，而遠(yuǎn)離引起毒性的組織位點(diǎn)。已知腫瘤壞死因子(TNF)不僅對腫瘤細(xì)胞有直接細(xì)胞毒性，它還能誘導(dǎo)破壞腫瘤血管(Watanabe等，1988)。然而，已證明全身給予TNF蛋白能導(dǎo)致顯著的宿主毒性，但沒有顯著的抗腫瘤作用(Moritz等，1989;Blick等，1987)。各種方法都希望利用這種物質(zhì)的抗腫瘤特性同時(shí)降低全身副作用，包括抗體介導(dǎo)的遞送(Liu等，2004;Scherf等，1996)或?qū)NF基因轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞內(nèi)(Koshita等，1995)。我們小組和其它小組對TNF作為靶向治療的治療載荷進(jìn)行了廣泛的臨床前評價(jià)(Liu等，2004;Rosenblum等，2000;Rosenblum等，1991;Curnis等，2004;Hoogenboom等，1991;Rosenblum等，1995)。近年來，新型免疫細(xì)胞因子scFv23/TNF靶向過度表達(dá)Her-2/neu的惡性腫瘤顯示出能使TNF耐受性的過度表達(dá)Her-2/neu的乳腺癌細(xì)胞對TNF誘導(dǎo)的凋亡敏感(Lyu和Rosenblum，2005)。這些數(shù)據(jù)表明，靶向腫瘤細(xì)胞的TNF經(jīng)融合構(gòu)建物行使的細(xì)胞學(xué)作用可能與TNF本身有根本差異。靶向遞送細(xì)胞因子的抗體不僅能提高體內(nèi)給藥后定位于腫瘤組織，它們也有能力延長治療劑的血漿半衰期(Miham等，1991)。如本研究所示，與單克隆抗體(半衰期一般為20-40小時(shí))相比TNF的血清半衰期相對較短。由化學(xué)偶聯(lián)于TNF的全長IgG抗體ZME-018組成的化學(xué)偶聯(lián)物ZME-TNF的血清半衰期顯著較長，從而延長了生物活性TNF的循環(huán)時(shí)間。因?yàn)閷?shí)體瘤如黑色素瘤的有效臨床管理通常需要延長的治療方案，所以關(guān)注此分子的免疫原性。含有全長抗體的抗體-細(xì)胞因子的免疫原性至少部分由于抗體本身較大和構(gòu)建物的循環(huán)時(shí)間長。融合構(gòu)建物scFvMEL/TNF的血清半衰期比化學(xué)偶聯(lián)物短得多，這表明相比較而言，單鏈免疫細(xì)胞因子的免疫原性應(yīng)該低得多，因?yàn)槠涑叽缧〔⑶覐难h(huán)系統(tǒng)中清除的相對較快。除這些特性外，scFvMEL/TNF的Vd最高(19.5ml)，cxt(96(iCi/mlx分鐘)顯著大于TNF和化學(xué)偶聯(lián)物ZME-TNF，這表明它在脈管系統(tǒng)以外的分布相對較多。scFvMEL/TNF構(gòu)建物的組織分布研究(Liu等，2004)表明，該構(gòu)建物能有效定位于腫瘤，相對于游離TNF，72小時(shí)內(nèi)，該融合構(gòu)建物在腫瘤組織中的濃度最高。該構(gòu)建物的腫瘤靶向能力可歸因于該構(gòu)建物的表觀分布容積(Vd)相對于TNF增加。此外，與較大的ZME-TNF偶聯(lián)物相比，scFvMEL/TNF構(gòu)建物較小可能使其相對易于在脈管系統(tǒng)外分布。用此構(gòu)建物觀察到半衰期短表明24或48小時(shí)的給藥間隔似乎有利于獲得該藥物在腫瘤組織中的最高濃度。對于最終臨床開發(fā)scFvMEL/TNF最重要的是檢測最大耐受劑量(MTD)毒性情況以及在良好鑒定的人黑色素瘤異種移植瘤模型中進(jìn)行此融合構(gòu)建物的效力研究。融合構(gòu)建物scFvMEL/TNF的MTD為每天0.8mg/kg體重連續(xù)5天，對應(yīng)的MTD總劑量為4mg/kg。重要的是，應(yīng)注意到用該融合構(gòu)建物在體內(nèi)觀察到的顯著抗腫瘤作用是在2.5mg/kg的劑量下獲得的，該劑量約為MTD劑量的60。/。，也低于我們的毒理研究所測定的NOAEL劑量(3mg/kg)。結(jié)果表明，i.v.注射scFvMEL/TNF在劑量高達(dá)100%MTD(4mg/kg)時(shí)不會引起顯著副作用或器官毒性。可以此方案安全地給予scFvMEL/TNF構(gòu)建物，劑量高達(dá)75%MTD(3.0mg/kg)。即使在肝和脾中觀察到劑量相關(guān)性髓外造血，并且在脾中觀察到濾泡細(xì)胞(淋巴)增生，也不認(rèn)為這些損傷是副作用。此外，在鹽水治療的對照中也觀察到了這些作用。此外，即使用100%MTD治療，也沒有在小鼠中觀察到血液學(xué)參數(shù)或臨床化學(xué)參數(shù)的顯著改變。在MTD劑量水平下，在3/5小鼠中觀察到肺組織中有單個(gè)再通血栓。這些血栓只在一根血管中發(fā)生，不會損傷肺功能。然而，認(rèn)為它們是生物學(xué)有害的，因此，在3mg/kg(75。/。MTD)劑量水平下評價(jià)未觀察到副作用水平(NOAEL)。發(fā)現(xiàn)scFvMEL/TNF在小鼠中的MTD顯著高于單獨(dú)的rhuTNP(0.3mg/kg)(Kuroda等，2000)。然而，rhuTNF在MTD下誘導(dǎo)嚴(yán)重毒性，因?yàn)殪o脈內(nèi)給予的TNF導(dǎo)致正常組織微血管的破壞(Kuroda等，2000;Kuroda等，1995)。在本研究中，scFvMEL/TNF在小鼠中沒有顯示出顯著的正常器官損傷作用，但具有較高的抗腫瘤能力。因此，與rhTNF的非特異性毒性特征相比，scFvMEL/TNF似乎對腫瘤有更高的選擇性活性。因此，小心評價(jià)scFvMEL/TNF構(gòu)建物的藥代動力學(xué)提供了設(shè)計(jì)最優(yōu)給藥方案的塞本依據(jù)。評價(jià)此方案療效顯示出對黑色素瘤異種移植瘤，包括建立的小病損和已有很大進(jìn)展的腫瘤都有顯著的長期抗腫瘤作用。這些效力研究與組織病理、臨床化學(xué)和對臨床化學(xué)參數(shù)的影響一起提供了設(shè)計(jì)在gp240陽性腫瘤患者中進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)的基本依據(jù)。實(shí)施例37實(shí)施例38-42的示范性材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)人黑色素瘤細(xì)胞獲自得克薩斯州休斯敦的M.D.Anderson癌癥中心的U.Fidler博士。用極限必需培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)TXM-1、TXM-13、TXM-18L細(xì)胞，用含有10。/。胎牛血清(FBS)、加入丙酮酸鈉(100mM)、非必需氨基酸(IOmM)、谷氨酰胺(200nM)和MEM維生素的Dulbecco，sMEM培養(yǎng)A375-M。用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)MEL-526。以7"06細(xì)胞/丁-75燒瓶的密度常規(guī)培養(yǎng)所有細(xì)胞，每周傳代兩次，用Gen-Probe測定試劑盒常規(guī)檢測發(fā)現(xiàn)不含支原體污染。ELISA加入含有5。/。牛血清白蛋白(BSA)的溶液1小時(shí)，以封閉含有貼壁的黑色素瘤細(xì)胞的96孑LELISA平板(5"04個(gè)細(xì)胞/孔)。為了檢測gp240抗原，用單克隆抗體ZME-018IgG2a孵育細(xì)胞，然后用山羊抗-小鼠/辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(HRP-GAM)孵育。為了獲得GrB/scFvMEL的結(jié)合活性，用不同濃度的純化GrB/scFvMEL室溫(RT)孵育細(xì)胞1小時(shí)。洗滌后，用兔抗-scFvMEL抗體孵育細(xì)胞，然后加入山羊抗-兔/HRP偶聯(lián)物(HRP-GAR)抗體。最后，將含有1i!l/ml30。/。H2O2的底物(2，2，-連氮基-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，ABTS)溶液加入各孔。30分鐘后測定405nm處的吸光度?？乖璯p240染色和FACS分析先在4'C用單克隆抗體ZME-018IgG2a處理由1^106細(xì)胞組成的樣品20分鐘，然后用別藻藍(lán)蛋白(APC)-偶聯(lián)的山羊-抗-小鼠抗體(BDImmunocytometrySystem,CA)4。C染色20分鐘，都重懸于100plFACS染色緩沖液(2。/。FCS/DPBS)中。作為陰性染色對照，用濃度與gp240抗體相同的特異性不相關(guān)的同種型匹配的對照抗體(小鼠lgG2a，PharMingen，加州圣地亞哥)染色細(xì)胞。染色后，用DPBS洗滌細(xì)胞兩次，然后重懸于500|111%多聚甲酸溶液中，并避光儲存在冰上。然后用FACSCaliber流式細(xì)胞儀(BectonDickinson,加州圣何塞)進(jìn)行FACS分析。在FL-4通道中檢測APC熒光。各細(xì)胞系獲取10,000個(gè)事件。用CellQuestProTM軟件(BectonDickinson)進(jìn)行分析。"'對黑色素瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒試驗(yàn)用黑色素瘤細(xì)胞單層的標(biāo)準(zhǔn)72小時(shí)細(xì)胞增殖試驗(yàn)和前述結(jié)晶紫染色法(Nishikawa等，1992)測定樣品(GrB/scFvMEL或scFvMEL/rGel)。對照的百分?jǐn)?shù)指與對照(未處理)孔相比，藥物處理孔的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。GrB/scFvMEL與化療藥聯(lián)用的研究將指數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中。24小時(shí)后，用含有藥物的培養(yǎng)基處理細(xì)胞。在所示孵育期結(jié)束時(shí)，用結(jié)晶紫染色評價(jià)生長抑制。為了測定先后順序的作用，用兩種不同順序處理細(xì)胞。順序I(C1):用化療藥預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)，然后用化療藥和GrB/scFvMEL共同處理72小時(shí)。順序H(C2):用GrB/scFvMEL預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)，然后用化療藥和GrB/scFvMEL共同處理72小時(shí)。順序III:用GrB/scFvMEL預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)，然后用化療藥處理72小時(shí)。順序IV:不經(jīng)GrB/scFvMEL預(yù)處理，即用不同化療藥處理細(xì)胞72小時(shí)?；熕幇ǘ嗳岜刃?DOX)、長春新堿(VCR)、依托泊甙(VP-16)、順鉑(CDDP)、阿糖胞苷(AraC)和5-FU。GrB/scFvMEL與放療聯(lián)用的研究以4000個(gè)細(xì)胞/孔的密度一式三份地接種細(xì)胞。137Cs放射源分別以劑量率2Gy、4Gy和6Gy遞送不同劑量的"射線。細(xì)胞單獨(dú)接受輻射或在加入不同濃度的GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物后接受輻射，以確定是否互相增敏。72小時(shí)后，用結(jié)晶紫染細(xì)胞。動物模型研究敘W75-M莉條微,4-6周齡無胸腺(nu/nu)小鼠獲自HarlanSpragueDawley，印第安納州印第安納波利斯。在無特定病原體的條件下飼養(yǎng)動物，6-8周齡時(shí)使用。用3"06個(gè)對數(shù)期A375-M黑色素瘤細(xì)胞皮下注射(右側(cè))動物，使腫瘤建立。一旦腫瘤可測定(30-50mm3)，用鹽水(對照)或GrB/scFvMEL溶液構(gòu)建物處理(i.v.尾靜脈)動物。全微郝05AcFvM五丄游定泣將GrB/scFvMEL給予A375-M異種移植瘤荷瘤小鼠。24小時(shí)后，處死動物，取出代表性組織切片，用福爾馬林固定，H&E染色，并用抗-GrB或抗-scFvMEL抗體免疫組化染色以檢測GrB/scFvMEL。尉檢謝亡游777皿微腫瘤組織切片用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(RocheMolecularBiochemicals，Mannhein，德國)以TUNEL法染色。簡要說，對石蠟包埋的組織進(jìn)行預(yù)處理以脫蠟、再水化，然后用蛋白酶K孵育，然后固定和通透。在濕室中，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)反應(yīng)混合物37'C孵育該組織切片60分鐘，然后用PBS沖洗玻片3次。在NikonEclipseTS100熒光顯微鏡下分析樣品，用裝在顯微鏡上的Nikon數(shù)碼相機(jī)(日本東京)拍照。敝微毒嫌充一旦腫瘤生長到可檢測大小(30-50mm勺后，每隔一天用鹽水(對照)或GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物(37.5mg/kg)處理(i.v.尾靜脈)動物，共5次。監(jiān)測動物，在接下來的28天中測定腫瘤。實(shí)施例38不同黑色素瘤細(xì)胞(A375-M、TXM-18、TXM-13、MEL526和TXM-1)上的抗原GP240表達(dá)為了檢測黑色素瘤A375-M、TXM-18、TXM-13、MEL526和TXM-1細(xì)胞上gp240抗原的表達(dá)，用特異性結(jié)合于gp240抗原的母體單克隆抗體ZME-018IgG2a進(jìn)行ELISA(圖33)和流式細(xì)胞術(shù)(圖34)。結(jié)果證明，gp240抗原出現(xiàn)在A375-M、TXM-18L、TXM-13和MEL-526細(xì)胞上，然而，在TXM-1細(xì)胞上的表達(dá)水平非常低。實(shí)施例39經(jīng)ELISA檢測GRB/SCFVMEL融合蛋白的SCFVMEL部分的結(jié)合活性進(jìn)行ELISA以測定GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物與黑色素瘤細(xì)胞的結(jié)合活性。GrB/scFvMEL結(jié)合于表達(dá)高水平gp240抗原的黑色素瘤A375-M、TXM-18L、TXM-13和MEL-526細(xì)胞。而且，A375-M和MEL-526的結(jié)合活性較強(qiáng)，其次是TXM-18L和TXM-13。然而，經(jīng)抗-scFvMEL兔單克隆抗體測定，該蛋白不結(jié)合gp240抗原表達(dá)水平非常低的TXM-1(圖35A和35B)。實(shí)施例40GRB/SCFVMEL對不同黑色素瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性(ICso比較)評價(jià)了GrB/scFvMEL對培養(yǎng)的對數(shù)期A375-M、TXM-18L、TXM-13、MEL-526和TXM-1細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在濃度約為20nM時(shí)，發(fā)現(xiàn)對A375-M細(xì)胞產(chǎn)生50%生長抑制作用，對MEL-526細(xì)胞約為50nM，對TXM-18L約為100nM，對TXM-13約為200nM。然而，在劑量高達(dá)1時(shí)發(fā)現(xiàn)對TXM-1細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用(圖36)。通過比較，GrB/scFvMEL對這些黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用與另一種融合毒素MELsFv/rGel基本相同(表14)。表14:GrB/scFvMEL與MELsFv/rGel對不同人黑色素瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒作用(I.C.so,iiM)細(xì)胞系GrB/scFvMELMELsFv/rGelA375-M32.1±7.9522.03±3.08MEL-52650.0±4.3240.0±5.55TXM-18L158.3±12.45144.3±9.56TXM-13200.0±17.92180.3±15.30TXM-1>1(aM〉1,這些數(shù)據(jù)證明，GrB/scFvMEL與gp240抗原陽性細(xì)胞的結(jié)合活性的高低包括(incorporatewkh)融合蛋白的細(xì)胞毒性。實(shí)施例41GRB/SCFVMEL與常規(guī)化療藥聯(lián)用對A375-M作用的研究將GrB/scFvMEL和化療藥(多柔比星、硫酸長春新堿、依托泊甙、順鉑或阿糖胞苷)共同給予A375細(xì)胞72小時(shí)，顯示出與阿霉素、長春新堿或順鉑聯(lián)用有協(xié)同的抗腫瘤活性，與依托泊甙或阿糖胞苷聯(lián)用有加成作用。與藥物預(yù)處理后共同接觸融合構(gòu)建物(順序I-C1)相比，用GrB/scFvMEL預(yù)處理6小時(shí)，然后共同接觸這些化療藥72小時(shí)(順序1I-C2)能顯著抑制生長(圖37)。而且，與不經(jīng)GrB/scFvMEL預(yù)處理(順序IV)相比，用GrB/scFvMEL預(yù)處理A375細(xì)胞6小時(shí)，然后用化療藥處理72小時(shí)(順序III)時(shí)，各種化療藥的細(xì)胞毒性顯著增加(p〈0.01)(表15)。表15:接觸72小時(shí)后，化療藥對A375-M細(xì)胞的細(xì)胞毒性:GrB/scFvMEL預(yù)處理6小時(shí)可顯著提高化療藥的細(xì)胞毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>*處理順序m與順序iv。.順序III:用GrB/scFvMEL預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)，然后用化療藥處理72小時(shí)順序IV:不經(jīng)GrB/scFvMEL預(yù)處理，用各種化療藥處理細(xì)胞72小時(shí)。"%細(xì)胞毒性***p<0.05統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異結(jié)果表明，可通過GrB/scFvMEL預(yù)處理6小時(shí)使得gp240抗原陽性靶向細(xì)胞對化療藥的作用敏化。實(shí)施例42GRB/scFvMEL的動物體內(nèi)研究(A375-M異種移植瘤模型)將GrB/scFvMEL給予A375-M異種移植瘤荷瘤小鼠。24小時(shí)后，處死動物，取出代表性組織切片，用福爾馬林固定，H&E和TUNEL染色。處理組的腫瘤組織顯示出凋亡核。用抗-GrB或抗-scFvMEL抗體免疫組化染色檢測GrB/scFvMEL。在腫瘤組織中觀察GrB/scFvMEL的定位或內(nèi)化。為了檢測GrB/scFvMEL的體內(nèi)抗腫瘤作用，對A375-M人黑色素瘤異種移植瘤進(jìn)行研究。每隔一天用GrB/scFvMEL或鹽水處理(iv尾靜脈)荷瘤小鼠，共5天。測定42天的腫瘤體積。在此期間，鹽水處理的對照腫瘤從50mmS增大到1200mm3。用GrB/scFvMEL(37.5mg/kg)處理的腫瘤從50mm3增大到200mm3(圖38)。實(shí)施例43實(shí)施例44-50的示范性材料和方法本實(shí)施例提供了涉及示范性GrB/scFvMEL嵌合分子的示范性材料和方法。細(xì)胞培養(yǎng)人黑色素瘤細(xì)胞獲目I.J.Fidler博士(M.D.Anderson癌癥中心，得克薩斯州休斯敦)。用極限必需培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)TXM-1、TXM-18L細(xì)胞，用含有10%胎牛血清(FBS)、加入丙酮酸鈉(100mM)、非必需氨基酸(IOmM)、谷氨酰胺(200nM)和MEM維生素的Dulbecco'sMEM培養(yǎng)A375-M。用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)MEL-526。以7><106個(gè)細(xì)胞/丁-75燒瓶的密度常規(guī)培養(yǎng)所有細(xì)胞，每周傳代兩次，用Gen-Probe測定試劑盒常規(guī)檢測發(fā)現(xiàn)不含支原體污染。GrB/scFvMEL的表達(dá)和純化以前描述了GrB/scFvMEL的構(gòu)建、表達(dá)和純化(Liu等，2003)。在無菌150mMNaCl中-2(TC冷藏融合蛋白?？乖璯p240染色和FACS分析先在4'C用ZME-018IgG2a處理由^106細(xì)胞組成的樣品20分鐘，然后用別藻藍(lán)蛋白(APC)-偶聯(lián)的山羊-抗-小鼠抗體(BDImmunocytometrySystem,CA)4。C染色20分鐘，都重懸于100(1lFACS染色緩沖液(2。/。FCS/DPBS)中。作為陰性染色對照，用濃度與gp240抗體相同的特異性不相關(guān)的同種型匹配的對照抗體(小鼠IgG2a，PharMingen，加州圣地亞哥)染色細(xì)胞。染色后，用DPBS洗滌細(xì)胞兩次，然后重懸于500^ill。/。多聚甲醛溶液中，并避光儲存在冰上。然后用FACSCaliber流式細(xì)胞儀(BectonDickinson,加州圣何塞)立即進(jìn)行FACS分析。在FL-4通道中檢測APC熒光。各細(xì)胞系獲取10,000個(gè)事件。用CellQuestProTM軟件(BectonDickinson)進(jìn)行分析。ELISA試驗(yàn)如上所述使用含有貼壁的黑色素瘤細(xì)胞的96孔ELISA平板(5xl04個(gè)細(xì)胞/孔)(Rosenblum等，1991)。為了檢測GrB/scFvMEL的結(jié)合活性，用不同濃度的純化GrB/scFvMEL室溫(RT)孵育細(xì)胞1小時(shí)。洗滌后，用兔抗-scFvMEL抗體孵育細(xì)胞，然后加入山羊抗-兔/HRP偶聯(lián)物(HRP-GAR)抗體。最后，將含有1pi/ml30%H2O2的底物(2，2，-連氮基-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，ABTS)溶液加入各孔。30分鐘后測定405nm處的吸光度。用免疫熒光進(jìn)行內(nèi)化分析以1"04個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于16-孔室玻片(NalgeNuncInternational,伊利諾斯州內(nèi)珀維爾)上。用GrB/scFvMEL(40nM)處理細(xì)胞1小時(shí)。通過簡單地用甘氨酸緩沖液(0.5MNaCl，0.1M甘氨酸，pH2.5)孵育去除結(jié)合于細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行免疫染色，如前所述(Liu等，2003)。簡要說，用3.7%甲醛固定細(xì)胞，用0.2%TritonX-100通透。用3%BSA封閉細(xì)胞，用山羊抗-GrBmAb孵育，然后與FITC偶聯(lián)的抗-山羊IgG和碘化丙錠(PI，2.5貼/ml)—起孵育。玻片上裝有含有1嗎/mlPI的DABCO，在NikonEclipseTS-100熒光顯微鏡下分析。用裝在顯微鏡上的相機(jī)拍照。體外細(xì)胞毒試驗(yàn)為了檢測GrB/scFvMEL或MEL/sFv/rGel的細(xì)胞毒性，以4"03個(gè)細(xì)胞/孔的密度將黑色素瘤細(xì)胞接種到96孔板上，在37'C、5%(302中靜置24小時(shí)貼壁。24小時(shí)后，用含有不同濃度的融合蛋白的培養(yǎng)基交換培養(yǎng)基。如前所述[19]，通過結(jié)晶紫(用20%甲醇配制的0.5%溶液)染色和Sorenson，s緩沖液(O.lM檸檬酸鈉，pH4.2，用50°/。乙醇配制)溶解來測定對培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長的影響。對照的百分?jǐn)?shù)指與對照(未處理)孔相比，藥物處理孔的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。GrB/scFvMEL與化療藥聯(lián)用的研究將指數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中。24小時(shí)后，用含有藥物的培養(yǎng)基處理細(xì)胞。在所示孵育期結(jié)束時(shí)，用結(jié)晶紫染色評價(jià)生長抑制。將1.C.25劑量的GrB/scFvMEL或化療藥用于此聯(lián)用研究。為了測定先后順序的作用，用兩種不同順序處理細(xì)胞。順序I:用化療藥預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)，然后與GrB/scFvMEL共同處理72小時(shí)。順序II:用GrB/scFvMEL預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)，然后與然后與化療藥共同處理72小時(shí)。化療藥包括多柔比星(DOX)、長春新堿(VCR)、依托泊甙(VP-16)、順鉑(CDDP)、阿糖胞苷(AraC)和5-氟尿嘧啶(5-FU)。產(chǎn)克隆存活試驗(yàn)用產(chǎn)克隆試驗(yàn)評價(jià)GrB/scFvMEL和電離輻射聯(lián)用的有效性。用PBS處理或用GrB/scFvMEL(10nM)預(yù)處理黑色素瘤細(xì)胞16小時(shí)。然后，用不同劑量的電離輻射輻射細(xì)胞，然后進(jìn)行產(chǎn)克隆細(xì)胞存活試驗(yàn)。處理后，用胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將已知數(shù)量一式三份地再接種，并放回培養(yǎng)箱以大量生成集落。大約14天后用結(jié)晶紫溶液染色并計(jì)數(shù)集落。根據(jù)用所研究藥物處理未輻射細(xì)胞后的存活情況計(jì)算給定處理的接種效率百分?jǐn)?shù)和存活分?jǐn)?shù)。腫瘤細(xì)胞侵襲(基質(zhì)膠)試驗(yàn)通過胰酶消化收集接近匯合的A375DR細(xì)胞，重懸于培養(yǎng)基，將20W(100，000個(gè)細(xì)胞)接種到培養(yǎng)皿蓋上。然后將該培養(yǎng)皿蓋放在裝有2m培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，37t:孵育48小時(shí)。將基質(zhì)膠溶液(100pl，2.7mg/ml)吸移到24孔培養(yǎng)皿的孔底，37'C靜置。將細(xì)胞聚集體轉(zhuǎn)移到墊子(cushion)上，然后用另外lOO(il基質(zhì)膠覆蓋。用含有或不含GrB/scFvMEL(50nM)的400j_d培養(yǎng)基覆蓋進(jìn)入基質(zhì)膠的聚集體。然后每天在光學(xué)顯微鏡下觀察該聚集體，孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)拍攝該聚集體的照片。用AlphaEase⑧FC軟件(Alphalnnotech，加州圣萊昂納多)分析侵入環(huán)繞該聚集體的基質(zhì)膠的細(xì)胞密度，根據(jù)兩組的細(xì)胞密度計(jì)算侵襲百分?jǐn)?shù)并用未處理對照組作為100%侵襲進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。動物模型研究(1)A375-M異種移植瘤模型和治療研究設(shè)計(jì)4-6周齡的無胸腺(nu/nu)小鼠獲自HarlanSpragueDawley，印第安納州印第安納波利斯。在無特定病原體的條件下飼養(yǎng)動物，6-8周齡時(shí)使用。用3xl(^個(gè)對數(shù)期A375-M黑色素瘤細(xì)胞皮下注射(右側(cè))動物，使腫瘤建立。一旦腫瘤可測定(~30-50mm3)，用鹽水(對照)或GrB/scFvMEL溶液構(gòu)建物通過i.v.尾靜脈處理動物。以0.2ml體積靜脈內(nèi)給予融合蛋白GrB/scFvMEL。本文所述劑量是每隔一天給予一次共給予5天的總劑量(qod)。將劑量表示為mg/kg，小鼠平均體重以20g計(jì)。例如，給予20g小鼠750(igGrB/scFvMEL對應(yīng)的劑量是37.5mg/kg。(2)全身給藥后GrB/scFvMEL的定位將GrB/scFvMEL(37.5mg/kg)給予A375-M異種移植瘤荷瘤小鼠。24小時(shí)后，處死動物，取出代表性組織切片，用福爾馬林固定，用蘇木精和伊紅(H&E)染色，并用抗-GrB或抗-scFvMEL抗體免疫組化染色以檢測GrB/scFvMEL。(3)用于檢測凋亡的TUNEL試驗(yàn)?zāi)[瘤組織切片用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(RocheMolecularBiochemicals，Mannhein，德國)以TUNEL法染色。簡要說，對石蠟包埋的組織進(jìn)行預(yù)處理以脫蠟、再水化，然后用蛋白酶K孵育，然后固定和通透。在濕室中，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)反應(yīng)混合物37'C孵育該組織切片60分鐘，然后用PBS沖洗玻片3次。在NikonEclipseTS100熒光顯微鏡下分析樣品，用裝在顯微鏡上的Nikon數(shù)碼相機(jī)(日本東京)拍照。(4)體內(nèi)細(xì)胞毒性研究一旦腫瘤生長到可檢測大小(30-50mmS)后，每隔一天用鹽水(對照)或GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物(37.5mg/kg)處理(i.v.尾靜脈)動物，共5次。用游標(biāo)卡尺監(jiān)測腫瘤生長-在接下來28天中每2或3天測定兩個(gè)垂直的腫瘤直徑，用下式計(jì)算腫瘤體積腫瘤體積氣寬)、長/2(Osborne等，1985)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用成對t檢驗(yàn)(Prism3.0)分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為平均值士SE。如果p<0.05則認(rèn)為差異有顯著性。實(shí)施例44黑色素瘤細(xì)胞上的抗原GP240表達(dá)、GRB/SCFVMEL的SCFVMEL組分的細(xì)胞結(jié)合活性和GRB/SCFVMEL的內(nèi)化為了監(jiān)測黑色素瘤細(xì)胞系上gp240抗原的表達(dá)，用特異性結(jié)合于gp240抗原的母體單克隆抗體ZME-018IgG2a染色1><106個(gè)黑色素瘤細(xì)胞20分鐘，用APC偶聯(lián)的山羊-抗-小鼠抗體4。C染色20分鐘。作為陰性染色對照，用濃度與gp240抗體相同的特異性不相關(guān)的同種型匹配的對照抗體(小鼠IgG2a)染色細(xì)胞。經(jīng)FACS試驗(yàn)評價(jià)，將黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375-M、MEL-526、TXM-18和TXM-1上gp240的表達(dá)水平表示為實(shí)線，這些細(xì)胞中g(shù)p240陽性百分?jǐn)?shù)(％陽性)分別為98.9、97.8、40.9和4.6。這些數(shù)據(jù)證明，gp240抗原在A375-M、MEL-526細(xì)胞上的表達(dá)水平高得多，在TXM-18細(xì)胞表達(dá)較高，然而在TXM-1細(xì)胞上表達(dá)水平非常低，其中實(shí)線被代表同種型對照的虛線覆蓋(圖34)。由于gp240抗原在黑色素瘤A375-M、MEL-526、TXM-18L細(xì)胞而非TXM-1細(xì)胞上高表達(dá)，我們進(jìn)一步檢測了GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物可否結(jié)合于抗原陽性細(xì)胞。進(jìn)行ELISA以測定GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物與黑色素瘤細(xì)胞的結(jié)合活性。結(jié)果證明，GrB/scFvMEL能夠結(jié)合于表達(dá)高水平gp240抗原的黑色素瘤A375-M、MEL-526和TXM-18L。而且，在A375-M和MEL-526中結(jié)合活性較強(qiáng)，其次是TXM-18L。然而，經(jīng)過抗-scFvMEL兔單克隆抗體檢測，該蛋白不結(jié)合于gp240抗原表達(dá)水平非常低的TXM-1(圖39)。用山羊抗-GrB抗體進(jìn)行免疫熒光染色以評價(jià)用GrB/scFvMEL處理1小時(shí)后是否將該融合構(gòu)建物的GrB部分有效遞送到gp240抗原陽性A375-M、MEL-526、TXM-18黑色素瘤細(xì)胞的胞漿中。這有效證明了腫瘤細(xì)胞表面上的gp240表達(dá)和構(gòu)建物與gp240抗原的結(jié)合能使GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物內(nèi)化。實(shí)施例45GRB/SCFVMEL對各種黑色素瘤細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性評價(jià)GrB/scFvMEL對培養(yǎng)的對數(shù)期-A375-M、MEL-526、TXM-18L和TXM-1細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在濃度約為30nM時(shí)，發(fā)現(xiàn)對A375-M細(xì)胞產(chǎn)生50M生長抑制作用，對MEL-526細(xì)胞約為50nM，對TXM-18L約為150nM。然而，在劑量高達(dá)1時(shí)發(fā)現(xiàn)對TXM-1細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用(圖36，表16)。通過比較，GrB/scFvMEL對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用與之前描述的MELsFv/rGel相似(Rosenblum等，2003)(表16)。表16.GrB/scFvMEL與MELsFv/rGel對各種人黑色素瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性*<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>*用標(biāo)準(zhǔn)72-小時(shí)細(xì)胞增殖試驗(yàn)和結(jié)晶紫染色測定樣品(GrB/scFvMEL，MELsFv/rGel)。計(jì)算I.C.5o值，表示為平均值土SEM(nM)。**陽性百分?jǐn)?shù)(％陽性)FACS分析。***在劑量高達(dá)1000nM時(shí)沒有觀察到細(xì)胞毒作用。這些數(shù)據(jù)表示，gp240高表達(dá)導(dǎo)致提高GrB/scFvMEL的細(xì)胞結(jié)合和導(dǎo)致融合蛋白的細(xì)胞毒性相對較高之間似乎有關(guān)聯(lián)。此外，本發(fā)明者的實(shí)驗(yàn)室研究證明，侶伴構(gòu)建物(companionconstruct)MELsFv/rGel通過壞死而非凋亡過程對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。這些對比研究說明，GrB荷載的細(xì)胞毒性/凋亡作用與含有rGd的融合毒素的強(qiáng)效細(xì)胞毒性/壞死作用相一致。實(shí)施例46GRB/SCFVMEL與常規(guī)化療藥聯(lián)用對A375-M作用的研究由于細(xì)胞凋亡過程似乎能介導(dǎo)對化療的反應(yīng)/耐受性(Simstein等，2003;Soengas和Lowe，2003)，本發(fā)明者接下來檢測了GrB/scFvMEL與各種化療藥聯(lián)用對耙細(xì)胞的作用。將GrB/scFvMEL和不同類型的化療藥共同給予A375-M細(xì)胞72小時(shí)，顯示出與阿霉素(DOX)、長春新堿(VCR)或順鉑(CDDP)有協(xié)同的抗腫瘤活性，與依托泊甙(VP16)、阿糖胞苷(Ara-C)或5-Fu聯(lián)用有加成作用。與藥物預(yù)處理后共同接觸融合構(gòu)建物(順序I)相比，用GrB/scFvMEL預(yù)處理6小時(shí)后共同接觸這些化療藥72小時(shí)(順序II)能顯著抑制生長(圖37)。結(jié)果表明，用GrB/scFvMEL預(yù)處理6小時(shí)可顯著提高化療藥對gp240抗原陽性黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。在濃度高達(dá)1pM時(shí)，GrB/scFvMEL對抗原陰性TXM-1細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。本發(fā)明者用1pM的GrB/scFvMEL預(yù)處理TXM-1細(xì)胞6小時(shí)，然后共同給予I.C.so或1(.25劑量的不同化療藥。不出所料，GrB/scFvMEL預(yù)處理6小時(shí)不能提高不同化療藥的細(xì)胞毒作用。實(shí)施例47GRB/SCFVMEL對A375-多柔比星耐受性(A375DR)亞系的細(xì)胞毒作用為了檢測對多柔比星的細(xì)胞耐藥性是否也引起對GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物的交叉耐藥，首先用以下方法建立A375-多柔比星耐藥性(A375DR)細(xì)胞系用濃度遞增的多柔比星連續(xù)接觸對數(shù)期親代A375-M細(xì)胞，然后連續(xù)稀釋，并對集落進(jìn)行克隆選擇。稱為A375DR的一個(gè)克隆對多柔比星的耐藥性是親代A375細(xì)胞系的400倍(A375DR的I.C.so為200nM，親代A375細(xì)胞系的I.C.so為0.5nM)。處理A375DR細(xì)胞的1.C.5o僅比親代A375細(xì)胞高4.5倍(I.C.5。63.6nMforA375DRvsI.C.50:14.5nMforA375)(圖40，表17)。用特異性識別gp240抗原的ZME-018抗體的ELISA評價(jià)gp240抗原的表達(dá)。本研究證明，在親代A375和A375DR細(xì)胞上相對gp240表達(dá)基本相同(數(shù)據(jù)未顯示)。數(shù)據(jù)顯示，多柔比星的細(xì)胞耐藥性與GrB/scFvMEL的邊際交叉耐藥性有關(guān)。表17.GrB/scFvMEL和多柔比星對親代A375細(xì)胞和A375多柔比星耐藥性(A375DR)亞系的細(xì)胞毒作用的比較細(xì)胞LC.5。(nM)I.C.so(nM)多柔比星GrB/scFvMELA3750.5±0.1914.5±3.93A375DR200.0±16.2863.6士4.01耐受指數(shù)*400.04.5*耐受指數(shù)定義為(對A375DR的1.C.so)/(對A375的I.C.50)實(shí)施例48GRB/SCFVMEL預(yù)處理對人黑色素瘤A375-M細(xì)胞的輻射敏感性的影響為了確定GrB/scFvMEL誘導(dǎo)凋亡可否影響黑色素瘤細(xì)胞對外束電離輻射的敏感性，首先用10nMGrB/scFvMEL預(yù)處理A375、A375DR和抗原陰性SKBR3細(xì)胞16小時(shí)，然后輻射細(xì)胞，接種使產(chǎn)克隆細(xì)胞存活。圖41顯示，GrB/scFvMEL處理抑制了A375和A375DR細(xì)胞的產(chǎn)克隆存活。輻射劑量為2、4和6Gy時(shí)存活集落的數(shù)量從A375單獨(dú)輻射對照組的大約34.8±0.23%、16.0±0.06%禾卩5.6±0.55%分別減少到GrB/scFvMEL加輻射處理組的23.1±1.59%、8.2±0.49%禾口2.8±0.52%(圖41A，表18A)。表18A.單獨(dú)用輻射處理(對照)與輻射和GrB/scFvMEL處理的A375細(xì)胞的產(chǎn)克隆存活率(％存活)<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>在2、4和6Gy劑量組中觀察到的增敏作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p0.05)。單獨(dú)用輻射處理A375DR細(xì)胞后，劑量4和6Gy的集落存活率分別為13.8±0.32%和6.9±0.64%，相比較而言，用GrB/scFvMEL和輻射共同處理的小組的集落存活率分別為9.4±0.29%禾口2.8±0.12%(圖41B，表18B)。表18B.單獨(dú)用輻射處理(對照)與輻射和GrB/scFvMEL處理的<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>4禾口6Gy日寸在A375DR組中觀察到的增敏作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，p<0.05。然而，相對于GrB/scFvMEL處理的細(xì)胞，以2、4和6Gy輻射處理抗原陰性SKBR3細(xì)胞沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增敏作用(pX).05)(圖41C，表18C)。因此，GrB/scFvMEL處理能使抗原陽性A375和A375DR多柔比星-耐藥細(xì)胞對電離輻射敏感。這種輻射增敏作用看起來取決于gp240抗原的表達(dá)，因?yàn)槲覀冇每乖幮约?xì)胞沒有觀察到輻射增敏作用。表18C.單獨(dú)用輻射處理(對照)與輻射和GrB/scFvMEL處理的<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>實(shí)施例49GRB/SCFVMEL對A375DR細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能的影響然后檢測GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物可否影響黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，因?yàn)榧?xì)胞凋亡狀況是已知負(fù)責(zé)介導(dǎo)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移潛能的因子之一(Glinsky和Glinsky，1996;Glinsky等，1997;Rubio等，2001;Simstein等，2003)。研究了GrB/scFvMEL對A375DR細(xì)胞侵襲重建基底膜基質(zhì)(基質(zhì)膠)的能力的影響。用懸滴技術(shù)制備時(shí)，A375DR細(xì)胞在基質(zhì)膠中自發(fā)地形成細(xì)胞聚集體。A375DR細(xì)胞在4和6天內(nèi)主動離開聚集體并侵入基質(zhì)膠制劑(圖42A)。用AlphaEase⑧FC軟件(AlphaInnotech，SanLeandro，CA)分析侵入環(huán)繞聚集體的基質(zhì)膠內(nèi)的細(xì)胞密度，根據(jù)兩組的細(xì)胞密度計(jì)算侵入百分?jǐn)?shù)，并用未處理對照組作為100%侵入的值標(biāo)準(zhǔn)化。用GrB/scFvMEL處理A375DR細(xì)胞抑制了A375DR侵入基質(zhì)膠。在第4天細(xì)胞侵入能力'顯著降低到50.0±2.89%，第6天降低到45.0±1.16%(圖42A和42B)。實(shí)施例50GRB/SCFVMEL的動物體內(nèi)研究(A375-M異種移植瘤模型)首先表征了GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物在A375-M異種移植瘤荷瘤小鼠中的內(nèi)化或定位。給予GrB/scFvMEL24小時(shí)后，處死小鼠，取出代表性組織切片，，用福爾馬林固定，用蘇木精和伊紅(H&E)染色，用抗-GrB抗體或抗-scFvMEL抗體檢測。觀察腫瘤組織中GrB/scFvMEL的定位和內(nèi)化。為了檢測GrB/scFvMEL的體內(nèi)抗腫瘤作用，在A375-M人黑色素瘤異種移植瘤上進(jìn)行研究。每隔一天用GrB/scFvMEL或鹽水治療(W尾靜脈)荷瘤小鼠5次。鹽水治療對照組腫瘤在28天中增大24倍(從50mm3至1200mm3)。相反，GrB/scFvMEL治療的腫瘤增大4倍(從50mm3至200mmS)(圖43)。GrB/scFvMEL融合構(gòu)建物顯示出顯著的抗腫瘤活性。用TUNEL試驗(yàn)染色腫瘤組織細(xì)胞核。結(jié)果明確顯示，在GrB/scFvMEL處理組中腫瘤組織顯示出凋亡核(圖40)。實(shí)施例51示范性臨床研究本實(shí)施例在具體示范性實(shí)施方式中提及scFvMEL/TNF，但本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，該示范性方案也可用于本發(fā)明其它嵌合分子。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，可通過本領(lǐng)域常規(guī)方式使此示范性方案適應(yīng)另一嵌合分子來優(yōu)化此方案。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，(例如)在患有g(shù)p240陽性晚期惡性腫瘤，包括黑色素瘤和乳腺小葉癌的患者中評價(jià)了本發(fā)明嵌合分子如scFvMEL/TNF的安全性和耐受性。在其它實(shí)施方式中，在給予個(gè)體，如患有g(shù)p-240惡性腫瘤的患者時(shí)評價(jià)本發(fā)明嵌合分子如scFvMEL/TNF的藥代動力學(xué)概況。在其它實(shí)施方式中，確定了本發(fā)明嵌合分子如scFvMEL/TNF的最大耐受劑量(MTD)和劑量限制毒性(DLT)。scFvMEL是在惡性黑色素瘤、乳腺小葉癌和可能的其它腫瘤類型上發(fā)現(xiàn)的gp240表面糖蛋白的鼠抗體。腫瘤壞死因子(TNF)是17,000MW的細(xì)胞毒性多肽，它介導(dǎo)了許多全身反應(yīng)和細(xì)胞反應(yīng)，包括腫瘤壞死和凋亡。TNF在體外對多種人腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒作用。在癌癥治療中采用TNF受到嚴(yán)重毒性的限制。研究了各種方案來利用該物質(zhì)的抗腫瘤特性同時(shí)降低其全身副作用，包括抗體介導(dǎo)的遞送。scFvMEL/TNF是單鏈?zhǔn)髥慰寺】贵w(scFvMEL)在C末端與重組TNF融合組成的融合蛋白。scFvMEL/TNF可將細(xì)胞毒量的TNF遞送給約80%表達(dá)gp240的惡性黑色素瘤腫瘤細(xì)胞。這種新型免疫細(xì)胞因子成為臨床試驗(yàn)開發(fā)中吸引人和有前途的化合物。示范性合格標(biāo)準(zhǔn)包括l)通過組織病理檢測確認(rèn)診斷有惡性黑色素瘤的年齡大于12歲的成年人；2)可獲得的病理樣品中多于20%腫瘤細(xì)胞的胞膜或胞質(zhì)中必須顯示出一些可檢測的染色標(biāo)記；3)參與者的心智能力和情感能力應(yīng)能理解和簽署知情同意書；4)足夠的工作狀態(tài)(performancestatus)。(Karnofsky等級60%/ECOG《)；5)距前次治療如大手術(shù)、細(xì)胞毒性化療、免疫治療白介素-2或干擾素或抗-癌疫苗接種至少三周；和/或6)通過以下參數(shù)反映的腎功能、肝功能和造血系統(tǒng)功能尚可肌酸酐<2.0mg/dL;AST/ALT〈進(jìn)行試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室參照的正常上限的2.5倍；如果發(fā)生肝轉(zhuǎn)移則AST或ALT〈正常上限的6倍；總膽紅素<2.5mg/dL如果發(fā)生肝轉(zhuǎn)移則AST或ALT〈正常上限的6倍；外周血血小板計(jì)數(shù)>100,000個(gè)細(xì)胞/VL;絕對中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)〉1.5個(gè)細(xì)胞/^lL;患者必須有至少一種可以在整個(gè)研究中跟蹤的可測定或可評價(jià)病損?；加胁豢蓽y定但仍可評價(jià)的病損(如小體積多處皮膚沉積物)的患者可編入此研究。排除的個(gè)體包括懷孕或哺乳期的婦女；可能在同意過程中不能足夠理解和作出決定的癡呆或其它精神障礙；伴隨使用免疫抑制性藥物(即皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢霉素、他克莫司等)；其它伴隨的原發(fā)性惡性腫瘤；和/或伴隨使用細(xì)胞毒劑或免疫劑(羥基脲、他莫昔芬等)。在門診中進(jìn)行所有scFvMEL/TNF給藥循環(huán)?；颊咦畛踉诟?8天循環(huán)的第1-5天和第8-12天以1小時(shí)IV輸注接受3mg/m、連續(xù)兩周每周的MON-FRl)。如果對象沒有出現(xiàn)不可接受的毒性(3-4級)或在治療期間疾病進(jìn)展，那么隨后繼續(xù)治療。在各循環(huán)結(jié)束時(shí)重復(fù)評價(jià)可見或可觸知腫瘤的反應(yīng)；在每兩個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)用成像技術(shù)評價(jià)可檢測腫瘤的反應(yīng)。由研究人員根據(jù)此時(shí)獲得的全部安全性和效力數(shù)據(jù)的評價(jià)確定是否用研究藥物進(jìn)一步治療。ScFvMEL/TNF是高選擇性免疫細(xì)胞因子經(jīng)ELISA評價(jià)，融合構(gòu)建物scFvMEL/TNF免疫細(xì)胞因子能特異性高水平結(jié)合于gp240抗原陽性黑色素瘤細(xì)胞，但不能或低水平結(jié)合于其它gp240抗原陰性細(xì)胞。放射性標(biāo)記的-scFvMEL/TNF與gp240抗原陽性、TNF敏感性人黑色素瘤A375-M細(xì)胞的結(jié)合的斯卡査德分析揭示出細(xì)胞表面上存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)的解離常數(shù)(Kd)為1.9nM，每個(gè)細(xì)胞上約有4000個(gè)這種結(jié)合位點(diǎn)，另一個(gè)Kd為15.6nM，每個(gè)細(xì)胞上約有1.6xl()S這種結(jié)合位點(diǎn)(Liu等，2004)。在溶液中scFvMEL/TNF是三聚體(135，000道爾頓)。用大小排阻FPLC分析scFvMEL/TNF顯示，scFvMEL/TNF融合構(gòu)建物遷移到約135kDa的表觀大小處，占93%注射蛋白。這與45kDa融合構(gòu)建物的三聚體結(jié)構(gòu)的預(yù)計(jì)大小一致。因此，融合構(gòu)建物似乎能以類似于天然TNF的方式在溶液中自身聚集成三聚體結(jié)構(gòu)。觀察到約占7%注射物質(zhì)的小峰遷移到約45kDa的表觀分子量處。這是scFvMEL/TNF單體的預(yù)計(jì)大小(Liu等，2004)。scFvMEL/TNF的TNF部分被有效內(nèi)化用A375-M細(xì)胞的免疫熒光評價(jià)scfVMEL/TNF的結(jié)合和內(nèi)化。細(xì)胞用抗-TNFRl抗體預(yù)封閉、然后在37'C用scFvMEL/TNF處理。在所示時(shí)間，洗滌細(xì)胞表面，用低pH(pH2.5)甘氨酸緩沖液洗提以去除過量融合蛋白。固定和通透細(xì)胞，然后封閉非特異性結(jié)合。用兔抗-huTNF抗體孵育其它細(xì)胞，用FITC偶聯(lián)的抗兔IgG檢測。用熒光顯微鏡在1小時(shí)處理的細(xì)胞胞漿中觀察到TNF信號，但在未處理的細(xì)胞中沒有觀察到該信號。胞漿中的TNF含量取決于接觸該構(gòu)建物的時(shí)間。該融合構(gòu)建物中TNF組分的生物學(xué)活性與天然TNF相同用依賴對L-929細(xì)胞的細(xì)胞毒性的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)測定TNF的生物學(xué)活性。天然TNF的特異性活性為26.7xl(^單位/mg蛋白。融合構(gòu)建物scFvMEL/TOF的TNF組分的生物學(xué)活性基本保持完整，因?yàn)閟cFvMEL/TNF的特異性活性(10x106單位/mg蛋白)與天然TNF基本相同。當(dāng)TNF融合于抗體結(jié)構(gòu)時(shí)沒有發(fā)生活性損失。免疫細(xì)胞因子特異性測試了與單獨(dú)的天然TNF相比，scFvMEL/TNF純化融合蛋白對抗原陽性、TNF敏感性人黑色素瘤A375-M細(xì)胞，抗原陽性、TNF耐受性人黑色素瘤AAB527細(xì)胞，抗原陰性、TNF敏感性人乳腺癌SKBR3-HP細(xì)胞和抗原陰性、TNF耐受性人神經(jīng)膠質(zhì)瘤H4細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性。免疫細(xì)胞因子對抗原陽性、TNF敏感性A375-M細(xì)胞的細(xì)胞毒作用比天然TNF高10倍。對抗原陰性、TNF敏感性SKBR3-HP細(xì)胞，scFvMEL/TNF的細(xì)胞毒性顯示出類似于天然TNF的劑量反應(yīng)曲線。對抗原陰性、TNF耐受性細(xì)胞，scFvMEL/TNF在劑量高達(dá)100nM時(shí)沒有細(xì)胞毒作用。然而，對抗原陽性、TNF耐受性AAB-527細(xì)胞，scFvMEL/TNF顯示出顯著的劑量相關(guān)性細(xì)胞毒作用。scFvMEL/TNF可克服TNF耐受性。scFvMEL/TNF在小鼠中的臨床前藥理研究scFvMEL/TNF在小鼠中的藥理研究顯示三相清除曲線，計(jì)算的a-、(3-和y-相的血漿半衰期分別為0.38、3.9和17.6小時(shí)。scFvMEL/TNF的立即表觀分布容積(Vda)為19.50ml。濃度曲線下面積(AUC)計(jì)算為4.0嗎/mlx小時(shí)。發(fā)現(xiàn)平均停留時(shí)間為8.3小時(shí)。scFvMEL/TNF在小鼠中的LD、MTD和毒理學(xué)研究在六次分處理中，用總劑量為0.5-16.7mg/kg的scFvMEL/TNF每天處理(iv)小鼠，共5天。發(fā)現(xiàn)8.3mg/kg的劑量是LDH)0，而LD25是4.8mg/kg。發(fā)現(xiàn)以此方案確定MTD的最高非致死劑量為4mg/kg總劑量。在Balb/c小鼠中以不同劑量進(jìn)行毒性研究，包括100%MTD(4mg/kg)、75%MTD(3mg/kg)、50%MTD(2mg/kg)和25%MTD(1mg/kg)。發(fā)現(xiàn)這些劑量對臨床化學(xué)參數(shù)沒有顯著影響。發(fā)現(xiàn)對血液學(xué)參數(shù)沒有顯著影響。未觀察到副作用水平(NOAEL)測定為3mg/kg(9mg/m2)。因此，患者中的起始劑量為1/3NOAEL劑量或3mg/m、在各28天循環(huán)的第1-5天和第8-12天給予的總劑量為0.3mg/m"天)。scFvMEL/TNF的體內(nèi)效力在早期(50mm勺用2.5mg/kg劑量的scFvMEL/TNF治療顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性，經(jīng)游標(biāo)卡尺測量監(jiān)測，在第21天5只小鼠中三只無腫瘤和完全腫瘤消退，在第43天5只小鼠中5只的腫瘤完全消退。在較晚時(shí)期(200mm、治療小鼠，也顯示出腫瘤消退，在第44天3/5無腫瘤。無腫瘤的小鼠后來不會長出腫瘤。這些數(shù)據(jù)證明，scFvMEL/TNF可在體內(nèi)靶向黑色素瘤細(xì)胞，并可導(dǎo)致顯著的抗-黑色素瘤作用。研究設(shè)計(jì)這是評價(jià)scFvMEL/TNF的安全性、耐受性、PK和效力的I期、開放標(biāo)記、劑量遞增研究。一旦確定了MTD后，將其它患者編入此劑量，以進(jìn)一步改進(jìn)推薦的I期劑量。在28天循環(huán)的第1-5天和第8-12天給予的起始劑量為0.3mg/m2(1/3小鼠NOAEL劑量)。劑量遞增如下所述進(jìn)行劑量遞增100%遞增，直到觀察到任何生物學(xué)活性(除了輕微惡心和嘔吐)；然后50%遞增，直到觀察到2級副作用(AE);然后25%遞增，直到碰到發(fā)生有限毒性的劑量。這被定義為6名患者中2名或多名出現(xiàn)3級非血液學(xué)副作用或4級血液學(xué)副作用的劑量。最大耐受劑量(MTD)定義為僅次于它的劑量水平。一旦確定了MTD，至少3名患者將接受該劑量的至少3個(gè)循環(huán)，以確定該劑量是否有蓄積毒性。以最大耐受劑量研究至少6名患者。每個(gè)劑量水平治療一名患者，直到發(fā)生2級副作用(AE);然后每個(gè)劑量水平編入3名患者。如果在任何給定劑量水平下，3名患者中1名產(chǎn)生^3級或更高的AE，那么將這3名患者編入該劑量水平。如果6名患者中^2名產(chǎn)生3級非血液學(xué)AE或4級血液學(xué)AE，則不進(jìn)一步提高劑量。此劑量水平將被定義為最大耐受劑量(MTD)。一旦達(dá)到每個(gè)劑量水平需要編入3名患者的劑量后，一旦前一劑量水平的3名患者中1名在14天中接受10次輸注外加2周隨訪，并且前一劑量水平的其余2名患者接受至少5次輸注并且符合進(jìn)行第六次輸注的條件，都沒有出現(xiàn)劑量限制毒性(DLT)，那么將這些患者編入下一個(gè)較高劑量水平。如果在前一循環(huán)期間沒有觀察到AE級別〉1，那么允許在下一個(gè)循環(huán)期間遞增同一患者的劑量。然而，如果出現(xiàn)2級或更高AE但該患者仍符合接受下一循環(huán)的條件，那么該患者將繼續(xù)接受scFvMEL/TNF而不進(jìn)一步遞增劑量。主要研究人員在咨詢醫(yī)學(xué)監(jiān)測員后作出關(guān)于劑量遞增的所有決定。在從臨床試驗(yàn)獲得信息時(shí)可改變劑量遞增水平計(jì)劃。如果有證據(jù)顯示改善(穩(wěn)定疾病或腫瘤減小、癥狀緩解)和非血液學(xué)副作用不高于2級，那么該患者符合接受下一循環(huán)的scFvMEL/TNF的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)研究人員的判斷，患者可接受高達(dá)總共5個(gè)額外循環(huán)。研究人員根據(jù)此時(shí)可獲得的所有信息確定用于下一循環(huán)的劑量。根據(jù)副作用調(diào)整接受>1個(gè)循環(huán)的個(gè)體患者的劑量。如果在前一循環(huán)中該患者發(fā)生與該研究藥物有關(guān)的3級AE，那么將保持該劑量，直到AE降低到預(yù)處理基線。劑量限制毒性(DLT)的定義DLT定義為滿足以下NCI普通毒性標(biāo)準(zhǔn)的"可能或確定與研究藥物有關(guān)的副反應(yīng)"血液學(xué)毒性4級嗜中性白血球減少癥^5天，4級血小板減少，嗜中性白血球減少癥感染；非血液學(xué)毒性任何3或4級非血液學(xué)毒性，除了惡心、嘔吐、腹瀉和脫發(fā)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析鑒于臨床試驗(yàn)的特性，用常規(guī)描述統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行分析。治療計(jì)劃在門診中進(jìn)行所有scFvMEL/TNF給藥循環(huán)?；颊咦畛踉诟?8天循環(huán)的第1-5天和第8-12天以1小時(shí)IV輸注接受3mg/m、連續(xù)兩周每周的MON-FRI)。如果對象沒有出現(xiàn)不可接受的毒性(3-4級)或在治療期間疾病進(jìn)展，那么隨后繼續(xù)治療。在各循環(huán)結(jié)束時(shí)重復(fù)評價(jià)可見或可觸知腫瘤的反應(yīng)；在每兩個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)用成像技術(shù)評價(jià)可檢測腫瘤的反應(yīng)。由研究人員根據(jù)此時(shí)獲得的全部安全性和效力數(shù)據(jù)的評價(jià)確定是否用研究藥物進(jìn)一步治療。每周觀察臨床患者，觀察時(shí)注意患者的癥狀和體征改變、可觀察的腫瘤和頒發(fā)的病癥，獲得血液以測定血液學(xué)參數(shù)和血清化學(xué)。在第一個(gè)循環(huán)的第三周開始時(shí)(第16±3天)，獲得重復(fù)腫瘤活檢樣品。在每隔一個(gè)循環(huán)的結(jié)束時(shí)重復(fù)評價(jià)腫瘤大小的成像研究。取得血樣用于藥代動力學(xué)分析對所有患者取血樣，以測定研究藥物水平和測定各循環(huán)的抗體水平。在第1個(gè)循環(huán)中進(jìn)行密集采樣；在接下來的循環(huán)中每次降低釆樣密集度。各血樣由抽入含肝素試管的10ml血液組成。所有血樣都應(yīng)在4。C立即離心，去除血槳，分三等分凍存?？筛鶕?jù)對前幾個(gè)患者的分析改變這些樣品的時(shí)間，以獲得最佳藥代動力學(xué)參數(shù)。對于第1個(gè)循環(huán)，第1天恰好在研究藥物開始輸注前，恰好在研究藥物完成輸注時(shí)和完成藥物輸注后的以下時(shí)間5、10、20、40、80、160和320分鐘。對于第2-5天和第8-12天恰好在每日藥物輸注結(jié)束前和每日藥物輸注結(jié)束時(shí)。對于第2個(gè)循環(huán)和所有后續(xù)循環(huán)，對于第1-5天和第8-12天恰好在每日藥物輸注結(jié)束前和每日藥物輸注結(jié)束時(shí)。腫瘤活檢的組織學(xué)評價(jià)第一次輸注研究藥物之前獲得可及腫瘤的活檢樣品，在第一個(gè)循環(huán)的第三周開始時(shí)(第16±3天)再次獲得。除常規(guī)病理學(xué)檢査外，用免疫組化和原位雜交實(shí)驗(yàn)評價(jià)處理前和處理后的樣品中的以下參數(shù)gp240表達(dá)、增殖速率(抗Ki67)和凋亡程度(用TUNEL技術(shù))、TNF的腫瘤含量和壞死程度。以半定量方式收集所有數(shù)據(jù)，用卡方檢驗(yàn)和Studentt檢驗(yàn)進(jìn)行比較。毒性評價(jià)監(jiān)測毒性，根據(jù)癌癥治療評價(jià)程序通用毒性標(biāo)準(zhǔn)2.0版(CTCv2.0)進(jìn)行評級。應(yīng)報(bào)道CTCv2.0中未包括的副作用，分到合適分類的"其它"副作用中?？蓮腃TEP主頁上下載CTCv2.0的拷貝。反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)腫瘤反應(yīng)是此臨床研究的預(yù)期第二終點(diǎn)。用實(shí)體瘤小組反應(yīng)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)評價(jià)此研究中的對象腫瘤反應(yīng)(Therasse，Arbuck等)。用游標(biāo)卡尺測量不難觀察到的皮膚病損；用M.D.Anderson癌癥中心放射科開發(fā)的方法指南以CT、MRI或超聲評價(jià)體內(nèi)腫瘤塊。用相同評價(jià)方法和相同技術(shù)表征基線時(shí)和隨訪期各鑒定和報(bào)道的病損。定義基線時(shí)，腫瘤病損分類如下?？蓽y定可在至少一個(gè)方向上準(zhǔn)確測量的所有病損[記錄的最長直徑]=常規(guī)技術(shù)測定時(shí)20mm，或螺旋CT掃描時(shí)40mm。在本說明書中通過至少一種病損的存在定義可測定疾病。不可測定經(jīng)常規(guī)技術(shù)測定最長直徑<20mm的所有病損或用螺旋CT掃描〈10mm的病損，確實(shí)不可測定的病損(柔腦膜病、腹水、胸膜或心包積液、骨病、淋巴管炎)。靶和非靶病損應(yīng)該將每個(gè)器官多達(dá)最多5處病損、總計(jì)10處病損的所有可測定病損(代表所有涉及的器官)鑒定為靶病損，并在基線時(shí)測定和記錄。應(yīng)通過大小(直徑最長的病損)和適合產(chǎn)生準(zhǔn)確重復(fù)測定結(jié)果的特性(成像研究或臨床)來選擇耙病損。所有靶病損的最長直徑之和將被計(jì)算和報(bào)道為基線最長直徑之和?；€最長直徑之和用作參比來表征對象腫瘤反應(yīng)。所有其它病損應(yīng)鑒定為非靶病損并在基線時(shí)記錄?？傮w反應(yīng)靶病損的評價(jià)所有靶病損消失時(shí)發(fā)生完全反應(yīng)；成像研究或臨床評價(jià)證明靶病損的最長直徑之和至少降低30%時(shí)發(fā)生部分反應(yīng)，將基線最長直徑之和用作參比；靶病損的最長直徑之和至少增加20%時(shí)發(fā)生進(jìn)行性疾病，將從治療開始后或出現(xiàn)一處或多處新病損時(shí)記錄的最小的最長直徑之和用作參比；縮小不足以限定部分反應(yīng)或增大不足以限定進(jìn)行性疾病時(shí)，發(fā)生穩(wěn)定疾病。非靶病損的評價(jià)完全反應(yīng)是所有非耙病損的消失；不完全反應(yīng)/穩(wěn)定疾病是一種或多種非靶病損的持續(xù)；進(jìn)行性疾病是出現(xiàn)一處或多處新病損和/或現(xiàn)有非靶病損的明確進(jìn)展；最佳總體反應(yīng)的評價(jià)最佳總體反應(yīng)是從治療開始時(shí)到疾病進(jìn)展/復(fù)發(fā)時(shí)記錄的最佳反應(yīng)(將從治療開始時(shí)記錄的最小測定值用作進(jìn)行性疾病的參比)。健康狀況惡化、需要中斷治療但此時(shí)沒有客觀證據(jù)說明疾病進(jìn)展的的患者應(yīng)被分類為"癥狀惡化"。應(yīng)竭盡所能記錄對象疾病進(jìn)展，即使在治療中斷后。如果完全解決了病損并難以區(qū)分殘留疾病與正常組織，必須用細(xì)針吸出物進(jìn)行殘留異常的組織學(xué)評價(jià)，然后確認(rèn)完整的反應(yīng)狀態(tài)。scFvMEL/TNF在小鼠中的藥代動力學(xué)研究測定scFvMEL/TNP在小鼠中代謝的示范性藥代動力學(xué)參數(shù)。用對碘苯甲酸酯以1251放射性標(biāo)記scFvMEL/TNF，采用這種放射性標(biāo)記scFvMEL/TNF的示范性方法。該方法將N-琥珀酰亞胺基對碘苯甲酸酯偶聯(lián)于蛋白質(zhì)。簡要說，將37.5pl1%HOAc/MeOH、101mg/mlN-氯琥珀酰亞胺的MeOH溶液和10jilPBS依次加入裝有橡膠隔片的反應(yīng)瓶中，該反應(yīng)瓶中裝有含4-三正丁基甲錫烷基苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯(NeorxCorp.,華盛頓州西雅圖)(12.5mg)的12.5(ilHOAc/MeOH溶液。將l-mCi等份的^1(Dupont)加入反應(yīng)溶液中，5分鐘后，通過加入10nl0.1MNaHSO3中止該反應(yīng)。在N2氣流下蒸發(fā)MeOH溶劑10分鐘。將100mlPBS中的500嗎蛋白質(zhì)樣品與100pl0.5M硼酸鹽緩沖液(pH9.3)混合，然后加入反應(yīng)瓶中。在室溫下偶聯(lián)5分鐘。通過在SephadexG-25(PD-10)柱(PharmaciaLKBBiotechnology,新澤西州皮斯卡塔韋)上層析去除未反應(yīng)的放射性碘。放射性化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)率為40%-60%。通過三氯乙酸沉淀測定，摻入放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)大于90%。放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)的特異性活性為0.4fiCi/嗎。示范性藥代動力學(xué)研究如下。采用4-6周齡BALB/c小鼠，每只小鼠注射2^Ci，200pl生理鹽水配制的5嗎總蛋白。注射后1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，用斷頸法處死各測定時(shí)間的兩只小鼠。從胸腔取血樣，稱重，用Y計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以測定總放射性(Packard，型號5360)。也離心血樣，傾析血槳，計(jì)數(shù)測定放射性。用最小平方非線性回歸(RSTRIP，來自MicroMath，Inc.)程序分析血漿放射性測定的結(jié)果，以測定藥代動力學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)作圖，測定各時(shí)間點(diǎn)上的數(shù)據(jù)的平均值土SEM。數(shù)據(jù)顯示，iv給藥后scFvMEL/TNF構(gòu)建物從循環(huán)系統(tǒng)中清除的末期半衰期為17.6小時(shí)。scFvMEL/TNF的立即表觀分布容積(Vda)為19.50ml。濃度曲線下面積(AUC)計(jì)算為4.0mg/mlx小時(shí)。測定平均停留時(shí)間為8.3小時(shí)。測定scFvMEL1TNF免疫細(xì)胞因子在裸小鼠中的最大耐受劑量(MTD)和致死劑量(LD)測定scFvMEL/TNF免疫細(xì)胞因子的MTD和LD。將裸小鼠(nu/nu)分配到6個(gè)不同籠中，通過尾靜脈每天給予scFvMEL/TNF(2mg/ml)免疫細(xì)胞因子，共5天。scFvMEL/TNF在小鼠中的LD25約為4.8mg/kg。scFvMEL/TNF在小鼠中的LD100約為8.3mg/kg。scFvMEL/TNF在小鼠中的MTD約為4.0mg/kg。為確定維持scFvMEL/TNF生物學(xué)活性的最佳貯存條件進(jìn)行的劑型研究測定用于維持scFvMEL/TNF的最佳生物學(xué)活性的最佳緩沖液組成、pH、儲存溫度和額外蛋白質(zhì)含量。將scFvMEL/TNF樣品加入pH6.5、7.0和7.5的磷酸鈉緩沖液(100mM)中。同時(shí)制備含有0.1。/。HSA的重復(fù)樣品，將所有六個(gè)樣品儲存于4'C或-2(TC。一段時(shí)間(8周)后，取出樣品，如下所述測定對培養(yǎng)的A375-M細(xì)胞的比較細(xì)胞毒性以4"03個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板中，靜置過夜貼壁。然后，用含有不同濃度的scFvMEL/TNF的培養(yǎng)基交換培養(yǎng)基。72小時(shí)后，用結(jié)晶紫染色確定scFvMEL/TNF對培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長的影響。簡要說，固定細(xì)胞，加入0.5%結(jié)晶紫的20%甲醇溶液(0.05ml/L)染色30分鐘。用去離子水洗滌該平板，加入0.2mlSorenson's緩沖液/孔(0.1M檸檬酸鈉，pH4.2，用50%乙醇配制)以萃取貼壁細(xì)胞中的結(jié)晶紫。室溫渦旋細(xì)胞平板30分鐘，在630nm處讀出吸光度(Bio-TekInstruments,Winooski，Vt)，并與只有培養(yǎng)基的對照孔作比較。在pH6.5、7.0或7.5緩沖液中4。C保存的樣品之間，scFvMEL/TNF的細(xì)胞毒作用沒有有效差異。在pH6.5、7.0或7.5配制并儲存于-2CTC的樣品之間，scFvMEL/TNF的細(xì)胞毒作用沒有有效差異。在pH6.5、7.0和7.5的制劑中加入0.P/。HSA并儲存于4'C或-2(TC沒有影響。因此，根據(jù)這些數(shù)據(jù)，scFvMEL/TNF的最佳配制條件是pH7.5的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。此制劑的最佳貯存條件是-2(TC儲存長達(dá)3個(gè)月，沒有檢測到生物學(xué)活性損失或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)降解。劑量范圍研究5次每日靜脈內(nèi)注射后scFvMEL/TNF在雌性Balb/c小鼠中的毒性在Balb/c雌性小鼠中進(jìn)行scFvMel/TNF的多劑量靜脈內(nèi)范圍研究。每組五只雌性小鼠每天靜脈內(nèi)注射0.2、0.4、0.6禾B0.8mg/kg/天scFvMel/TNF(第2-5組)，共5天。遞送的總劑量為l、2、3和4mg/kg，對應(yīng)于之前確定的最大耐受劑量(MTD)的25、50、75和100%。載體對照組(第1組)由鹽水組成。最后一次注射(第12天)后7天，用二氧化碳處死研究的動物，最后放血，以進(jìn)行血液學(xué)和臨床化學(xué)分析，并進(jìn)行完全尸檢。在本研究的條件下，主要發(fā)現(xiàn)是沒有發(fā)生死亡；沒有觀察到血液學(xué)或臨床化學(xué)參數(shù)發(fā)生與受試物質(zhì)相關(guān)的改變；沒有觀察到與組織樣品的受試物質(zhì)相關(guān)的總改變；在所有劑量組中觀察到相對脾重發(fā)生劑量相關(guān)性增加，脾重的增加與紅髓髓外造血和白髓濾泡增生增加有關(guān)；可在顯微鏡下觀察到肝、脾和肺中存在與受試物質(zhì)相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。在肝和脾中觀察到劑量相關(guān)性髓外造血，在脾中觀察到濾泡細(xì)胞(淋巴)增生。不認(rèn)為這些病損是副作用。在最高劑量水平下的3/5小鼠中觀察到單個(gè)再通血栓。這些血栓只在一根血管中發(fā)生，不會損傷肺功能。然而，認(rèn)為它們是生物學(xué)有害的。對于雌性小鼠來說，在本研究條件下未觀察到副作用水平(NOAEL)為0.6mg/kg/天。此劑量水平遞送了總共3mg/kg劑量，等價(jià)于之前確定的MTD的75。/。。本研究的示范性材料和方法如下。在計(jì)劃的處死日第12天，用二氧化碳處死動物，最后從心臟放血，進(jìn)行完全尸檢。對于臨床病理學(xué)，將血液收集到EDTA容器中進(jìn)行全血計(jì)數(shù)(CBC),將全血放入凝血管中，以收獲血清進(jìn)行臨床化學(xué)研究。血液學(xué)CBC臨床化學(xué)總膽紅素鈣磷鈉AST(SGOT)鉀ALT(SGPT)氯總蛋白堿性磷酸酶白蛋白肌酸酐球蛋白BUN在尸檢中，完全尸檢定義為檢查尸體的外表面、所有開口、顱腔、胸腔和腹腔及其內(nèi)容物。收集所有設(shè)計(jì)處死小鼠的以下組織消化系統(tǒng)、包括肝、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、唾液腺、胰腺；心血管系統(tǒng)、包括心臟和主動脈；呼吸系統(tǒng)、包括氣管和肺；泌尿系統(tǒng)、包括腎和膀胱；造血系統(tǒng)、包括脾、胸腺、腸系膜淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)、骨髓(股骨/胸骨)；內(nèi)分泌系統(tǒng)、包括腦垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺；神經(jīng)系統(tǒng)、包括腦(大腦、中腦、小腦、延髓/腦橋)、脊髓(頸髓、胸髓、腰髓)、坐骨神經(jīng)；肌肉骨骼系統(tǒng)、包括骨骼肌、股骨/膝關(guān)節(jié)、胸骨；生殖系統(tǒng)、包括睪丸、副睪、前列腺、精囊、卵巢、子宮(宮頸、宮體、喇叭體(hom))和其它、包括皮膚、乳腺、眼、注射部位和總病損。將所有組織放入10%福爾馬林中性緩沖液中固定。將設(shè)計(jì)處死小鼠的以下器官*稱重肝、腎和脾。計(jì)算相對器官重量(最終體重的百分?jǐn)?shù))。將從第1組和第5組收集的所有組織切片，用蘇木精和伊紅染色，顯微鏡檢查。將從第2-4組收集的肝、腎、肺和脾切片，用蘇木精和伊紅染色，顯微鏡檢査。結(jié)論本領(lǐng)域技術(shù)人員能了解，可對本發(fā)明嵌合分子進(jìn)行相似的常規(guī)方法。專利和專利申請美國專利號4,677,064美國專利號5,247,070美國專利號5,422,104美國專利號5,519,119美國專利號5,606，023美國專利號5，652，353美國專利號5,652,353美國專利號5,773,582WO93/21232WO97/22364WO97/46259WO99/45128WO99/49059發(fā)表物A.P.Simoes-Wust，T.Schurpf,J.Hall，R.A.Stahel和U.Zangemeister-Wittke，Bcl-2/bcl-xL雙特異性反義處理使乳腺癌細(xì)胞對多柔比星、紫杉醇和環(huán)磷酰胺敏感(Bcl-2/bcl-xLbispecificantisensetreatmentsensitizesbreastcarcinomacellstodoxorubicin,paclitaxelandcyclophosphamide)，5restQwcerTVea.76，第157-166頁(2002)。A.Sierra,X.Castellsague，A.Escobedo，B.Lloveras，M.Garcia-Ramirez，A.Moreno和A.Fabra，Bcl-2與凋亡損失允許累積遺傳改變?nèi)巳橄侔┺D(zhuǎn)移進(jìn)展的途徑(Bcl-2withlossofapoptosisallowsaccumulationofgeneticalterations:apathwaytometastaticprogressioninhumanbreastcancer),JC。wcer89，第142-147頁(2000)。Adams，G.P.和Schier，R.產(chǎn)生用于腫瘤耙向的改進(jìn)的單鏈Fv分子(Generatingimprovedsingle-chainFvmoleculesfortumortargeting),/7mmwno/.她Aoa^，231:249-260，Review,1999。AggarwalBB禾QNatarajanK.腫瘤壞死因子最近十年的發(fā)展(Tumornecrosisfactors:developmentsduringthelastdecade),EurCytokineNetw1996;7:93-124。AignerA，HsiehSS，MalerczykC，CzubaykoF，逆轉(zhuǎn)HER-2過度表達(dá)使人卵巢癌細(xì)胞對泰素高度耐藥(ReversalofHER-2over-expressionrendershumanovariancancercellshighlyresistanttotaxol)，Toxicology2000;144:221-28。AmarS，VanDykeTE，EugsterHP,SchultzeN，KoebelP，BluethmannH，TNF受體-1介導(dǎo)了腫瘤壞死因子(TNF)-誘導(dǎo)的皮膚壞死(Tumornecrosisfactor(TNF)-inducedcutaneousnecrosisismediatedbyTNFreceptor-l)，JInflamm1995;47:180-9。AqeilanR，YarkoniS，Lorberboum-GalskiH，白介素2-Bax:用于耙向治療的人嵌合蛋白的新原型(Interleukin2-Bax:anovelprototypeofhumanchimericproteinsfortargetedtherapy),FEBSLett,1999August27;457(2):271-6。AtwellJL，BreheneyKA，LawrenceLJ，McCoyAJ，KorttAA，HudsonPJ，抗-神經(jīng)氨酸酶抗體NC10的scFv多聚體VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的接頭長度準(zhǔn)確指出了雙抗體禾D三抗體之間的轉(zhuǎn)變(scFvmultimersoftheanti-neuraminidaseantibodyNC10:lengthofthelinkerbetweenVHandVLdomainsdictatespreciselythetransitionbetweendiabodiesandtriabodies)，ProteinEng1999;12:597-604。AwadaA，CardosoF，AtalayG，GiulianiR，ManoM和PiccartMJ(2003)，2003年用于治療乳腺癌的新抗癌藥的遞送途徑(Thepipelineofnewanticanceragentsforbreastcancertreatmentin2003)，CritRevOncolHematol48，45-63。B.Bucci，E.Carico，A.Rinaldi，F(xiàn).Froio，Y.M.Puce，I.D'Agnano，A.Vecchione禾QE.Brunetti，Tl管侵襲性乳腺癌的攻擊性的生物指標(biāo)(BiologicalindicatorsofaggressivenessinTlductalinvasivebreastcancer),AnticancerRes，21，2949-2955(2001)。BajettaE，DelVecchioM，Bernard-MartyC，VitaliM，BuzzoniR，RixeO，NovaP，AglioneS，TaillibertS和KhayatD(2002)，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤化療(Metastaticmelanoma:chemotherapy),SeminOncol29，427-445。BargmanCI，HungMC，WeinbergRA，neu癌基因編碼表皮生長因子相關(guān)蛋白(Theneuoncogeneencodesanepidermalgrowthfactor-relatedprotein),Nature1986;319:226-30。BelkaC，HeinrichV，MariniP，F(xiàn)altinH，Schulze-OsthoffK，BambergM禾口BudachW(1999)，電離輻射和在凋亡敏感性高的淋巴瘤細(xì)胞中活化胱冬酶-8(Ionizingradiationandtheactivationofcaspase-8inhighlyapoptosis-sensitivelymphomacells),IntJRadiatBio175，1257-1264。BerchuckA，KamelA，WhitakerR等，HER-2/neu過度表達(dá)與晚期上皮卵巢癌存活差有關(guān)(OverexpressionofHER-2/neuisassociatedwithpoorsurvivalinadvancedepithelialovariancancer),CancerRes1990;50:4087-91。Bharti，A.C.和Aggarwal，B.B.，核因子-kB和癌癥它在預(yù)防和治療中的作用(Nuclearfactor-kappaBandcancer:itsroleinpreventionandtherapy),Biochem.Pharmacol.,64:883-888，2002。Bian，X.，Opipari，A.W.Jr.，Ratanaproeksa，A.B.，Boitano，A.E.，Lucas，P.C.和Castle，V.P.，S型成神經(jīng)細(xì)胞瘤的存活需要組成性活化的NF-kb(ConstitutivelyactiveNFkappaBisrequiredforthesurvivalofS-typeneuroblastoma),J.Biol.Chem.，277:42144-42150，2002。BirdRE，HardmanKD，JacobsonJW，JohnsonS,KaufmanBM，LeeSM，LeeT，P叩eSH，RiordanGS，WhitlowM，單鏈抗原結(jié)合蛋白(Single-chainantigen-bindingproteins),Science1988;242:423-426。BlickM，SherwinSA，RosenblumM，GuttermanJ，重組腫瘤壞死因子在癌癥患者中的I期石開究(PhaseIstudyofrecombinanttumornecrosisfactorincancerpatients),CancerRes1987;47:2986-2989。Boris,L.C.和Steinke，J.W.，細(xì)胞因子和趨化因子(Cytokinesandchemokines)，丄AllergyClin.Immunol.,Ill:S460-475,Review,2003。BorishLC和SteinkeJW，2.細(xì)胞因子和趨化因子(Cytokinesandchemokines)，JAllergyClinImmunol2003;111:S460-S475。BozG，DePaoliA，InnocenteR.，RossiC.，TosoliniG.，PederzoliP，Talamini，R，Trovo，MG，對不能切除的胰腺癌患者進(jìn)行放療并連續(xù)輸注5-氟尿嘧啶(Radiotherapyandcontinuousinflision5-fluorouracilinpatientswithnonresectablepancreaticcarcinoma),IntJRadiatOncolBiolPhys2001;51:736-40。BrennanP，BabbageJW，BurgeringBM，GronerB，ReifK,CantrellDA，磷脂酰肌醇3-激酶使白介素-2受體與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)(Phosphatidylinositol3-kinasecouplestheinterleukin-2receptortothecellcycleregulation),Immunity1997;7:679-89。BuchlerP，ReberHA，BuchlerMC，RothMA，Buchler，MW，F(xiàn)riessH，Isacoff，WH，Hines，OJ，用重組人源化抗-HER2抗體(賀賽汀)治療胰腺癌(Therapyforpancreaticcancerwitharecombinanthumanizedanti-HER2antibody(herceptin))，JGastrointestSurg2001;5:139-46。BuchsbaumDJ，BonnerJA，GrizzleWE，StackhouseMA,CarpenterM，HicklinDJ，Bohlen，P，Raisch，KP，用艾比特斯(IMC-C225)抗-EGFR抗體、吉西他濱和放療治療胰腺癌異種移植瘤(Treatme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發(fā)明內(nèi)容不難知道本發(fā)明可以利用目前已有的或以后開發(fā)的過程、機(jī)器、生產(chǎn)、物質(zhì)的組成、方式、方法或步驟來執(zhí)行與本文所述相應(yīng)實(shí)施方式基本相同的功能或達(dá)到基本相同的結(jié)果。因此，附加的權(quán)利要求書的范圍應(yīng)包括這種過程、機(jī)器、生產(chǎn)、物質(zhì)的組成、方式、方法或步驟。權(quán)利要求1.一種在個(gè)體中產(chǎn)生或恢復(fù)一種或多種化療耐受性細(xì)胞的化療敏感性的方法，所述方法包括將治療有效量的嵌合分子遞送給所述個(gè)體，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞特異性耙向部分被進(jìn)一步限定為癌細(xì)胞-靶向部分。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞-耙向部分被進(jìn)一步限定為抗體、生長因子、激素、肽、適體或細(xì)胞因子。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗體被進(jìn)一步限定為全長抗體、嵌合抗體、Fab'、Fab、F(ab'》、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、Fv、單鏈Fv(scFv)、小抗體、雙抗體、三抗體或其混合物。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗體是scFv。6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗體是抗-HER-2/neu抗體。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述HER-2/neu抗體是scFv23。8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗體是抗-gp240抗原抗體。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗-gp240抗原抗體包括scFvMEL。10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞-靶向部分包括一種或多種生長因子。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述生長因子是轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、調(diào)蛋白、血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子或缺氧誘導(dǎo)因子。12.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞-耙向部分包括一種或多種激素。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述激素是人絨毛膜促性腺素、促性腺素釋放激素、雄激素、雌激素、促甲狀腺激素、促卵泡激素、黃體生成素、促乳素、生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、催產(chǎn)素、促甲狀腺激素釋放激素、生長激素釋放激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、促生長素抑制素、多巴胺、褪黑激素、甲狀腺素、降鈣素、甲狀旁腺激素、糖皮質(zhì)激素類、電解質(zhì)代謝皮質(zhì)激素、腎上腺素、去甲腎上腺素、孕酮、胰島素、胰高血糖素、糊精、促紅細(xì)胞生成素、骨化三醇、骨化醇、心房利鈉肽、胃泌素、促胰液素、膽囊收縮素、神經(jīng)肽Y、ghrdin、PYY3.36、胰島素樣生長因子-1、瘦激素、血小板生成素、血管緊張素原、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL陽8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL畫12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL陽26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35或IL-36。14.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞-靶向部分包括一種或多種細(xì)胞因子。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞因子是IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、ILIO、ILll、IL12、IL13、IL14、IL15、IL-16、IL-17、IL-18、粒細(xì)胞-集落刺激因子、巨噬細(xì)胞-集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白血病抑制因子、紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、制瘤素M、白血病抑制因子、IFN-y、IFN-a、IFN-(3、LT-(i、CD40配體、Fas配體、CD27配體、CD30配體、4-lBBL、TGF-(3、ILla、IL-1(3、IL-1RA、MIF、IGIF或其混合物。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗-細(xì)胞增殖部分被進(jìn)一步限定為凋亡誘導(dǎo)部分或細(xì)胞毒劑。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述凋亡誘導(dǎo)部分是粒酶、Bd-2家族成員、細(xì)胞色素C或胱冬酶。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述粒酶是粒酶A、粒酶B、粒酶C、粒酶D、粒酶E、粒酶F、粒酶G、粒酶H、粒酶I、粒酶J、粒酶K、粒酶L、粒酶M或粒酶N。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述粒酶是粒酶B。20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述Bcl-2家族成員是Bax、Bak、Bcl-Xs、Bad、Bid、Bik、Hrk或Bok。21.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述胱冬酶是胱冬酶-1、胱冬酶-2、胱冬酶-3、胱冬酶-4、胱冬酶-5、胱冬酶-6、胱冬酶-7、胱冬酶-8、胱冬酶-9、胱冬酶-10、胱冬酶-11、胱冬酶-12、胱冬酶-13或胱冬酶-14。22.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞毒劑是TNF-oc、白樹毒素、靈菌紅素、核糖體抑制蛋白(RIP)、假單胞菌外毒素、艱難梭菌毒素B、幽門螺桿菌VacA、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌YopT、紫色桿菌素、二亞乙基三胺五乙酸、伊羅夫文、白喉毒素、絲林霉素、蓖麻毒蛋白、肉毒桿菌毒素、霍亂毒素或皂草毒蛋白6。23.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞毒劑是重組的。24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞特異性靶向部分和所述抗-細(xì)胞增殖部分是化學(xué)偶聯(lián)的。25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞特異性靶向部分和所述抗-細(xì)胞增殖部分包含在一融合多肽中。26.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞特異性靶向部分和所述抗-細(xì)胞增殖部分通過接頭連接。27.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述化療耐受性癌細(xì)胞被進(jìn)一步限定為過度表達(dá)HER-2/neu、耐受TNF-a、過度表達(dá)Nf《B、Nf-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型或其組合。28.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述化療耐受性癌細(xì)胞能耐受一種或多種類型的化療藥。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述化療藥類型選自烷化劑、亞硝基脲、抗代謝劑、抗腫瘤抗生素、植物生物堿、紫杉烷或激素藥。30.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述化療耐受性細(xì)胞能耐受5-氟尿嘧啶、順鉑、依托泊甙、多柔比星或吉西他濱中的一種或多種。31.如權(quán)利要求l所述的方法，還包括對個(gè)體進(jìn)行額外癌癥治療。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述額外癌癥治療是化療、手術(shù)、放療、基因治療、激素治療、免疫治療或其組合。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述化療和所述嵌合分子伴隨給藥。34.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述化療和所述嵌合分子連續(xù)給藥。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，在所述化療之前給予所述嵌合分子。36.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，在所述化療之后給予所述嵌合分子。37.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述化療和所述嵌合分子對癌細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同作用。38.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述化療和所述嵌合分子對癌細(xì)胞產(chǎn)生加成作用。39.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述嵌合分子被進(jìn)一步限定為腫瘤輔助手術(shù)治療。40.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述嵌合分子被進(jìn)一步限定為輔助后手術(shù)治療。41.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述嵌合分子是scFvMEL/GrB。42.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述嵌合分子是scFv23/TNF-a。43.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合分子是scFvMEL/TNF-a。44.一種使個(gè)體中一種或多種癌細(xì)胞對化療敏感的方法，所述方法包括給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。45.—種誘導(dǎo)個(gè)體中一種或多種TNF耐受性癌細(xì)胞凋亡的方法，所述方法給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。46.—種誘導(dǎo)個(gè)體中一種或多種過度表達(dá)HER-2/neu的癌細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包括給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性耙向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。47.—種誘導(dǎo)個(gè)體中一種或多種gp240抗原陽性細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包括給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。48.—種在個(gè)體中治療過度表達(dá)Her-2/neu和Nf-KB的癌癥的方法，所述方法包括給予該個(gè)體治療有效量的嵌合分子，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。49.一種在個(gè)體中治療癌癥的方法，所述方法包括給予該個(gè)體治療有效量的至少一種化療藥和嵌合分子，其中所述藥物通過中斷NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用，所述嵌合分子包含細(xì)胞特異性靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分。全文摘要本發(fā)明涉及包含靶向部分和抗-細(xì)胞增殖部分的嵌合癌癥治療分子。在具體實(shí)施方式中，抗-細(xì)胞增殖部分可包括細(xì)胞毒劑或凋亡誘導(dǎo)因子。在具體實(shí)施方式中，嵌合分子的抗-細(xì)胞增殖機(jī)制包括凋亡途徑。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明嵌合分子使對化療耐受的細(xì)胞產(chǎn)生化療敏感性。文檔編號A61K47/48GK101203247SQ200680006202公開日2008年6月18日申請日期2006年1月10日優(yōu)先權(quán)日2005年1月10日發(fā)明者A·D·埃林頓,M·G·羅森布拉姆申請人:研究發(fā)展基金會